JPH06503559A - サブユニット・パピローマウイルス・ワクチンおよびそれに使用するペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サブユニット・パピローマウィルス・ワクチンおよびそれに使用するペプチド本 発明は、肛門性器ヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）感染から保護するサブユ ニット・パピローマウィルス・ワクチンに関する。また、本発明は、その範囲内 に、該ワクチンの抗原性成分を構成するペプチドを含む。

パピローマウィルスはそれが感染する宿主に基づいていくつかの区別される群に 分類できることはよく知られている（例えば、「パピローマウィルスおよびヒト 癌（Ｐａｐｉｌｌｏｍａ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　Ｈｕａ＋ａｎ　Ｃａｎｃｅ ｒ）Ｊ　、エイチ・ツイスタ−（ＩＩＩ。

Ｐｆｉｓｔｅｒ）＆ｉ、　ＣＲＣプレス・インコーホレイテッド（ＣＲＣＰｒｅ ｓｓ　Ｉｎｃ、　）発行、１９９０年）。サラに、ヒト・パピローマウィルス（ ＨＰＶ）はＤＮＡ配列の相同性に応じてタイプ１−５６に区別される。タイプ１ ６．１８および４２は肛門性器管、特に頚部で生じ得る上皮内癌および侵食癌の 大部分と関連する。この点、多数の頚部上皮細胞間新生物および頚部の癌がＨＰ Ｖ１６およびＨＰＶ１８と関連付けられてきた。（ランカスター（Ｌａｎｃａｓ ｔｅｒ）ら、１９８７：キヤンサー・メタスタン７、−レビューズ（Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｍｅｔａｓｔ、　Ｒｅｖ、　）、旦、６５３およびツイスタ−（Ｐｆｉｓｔ ｅｒ）　、１９８７、アドバーンシズ・イン・キャンサー・リサーチズ（＾ｄｖ 。

Ｖａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）、４８．１１３）。これらの同一の２つの文献もま た、パピローマウィルスは８つまでの初期および２つの後期遺伝子をコードする 小ＤＮＡウィルスであることを指摘している。

初期遺伝子Ｅ７の発現からの蛋白は９３ないしコ２７のアミノ酸残基の間で変化 する。該Ｅ７蛋白はＨＰＶ１６を含有するＣａ５ｋｉおよび５ｉＨａ偏平上皮癌 細胞系およびＨＰＶ１８を含有するＨｅＬａおよびＣ４−１系で最も豊富なウィ ルス蛋白である。（シードルフ（Ｓｅｅｄｏｒｆ）ら、１９８７、エンボ・ジャ ーナル（ＥＭＢＯＪ、　）、６．１３９）。ＤＮＡトランスフェクンヨンコンは 、マウス線維芽細胞（ヤスモト（Ｙａｓｕｍｏｔｏ）ら、１９８６、ジャーナル ・オブ・パイロロン−（Ｊ。

ら、１９８７、エムポ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、　）、旦、１７４１）および 初代ヒト・ケラチノサイト（ンユレーゲル（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ）ら、１９８８、 エムポ・ジャーナルり十分な形質転換が導かれ（マトラシエブスキイー（Ｍａｔ ｌａｓｈｅｖｓｋｉ）ら、１９８７、エムボ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、　）、 旦、１７４１）、形質転換した表現型を維持するためにはＥ７遺伝子の継続的発 現が必要である（クルツク（Ｃｒｏｏｋ）ら、１９８９、エムポ・ジャーナル（ ＥＭＢＯＪ、）、旦、５１３）。該Ｅ７蛋白は免疫系によって認識され得る。と いうのは、抗Ｅ７抗体はＨＰＶ１６関連頚部病変を持つ患者の約２０％の血清で 検出できるからである（ジェニソン（Ｊｅｎｉｓｏｎ）ら、１９８８、ジャーナ ル・オブ・パイロロジ−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、６２．２１１５　：ジョクマ スークディールカ（Ｊｏｃｈｍｕｓ−Ｋｕｄｉｅｌｋａ）ら、１９８９、ジャー ナル・オブ・ナショナル−キャンサー・インスティテユート（Ｊ、　Ｎａｔｌ、 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、足１．１６９８ニスミル（Ｓｍｉｌｌ ｉｅ）ら、１９９０、イミュノル・インフエクト・ディス（Ｉｍｗｕｎｏｌ、　 Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、）、１．１３）。

タイプ１６．１８および４２の外、さらにタイプ１６．１８および４２として同 一の下位群内にある遺伝子型６．１１．３１．３３．３５および３９が肛門性器 上皮に対して感染する（ギスマン・キャンサー・サーベイズ（Ｇｉｓｓｍａｎ　 ＣａｎｃｅｒＳｕｒｖｅｙｓ）３　１６２−１８１（１９８４）ツル＋ハオゼン ・ラント・シュナイダ−（Ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ　＆　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ）ザ ・パピローマウィルスズ（Ｔｈｅ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ）ｐ２４ ５−２６３　ホウレイおよびサルラマン（Ｂｏｗｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓａｌｚｍａ ｎ）編、ニューヨーク、プレナムプレス（Ｐｒｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）　（１９ ８７）　）　、　ＨＰＶタイプ１６および１８のＤＮＡはしばしば生殖器腫瘍で 見い出され（ドウルスト（Ｄｕｒｓｔ）ら、ジャーナル・オブ・ンエネラル・バ イオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　）、６６．１５１５−１５２２　 （１９８５）　、ギスマン（Ｇｉｓｓｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ、８０．５６０−５ ６３（１９８３）、この下位群のメンバーは生殖器癌の病因において本質的役割 を果しているという考えを支持する（シルジャネン（Ｓｙｒｊａｎｅｎ）ら、ブ リティッシュ・ジャーナル・オブ・オブステトリックス・アンド・ギネコロジー （ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　０ｂｓｔｅｔｒｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｙ ｎａｅｃｏｌｏｇｙ）　９２　１０８６−１０９２　（１９８５））。ＨＰＶ１ ６ＤＮＡの宿主ゲノムへの組込は、Ｅ２ウィルスＯＲＦの妨害により類題でしば しば観察され、その領域の蛋白産物はｐ９７プロモーターからの初期のＯＲＦ転 写および無傷のＥ６およびＥｌ　０ＲＦの保持をトランス調節する。

豊富な状況証拠は、肛門性器上皮のＨＰＶ関連腫瘍の制御における宿主免疫機構 を示す（シンガー（Ｓｉｎｇｅｔ）ら、ブリティッンユ・メディカル・ジャーナ ル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ）　２８８．７３５−７ ３６．１９８４）。ヒト免疫不全ウィルス感染により免疫抑制された同性愛ヒト でプレ新生物関連（フラツエール（Ｆｒａｚｅｒ）ら、ランセット（Ｌａｎｃｅ ｔ）　ｉｆ　６５７−６６０．１９８６）および新生物関連病変の発生率が高ま っており、免疫抑制した同種移植受容者において乳房および直腸のごとき制御器 官ではなく頚部および外陰部の偏平上皮細胞癌（ＳＣＣ）の危険が顕著に増大し ている（シエイルおよびフラベル（Ｓｈｅｉｌ　ａｎｄＦｌａｖｅｌ）オースト ラリアおよび二二−ジランド合同透析および移植登録の第９回報告（Ｎｉｎｔｈ 　Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａｎ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎ ｄ　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ@ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）　１０４−１１２頁、エイ・ビイ・ ニス・ディズニイー（ＡＰＳ　Ｄｉｓｎｅｙ）編１９８６）。

前記を踏まえると、α〜γグロブリン血症を持つほとんどの患者におけるＨＰＶ 感染の通常の自然履歴は、体液性応答よりも細胞性応答がＨＰＶ感染の表現型の 制御に重要なことを示唆する（キルシュナー（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ）、プログレ ス・イン・メディカル・パイロロジー（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃａ ｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９８６）。

肛門性器ＨＰＶ感染の研究に対する標準的な免疫学的アプローチは、適当な動物 モデルおよびＨＰＶ許容的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ上皮細胞培養がないことによって妨 げられてきた。

また、ＨＰＶに関してワクチンが提案されたが、はとんど成功していない。

自原性腫瘍ホモノネートを含有するワクチンを使用することが提案されている［ アブカリアン（＾ｂｃａｒｉａｎ）ら、ツヤ−ナル・オブ・サージカル・リサー チ（ＪＳｕｒｇ、Ｒｅｓ、）２２　：　２３１−２３６　（１９７７）　、ディ ス・コロン・レフタム（Ｄｉｓ　Ｃｏ１ｏｎ　Ｒｅｃｔｕｍ）　２５　：　６４ ８５４．１９８２、ディス・コロン・レフタム（ＤｉｓＣｏｌｏｎＲｅｃｔｕｍ ）　１９　：　２３７−２４４　（１９７６）コ。しかしながら、最近、ウィル スＤＮＡの癌原効果の可能性のため、もはや自原性ワクチンで患者を治療すべき でないと主張されている（ブンニイ（Ｂｕｎｎｅｙ）、１９８６、プリティノノ ユ・メディカル・ジャーナル（Ｂｒ、　Ｍｅｄ、　Ｊ、）２９３．１０４５−１ ０４７）。

遺伝子工学ワクチンの生産に関しては、この事項は前記ツイスタ−（Ｐｆｉｓｔ ｅｒ）（１９９０）で議論されており、異なるパピローマウィルス型の体液過剰 のため、効果的なワクチンを得るのが困難であったらしい。しかしながら、ツイ スタ−（Ｐｆｉｓｔｅｒ）は、いわゆる初期蛋白（すなわち、Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３ 、Ｅ４、Ｅ５、Ｅｌ、ＥｌまたはＥ８）に注意を払うべきことを指摘している。

なぜならば、これらの蛋白は、上部表皮層で発現される構造蛋白とは対照的にイ ボ感染の増殖する基底細胞でもっとも合成されるようだからである。従って、ツ イスタ−（Ｐｆｉｓｔｅｒ）　（１９９０）によると、ウィルス・カプシド蛋白 はワクチンでの使用に関しては制限されるようである。真核細胞中のパピローマ ウィルス初期蛋白についてのｉｎ　ｖｉｔｒｏテスト系で組換えワクシニアウィ ルスを使用することもツイスタ−（Ｐｆｉｓｔｅｒ）で議論されている。これは 、パピローマウィルス蛋白を発現するか、あるいはワクンニア組換え体でｉｎ　 ｖｉｔｒｏ感染したまたは他の発現ベクターでトランスフェクトしたパラホルム アルデヒド固定自家細胞の表面にある遺伝子的に修飾したワクシニアウィルスよ りなる生ワクチンの形態を採るであろう。ツイスタ−（Ｐｆｉｓｔｅｒ）で議論 されているワクチン開発についてのもう１つの戦略は、グリコシドＱｕｉｌ＾の 免疫刺激複合体を用いることである。

成功した予防的ワクチン接種のデータは、ラン線維乳頭腫のウシ・線維乳頭腫ホ モジナイズ化ホネジネートについてしか存在せず、限定的な免疫性しか呈しない ことを示している［オルラン（Ｏｌｓｏｎ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン ・ベテリナリ・メディカル・アソーンエーシａ　：／（Ｊ、　Ａ１１ｌ、　Ｖｅ ｔ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、　）　１３５．４９９　（１９５９）　、キャン サー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）、λ２，４６３　（１９６２）］ 。遺遺伝子型によるＬ１融合蛋白を含むワクチン（ピラジンスキイー（Ｐｉｌａ ｃｉｎｓｋｉ）ら、ＵＣＬＡシンポジウム、モレキュラー・アンド・セリュラー ・バイオロジー・二ニー・ンリージズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ＮｅｗＳｅｒｉｅｓ）　３２巻、パピローマウィル ス分子および臨床的展望（Ｐａｐｉｌｌｏｍａ　ＶｉｒｕｓｅｓＭｏｌｅｃｕｌ ａｒ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ）アラン・アール・リス（Ａ ｌａｎ　ＲＬｉ５ｓ）、ニューヨーク、１９８５．２５７）も子ウシで用いられ てきたが、ヒトではうま（ゆかないことが判明している。ツイスタ−（１９９０ ）においては、キャプシド蛋白ワクチンの使用によるＨＰＶ感染防止の可能性に ついての証拠は現在ないが、抗腫瘍細胞免疫の誘導は可能であろう述べられてい る。

ＬｌおよびＬ２遺伝子はパピローマウィルス感染の防止および治療用ワクチンお よびパピローマウィルスの診断および検出で使用する免疫原の基礎とされてきた （国際特許出願明細書Ｗｏ８６０５８１６およびＥｏ８３０３６２３）。しかし ながら、これらのワクチンの商業的使用は行われていない。

ワクチンで有用であり得るＨＰＶ１６　Ｅ７蛋白の新しい免疫原性領域を記載す る特許明細書ＥＰ３８６７３４、ＨＰＶ１６蛋白の検出に免疫アッセイ薬剤とし て有用であって、ＨＰＶ１６についての抗原決定基を含有するＨＰＶ１６ペプチ ドを記載するＥＰ３７５５５５、抗腫瘍活性を与えるのに使用されることを意図 したＨＰＶのＥ５、Ｅ６またはＥｌ　０ＲＦを発現する組換え体を含むワクチン を記載Ｔる’）クチン［（ＶＡＣＣｒＮＥＸ１９９０）８　３．１９９−２０４ １中の文献、ＨＰＶ１６　ＬｌまたはＥ７蛋白のエピトープである抗原に対する 特異性についての抗体スクリーニングを記載するオーストラリア明細書５２８６ ０／９０、少なくとも１つの逆ターンおよび予測される親水性を有するアミノ酸 配列領域に対応するＨＰＶの合成ペプチドを記載するオーストラリア明細書７５ ５３５／８７．１５−７５ヌクレオチドを含有するワクチンで有用なタイプ特異 的ＩくピローマウイルスＤＮＡ配列およびペプチドを記載する特許明細書ＥＰ２ １７９１９、パピローマウィルスの少なくとも１つの抗原決定基および免疫原な らびに該抗原決定基を含有するワクチンを記載するＵＰ明細書４５５１２７０． 頚部および生殖器イボの治療用ワクチンで使用され得る、網膜芽細胞腫遺伝子へ のＨＰＶＥ７蛋白の結合を阻害する配列Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌ ｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−３ｅｒ−３ｅｒを有するポリペプチドを 記載する特許明細書ＥＰ４１２７６２を参照されたい。非構造パピローマウィル スの領域をコードする異種ＤＮＡを有する組換えポックスウィルスを含有するパ ピローマウィルスによって誘導される腫瘍の治療用ワクチンを記載するフランス 明細書２６４３８１７、抗原ポリペプチドがＥ６蛋白の一部であるＴｙｒ−ＧＪ ｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＧＪｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅ ｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−ＣｙｓまたはＥ７蛋白の一部であるＣｙｓ−Ｔｙ ｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓ ｐ−Ｇｌｕ−Ｉ　Ｉｅ−ＡｓｐであるＨＰＶ１６　Ｂ６またはＢ７の抗原ポリペ プチドに対して形成された抗体を記載する日本国明細書ＪＯ１０６１６６５、抗 体の産生で使用され得るＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８の発現産物を記載するオー ストラリア明細書７６０１８／８７、Ｂ６、Ｂ７またはＬ２遺伝子の発現産物で あるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８を含めたパピローマウィルスのい（っかの群に より発現されるポリペプチドを含有するキットを記載するＥＰ２３５１８７．１ つが治療剤として使用され得る蛋白Ｅ６の残基４５−５８または蛋白Ｅ７の４０ −５０残基を含む、ＨＰＶ用診断合成ペプチドを含む米国特許第４７７７２３９ 号。

前記先行技術で特に興味深いものは、ＨＰＶ１６抗体の診断用の免疫アッセイ試 薬として使用され得るペプチドＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣを記載する明細１ ＥＰ３７５５５５である。しかしながら、この書類のレビューからは、ＤＲＡＨ ＹＮＩ配列がＨＰＶ１６のＥ７蛋白のＯＲＦのＴヘルパー細胞エピトープに対応 していたとは理解されず、また、本明細書で議論するごとく、ＨＰＶに関する結 果はみられないことは明らかである。

また、特に関連するのは、そのうちの１つ（すなわち、Ｎ　ｏ、　（Ｖ））が配 列Ａｓｐ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ −Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐｍ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒよりな る多数のペプチドを開示する明細書ＥＰ３８６３４である。この配列は配列ＤＲ ＡＨＹを含むことに気がつくであろう。この特別のペプチドはＨＰＶ１６　Ｅ７ 蛋白の有用な免疫原性領域に対応し、かくして、ワクチンで有用であると記載さ れているが、後記する考察より、配列ＤＲＡＨＹＮＩはより有用な抗原原性特性 を有し、かくして、さらに大きな免疫応答を刺激することが理解されるであろう 。

本明細書では、アミノ酸は単一文字コードで以下のごとく表す。

Ｐｈｅ：Ｆ　Ｌｅｕ：Ｌ　Ｉｌｅ：Ｉ　Ｍｅｔ：ＭＶａｌ：Ｖ　Ｓｅｒ：Ｓ　Ｐ ｒｏ：Ｐ　Ｔｈｒ：ＴＡｌａ：Ａ　Ｔｙｒ：Ｙ　Ｈｉｓ：ＨＧｌｎ：ＱＡｓｎ： Ｎ　Ｌｙｓ：Ｋ　Ａｓｐ：Ｄ　Ｇｌｕ：ＥＣｙｓ：ＣＴｒｐ：Ｗ　Ａｒｇ：ＲＧ ｌｙ：Ｇ従って、本発明の目的は、ＨＰＶ感染を治療するのに使用でき、また、 ＨＰＶ感染に対して免疫を生じさせるのにも使用できるサブユニットワクチンを 提供することにある。

さらに、本発明の目的は、該サブユニットワクチンの抗原原性成分を構成し得る ペプチドを提供することにある。

本発明のペプチドは構造ＤＲＡＨＮＩまたはその構造同族体を有し、その同族体 は単一のアミノ酸置換を有し、そのペプチドはＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＢ エピトープに対応する１またはそれを超えるアミノ酸配列に直接または間接に連 結している。

適当なりエピトープはＨＰＶ　Ｂ７の１６のエピトープから選択され、それはＱ ＡＥＰＤ、ＩＤＧＰ、ＥＹＭＬＤおよびＹＭＬＤを包含する。ＨＰＶ　Ｂ７の１ ８のエピトープから選択し得る適当なりエピトープはＤＥＩＤＧＶＮＨＱＬおよ び５ＥＥＮＥＤを包含する。

本発明の範囲内にある代表的なペプチドは以下のものを包含する：Ｂｌ−Ａｌ− ＤＲＡＨＹＮＩ−Ａ２　・・・・・・（１）Ｂ２−ＤＲＡＨＹＮＩ−Ｂ３　・・ ・・・・（２）Ｂｌ−ＡＩ−ＤＲＡＨＹＮＩ−Ａ２−Ｂ４　・・・・・・（３） Ｂ２−ＤＲＡＨＹＮＩ−Ａ２　・・・・・・（４）ＡＩ−ＤＲＡＨＹＮＩ−Ｂ３ 　・・・・・・（５）Ａ　１　−ＤＲＡＨＹＮ　Ｉ　−、へ　２−Ｂ　４　・・ ・・・・　（６）Ｂｌ−Ａｌ−Ｂ４−、Ａ１−ＤＲＡＨＹＮＩ−Ａ２　・・・・ ・・（７）Ｂｌ−Ａｌ−８４−ＤＲＡＨＹＮＩ−Ｂ３−Ａ２−Ｂ５　・・・・・ ・（８）Ｂ１−ＡＩ−８４−Ａ２−８２−ＤＲＡＨＹＮＩ−Ａ２　・・・・・・ （９）前記式（１）ないしく９）において、Ｂ１、Ｂ４およびＢ５は、Ａ１およ びＡ２のごときＢエピトープ配列ではないアミノ酸の介在配列を通じて間接的に Ｔエピトープ配列に連結し得るＢエピトープ配列を表す。

いくつかの場合において、Ｂエピトープ配列はＴヘルパーエピトープ配列に直接 連結し得、かかる場合、第１の局面において、Ｂヘルパーエピトープ配列の末端 アミノ酸とＴエピトープ配列の最初のアミノ酸とは連結し得る。他の場合では、 第２の局面において、Ｔヘルパーエピトープ配列の最後のアミノ酸とＢエピトー プ配列の最初のアミノ酸は連結し得る。従って、この具体例においては、Ｂ１は 、最初の配置をいうＢエピトープ配列を表し、Ｂ３は第２の配置を表すＢエピト ープ配列を表す。第１および第２の局面の具体例はＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩ−Ａ ２　・・・・・・（１０）およびＡ　１−ＤＲＡＨＹＮ　Ｉ　ＤＧ　Ｐ　・・・ ・・（１１）。

式（１９）および（１１）においては、アスパルチンに対応するアミノ酸りは第 １の局面を表し、式（１１）においては、イソロイシンに対応するアミノ酸Ｉは 第２の局面を表す。

本発明で使用し得る特に好ましいペプチドはペプチドＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮｒ− Ａ２である。

本発明における配列ＤＲＡＨＹＮｌはＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ７オープ ンリーデイングフレーム（ＯＲＦ）中の主要Ｔヘルパー細胞エピトープに対応す るものと確認された。ＤＲＡＨＹＮＩはＢ７　０ＲＦのアミノ酸４８−５４に対 応する。

合成により形成し得る本発明の前記ペプチドは、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８Ｅ ７攻撃に対する強力な抗体応答を誘導できる免疫原を形成し得る。Ｔエピトープ は、同時に、いくつかのＢエピトープに対する抗体の産生を容易とできる。

また、本発明は、その範囲内に、適当なアジュバントと組み合わせて１またはそ れを超える前記ペプチドを包含するワクチンを含む。ＨＰＶで感染した動物では 、一般に、適当なアジュバントは、フロイントの完全アジュバント、フロイント の不完全アジュバント、ＱｕｉｌＡおよびサポニンから選択し得る。ヒトに関し ては、ヒトに適合するアジュバントを使用するのが好ましく、この点で適当なア ジュバントはＩＳＣＯＭ（すなわち、免疫刺激複合体）である。

本発明は、エイズのようにヒト生活を荒廃させる頭痛に関するその治療価値とい う理由で重要である。これらの病気に対するワクチンが開発できれば、人類に最 大に益するところである。弱毒化ウィルスまたは死菌ウィルスでの免疫化はそれ に関連した特有の危険を有する可能性がある。危険を減少させるには、ワクチン として必要なりおよびＴエピトープを含有する小ペプチドを使用することができ る。ペプチドワクチンの主要な利点は、（ｉ）自動化化学合成により大量の比較 的純粋なペプチドを得易ことができること、（ｉｌ）有害なりエピトープは除去 できる一方、有用なりエピトープをワクチン構築体に取り込むように該ペプチド を仕立てることができること、（伍）要すれば、多くの人工的なＴ−ヘルパーエ ピトープを混合ワクチンに取り込んで、非近交集団におけるＭＨＣ制限の克服を 助けることができることである。

動物でフロイントのアジュバントを用いてペプチドに対する抗体を誘導すること は容易である。ただし、当該ペプチドはその配列に取り入れたＴ−ヘルパーを有 することを条件とする。しかしながら、ヒトに使用する場合には、同等の効率を 持って、フロイントのアジュバントよりも害のないアジュバントを用いることが できる。また、理想的には、該アジュバントは、ペプチドを免疫原として用いる 場合に、ＣＤ　８　＋ＭＨＣクラスＩで制限される細胞障害性１９２８球を誘導 できるものとすべきである。免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）は前記条件を共に満 足する可能性を有する。ｌＳＣ０Ｍは安定な分子構造で、平均直径３５ｎｍであ り、そこでは蛋白抗原はコレステロールおよびアジュバントのグリコシドＱｕｉ ｌＡのマトリックスに取り込まれる。

蛋白をｌＳＣ０Ｍに取り込むためには、該蛋白は脂質結合領域を有するものでな ければならない。最近、ｐＨを変化させることにより隠れた脂質結合領域を暴露 することによって、あるいは脂質に結合することが知られている蛋白とカップリ ングさせることによっては、脂質結合蛋白はｌＳＣ０Ｍに結合されていない。

これらの実験において、研究者は、ヒトへの使用で安全でないかも知れないおよ び／またはヒトでの使用に必要な純度に調節するのが困難な全長蛋白を使用して きた。本明細書では、マウスにて、合成脂質結合ペプチドにカップリングさせた 構造の明確化なりおよびＴ細胞エピトープの小合成ペプチドを用いてワクチンを 調製する方法を後記する。多くのペプチドはそれ自身では脂質に結合しないので 、脂質の存在下で両親媒性αヘリックス立体配置を採る脂質結合ペプチドＬＡＰ ２０にカップリングさせることによって脂質結合性とすることができる。

ペプチドは、ベンズヒドリル樹脂上の誘導体化ｔ−Ｂｏｃアミノ酸を使用するか 、あるいはアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ）　４３１　Ａペプチド合成器を用いることにより、ホフテン（Ｅｏｕｇｈ ｔｅｎ）　（Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　Ｕ　Ｓ　Ａ８２　５１３１−５１３５　１９８５ ）によって初めて記載された同時多重ペプチド技術を用いて合成した。ペプチド は、ＨＰＬＣによって均一性につきルーチン的に分析した。９０％未鵬の純度の ペプチドは精製した。すべてのペプチドのアミノ酸組成をチェックし、ペプチド ８Ｑをアミノ酸配列決定した。２または３の別合成のペプチドおよび２つの異な る化学（Ｆｍｏｃおよびｔ−Ｂｏｃ）を用いてデータを確認して、バッチごとの 特異的要因を排除した。すべてのペプチドを、非初回免疫リンパ節細胞について の非特異的分裂促進性につきテストし、ツベルクリンＰＰＤ−初回免疫Ｔ−細胞 に対する傷害性をテストした。５ｍｇ／ｍ１にて組織培養基にペプチドを溶解す ることによってストック溶液を作成した。

いくつかの場合において、５％までの酢酸を添加して溶液を得た。

ＨＰＶ１６　Ｅ７蛋白 ＨＰＶ１６　Ｅ７蛋白は、イー・コリにおいて、（エル・ギスマン（Ｌ、　Ｇｉ ｓｓｍａｎｎ）から提供を受けた）ｐＰＬｃ発現ベクター中の熱誘導性ファージ ・プロモーターからＭＳ２融合蛋白（Ｆ　Ｐ）として生産し、トリトン−Ｘ１０ ０によってリリチウム−破壊細菌から６００１５３７．ＦＰを部分的に精製し、 続いての尿素抽出は記載されているごとくに行った（シードルフ（Ｓｅｅｄｏｒ ｆ）ら、１９８７、ＥＭＢＯＪ、旦、１３９−１４４）。精製はファーゼ（ＰＩ ＩＡＳＥ）　（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））　Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ 　Ｇ　Ｅでモニターした。ゲル上で適当なサイズの主要バンドによって判断して ６０−９０％純度ＦＰを含有する調製物を８−１０Ｍ尿素抽出物として得た。

リンパ節細胞（ＬＮＣ）増殖アッセイ フロイントの完全アジュバント（Ｈ３７Ｒａ、ＣＦＡ　ディフコ・ラボラトーズ （Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ、　）、デトロイト）に乳化したペプチド２２０−５０ ｕで尾の基部にてマウスを皮下免疫化した。８〜１０日後、マウスを殺し、イン グリナル（ｉｎｇｕｒｉｎａｌ）節および大動脈周囲節を取り出し、リンパ節細 胞の懸濁液を調製した。グルタミン、ピルビン酸、２％熱不活化マウス血清およ び５ＸＩＯ−’Ｍ２−メルカプトエタノール、ならびに種々の濃度の抗原を含有 するＨｅｐｅｓ緩衝化ＲＰＭＩ　１６４０培地中、平坦な底の９６穴マイクロタ イタープレートにて細胞を４Ｘ１０’１０．２ｍｌにて二連で平板培養した。４ 日後、（３Ｈ）−チミジン（５Ｃ１／ｌｌｌ１１０１）、アメルスハム（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ）　Ｕ、　Ｋ、　）の１μＣ１でパルスラベルし、さらに１８時間後 、取り込まれた３ＨをＢ−発光分光分析によって定量した。

二二二 クイーンズランド（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）大字動物学部から、あるいは動物の リソーシズ・インコーポレイテッド（Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　Ｉｎｃ、　）　［ペ ルス（Ｐｅｒｔｈ）、ウェスタン・オーストラリア］から遅発マウス株を入手し た。マウスは８−２４週令にて使用した。

サイトカイン産生についてのアッセイ １０％胎児ウノ血清およびＩＬ−２産生細胞系ＭＬＡ　１４４からの１０％上澄 みを補足したＰＲＭＩ培地にて、リンホカイン（インターロイキン−２（ＩＬ− ２）およびインターロイキン−４）依存性ＨＴ−２細胞系をｉｎ　ｖｉｔｒｏに て維持した。ＭＬＡ上澄みを省略した結果、（３Ｈ）−チミジン取込による測定 によると、１８時間内に細胞分裂が停止した。ＬＮＣ増殖アッセイからの上澄み を第３日月に収穫し、ＭＬＡ上澄みを一昼夜枯渇させ、無血清培地中で十分洗浄 したＨＴ−２細胞の増殖の誘導についてテストした（エルテル（Ｅｒｔｌ）ら、 （１９８９）、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）旦且、 ２８８５−２８９２）。１０％ＦＣ３を補足した１００μＩＲＰＭＩ培地中の２ Ｘ１０’ＨＴ−２細胞を、遠心して残存リンパ節細胞を除去したＬＮＧ増殖アッ セイ上澄みの５０μｌと共に、二連で培養した。６時間の（３Ｈ）−チミジンパ ルスラベル（ウェル当たり０５μＣｉ）によって増殖を４０〜４８時間後に測定 した。

ペプチド・エライザ・アッセイ 記載されているごとくに（アブラメウス（＾ｖｒａｍｅｕｓ）　１９６９−イミ ノ°ケミストリー（Ｉｍｍｕｍｏ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、旦、４３−４７）、 単一工程のグルタルアルデヒド法を用い、ペプチド３Ｑ、６Ｑ、７Ｑおよび８Ｑ をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に複合させた。炭酸水素塩結合緩衝液ｐＨ９， ６中における５０ｕｇ／ｍｌでのインキュベーションによってペプチド−ＢＳＡ 複合体をマイクロタイタープレートに結合させた。５％脱脂粉乳、０．１％ＢＳ Ａ、０．１％ツイーン２０を含有するＰＢＳ中における一連の希釈にて、種々の ペプチド構築体で免疫したマウスからの血清でのインキュベーションに先立ち、 ５％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、マイクロタイタープ レート上に残存する部位をブロックした。適当に洗浄した後、ホースラディッシ ュベルオキシダーセ結合抗マウスＩｇ（シレナス・ラボラトリーズ（Ｓｉｌｅｎ ｕｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、オーストラリア）および２，２°−アジノ ビス（３−エチルーペンズトリアゾリンスルホナー１−）（ＡＢＴＳ）基質を添 加した。タイターチック（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）マルチスキャン・マイクロタイタ ー・プレート・リーダー（フロラ・ラボラトリーズ（ＦＩＯＷｔ、ａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ）、スコツトランド）にて光学密度（○Ｄ、）を４１４ｎｍで定量し た。ＨＰＶ１６　Ｅ７／ＭＳ　ＦＰエライザ・アッセイを、記載されている方法 を修飾して行った（ティンドル（Ｔｉｎｄｌｅ）ら、１９９０、ジャーナル・オ ブ・ジェネラル・バイｏｏジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）、ヱ１．１３ ４７−１３５４）。

すべてのエライザ・アッセイ・プレートは、陽性および陰性対照として、各々、 ＨＰＶ１６　Ｅ７線状エピトープＥＹＭＬＤ、ＩＤＧＰおよびＱＡＥＰＤに特異 的なモノクローナル抗体８Ｆ、４Ｆおよび６Ｄのパネルで同時にインキュベート したウェルを含有するものであった（ティンドル（Ｔｉｎｄｌｅ）ら、（１９９ ０）、ペプチド・リサーチ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｓ、　）、旦、１６２−１６ ６）。

抗体産生についてのペプチド免疫 フロイントの完全アジュバント中に乳化したペプチド２０−５０ｕｇで、１４日 間隔にて、マウスを３回腹腔内（ｉｐ、）免疫化した。最後の注射８日後、後方 眼高科叢からマウスの血液を採取し、血清を調製し、エライヤ法を行った。

担体初回免疫アッセイ ＣＦＡ中で乳化したペプチド２０−５０ｕｇのペプチド８ＱまたはＰＢＳでマウ ス（群当たり３〜５匹）を腹腔的免疫化した。３〜５週間後、完全なＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子（ＶＡＣ−Ｅ７）（ドルス・エイ・ミンランおよびジエイ・スターリ ング（Ｄｒｓ、Ａ、　Ｍｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）、ｐｅ ｒｓ、ｃｏｎｃｓ、）を含有する組換えワクシニアウィルスの１０７ブラーク形 成単位（ｐｆｕ）または野生型ワクシニアウィルス（ＷＲ−ＶＡＣ）のｌＱ’ｐ ｆｕにて、尾基部傷付は処理によってマウスを感染させた。７−８日後、各マウ スから血清を調製し、マイクロタイターブレートに結合したペプチド８Ｑまたは ＲＰＭＩ６　Ｂ７　ＦＰに対するエライザアッセイによって抗−Ｅ７抗体を測定 した。陰性対照は無関係ペプチド（６Ｑ）で免疫したマウス、および無関係ペプ チドを結合させたマイクロタイタープレートで完全な予測されるＲＰＭＩ６　Ｅ ７蛋白をカバーする重複した１５−２Ｑ量体ペプチドのセット（図ＩＡ）を用い てＴ−増殖性エピトープの位置を決定した。

ＣＦＡ中のペプチド２Ｑ−５Ｑ、６Ｑ〜９Ｑまたはｌ０Ｑ−１２Ｑの混合物、あ るいはＣＦＡ中のＲＰＭＩで、４群のＣ５７Ｂ１／６（Ｈ−２ｂ）マウスを免疫 した。各群からのプールしたＬＮＧを、個々のペプチドの２または２０μｇ／ｍ ｌでｉｎ　ｖｉｔｒｏにて攻撃し、放射能標識チミジンの取込として増殖を測定 した。図ＩＢに示したデータは６つのアッセイの代表的なものである。ペプチド ８Ｑは、６Ｑ−９Ｑ免疫化群からのＬＣＮにおいて強い増殖を首尾一貫して誘導 した（図ＩＢ、ｂ）。ペプチド７Ｑはこの群では弱い応答を誘導した。ペプチド ８Ｑおよび７Ｑは４４−５５位にて１２個のアミノ酸重複を有する。ペプチド４ Ｑおよび５Ｑで攻撃した場合、弱く首尾一貫しない応答が２Ｏ−５Ｑ免疫化マウ スで観察された（６実験のうち３、図ＩＢ、ａ）。適当に免疫化したＢ１０．Ａ （４Ｒ）（Ｈ−３ｈ２）　、またはＢａ　ｌ　ｂ／ｃ　（ｈ−２’）　マウスか らのＬＮＧを用いるアッセイにて、２Ｑ−１２Ｑシリーズからのさらなるペプチ ドはいずれも増殖を誘導しなかった（データ示さず）。

８Ｑに対する増殖応答のＭＨＣ制限を調べるため、ＭＨＣクラス２座のみが異な る一連の同種マウス、およびＭＨＣクラス２のハブロタイブが明確なマウスの他 の近文系をペプチド８Ｑおよび６Ｑの混合物で免疫し、そのＬＮＧを引き続いて ８Ｑまたは６Ｑでｉｎ　ｖｉｔｒｏにて攻撃した（６Ｑは内部陰性対照として含 ませた）。

ＢＩＯバックグラウンド上のすべての同種株からの免疫マウスは、０．０４−２ ７μｇ／ｍｌ範囲にわたり、ペプチド８Ｑに対する強い増殖応答を示したが、対 照ペプチド６Ｑに対しては示さなかった（図２ａ）。さらなる実験において、他 の免疫株ｓ７Ｒ（Ｉ−ＡＳ’−Ｅ’）　、Ｓ９４　（Ｉ−ＡＪ−Ｅ”Ｓ）、Ｃ８ Ｈ（１−ＡＭ−Ｅ’）　、ＣＢＡ（１−ＡｋＩ−Ｅ’）、ＤＢＡ（１−Ａ’Ｉ− Ｅ’）、Ｂａ１ｂ／ｃ　（Ｉ−Ａ’Ｉ−Ｅ’）　、Ｃ５７Ｂ１　（１−Ａ”１− Ｅｂ）およびＢＬＩＯ（Ｉ−ＡｂＩ−Ｅ１′）は、すべて、８Ｑに対する増殖性 応答を示した。これらのデータは、先に初回免疫したマウスにおけるペプチド８ Ｑに対する増殖性応答は、テストした５のＩ−Ａまたは８のＩ−Ｅ対立遺伝子の いずれを通じても制限されないことを示す。

増殖を誘導するであろう最小ペプチドを明確化するために、８Ｑ免疫化マウスか らのＬＮＧを、８Ｑの一連のＣ゛−末端およびＮｏ−末端切形でｉｎ　ｖｉｔｒ ｏにて攻撃した（表１）。ペプチドＢ３、Ｂ４．８ＱおよびＢ７−１０で刺激し たＬＮＣは有意な増殖を示し、これは、コンセンサス配列”ＤＲＡＨＹＮＩ５４ は最小の増殖性エピトープであることを示した。続いての実験において、刺激指 標はかなり低かったにも拘わらず（各々、６．１および５．１）、８Ｑ初回免疫 Ｂ１０．Ａ（２Ｒ）および２９ＲマウスからのＬＮＧは、７量体ペプチドＤＲＡ ＨＹＮＩに応答して増殖した。

ＲＰＭＩ６　Ｅ７蛋白でのｉｎ　ｖｉｔｒｏ攻撃に対するＬＮＧの応答につき初 回免疫するペプチド８Ｑの能力をテストした。ＲＰＭＩ６　Ｂ７　ＦＰおよび８ Ｑを用いるペプチド８Ｑ免疫化マウスからのＬＮＣの攻撃によって誘導された増 殖は、攻撃が８Ｑについてのものとほぼ等モルに調整すると、同じ桁の大きさで あった（図２）。

ＲＰＭＩ６　Ｅ７ｍ白がペプチド８Ｑにつき初回免疫するが否かをテストする実 験において、ＲＰＭＩ６　Ｂ７で免疫化したマウスからのＬＮＧは、「偽」免疫 化マウスを除き、８Ｑでｉｎ　ｖｉｔｒｏ攻撃した場合に、増殖した（図２Ｃ） 。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏで刺激した場合、初回免疫マウスからのＬＮＣはインターロイ キンを産生ずる。

６Ｑまたは９Ｑ攻撃ではなく、８Ｑおよび７Ｑ攻撃した、６Ｑ−９Ｑペプチドの 混合物で先に免疫化したマウスからのＬＮＣからの上澄み流動体は、ＩＬ−２／ ＩＬ−４依存性細胞系ＨＴ−２の増殖を誘導した（図２Ｄ）。他のＱシリーズペ プチドで免疫化し、次いでそれでｉｎ　ｖｉｔｒｏ攻撃したマウスからのＬＮＣ の上澄みはＨＴ　−２細胞の増殖を誘導しなかった（示さず）。

ペプチド８Ｑが、初回免疫ＬＮＣがそれに対して応答するＴ−エピトープを含有 することを、増殖およびサイトカイン産生によって決定した後、次いで、本発明 者らは、初回免疫ＬＮＧが、ＲＰＭＩ６　Ｂ７のＢ細胞エピトープに対する特異 的抗体の産生につき、Ｂ細胞を「助力」するか否かを決定するために、一連の実 験を行った。本発明者らの研究所の以前の実績では、マウス・モノクローナル抗 体（Ｍａｂｓ）によって認識される、ＲＰＭＩ６　Ｅ７蛋白中の３つの免疫優性 Ｂ−細胞線状エピトーブの位置が確認されている（ティンドル（Ｔｉｎｄｌｅ） ら、ンヤーナル・イブ・シエネティノク・パイロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉ ｒｏｌ、）、７１．１３４７−１３５４）。初期の実験において、本発明者らは 、前記にて定義したＴ−エピトープ”ＤＲＡＨ’ｒＮＩ”に加え、ペプチド８Ｑ もまた免疫優性Ｂ−二ピトープ４４Ｑ、ＡＥＰＤ４ｇを含有するという事実を見 い出した。

８Ｑて免疫し、野生型ウィルス（ＷＲ−〜’ＡＣ）ではなく組換ワクシニア−Ｅ ７ウイルス（ＶＡＣ−Ｂ７）に３・１／２週間後に感染させたマウスの血清は、 共１：ＱＡＥＰＤ　Ｂ−Ｌビトープを含有する８Ｑ（図３Ｂ）お、、ｌ：ぴＲＰ ＭＩ６　Ｂ７（図３Ａ）と反応する抗体を含有していた。

従って、全真核生物Ｅ７蛋白ての引き続いての攻撃につき含ＱＡＥＰＤペプチド を認識する８Ｑペプチド初回免疫ＤＲＡＨＹＮＩ−反応性Ｔ−ヘルパー（Ｔｈ） 細胞およびＢ−細胞での単一の免疫は、初回免疫ＤＲＡＨＹＮＩ−反応性Ｔｈ− 細胞を刺激して含Ｑ　Ａ　Ｅ　Ｐ　Ｄペプチドに対するＢ−細胞産生抗体を助力 するように行うのは明らかである。

Ｔ−エピトープＤＲＡＨＹＮＩおよびＲＰＭＩ６　Ｂ７またはＲＰＭＩ８　Ｂ７ のＢ−エピトープを含有するペプチドで免疫したマウスはＥ７蛋白を特異的に認 識する抗体を産生ずる。

ペプチド８Ｑで免疫したマウスからの血清は、エライザ・アッセイにて、８Ｑお よび７Ｑ（図４Ａ、Ｂ）ならびにＲＰＭＩ６　Ｂ７　ＦＰ（図４Ｄ）と反応した が、対照ペプチド６Ｑ（図４６）、または２Ｑ、４Ｑおよび１０Ｑ（データ示さ ず）とは反応しなかった。これらのデータは、血清抗体は、８Ｑ、７ＱおよびＲ ＰＭＩ６　Ｂ７内に含有されたＢ−エピトープＱＡＥＰＤを認識したかもしれな いことを示唆した。さらなる一連の実験において、ペプチドＢ７またはＢ８で免 疫したいくつかのマウスからの血清は８Ｑおよび７Ｑと反応したが、Ｂ１６、Ｂ ］、７、Ｂ１９またはＢ３で免疫したマウスからの血清は反応しなかった（表２ ）。

該データは、Ｂ−エピトープＱＡＥＰＤを含有するペプチドおよびＨＰＶ１６Ｅ ７　ＦＰに対する抗体を誘導させるためには、免疫原は、配列ＱＡＥＰＤの他に Ｔ−エピトープＤＲＡＨＹＮ１を含有する必要があることを示した。

さらに実験を行って、免疫に用いる合成ペプチドにＴ−エピトープＤＲＡＨＹＮ ｌを含ませると、ＱＡＥＰＤ以外のＢ−エピトープを含有する配列まで助力が拡 大されるか否かを決定した。ペプチドＢｌｌで免疫した３匹のマウスの血清はす べてＢ−エピトープＥＹＭＬＤおよびＱＡＥＰＤに対する抗体を含有しており、 ＲＰＭＩ６　Ｂ７と反応シタ（表２）。ＨＰＶ１６Ｅ７とノ反応性１；！（ＱＡ ＥＰＤを含有する）ペプチド８Ｑおよび（ＥＹＭＬＤ）を含有する２Ｑでのンア （ｓｅａｒ）をブレインキュベートすることによって奪うことができるであろう 。また、これらのマウスのうちの１のものの血清もＢ−エピトープＩＤＧＰに対 する抗体を含有していた。７Ｑで免疫したマウスの血清はＱＡＥＰＤに対する抗 体を含有していたが、ＩＤＧＰに対する抗体は含有していなかった（表２）。

ＨＰＶ１６以外のＨＰＶ遺伝子型の推定Ｅ７蛋白からのＢ−エピトープを含有す る合成ペプチドにＤＲＡＨＹＮＩを含ませると、異種抗体の産生を駆動し得るか 否かを決定するために、］（Ｐ’ｖ’１８　Ｂ７の免疫優性線状Ｂ−エピトープ ＤＥＩＤＧＶＮＨＱＨＬを含有するペプチドＧＦＩＩ、ＣＦ１２およびＣＦ１５ でマウスを免疫した（セルベイ（Ｓｅｌｖｅｙ）ら、１９９０、ジャーナル・イ ブ・イミュノロジー（Ｊ、　Ｉａ＋ｍｕｎｏ１．）、上４５．３１０５−３１１ ０）。該Ｂ−エピトープを含有するペプチド（ＣＦ１３）、全ＨＰＶ１８　Ｅ７ を認識した血清抗体は、無傷ＤＲＡＨＹＮＩを含有するＣＦ１５で免疫したすべ ての３匹のマウスで産生されたが、Ｔ−エピトープが切形されたかあるいは存在 しないＣＦ１２またはＧＦＩＩで免疫したマウスで産生きれなかった。ＧＦ１５ 免疫マウスは同時に、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｂ−ｘビトーブＱＡＥＰＤおよび全ＨＰＶ １６　Ｅ７をＤ識した抗体ｔ−産生じた（表２）。

Ｔ−およびＢ−エピトープを共に含有する合成ペプチドで免疫し、抗体を産生じ たマウスでは、恐らくは、リンパ球の両セット、すなわち、該細胞および抗体産 生Ｂ−細胞が初回免疫された。

Ｔ−エピトープ単独での免疫は抗体応答につき初回免疫し得る。

（Ｔ−エピトープＤＲＡＨＹＮＩを含有するがＢエピトープを含有しない）ペプ チドＢ３で免疫し、（Ｂ−エピトープＡＱＥＰＤおよびＴ−エピトープＤＲＡＨ ＹＮＩを含有する）ペプチドＢ７で攻撃したマウスは、５日後に、８Ｑおよび全 ＨＰＶ１６　Ｅ７　ＦＰを認識した検出可能な抗体を産生じた（表２）。

Ｂ３で攻撃したマウスは抗体を産生じなかった。すでに１回免疫していたマウス もまた同じ。

０日の増殖アッセイ フイコールヒバク（Ｈｙｐａｑｕｅ）で血液６０ｍ１からＰＢＭＣを分離し、Ｒ ＰＭ１１６４０中で３回洗浄した。該細胞を集め、希釈して１６６細胞／ｍＬす なわち、１０％ヒト・プールＡＢを含む完全なＲＰＭｌ　１６４０中（１，５Ｘ １０５細胞）／（１５０μｍウェル容量）とした。この実験では、１０６細胞／ ｍｌの細胞１５０μｌを、表４に記載したごと（に、９６ウエルＵ底プレートの 該ウェルに添加した。表３に示すペプチド１０１−１０９で、二連にて、該細胞 を攻撃した。（ペプチド１６０はペプチド８Ｑに対応することに注意されたい。

）表４より、ＰＨＡと共にあるいはそれなしにて、１０６単独で、および３群中 の他のペプチドで、２つの濃度で細胞が攻撃されたことに気かっ（であろう。破 傷風トキソイドおよび培地単独のウェルを、各々、陽性および陰性対照として含 ませた。

次いで、細胞を５％Ｃｏｗ、３７℃にて７日間インキュベートし、１μｃ／ｍ１ ３Ｈチミジンで一昼夜標識した。次いで、細胞を収穫し、乾燥し、計数し、結果 を計数７分として記録した。また、該手法を修飾して、４連にて、５および１５ μｇ／ｍ１のペプチド濃度で細胞を攻撃した。結果を表５に掲げる。

ペプチドのｌＳＣ０Ｍへの結合 Ｆｍｏｃ化学を用い、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ）４３１Ａペプチド合成器でペプチドを合成した。ペプチドの純 度はＨＰＬＣおよびアミノ酸分析でチェックし、９０％を超えることが判明した 。

合成したペプチドは：ＢＴ５（ＢエピトープＱＡＥＰＤおよびＴ−ヘルパーエピ トープＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤを含有するＲＰＭｌ６　Ｅ７がらのべ− ｆチド）、ＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤ、ＬＡＰ２０　（合成脂質 結合ぺ＃）’）　、ＶＳＳＬＬＳＳＬＫＥＹＷＳＳＬＫＥＳＦＳ、７Ｑ　（Ｂｚ ビトープＱＡＥＰＤを含有するＲＰＭｌ６　Ｅ７からのベブチＩ’）　、ＥＩＤ ＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩ、　ＧＦＩＩＯ（ＲＰＭｌ６　Ｅ７　Ｔ−ヘル パーエピトープＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤにカップリングしたＨＩＶウィ ルスかラノヘプｆ）’）　、ＴＲＫＳ　ＩＲＩＱＲＧＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣ ＣＫＣＤ０グルタルアルデヒドを用い、アブラメス（＾ｖｒａｍｅａｓ）　（７ ）の方法によって、脂質結合ペプチドＬＡＰ２０へのペプチドのカップリングを 行った（ポウナル（Ｐｏｗｎａｌｌ）ら、ＰＮＡＳＳヱヱ、３１５４−３２８− １９８０）を行った。略言すれば、注目するペプチド２ｍｇを５ｍｌのＰＢＳに 溶解し、２５％グルタルアルデヒド溶液３０μｍを添加し、室温で２時間撹拌し 、−昼夜４℃に保った。次いで、１ｍｌ　１Ｍグリシンを添加し、室温で２時間 撹拌し、６０００の分子量カットオフを持つ透析膜を用い、４℃で一昼夜透析し た。グルタルアルデヒド処理段階の間および透析の間に、重い沈澱の形成が、Ｃ Ｆ２３を除（すべてのペプチドで観察された。

Ｂｒ３、ＬＡＰ２０、およびＢＴ／ＬＡＰ２０複合体につきアミノ酸分析を行っ て、！ｆ複合体中ＬＡＰ２０に対するＢｒ３の比をめた。

ｌＳＣ０Ｍの調製 簡単に述べれば、２ｍｇホスファチジルコリンおよび１ｍｇコレステロールをク ロロホルム数滴に溶解させ、窒素気流下で溶媒を除去する透析法によってｌＳＣ ０Ｍを調製した。乾燥した脂質混合物を３ｍｌトリス緩衝液（２０ｍＭトリス／ ＨＣＩ　ｐＨ＝７．８．１５０ｍＭ　ＮａＣ＋　１％オクチルゲルコンド含有） に溶解した。２ｍｌのＰＢＳおよび水中の４ｍｌの１０％ｑｕｉｌ−Ａ溶液を脂 質混合物に添加し、室温にて１時間混合した。混合物を４℃にて一昼夜ＰＢＳｉ ：対して透析した。透析の間に形成される沈澱を低速遠心によって除去した。上 澄みを収集し、該上澄みをＰＢＳクッション中の１０％スクロースに重層し、ベ ックマンＴＬＡ１００．３０−ターを用い、６℃、４０００ｒｐｍにて、１６時 間遠心してｌＳＣ０Ｍをベレットとすることによって、ｌＳＣ０Ｍを遊離ペプチ ドおよびＱｕｉｌ−＾から分離した。該ｌＳＣ０ＭベレットをＰＢＳに溶解した 。

６〜１０週令のＣＢＡマウスを免疫で用いた。ｌＳＣ０Ｍにカップリングさせた ２０μｇペプチドで、およびフロイントの完全アジュバント中の陽性対照１００ μｇペプチドとして、尾の基部にて、マウスに皮下注射した。陰性対照として、 ＰＢＳ中のＢＴ５／ＬＡＰ２０あるいはＱｕｉｌ−＾および／または脂質を含む Ｂｒ３の２０μｇを用いた。２１日後、マウスの血液を抜き、もう１つのブース ター注射し、さらに１４日後、再度血液を抜いた。ペプチド自体あるいはイー・ コリもしくは組換えバクロウィルス感染スボドブテラ細胞からのＭＳ２融合蛋白 から誘導された組換え蛋白で調製したエライザ・プレートによって抗体を検出し た。

ｌＳＣ０Ｍに結合するペプチドのモニタリングｌＳＣ０Ｍの調製の各段階におい て、ＢＣＡ蛋白アッセイキット（ビエス・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　））を用いて蛋白アッセイを行い、つ／血清アル ブミンを蛋白標準として用いた。

考察 本実験において、本発明者らは、テストした明確なハブロタイブのマウスのすべ ての株のＴ−細胞を刺激するＲＰＭｌ６　Ｅ７中の主要増殖性Ｔ−二ピトープ” ＤＲＡＨＹＮＩ５４を明確化する。ＤＲＡＨＹＮＩは応答Ｔ細胞においてサイト カイン産生を刺激し、同種Ｂ−エピトープにカップリングさせ、マウスに注射し た場合、天然Ｅ７蛋白を認識する特異的抗体の産生についての同種助力を誘導で きる。

２の重複ペプチド７Ｑおよび８Ｑが初回免疫Ｔ細胞で増殖を刺激したので（図１ ）、両者に共通の配列が原因のようである。ペプチド８ＱのＣ−およびＮ−末端 切形での増殖実験は、配列ＤＲＡＨＹＮＩは最小の反応性エピトープであること を示した。本発明者のデータは、１を超える区別できるＴ細胞部位が７Ｑおよび ８Ｑによって媒介される増殖の原因であろうという可能性を完全には排除しなか ったが、本発明者らはそれはありそうもないと考える。というのは、７Ｑの７個 のＮ−末端アミノ酸は増殖性エピトープを含有しないペプチド６Ｑ内にすべて含 有されるからである。多（の反復実験において、８Ｑに対する増殖性応答は、適 当に初回免疫したマウスからのＬＮＧにおける７Ｑに対するそれよりも常に大き いオーダーであり、これは、最小エピトープＤＲＡＨＹＮＩの外部のフランキン グ配列は応答に影響し得ることを示唆する（ロスバード（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）ら 、１９８８、ＥＭＢ○ジャーナル７．９３−１００）。この推測のさらなる証明 は、７量体ＤＲＡＨＹＮＩでの８Ｑ初回免疫マウスからのＬＮＧの攻撃は増殖を 誘導したが、応答の大きさはＤＲＡＨＹＮＩがＣ−またはＮ−末端伸長で提示さ れた場合にはより高いという観察である（表１、および本文）。い（つかの実験 において、特異的に初回免疫していないマウスからのＬＮＧは、８Ｑペプチドで の共培養に応答する低レベルの増殖を示した（図２への説明）。これは、ｉｎ　 ｖｉｔｒｏの最初の応答であり得、これは、そのＴｃＲがＤＲＡＨＹＮＩを認識 するＴ−前駆体の頻度が高いことを示唆するであろう。

１の主要ＴエピトープのみがペプチドのＱ−シリーズ範囲を用いて全ＨＰＶ１６ 　Ｅ７分子で同定され、５のＭＨＣハブロタイブが用いられたことは恐らく驚く べきことである。サイトカイン産生は検出されなかったにも拘わらず、双方がア ルゴリズム予測Ｔ一部位を共に含有する４Ｑおよび５Ｑによって誘導された少な い増殖が初回免疫ＢＩＯＡ　（２Ｒ）およびＣ５７Ｂ１／６マウスで観察された 。４Ｑの推定Ｔ−配列は、両方を含有するペプチド３Ｑを用いてマウスを免疫し た場合、隣接ＥＹＭＬＤ　Ｂ−エピトープに対する抗体産生についての助力を生 じ得なかった。ＶＡＣ−Ｅ７での引き続いてのｉｎ　ｖｉｖｏ攻撃に際し、４Ｑ 初回免疫マウスも抗体産生につき助力を生じ得なかった。重複ペプチドの本発明 者らのパネルは、包括的にＥ７分子を網羅するように設計したにも拘わらず、本 発明者らは、特に、推定エピトープ部位からの残基距離がＴ−エピトープ認識に 影響できる場合に、他のＴ−細胞部位は失われていなかったということを完全に は確信できなかった。ＤＲＡＨＹＮＩはデリシ・アンド・ベルシフスキイー（Ｄ ｅＬｉｓｉ　＆Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）　（１９８５、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ８２，７ ０４８−７０７２）またはロスバード（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）　（前記）のＴ−エ ピトープ・アルゴリズムによっては予測されなかった。ＤＲＡＨＹＮＩの予測さ れた二次構造はそのＮ−末端がターンまたはコイルである一方、チロシンおよび アスパラギンはＣ′末端方向に伸びるベーター鎖の部分を形成するようである。

本発明者らは、Ｂ−エピトープに連結したＤＲＡＨＹＮＩでのマウスの免疫化は 、該エピトープを含有するペプチド、および全Ｅ７分子と特異的に反応する抗体 を誘導するであろうことを明確に鉦明した。

さらに、ＤＲＡＨＹＮＩを含有するがＢ−エピトープを含有しないペプチドでの マウス免疫化は、マウスを引き続いてＤＲＡＨ’ｒ’ＮＩ＋Ｂ−エピトープで攻 撃した場合に、第２の抗体応答を誘導し、これは、Ｂ細胞応答の不存在下におけ るＴ−活性化は初回免疫に十分であることを示唆する。

ペプチドワクチンを開発するには、候補物は、ペプチドが由来する全天然分子に 対するｉｎ　ｖｉｖＯＴ細胞応答を誘導する能力を有するべきである。本発明者 らは、ＤＲＡＨＹＮＩおよびＱＡＥＰＤ　Ｂ−エピトープを含有するペプチドの 単一の初回免疫投与は、全長Ｅ７遺伝子を含有する生ワクシニアーＥ７組換えウ ィルスでの引き続いてのｉｎ　ｖｉｖｏ感染によって呼び戻すことができる免疫 記憶を誘導するであろうことを示した。この後者の観察は、真核生物全Ｅ７は、 その機能の成長がＤＲＡＨＹＮＩによって刺激されたＴｈ細胞より提供された同 種助力に依存するように、加工され、免疫系に提示され得ることを示す。全真核 生物Ｅ７蛋白の認識に対する抗−ペプチド応答の関係は、さらに、マウス抗−Ｑ ＡＥＰＤモノクローナル抗体が免疫沈降においてＣａ５ｋｉ細胞中の天然ＨＰＶ １６　Ｅ７を認識するという観察によって示される（ティンドル（Ｔｉｎｄｌｅ ）ら、１９９０、ペプチド・リサーチ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｓ、　）、旦、１ ６２−１６６）、他のウィルス感染において、ｉｎ　ｖｉｖｏ抗ウィルス保護に ついての明確なＴｈおよびＴｃエピトープの関係は、Ｅ７と同様に細胞表面で発 現されないウィルス蛋白、例えば、インフルエンザＡウィルス核蛋白（タウンゼ ント（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）ら、１９８６、セル（Ｃｅｌｌ）、−３９７２，１９ ８８）、ならびに中和抗体を誘導することによって恐らく保護する細胞表面上の 蛋白について記載されている。

種々のコンフォメーションで連結したＤＲＡＨＹＮＩおよびＢ−エピトープでマ ウスを免疫する実験は、ＤＲＡＨＹＮＩは抗体分泌Ｂ細胞の１を超えるクローン に同種助力を与えて、異なる特異性の多重抗体を産生させることを示した。すべ ての変更をテストするのがこれらの実験の目的ではなかったが、抗体の産生はＴ −エピトープに関するＢ−エピトープの位置および配位のいくつかの組合せにお いて起こることが明らかであった。エピトープの配位についての同様の知見が他 の者によって報告されている（レベルリイ（Ｌｅｖｅｒｌｙ）ら、セル・イミュ ノル（Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　１２５．６５−７８　１９９０）　 （グツド（Ｇｏｏｄ）ら、１９８７．１０５９−１０６２）。本発明者らは、そ こではＢ−およびＴ−エピトープが密接に連結している本明細書で報告した実験 におけると同様にＢ−およびＴ−エピトープがその天然の立体配置にある状況下 で、ＤＲＡＨＹＮＴが、全Ｅ７／ＭＳ２　ＦＰで免疫したマウスにおいて抗−Ｑ ＡＥＰＤ、抗−ＥＹＭＬＤおよび抗−ＩＧＰＤ抗体を産生ずるＢ細胞を助ける原 因のＴ−エピトープであるか否かを示すデータを有していない（ティンドル（Ｔ ｉｎｄｌｅ）ら、１９９０、ペプチド・リサーチ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｓ、　 ）、冬、１６２−１６６）。この意味において、免疫優性Ｔｈ部位はＢ細胞部位 にしばしば近いと報告されている（マン力（Ｍａｎｃａ）ら、１９８５、ニーロ ビーアン・／ヤーナル・イブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ 、　）、〕５．３４５−３５０）。

ＤＲＡＨＹＮＩは、通交外集団で用いる効果的なＴ−エピトープワクチンの基準 を満足し、多くの異なるＭＨＣハブロタイブに関連して認識される。それは、多 重ＭＨＣハブロタイブに関連して認識される、最近記載されている少数の刺激ペ プチドを結合させる（ンニガグリア（Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ）ら、１９８８）（ ミリヒ（Ｍｉｌｉｃｈ）ら、１９８８、プロシーデイングズ・イブ・ナショナル ・アカデミ−・イブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、）ＵＳＡＳ８５、１６１０−１６１４）、にコラス（Ｎｉｃｈｏｌａｓ）ら 、１９８８、ンヤーナル・イブ・ノ１イロロシ−０，Ｖｉｒｏｌ、）、６２．４ ４６５−４４７３）、（７Ｘ−／　＜−一カツ（Ｈｅｒｂｅｒ−Ｋａｔｚ）ら、 １９８８、ジャーナル・イブ・エクスベリメンタル・メデインン（Ｊ、　Ｅｘ′ ｐめの要件はＴＣＴに結合するためのそれほど厳格ではないが（セソテ（Ｓｅｔ ｔｅ）、１９８７）、それにもかかわらず、テストしたすべてのＩａノ＼プロタ イプにおいて、ＤＲＡＨＮ＋が増殖を引き起こし、従って、恐ら（はそれに結合 したてあろうことは驚（べきことである。広範囲反応性ペプチドは、多くのクラ スのＩａ対立遺伝子と協同できる「理想的な」Ｔ−エピトープに近い構造を成形 できることが示唆されている（ンユリエール（Ｓｈｒｉｅｒ）ら、１９８９、ジ ャーナル・イブ・イミュノｏン−（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、団、１１６６− １１７６）。強力な異種エピトープをワクチンに導入することが主張されている が（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス−：）７抗原）（ンユタールおよびムライ（Ｓｔ ａｈｌ　ａｎｄ　Ｍｕｒｒａｙ）、１９８９、プロシーディングズ・イブ・ナシ ョナル・アカデミ−・イブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　８旦、６２８３−６２８７）　、理想的に合成されたＨＰ Ｖワクチンは、潜在的および／または引き続いての感染がリンパ球の両集団から の応答を誘導するように、同一生物体由来のＴおよびＢ細胞部位からなるであろ う。かかる天然ブースター注射は、一定の高レベルの抗体が保護で必要であれば 、重要である。ＨＰＶコードＴ−エピトープに対する応答もまた抗体非依存性Ｔ −細胞免疫が保護に必要であれば非常に重要である。

細菌中にてＭＳ２レプリカーセで組換え融合蛋白として産生された全ＨＰ　Ｖ２ ＣＥ７でのマウスの免疫は、８Ｑでの引き続いてのｉｎ　ｖｉｔｒｏ攻撃につき 初回免疫した。しカルながら、応答の大きさはペプチドでの初回免疫よりも終始 低く、また再現性もなかった。８Ｑが８Ｑにつき初回免疫化するよりも全Ｅ７蛋 白が８Ｑペプチドにつき初回免疫化が不十分であるのは何故かということは本実 験では触れられていないが、恐らくは、免疫系に対する初回投与抗原の断片の加 工および提示に関係する。

ＨＰＶ感染を根絶するための予防用および治療用ワクチンが望ましい。というの は、すべてのウィルス感染の破壊的排出は技術的に可能でないようであり、特異 的抗−ウイルス薬剤が利用できないからである。「弱毒化Ｊ　ＨＰＶは、単独で は、その極度に制限された宿主細胞範囲およびその感染性の構成的欠如のため、 優れたワクチンとして成功するものではないようである。さらに、ワクチン接種 者に対する生ＨＰＶの使用は、推定ＨＰＶオンコンーンが宿生細胞ＤＮＡに組み 込まれるという本質的危険性のため問題外である。いずれの場合においても、こ のアプローチは除外される。というのは、大量の全ＨＰＶを生産する組織培養ま たは動物系がないからである。ペプチドワクチンの開発には、宿主の免疫系によ って認識されるＯＲＦペプチド内のＢ−およびＴ−エピトープの構造概略が必要 であり、エピトープ応答性細胞間の相互反応の結果特異的抗体および細胞傷害性 エフェクターが生じる。本発明者らのグループは、最近、ＨＰＶ　１６　Ｅ７お よびＨＰＶ１８　Ｅ７ペプチドにおいて免疫優性Ｂ−エピトープを明確化した（ テインドル（Ｔｉｎｄｌｅ）ら、１９９０．ジャーナル・イブ・ジェネラル・パ イロロジーイ（Ｓｅｌｖｅｙ）ら、１９９０、ツヤ−ナル・イブ・イミュノロジ ー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１４５．３１０５−３１１０）。

Ｔ−エピトープＤＲＡＨＹＮＩは、まず、ＤＮＡから翻訳された全推定ＨＰＶ１ ６　Ｅ７蛋白にわたる重複１１〜２０量体ペプチドの混合物でマウスをｉｎ　ｖ ｉｖ。

にて初回免疫しくンードルフ（Ｓｅｅｄｏｒｆ）ら、１９８５）、個々のペプチ ドで排出するリンパ節からの細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏ攻撃することによって同定 された。他のウィルスについての研究は、天然ウィルスでの感染に関連するＴ− エピトープが同様の戦略を用いて合成ペプチドによって明確化できることを確認 的に示している（ガオ（Ｇａｏ）ら、１９８９、ジャーナル・イブ・イミュノロ ジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、（ヴアン・デ・ジー（Ｖａｎ　ｄｅ　Ｚｅｅ ）ら、１９８９）。

本発明者らの知る限り、不明細書で報告する研究は、肛門性器ＨＰＶの○ＲＦ蛋 白内の第１の機能的Ｔ−ヘルパーエピトープを記載する。本明細書中で報告する 実験および本発明者らの従前の実験（ティンドル（Ｔｎｄｌｅ）ら、ペプチド・ リサーチ（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、３．１６２−１６６．１９９ ０）のごとき基本的な免疫実験は、公表されたワクチン戦術が基礎を置くのに必 要である。ＤＲＡＨＹＮ　■は、全Ｅ７蛋白に対する抗体の産生のためにＴ−お よびＢ−リンパ球の間の同種相互作用を誘導するのに用いることができるＴｈ細 胞刺激エピトープである。これらの基準を用い、ＤＲＡＨＮＩは、肛門性器ＨＰ 　Ｖ用合成サブユニットワクチンに含ませるのに適する。

前記にて考察した実験はすべてマウスに適用したものであった。今回、行われた 他の実験（すなわち、０日増殖性アッセイ）から、ＤＲＡＨＮＩ　Ｔ−エピトー プを含有するペプチドはハブロタイブＤＲ３、ＤＲＷ８およびＤＲ２、ＤＲＷ１ ２のヒト叡者において増殖を誘導することが示される。正確な制限要素はいまだ マツプされていないが、ＤＲ２が白色人種集団の２６％をカバーし、ＤＲ３がそ の２１％をカバーするのは重要である。従って、ヒトにおいては、該エピトープ は、マウスにおけるよりも大きな制限を示すが、なお広範囲に適用可能であろう 。

前記したことより、本発明のペプチドは、熟練した化学者によく知られた標準的 な技術を用いて合成により製造できることが理解されよう。しかしながら、本発 明のペプチドは、当業者に公知のように組換えＤＮＡ法によっても生産できるこ とを強調しておこう。

表１ ３６　４４−５ｏ　□熱　１．３ ８１６　４４−５１　Ｑｌ”ＥＦＤＲ１’に　’Ｊ−−ＯＢコア　４４−５２　 ０ＡＥＦＤＲＡト［Ｙ　１−１Ｅ１５４−６２　−＝　１・７ ””　”１−６２瑯□゛ｒπヒＤ２−６Ｂ１４　５ｏ−６２ｆｉ、ｈ□Ｔ□□　 ０．９３ゴ５　４９−５２　Ｒ）（トｒ？）１１１１丁−二て〕：コく【ゴ〕　 Ｏ，フ表２ 表３ ペプチドＧＦＩＦＩ−ＧＦＩ０９の構造ＧＦ１０１　二聾吸斐Ｌ ＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥ　１８ＡＡ　２−Ｆ１０５ ＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡ）４ＹＮ工　１Ｂ人人　２−Ｆ１０６ ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤ　２０ＡＡ　ＯＦ１０７ エＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴ　１９ＡＡ　１　＋Ｆ１０８ ＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥ　１９ＡＡ　ＯＦ１０９ ＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰ工Ｃ３ＱＫ　２６ＡＡ　０表４ １度 表５ 種々のペプチド組合せで反復刺激された細胞によって表６ ペプチドＢＴ５に対する体液性免疫応答に対する抗原送達系の影響下記に対する 測定可能抗体 を有するマウス数 送達系零　抗原　ペプチドμｇ　７　Ｑ　１６Ｅ７／ＭＳ２　１８Ｅ７／ＭＳ２ ＣＦＡ　ＢＴ５　１００　２／２　２／２　０／２ＩＳＣＯＭ　ＢＴ５／ＬＡＰ ２０　２０　２／３　２／３　０／３ＩＳＣＯＭ　ＢＴ５　２０　０／２　０／ ２　０／２生理食塩水　ＢＴ５／ＬＡＰ２０　２０　０／　４　ＮＤ　ＮＤ＊Ｏ 日および２１日に免疫し、３５日に血液採取したマウス＃方法参照 ２１日に行った第１の血液採取では抗体は検出されなかった。

表７ グルタルアルデヒドで処理した使用ペプチド各段階における合計蛋白　ＢＴ５／ ＬＡＰ２０　ＨＴ５　ＧＦ２３／ＬＡ２０　ＧＦ２３１）グルタルアルデヒド処 理　６００μｇ　６００μｇ　１２５μｇ　１２５μｇおよび透析の後 ２）　ＩＳＣＯＭＪ製および透析、３３４μｇ　１４５μｇ　５６μｇ　３６μ ｇならびに沈殿除去の後　（１６４μｇ）（１５３μｇ）３）超遠心して未結合 へ１チＦ　１．５．６μｇ　９．９μｇ　１５μｇ　１６μｇを除去した後 説明 図１ Ａ、　Ｔ−増殖性エピトープの位置決定に用いた推定ＨＰＶ１６　Ｅ７蛋白にわ たる重複ペプチドのセット（２Ｑ−１２０）（本文参照）。モノクローナル抗体 ８Ｆ、４ＦおよびＩＯＦによって明確化される線状Ｂ−エピトープ（ティンドル （Ｔｉｎｄｌｅ）ら、１９９０）はボックスに入れた。下線は、各々、ロズハー ド（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）　（ｒ　）およびプリ／およびベルシフスキイー（Ｄｅ Ｌｉｓｉ　＆　ＢｅｒｚｏｆｓｋｙＸ　ｂ　）のアルゴリズムによって予測され た推定Ｔ−エピトープの位置を示す。

Ｂ、リンパ節細胞（ＬＮＣ）増殖アッセイ。ペプチド２Ｑ−５０（パネルａ）、 ペプチド６Ｑ−９Ｑ（パネルｂ）、ペプチドｌ０Ｑ−１２Ｑ　（パネルｃ）　の ＣＦＡにおける等モル混合物で免疫したＣ５７Ｂ１／６マウスからのＬＮＧは（ 群当たり３匹のマウス、細胞はプール）個々のペプチド２Ｑ−１２Ｑの２０μｇ ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌでｉｎ　ｖｉｔｒｏ攻撃した。バックグラウンド（Ａ 　ｇ、無添加）は２３Ｑ−５０免疫マウスにっき８４５±９０ｃｐｍ、６Ｑ−９ Ｑｖウスにっき１２２７±３３０ｃｐｍ、ｌ０Ｑ−１２Ｑ？ウスにっき１９０± ３１２であって、ペプチドでの結果から差し引いた。結果を二連ウェルの相加平 均として示す。

ＰＰＤ攻撃ＬＮＣの陽性対照は１６８８４９±８３４６ｃｐｍを示した。

説明 図２ 予めＨＰＶ１６Ｅ７またはＥＴペプチドで８日前に免疫し、ＲＰＭＩ６　Ｅ７ま たは種々のＥ７ペプチドで攻撃したマウスからのＬＮＧのｉｎν１ｔｒｏ増殖性 応答（パネルＡ−Ｃ）およびリンホカイン産生（パネルＤ）。

７・＼　ペプチド８Ｑおよび６Ｑの等モル混合物で免疫した同種マウスからのＬ ＮＧ　（群当たり３匹のマウス、細胞はプール）を種々の濃度の８０（開いた記 号）または６Ｑ（閉じた記号）で攻撃した。

Ｂ］、０．Ｄ２　（１−Ａ”−’ｄ）：　Ｂ１０．Ａ　（Ｉ−ＡＪ−ＥＳ）：　 Ｂ１０．ＢＲ（１−Ａ’ｌ−Ｅ’）。

Ｂ　１　０．Ａ（２ＲＸ　Ｉ　１八’Ｔ−Ｅ’）　：Ｂ１０．Ａ　（４Ｒ）　（ １−Ａ″　Ｉ−Ｅｂ）バックグララウンドｃｐｍ（抗原無添加）およびＰＰＤ応 答は、Ｂ１０．Ｄ２番二つき２６３６および８８１０３　：　Ｂ１０．Ａにっき ７８５４および７５０６１：Ｂ　１０．　ＢＲＩ：：ツき２６００およＪ９３５ ０３　：　Ｂ１０．Ａ　（２Ｒ）ｔニーっき１０９１および８８７２１　：Ｂ１ ０．Ａ　（４Ｒ）につき２６００および９３３７６であった。各々９および２７ μｇ／ｍｌの８０ペプチド濃度で１５４３７および１８９７２ｃｐｍならびに５ ６２３および８７４７ｃｐｍを記録したＢＩＯ，、八およびＢ］、ＯＡ９　（２ Ｒ）を除き、１偽」免疫マウス（ＲＰＭＩ＋アンユバント）でペプチド８Ｑに対 する応答は観察されなかった。

８Ｑまたは口偽」免疫ＢＩＯＡ（２Ｒ）マウスからのＬＮＧ　（群当たり５匹） をＲＰＭＩ６　Ｅ７　ＦＰの１６もしくは６４　μｇ／ｍ　＋　、または８Ｑの ２もしくは８μｇ／ｍ］で攻撃した。ＲＰＭＩ６　Ｅ７および８Ｑ攻撃量は８Ｑ 配列につきほぼ等モルであった。バックグラウンド対照（抗原無添加）およびＰ ＰＤ対照は、各々、１２６９ｃｐｍおよび９８７７；５ｃｐｍであった。

Ｃ，１００μｇのＲＰＭＩ６　Ｅ７　ＦＰまたはＲＰＭＩ（ｒ偽」）でＢ１０． Ａ（２Ｒ）マウスを免疫しく群当たり５匹のマウス）　、ＬＮＣを８Ｑの０１． １０および１０μｇ／ｍｌで攻撃した。バックグラウンド対照（Ａｇ無添加）お よびＰＰＤ対照は、各々、ＲＰＭＩ６　Ｅ７　ＦＰ免疫マウスにつき３６１ｃｐ ｍおよび６８８７５ｃｐｍであった。

Ｄ　３匹のＢ１０．Ａ（４Ｒ）７ウスの４群をペプチド２Ｑ−５Ｑｉｎｃ、、６ Ｑ−９Ｑｉｎｃ、、　ＩＯＱ　１２Ｑｉｎｃ、、またはＣＦＡ中のＰＢＳ（ｒ偽 」）ノ等モル混合物５０μｇで免疫した。各群からのＬＮＣをプールし、別々の ウェル中、６７および６７μｇ／ｍｌにて各ペプチドで個々に攻撃した（ペプチ ド当たりの濃度当たり３ウニル）。培養上澄みを３日後に収穫し、ＨＴ−２細胞 に１２希釈にて添加した。ＨＴ−２細胞を４１４４時間後に６時間３Ｈ−チミジ ンでパルスラベルし、収穫し、計数した。明確にするため、ペプチド混合物６Ｑ −９Ｑで初回免疫し、６Ｑ、７Ｑ、８Ｑおよび９Ｑで攻撃したマウスからのＬＮ Ｇについてのデータのみを示す。（今回データは、２Ｑ−５０、ＩＯＣ＞−１２ ＱまたはＰＢＳて初回攻撃し、各ペプチドで個々に攻撃したマウスからのＬＮＣ の上澄みはＨＴ−２細胞の分裂を刺激しなかったことを示す）。上澄みの代わり にＨＴ−２細胞に添加したＲＰＭＩに関しては、バックグラウンドは１８７０ニ ア２０ｃｐｍであった。

説明 図３ 組換えワクシニアウィルスから産生されたＨＰＶ１６　Ｅ７でのｉｎ　ｖｉｖｏ 攻撃についてのペプチド８Ｑ初回免疫マウスの免疫６匹のマウスの５群を、ペプ チド２Ｑ−５Ｑｉｎｃ、、６Ｑ−９Ｑｉｎｃ、、１０Ｑ−１２ｉｎｃ、の等モル 混合物、または８Ｑ単独、あるいはＣＦＡ中のＰＢＳ（ｒ偽」）の５０−１００ μｇで免疫した。３・１／２週間後、各群を分割した；３匹のマウスをＶＡＣ− Ｅ７で攻撃し、他の３匹をＷＲ−ＶＡＣで攻撃した。さらに８お（パネルＡ）、 またはペプチド８Ｑ（パネルＢ）につき、ＶＡＣ−Ｅ７　（０，）、またはＷＲ −ＶＡＣ（０，）での攻撃した８Ｑ初回免疫マウス（０，・）および「偽」初回 免疫マウス（）からのプールした８日血清についてのエライヤ法の結果のみを示 す。（データ示さず：ＶＡＣＥ７またはＷＲ−ＶＡＣて攻撃した一ＶＡＣで攻撃 したマウスからの血清はペプチド２Ｑ、６Ｑ、８Ｑまたｔ；！１２ＱあるいはＨ ＰＶ１６　Ｅ７　ＦＰと反応しなかった。６Ｑ−９Ｑで免疫し、ＶＡＣ−Ｅ７ま たはＷＲ−ＶＡＣで感染させたマウスからの血清は８Ｑ単独で免疫したマウスと 同一の反応性パターンを示した。１３日血清についての結果：ま８日血清につい ての示されたのと同様であった）。

説明 図４ ペプチド８Ｑ（０）またはＣＦＡ中の対照ペプチド３Ｑ（）で免疫したＢ１０． Ａ　（２Ｒ）マウスからの血清を、ペプチド８Ｑ（パネルＡ）、ペプチド７Ｑ（ パネルＢ）、ペプチド６Ｑ（パネルＣ）、ＨＰＶ　Ｅ７　ＦＰ（パネルＤ）に対 する抗体につきエライヤ法によって検定した。データの点は、３匹のマウスから 個々に収集した血清の相加平均（土標準偏差）である。（データ示さず・パネル Ａ−Ｃについては、さらに陰性対照は１）８Ｑおよび７Ｑでコートしたプレート 上の２Ｑ、４Ｑ、ＩＯＱおよびＰＢＳで免疫したマウスからの血清の反応性が欠 如していた。２）ペプチド２Ｑ、４ＱおよびＩＯＱでコートしたプレート上の８ Ｑで免疫したマウスからの血清の反応性が欠如していた。パネルＤについては、 さらなる陰性対照はＨＰＶ１６　Ｅ６　ＦＰでコートしたプレート上の８Ｑで免 疫したマウスからの血清の反応性が欠如していた）。

説明 表１／ 平均ｃｍｐに対する、抗原添加のテストウェルの平均ｃｐｍの比と定義した。ノ く・ツクグラウンドｃｐｍ（Ａｇ無添加）は範囲３８０７−５４２３内にあった 。

説明 表２゜ １、エライヤ法において、種々のペプチド構築体で免疫した個々のマウスからの 血清（少なくとも群当たり３匹）を、１　：　６４−１　：　４０９７６の二倍 希釈の範囲にわたり、ペプチド８Ｑ、７Ｑ、６Ｑ、２Ｑ、３Ｑ、１２ＱまたはＧ Ｆ１３、ならびにＨＰＶ１６　Ｅ７またはＨＰＶ１８　Ｅ７が結合したマイクロ タイタープレートと反応させた。「−」は、ペプチドについての１：５１２の血 清希釈にて各々〉１およびくＯ６１の”４１４の読みによって、およびＥ７　Ｆ Ｐについての１：２５６の血清希釈にて各々〉０．５および〈０．１の読みによ って検出される抗体が無いことを示す。

２、配列ＱＡＥＰＦ、ＩＤＧＰおよびＥＹＭＬＤはＨＰＶ１６　Ｅ７蛋白におけ る免疫優性線状Ｂ−エピトープである（ティンドル（Ｔｉｎｄｌｅ）ら、１９９ ０）。

配列ＤＥＩＤＧＶＮＨＱＨＬはＨＰＶ１８　Ｅ７における免疫優性Ｂ−エピトー プ領域である（セルベイ（Ｓｅｌｖｅｙ）ら、１９９０、ジャーナル・イブ・イ ミュノ３、括弧中の配列はペプチドが含有するＢ−エピトープを示す。

４、ＨＰＶ１６　Ｅ７　Ｆｐと反応するいずｉの血ｎもＨｐｖｘｓ　Ｅ６ＦＰ（ 陰性対照）と反応しなかった。

５゜２週間間隔でＣＦＡ中の５０μｇペプチドＢ３で２−３ｘｉｐにてマウスを 免疫し、続いて、ペプチドＢ１６で最終注射した。３および５日後に血清を調製 した。

６、ＧＦ１３の全長配列はＲＡＨＹＮＩＤＥＩＤＧＶＮＨＱＨＬである。

Ｌｏｇ＋血清稀釈 １−０ｇ＋血清稀釈 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１５／１２　 ８５１７−４ＨＣ１２Ｎ　１５／３３ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｋ　８２１４−４ＢＺＮＡ　Ｃ８２１４−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ 、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ、ＳＤ、　ＳＥ、　Ｓ Ｕ、　ＵＳ Ｉ （７２）発明者　フェルナンド、ジャーメインオーストラリア国りィーンズラン ド４０７４、ジャンポリ−・ハイツ、アンダマン・ロード６４＃ （７２）発明者　フレーザー、イアン オーストラリア国クィーンズランド４０６７、セント・ルチア、ハイランド・テ ラス１１０番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＢエピトープに対応する１個またはそれを超 えるアミノ酸配列に直接または間接に連結した配列ＤＲＡＨＮＩまたは単一のア ミノ酸置換を有するその構造同族体を含むペプチド。 ２．該構造同族体がＤまたはＩを含む末端アミノ酸置換である請求の範囲第１項 記載のペプチド。 ３．ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＢエピトープに対応する１個またはそれを超 えるアミノ酸配列に直接または間接に連結した配列ＤＲＡＨＹＮＩを包含するペ プチド。 ４．ＨＰＶ１５Ｅ７ＯＲＦからのＢエピトープがＱＡＥＰＤ、ＩＤＧＰ、ＥＹＭ ＬＤまたはＹＭＬＤから選択される請求の範囲第１項記載のペプチド。 ５．ＨＰＶ１８Ｅ７ＯＲＦからのＢエピトープがＤＥＩＤＧＶＮＨＱＬおよびＳ ＥＥＮＥＤから選択される請求の範囲第１項記載のペプチド。 ６．以下の 【配列があります】 から選択される請求の範囲第１項記載のペプチド。 ［式中、Ｂ１、Ｂ４およびＢ５は、Ａ１およびＡ２によって表されるＢエビトー プでないアミノ酸の介在配列を通して間接的にＤＲＡＨＹＮＩに連結し得るＢエ ピトープ配列を表し、Ｂ２およびＢ３は、Ｂエピトープ配列の末端アミノ酸およ びＤＲＡＨＹＮＩ配列の最初のアミノ酸が連結する第１の局面ならびにＤＲＡＨ ＹＮＩ配列の最後のアミノ酸およびＢエピトープ配列の最初のアミノ酸も連結す る第２の局面を包含するＤＲＡＨＹＮＩに直接連結したＢエピトープ配列を表す ］７．配列【配列があります】を有する請求の範囲第６項記載のペプチド。 ８．配列【配列があります】を有する請求の範囲第６項記載のペプチド。 ９．配列【配列があります】を有するペプチド。 １０．配列【配列があります】を有するペプチド。 １１．配列【配列があります】を有するペプチド。 １２．配列【配列があります】を有するペプチド。 １３．配列【配列があります】を有するペプチド。 １４．ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＢエピトープに対応する１個またはそれを 超えるアミノ酸に直接または間接に連結した配列ＤＲＡＨＮＩまたは単一のアミ ノ酸置換を有するその構造同族体を含むペプチドを主要抗原性成分として含むサ ブユニットＨＰＶワクチン。 １５．該構造同族体がＤまたはＩを含む末端アミノ酸置換である請求の範囲第１ ４項記載のサブユニットＨＰＶワクチン。 １６．ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＢエピトープに対応する１個またはそれを 超えるアミノ酸に直接または間接に連結した配列ＤＲＡＨＮＩまたは単一のアミ ノ酸置換を有するその構造同族体を含むペプチドを主要抗原性成分として含むサ ブユニットＨＰＶワクチン。 １７．ＨＰＶ１６Ｅ７ＯＲＦからのＢエピトープがＱＡＥＰＤ、ＩＤＧＰ、ＥＹ ＭＬＤまたはＹＭＬＤから選択される請求の範囲第１４項記載のサブユニットＨ ＰＶワクチン。 １８．ＨＰＶ１８Ｅ７ＯＲＦからのＢエピトープがＤＥＩＤＧＶＮＨＱＬおよび ＳＥＥＮＥＤから選択される請求の範囲第１４項記載のサブユニットＨＰＶワク チン。 １９．該ペプチドが請求の範囲第４項で定義される請求の範囲第１４項記載のサ ブユニットＨＰＶワクチン。 ２０．該ペプチドが配列【配列があります】を有する請求の範囲第１４項記載の サブユニットＨＰＶワクチン。 ２１．該ペプチドが配列【配列があります】を有する請求の範囲第１４項記載の サブユニットＨＰＶワクチン。 ２２．該ペプチドが配列【配列があります】を有する請求の範囲第１４項記載の サブユニットＨＰＶワクチン。 ２３．該ペプチドが配列【配列があります】を有する請求の範囲第１４項記載の サブユニットＨＰＶワクチン。 ２４．該ペプチドが配列【配列があります】を有する請求の範囲第１４項記載の サブユニットＨＰＶワクチン。 ２５．該ペプチドが配列【配列があります】を有する請求の範囲第１４項記載の サブユニットＨＰＶワクチン。 ２６．該ペプチドが配列【配列があります】を有する請求の範囲第１４項記載の サブユニットＨＰＶワクチン。 ２７．さらにアジュバントとして、該ペプチドに化学的に結合したアジュバント のイスコム（ＩＳＣＯＭ）を含む請求の範囲第１４項記載のサブユニットＨＰＶ ワクチン。 ２８．配列ＤＲＡＨＹＮＩを有するペプチドを主要抗原性成分として含むサブユ ニットＨＰＶワクチン。