JPH10510989A - ヒトパピローマウイルス抗原の変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 宿主動物中でＨＰＶに対する体液性および／または細胞性免疫応答免疫応答を引き出し得るが、宿主動物中で細胞形質転換性ではないヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ6 およびＥ7 タンパク質の変異型が開示されており、これらの変異型はＨＰＶが関与する疾病または症状の処置または予防に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトパピローマウイルス抗原の変異体 発明の分野 本発明は一般的にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原の変異体に関し、か つ詳細には本発明はワクチンに使用するのに適する、ＨＰＶ抗原の非形質転換性 変異型に関するものである。また本発明はＨＰＶ抗原のこれらの変異型を活性免 疫原として含むワクチン組成物はもとより、ＨＰＶに対する免疫応答を引き出す ためのこれらの変異体の使用方法にも及ぶ。 発明の背景 パピローマウイルスは小さなＤＮＡウイルス類であり、いろいろな動物種に感 染する。あるものはそれらの自然宿主中での悪性腫瘍の発生と関連がある。６０ タイプ以上のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が確認されている。これらは身 体のいろいろな位置でヒトに感染し、通常の皮膚いぼ、喉頭乳頭腫、生殖器いぼ 、および他のいぼ様病変の原因である。特に生殖器ＨＰＶ感染が普通であり、多 くのＨＰＶタイプ、最も頻繁にはタイプ６、１１、１６および１８が男性および 女性両方の生殖器路に感染する。女性では、頸部を包含する生殖器路のいろいろ な部分にＨＰＶ類は感染する。 生殖器ＨＰＶ類は重要な臨床的問題である。現在では肛門−性器病変のＨＰＶ 感染はウイルス性の性的感染病（ＳＴＤ）の最も普通の形態とみなされている。 上記ウイルス類はつぎの３つの態様の１つに兆候があらわれる生殖器感染を引き 起こす： ｉ 臨床感染、ここでは目立った生殖器いぼが肉視できる； ｉｉ 無症状感染、ここではウイルス性病変は明瞭ではないが、特殊観察技 術を使えば検出し得る； ｉｉｉ 潜伏、ここでは感染の唯一のサインはＨＰＶ ＤＮＡの存在である。 無症状感染が普通である。パパニコロー（Ｐａｐ．）スメアー（塗抹標本）試 験の２ないし４％はＨＰＶの証拠を示すと算定されている。潜在的感染はさらに 一層頻繁であり、かつ成人の大多数は生殖器ＨＰＶの１種または２種以上を持っ ている。 子宮頸部の癌腫（ＣａＣｘ）は女性における普通の癌である。２つ形態の頸部 癌が認められる；扁平細胞癌腫（ＳＣＣ）が最も頻繁で、観察されたケースの約 ９０％を占め；分泌細胞の癌である腺癌は約１０％を占める。頸部癌は前癌中間 段階を経由して侵襲形態（癌腫）に発展し、この侵襲形態癌腫は生命を危険にさ らしうる。苛酷さが増した前癌段階は、頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）グレード １ないし３として知られている。２０年以上の期間に亙って、未処置のＣＩＮ３ 患者の約４０％が侵襲癌を生じ、このうちますます重大な形態は段階ＩないしＩ Ｖとして知られている。侵襲癌はしばしば死へと導く。 前癌段階および侵襲段階両方の頸部癌は、高度に信頼できる比較的安価なスク リーニング方法が利用され得るいくらかの癌の１つである。パパニコロー（Ｐａ ｐ．）スメアー中には、前癌または侵襲癌の指標である異常頸部細胞の存在を試 験するための頸部掻は片の細胞学的試験が包含される。異常性が検出されるとさ らに探索され、かつ必要であれば処置が行われる。 頸部癌の数と、これによる死亡数の低減に有効であるべく、Ｐａｐ．スメアー スクリーニングが大規模に行われ、観念的には性的活性年齢の全ての女性を包含 する。ＣＩＮの検出および次段の治療による侵襲癌防止の成功率は極めて高く、 一方、後者の早期発見は死亡率に対して著しい影響を及ぼし得る。 大部分の発展国では高度に展開されたＰａｐ．スメアースクリーニングプログ ラムを有しており、このプログラムにより１９６０年および１９８０年の間にＣ ａＣｘに起因する年代別死亡率が３０％低下する結果になった。しかし、スカ ンジナビヤ諸国は別として、小数の発展国では女性の５０％ないし６０％以上を スクリーニングしてＣａＣｘおよび結果的死亡に重要な問題点を残している。発 展途上国では、組織的スクリーニングプログラムがほとんど存在しないので状況 は一層悪く、これらの諸国では年間４００，０００件の新しい侵襲癌が発生して いる。 前にも触れたように、いろいろなタイプのＨＰＶがヒトの生殖器感染を引き起 こすが、４つのタイプ（６、１１、１６、１８）が支配的である。過去１５年間 に亙って採取した証拠は、ＨＰＶのいくつかは頸部癌の発生と関連があることを 強く示唆している。事実、多くの研究者らは特定ＨＰＶタイプが、多数の癌の発 生に原因する本質的な病因学的因子であると結論付けている。 ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８による感染は頸部癌の発生と関連がある。Ｈ ＰＶは頸部発癌現象における起爆薬として働き、かつ悪性転換は他の因子との相 互反応に依存することが明らかに仮定されている。ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１ １による感染は生殖器いぼの発生と関連がある。生殖器ＨＰＶ感染に関する男女 両方の患者訪問が最近著しく増加し、かつ３０才未満のいくらかの女性のＰａｐ ．スメアー試験におけるＨＰＶの存在から判るように、ＨＰＶ感染の発生率は増 加しつつあるように思われる。 近年、一般的にはパピローマウイルス特にはＨＰＶ−１６の性質が十分に研究 されてきている。ＨＰＶ−１６は７９０４ｂｐの二本鎖ＤＮＡゲノム［Ｓｉｅｄ ｏｒｆ，Ｋ．らによるＶｉｒｏｌｏｇｙ（１９８５）１４５：１８１−１８５］ を含む。このキヤプシドは５０ｎｍであり、かつ７２のキヤプソメアを含む［Ｋ ｌｕｇ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９６５）１１：４０３−４２３］。 米国特許第４，７７７，２３９号公報は、ＨＰＶ−１６への抗体類を強化し得る と言われ、したがって診断目的に有用である１７の合成ペプチドシリーズを開示 している。加えて、欧州特許第０ ４１２ ７６２号公報は、ＨＰＶ Ｅ7 タンパク質と網膜芽腫遺伝子（ＲＢＧ）タンパク質との生化学的相互反応の 拮抗物質であり生殖器いぼおよび頸部癌の処置に有用であると言われるポリペプ チドを開示している。 いくつかのパピローマウイルス類のＤＮＡが配列決定されており、これらの中 にはいくつかのＨＰＶタイプ、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、およびワタ オウサギの尾パピローマウイルス（ＣＲＰＶ）が包含される。これらの全ては、 オープンリーデイングフレーム（読み取り枠）に関してヌクレオチド配列と類似 のパターンを示す。上記オープンリーデイングフレームは機能的に初期領域（Ｅ ）および後期領域（Ｌ）に分割できる；このＥ領域は複製および形質転換に必要 なタンパク質をコードするのは自明であり；かつこのＬ領域はウイルスキヤプシ ドタンパク質をコードするのは自明のこととみなされる［Ｄａｎｏｓ，Ｏ．，ら のＪ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．（１９８４）８３：７ｓ−１１ｓ］。 ２つのＨＰＶコード化タンパク質Ｅ6 およびＥ7 は、ＨＰＶ誘発異常細胞増殖 の病原論中に包含されるように思われる［SｔｏｐｐｌｅｒらのＩｎｔｅｒｖｉ ｒｏｌｏｇｙ，（１９９４）３７：１６８−１７９］。核酸配列から推論される ようなＨＰＶ−１６ Ｅ6 およびＥ7 タンパク質のアミノ酸配列は［Ｓｉｅｄｏ ｒｆらのＶｉｒｏｌｏｇｙ，（１９８５）１４５：１８１−１８５］中に記載が ある。 Ｅ6 およびＥ7 をコードするＨＰＶ遺伝子はＨＰＶ感染に伴う頸部癌から得ら れる組織または腫瘍細胞中に必ず発現される。加えて、ＨＰＶ−１６株由来のＨ ＰＶＥ6 およびＥ7 遺伝子は他のＨＰＶ遺伝子の存在なしに細胞培養中での上皮 細胞形質転換を誘発し得る。これらの観察によると、ＨＰＶ感染により引き起こ される細胞増殖の刺激の少なくとも１部はＥ6 およびＥ7 ウイルスタンパク質に よるものであることを示している。 上記ＨＰＶ Ｅ6 およびＥ7 タンパク質は、腫瘍退縮の場合の有効な免疫学的 ターゲットであると信じられる。しかしながら上記のようにＥ6 およびＥ7 遺伝 子は、コントロール細胞成長に関与する細胞タンパク質と干渉することにおいて 、多分それらのタンパク質産物の作用により細胞を”形質転換”することが知ら れている。したがってもしワクチン調製においてＥ6 およびＥ7 タンパク質をコ ードするＤＮＡの痕跡でも存在すると、このことがワクチン製剤をしてワクチン 調製レシピエント細胞中での不可逆的形質転換事象を開始させ得る。本発明の目 的の１つは宿主動物（特にヒト）中で、ある範囲の体液性および細胞性免疫応答 を誘発し得て、したがってＨＰＶ誘発疾病またはＨＰＶ感染抑制により得るとこ ろがあるＨＰＶ誘導疾患または他の疾患の防止、予防、治療および処置のための ワクチン製造の使用に適するＨＰＶ Ｅ6 およびＥ7 タンパク質の、非形質転換 変異体を提供することにある。 本発明に至る研究中、Ｅ6 および／またはＥ7 タンパク質に対する免疫応答を 誘発する４つの方法があることが認められた： （ｉ）全タンパク質の使用（この場合、きょう雑ＤＮＡがこのタンパク と結合し得る可能性がもたらされる）； （ｉｉ）点突然変異体の使用にの場合、本来のタンパク質への逆転が考 えられ、回避するには多重突然変異を要し；加えるに、いかなる点突然変異でも 潜在的に重要なエピトープの損失につながる）； （ｉｉｉ）特定ペプチドの使用（この場合、広く役立つワクチンを作る ためには、同一性の確認が極めて煩雑な甚だ多くのペプチドを必要とする）；お よび （ｉｖ）欠失突然変異体の融合体およ組合せ等の変異型の使用（この方 法の場合、上記のような制約がない）。 Ｅ7 タンパク質それ自体の細胞形質転換性に加えて、このタンパク質がβ−ガ ラクトシダーゼと融合すると細胞形質転換性になることも示されている ［ＦｕｊｉｋａｗａらのＶｉｒｏｌｏｇｙ，２０４，７８９−７９３（１９９４ ）］。したがって、完全長または非完全長の何れにしても、Ｅ6 および／または Ｅ7 部分の融合の場合にもまた細胞形質転換性ではないであろうことの予測でき なかった。 発明の概要 １つの局面において本発明は、宿主動物中でＨＰＶに対する体液性および／ま たは細胞性免疫応答を引き出し得るが、宿主動物中で細胞形質転換性ではないよ うな、ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の変異体を単離タンパク質として提供 する。 他の局面において本発明は、宿主動物中でＨＰＶに対する免疫応答を引き出す 方法を提供し、この方法は宿主動物にＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の変異 型の有効量を投与することを含み、この変異型は宿主動物中でＨＰＶに対する体 液性および／または細胞性免疫応答は引き出し得るが、宿主動物中で細胞形質転 換性ではないような変異型である。 さらに他の局面において本発明は、宿主動物中でＨＰＶに対する免疫応答を引 き出すのに使用するためのワクチン組成物を提供し、この組成物はＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の変異型および必要に応じて薬剤的に許容できるキヤリヤ ーおよび／または希釈剤と一緒にアジュバントを含み、この変異体は宿主動物中 でＨＰＶに対する体液性および／または免疫応答を引き出し得るが、宿主動物中 で細胞形質転換性ではないものである。 またこの発明の範囲は、宿主動物中でＨＰＶに対する体液性および／または細 胞性免疫応答を引を出し得るが、宿主動物中で細胞形質転換性ではないようなＨ ＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の変異体を、宿主動物中でＨＰＶに対する免疫 応答を引き出すことに使用すること、およびアジュバントの任意の使用にまで拡 大される。 明細書を通じて特に言及がなければ「含む」なる用語、または「含み」もしく は「含んでなる」等の変形用語は、記載された完全体（integer）または完全体 のグループの包含を意味するが、他のいかなる完全体または完全体のグループの 除外を意味するものではないと理解されるべきである。 発明の詳細な説明 ここに”宿主動物中で細胞形質転換性ではない”と記載されている本発明の変 異型に関する言及は、上記変異型では”親”または野生型ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ 7 タンパク質の細胞形質転換性が低減されており、かつ好ましくは除去されてい ることを意味する。特にこれらの言及は、適当な試験システムにおける野生型Ｅ 6 またはＥ7 タンパク質との比較において、この細胞形質転換性が有意に低減さ れていることを示す。 本発明の非形質転換性変異体ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質は適当なコー ド組み換えＤＮＡ分子の発現により生産され、野生型Ｅ6 またはＥ7 遺伝子とは 違ってかかるコードＤＮＡの性質は、宿主動物の細胞中で不可逆な形質転換事象 を開始させる可能性を有しないことが理解されるであろう。 本発明の変異体ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質は、次に記載のものに限定 はされないが、野体型Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の欠失突然変異体を野体型タン パク質の非完全長の形で含有すると共に、Ｅ6 および／またはＥ7 部分がＥ6 お よび／またはＥ7 部分間のアミノ酸残基１ないし５０の連鎖、好ましくは１ない し２０の短連鎖、および一層好ましくは１ないし５の連鎖と任意に融合している 融合タンパク質をも含んでいる。かかる融合タンパク質における上記Ｅ6 および ／またはＥ7 部分は完全野生型Ｅ6 またはＥ7 タンパク質を含んでいてもよく、 またはその代わりとしてそれらは野生型タンパク質の非完全長フラグメントを含 んでいてもよい。またこの融合タンパク質は、それに融合した他の部分、そうで なければそれに結合した他の部分、例えばこの融合タンパク質の精製に役立つ部 分（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフアーゼすなわちＧＳＴ部分またはヘ キサ−Ｈｉs部分）またはこの融合タンパク質の免疫原性を強化する部分（例え ば、ジフテリヤもしくはコレラ毒素等のアジユバントまたはホロトキソイドもし くはコレラ毒素のＢサブユニット等の、それらの非毒性誘導体）も含むこともで きる。 ここに記載の”非完全長フラグメント”なる用語は、完全長Ｅ6 またはＥ7 タ ンパク質配列の例えば少なくとも５０％、一層好ましくは６０−７０％、さらに は８０−９０％さえにも対応するＥ6 またはＥ7 タンパク質の欠失変異体を含み 得るポリペプチドを記述するのに使用される。単なる例示として、上記フラグメ ントはＥ6 またはＥ7 タンパク質のＮ末端またはＣ末端３分の２に対応する欠失 突然変異体であってもよい。 上記したような、適当な非完全長フラグメント、およびＥ6 および／もしくは Ｅ7 タンパク質またはその非完全長フラグメントを含む融合タンパク質は、当分 野周知で下記に例示した手法により容易に生産できる。業界の当事者には、Ｅ6 および／またはＥ7 部分の各種組み合わせを含む融合タンパクを包含する上記の ような変異型ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質はこれらの公知手法を用いて容 易に生産でき、ついで生成した融合タンパク質または他の変異型タンパクが本発 明の基準に合致するかどうかを確定するためのルーチン法、すなわち、このもの が宿主動物中で体液性および／または細胞性免疫応答を引き出し得るが、しかし 宿主動物中で細胞形質転換性ではないということを確証するためのルーチン法を 用いて試験される。 好ましくは、この宿主動物はヒトであるが、また宿主動物は非ヒト哺乳類であ ってもよい。 本発明は特にＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８遺伝子型のＥ6 またはＥ7 タン パク質の変異型に対するものであるが、しかしこれのみに限定されず、本発明の 範囲は他のＨＰＶ遺伝子型、特に尖型コンジローム（condylomata acuminta）の 原因因子であるＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１遺伝子型、およびＨＰＶ−１６お よびＨＰＶ−１８類似タイプの腫瘍発生可能性を有する他の遺伝子型中の対応タ ンパク質の変異型にまでおよぶことが理解されるであろう。 この分野における従来の研究では、ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質を発現 する生ウイルスベクターを用いたラットのワクチン注射は移植Ｅ7 保有腫瘍細胞 の拒絶にに至らせ［ＭｅｎｅｇｕｚｚｉらのＶｉｒｏｌｏｇｙ，１８１：６２− ６９（１９９１）］、一方アジユバント化ＨＰＶ Ｅ7 ワクチンによる牛（catt le）のワクチン注射はウシ（bovine）パピローマウイルスにより誘発される腫瘍 の促進された拒絶に至らしめる［ＣａｍｐｏのＣａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ，３： ４２１−４２６ （１９９１）］ことが判明した。 本発明の変異体ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質は、単離タンパク質として 提供され、すなわちそれらは他のＨＰＶタンパク質を実質的に含有せず、生殖器 いぼ、頸部癌またはヒトのＨＰＶが原因である他の疾患の治療に際立った有用性 が見いだされる。この変異型タンパク質は、上記の他の症状はもとより、ＨＰＶ 関与疾患の処置または予防のための薬剤組成物中に含ませることができる。 本発明の変異型ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質は、ＨＰＶ感染に対する保 護が所望される患者において、すなわち予防ワクチンとして、または既に存在す るＨＰＶ感染に対する免疫応答を強化するための、すなわち治療用ワクチンとし てのいずれかで、抗体の強化および／または細胞免疫応答の誘発に使用できる。 またそれらは、生産種中に注射して抗血清を得ることができる。生産種中に得ら れるポリクロナール抗血清の代わりに、動物に注射して抗体生産クローンを得る ために、ひ臓もしくは他の抗体生産細胞の不滅化により標準法またはその最新修 飾法を用いてモノクロナール抗体も生産できる。必要に応じて種変動の補正を行 った取得ポリクロナールまたはモノクロナール抗体もまた治療剤として使用でき る。 上記変異型タンパク質を宿主中に直接投与すると、ＨＰＶに対する防御免疫か 、または患者が既に感染している場合にはＨＰＶ誘発疾病の進行に対して一層効 果的に対抗させるための宿主自体の免疫応答の増加のいずれかが与えられる。 本発明の変異型ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の予防または治療用量の程 度は、当然乍ら患者のグループ（年齢、性別等）、処置されるべき疾患の性質ま たは苛酷度、および特定の変異型タンパク質および投与経路で変化する。一般に は、１週間の用量範囲は哺乳類の体重１ｋg当り約０．１ないし約５μｇの範囲 以内である。 本発明の変異型タンパクの有効用量を哺乳類特にヒトに与えるのに採用する投 与経路は、いずれか適当な経路が採用できる。例えば、経口、直腸経由、腟経由 、局所投与、非経口、眼経由、鼻経由、舌下経由、頬経由、静脈およびその他経 由が採用できる。投与形態中には、錠剤、トローチ、分散剤、懸濁剤、溶液、カ プセル、クリーム、軟膏、座薬、エーロゾル等が包含される。上記の投与形態中 には、この目的に対して特別に設計された注射用または移植用徐放手段も包含さ れる。 この変異型タンパク質をワクチンとして投与する場合には、保護すべき患者に 対するかかる投与のための慣用方法にしたがって処方する。この抗体を治療目的 に使用するのであれば、処置すべき患者と相容性の種特性をそれらに与えること が一般的に望ましい。したがって適当なパートナーとの融合が、分泌モノクロナ ール上に所望特性を与え得ることが可能なので、これらの抗体をモノクロナール 形態で調製することがしばしば望ましい。 上記変異型タンパク質は、ＩＳＣＯＭＳ^TM（免疫刺激コンプレックス）、リポ ソーム中で、またはアクリレートもくはポリ（ＤＬ−ラクチド−共グリコシド） 等の化合物中に封入されて微小球に形成されて、本発明にしたがって搬送される 。またこの変異型タンパク質は油性乳化物中に加えられて経口的に搬送されても よい。 他のアジュバントならびに慣用の薬剤的に許容されるキヤリヤー、賦形剤、緩 衝剤もしくは希釈剤もまた本発明のワクチン組成物中に含ませることができる。 一般的に本発明のワクチン組成物は、免疫学的有効量の上記変異型ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質、および任意にアジュバントを、１種または２種以上の薬 剤的に許容される慣用のキヤリヤーおよび／または希釈剤と一緒に含むことにな る。徹底的ではないが広範囲のアジュバントのリストがＣｏｕｌｔｅｒおよびＣ ｏｘによるＡｎｉｍａｌ Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｕｔｉｌｉｚｉ ｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４，Ｅｄ．Ｙｏｕｎｇ， Ｗ．Ｋ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）中の”Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａ ｄｊｕｖａｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”に 記載されている。ここで用いる”薬剤的に許容されるキヤリヤーおよび／または 希釈剤”なる用語中には、任意のおよび全ての溶剤、分散媒体、水性溶液、被覆 剤、抗菌および抗カビ剤、等張および吸収遅延剤等が包含される。薬剤活性物質 に対するかかる媒体および薬剤は業界で周知であり、かつＲｅｍｉｎｇｔｏｎの Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉ ａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．中に例示的な記載がある。 実際の使用において本発明の変異型タンパク質は、慣用の薬剤配合技術に従っ て薬剤キヤリヤーと一緒に活性成分として完全に混合して併合できる。このキヤ リヤーは、例えば経口または非経口（静脈内および動脈内を包含し）等の投与の 場合に望まれる製剤の形式に依存する多種類の形態をとりうる。経口投与形態の 組成物の調製においては、水グリコール、油類、アルコール類、フレーバー剤、 保存剤、着色剤等の、通常の薬剤的媒体のいずれもが採用でき、経口液体調剤の 場合には例えば懸濁剤、エリキシル剤および溶液等が；または例えば粉末、カプ セルおよび錠剤等の経口固形調剤の場合には澱粉、糖類、微晶質セルロース、希 釈剤、顆粒化剤、滑剤、結合剤、崩解剤等のキヤリヤーが採用される。投与の容 易さから、錠剤およびカプセルが最も便利な経口投与ユニット形態であり、この 場合は固形状の薬剤キヤリヤーが明らかに採用される。所望に応じて、錠剤は標 準法により糖衣または溶腸性コートを施すこともできる。 通常の投与形態以外にも、本発明の変異型タンパク質は制御された放出手段お よび／またはデリバリー手段により投与することもでき、例えば国際特許出願明 細書Ｎｏ．ＰＣＴ／ＡＵ９３／００６７７（公開Ｎｏ．ＷＯ９４／１５６３６号 ）中に開示された、制御された放出製剤の例示が包含される。 経口または非経口投与に適する本発明の薬剤組成物は、カプセル、カシェー剤 または錠剤等の離散ユニットとして提供でき、それぞれ予め決められた量の活性 成分を粉末もしくは粒状物として、または溶液もしくは水性懸濁液、非水性液体 、水中油型乳剤もしくは油中水型乳化物として含有している。かかる組成物は薬 剤学のいかなる方法によっても調製できるが、すべての方法中には活性成分と１ 種または２種以上の必要成分から構成されるキヤリヤーとを併合させる工程が包 含される。一般に、この組成物は活性成分を液体キヤリヤーもしくは微細にした 固体キヤリヤーまたは両方を均一に密接に混合し、ついで必要に応じて所望の提 示へと生成物を成形する。 本発明のさらなる特徴はつぎの実施例において一層完全に記載される。しかし 、この詳細な記載は単に本発明の例示目的のものであり、本発明の広範な上記記 載を制限するものと理解されるべきではない。 実施例１ ＧＳＴＥ6 ／Ｅ7 融合タンパク質のクローニングおよび発現 ”イン・フレーム”融合としてＨＰＶ−１６ Ｅ6 およびＥ7 配列からなる分 子をつぎのように創った。Ｅ6 およびＥ7 両方のゲノム配列を含むＨＰＶ−１６ ＤＮＡのクローンを、オリゴヌクレオチドを用いるＥ6 およびＥ7 の別々のＰＣ Ｒ増幅用の鋳型として働いた： Ｅt の３′末端およびＥ7 の５’末端におけるＳｍａＩ認識部位は上記融合を 容易にし、Ｅ6 およびＥ7 間に２つの追加的アミノ酸（プロリンおよびグリシン ）を導入した。この融合分子（上記オリゴヌクレオチド中に導入）の５’および ３’境界における追加的制限酵素認識サイトが次段のクローニング手順において 助けになった。 上記融合Ｅ6 ／Ｅ7 配列がイン・フレーム３’ヘキサ−ｈｉｓ（hh）配列を供 給したベクターｐＤＳ５６［Sｔｕｂｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．，（１９８４）３ ：３１４３−３１４８］中にＢg ＩＩＩ−ＢａｍＨ1 フラグメントとしてクロー ン化された。これからＥ6 ／Ｅ7 ｈｈが除かれ、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフ ラグメントとしてｐＧＥＭ７＋３中にサブクローン化されたが、これはｐＧＥＭ ３−Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ポリリンカーのＢａｍＨ１／ＨｉｎｄＩＩＩ 部分をｐＧＥＭ７−Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターの多重クローニング サイトのＢａｍＨ１／ＨｉｎｄＩＩＩ部位中に挿入して創られた。ついでＥ6 ／ Ｅ7 hhをｐＧＥＭ７＋３からＥｃｏＲＩ／ＳａＩＩフラグメントとして除き、か つｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の多重クローニングサイト中に挿 入してｐＧＥＸ−４Ｔ−１ Ｅ6 ／Ｅ7hh を生じさせた。このプラスミドはＴＯ ＰＰ2 （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＢＬ21（Ａｍｒａｄ／Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）を包含する各種Ｅ．ｃｏｌｉ菌株を形質転換するのに使用された。両タイプ の形質転換細胞はＩＰＴＧ誘導（図２）に続いてかなりの量の融合タンパク質を 生じた。この融合タンパク質（図１ａの図式で示すＧＳＴＥ6 ／Ｅ7 hh）は約６ ０ｋＤａの期待サイズ範囲内のものであった。このタンパク質の確認はＥ7 ［Ｌ ＨＩＬ．１６Ｅ7.8 ＦおよびＬＨＩＬ．１６Ｅ7.6 Ｄ、ＴｉｎｄｌｅらのＪｏｕ ｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（１９９０）７１：１３ ４７−１３５４）］（図３）に対して指向する２つのモノクロナール抗体でプロ ーブされたウエスタンブロット法により確認された。 実施例２ Ｅ6 ／Ｅ7 融合タンパク質のクローニングおよび発現 ＧＳＴを欠くタンパク質としてのＥ6 ／Ｅ7 ｈｈを発現するために、リン酸 化リンカーＴＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＡを用いてＧＳＴ翻訳開始コドンに対するユ ニークＢａｌＩ部位３’において、かつイン・フレームで終止コドンをｐＧＥＸ −４Ｔ−１ Ｅ6 ／Ｅ7 ｈｈ中に導入した。 この新しいプラスミド（［ＧＳＴ］Ｅ6 ／Ｅ7 hh）を用いてＥ．ｃｏｌｉ菌株 ＢＬ２１を形質転換後、かなりの量のタンパク質（Ｅ6 ／Ｅ7 hh、図１ｂの図式 で示す）がＩＰＴＧ誘導に続いて、Ｅ6 ／Ｅ7 hh融合タンパク質（図２）の期待 サイズに該当するサイズ約３３ｋＤで生じた。 このタンパク質の同一性は、実施例１（図３）におけると同じモノクロナール抗 体を用いたウエスタンブロット法により確認した。 実施例３ Ｅ6 およびＥ7 の欠失形（非完全長）のクローニングおよび発現 （ｉ）△Ｅ6 Ｃ／△Ｅ7 Ｎの構築 ｐＧＥＭ3（Ｐｒｏｍｅｇａ）中の完全長Ｅ6 ／Ｅ7 が、オリゴヌクレオチド を用いた、Ｅ6 ／Ｅ7 の欠失形態のＰＣＲ増幅用鋳型として働いた。 Ｅ6 のＮ末端およびＥ7（９６ｂｐ）のＣ末端における配列（１８９ｂｐ）を 欠いたＥ6 ／Ｅ7 の生成載断を、ＧＳＴ配列中に終結コドンを含むｐＧＥＸ−４ Ｔ−１中にサブクローン化して［ＧＳＴ］△Ｅ6 Ｃ／△Ｅ7 Ｎ hh を生成させた 。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１の形質転換に使用した。形質転換 細胞はかなりの量の融合タンパク質（△Ｅ6 Ｃ／△Ｅ7 Ｎ hh、図１ｃの図式で 示す）をＩＰＴＧ誘導（図４ａ）に続いて発現し、ほぼ期待サイズのタンパク質 （２０ｋＤ）を生じた。このタンパク質の同一性は実施例１（図４ｂ）と同じモ ノクロナール抗体を用いたウエスタンブロット法により確認した。 （ｉｉ）△Ｅ7 Ｃ／△Ｅ6 Ｎの構築 実施例１のオリゴヌクレオチド（ａ）および５’ＣＧＣＣＣＧＧＧＴＡＡＴＧ ＴＴＧＴＴＣＣＡＴＡＣＡＡＡＣＴＡ３’を用いて、２８５ｂｐを含むＥ6 のＮ 末端提示を実施例１で用いたと同じＨＰＶ−１６クローンから増幅した。同様に 、オリゴヌクレオチド５’ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＡ ＴＡＧＡＴＧ３’および実施例１の（ｄ）を１９８ｂｐＣ末端Ｅ7 配列の生成に 用いた。これらはそれぞれｐＧＥＭ７−Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に平滑 クローン化された。ＫｐｎＩ／ＢｇＩＩＩを用いてＥ6 クローンを制限し、かつ Ｅ7 配列上流をＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして挿入することにより融 合 カセットを形成させた。ついでこの融合配列を、［ＧＳＴ］△Ｅ7 Ｃ／△Ｅ6 Ｎ hhを生成させるために、ＧＳＴ配列中に終止コドンを含むｐＧＥＸ−４Ｔ−１中 への挿入のためのＳｍａＩおよびＢｇＩＩＩクローニングサイトを用いて再増幅 した。Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１中に形質転換後、タンパク質生産をＰＡＧＥ、続 いてクーマシー染色およびウエスタンブロット法（図５ａおよび５ｂ）により分 析した。期待サイズ（２０ｋＤ）のタンパク質（△Ｅ７Ｃ／△Ｅ6 Ｎhh、図１ｄ の図式で示す）がウエスタンブロット上に明瞭であった。 実施例４ Ｅ6 ／Ｅ7 完全長および欠失構築体のＤＮＡ配列 Ｅ6 ／Ｅ7 構築体をオーバーラッピング配列情報を発生するプライマーを用い てジデオキシ法により両方向に配列決定した。^T7Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ^TMＫｉｔ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）用いて³⁵Ｓ−ラベル化鎖終結フラグメントを発生させた 。このフラグメントをＳｅｑｕｉ−Ｇｅｎ^TM（Ｂｉｏｒａｄ）電気泳動ゲル装置 で分析した。Ｅ6 ／Ｅ7 hh（ＰＰＶ１６２．ＤＮＡ）、△Ｅ6 Ｃ／Ｅ7 Ｎ hh（ ＣＡＤ６００．ＳＥＱ）および△Ｅ7 Ｃ／Ｅ6 Ｎ hh （C620.ＴＸＴ）の場合の ＤＮＡおよび対応アミノ酸配列をつぎに示す。 実施例５ Ｅ6 ／Ｅ7 hhタンパク質の免疫原性 Ａ．Ｅ6 ／Ｅ7 hh の精製 上記［ＧＳＴ］Ｅ6 ／Ｅ7 hhプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ 細胞（菌株ＢＬ ２１）を０．１−０．５ｍＭ ＩＰＴＧを用いて誘発し、ついで誘発後３−４時 間で収穫した。この細胞を低速遠心分離によりペレット化し、Ｅ6 ／Ｅ7hh タン パク質を含む封入体を超音波処理および遠心分離により単離した。この封入体ペ レットを７Ｍ尿素または６ＭグアニジンＨＣｌ中に溶解し、ニッケルキレートカ ラムクロマトグラフイー［ＰｏｒａｔｈらのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２， １６２１−１６３０（１９８３）］に処した。イミダゾール増加勾配またはｐＨ 低減勾配のいずれかを用いてタンパク質を溶離し、Ｅ6 ／Ｅ7 hh含有フラクショ ンをプールし、かつ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１％ＮＯＧ、１ ０ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ７．５に対して透析した。透析産物の同一性および純度は 実施例１で引用した（図６ａおよび６ｂ）クーマシー染色ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動およびモノクロナール抗体使用のウエスタンブロット法により決定し た。 Ｅ6 ／Ｅ7 hhの免疫原性 ０日に、５Ｃ５７ＢＬ／６マウスの２グループ（生後８週、雌）を尾の基部の 皮下に、６μｇのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ^TM、１９μｇのＥ6 ／Ｅ7 hh（上記Ａに おけるように精製した）（ＰＢＳ ｐＨ７．２中）を含む配合物０．１ｍＬを接 種した。 この配合物の第２用量を日１４にグループ１に、かつ日１７にグループ２に投 与した。日２１および日２４には、グループ１および２（それぞれ）中のマウス が採血された。ついでＥ6 ／Ｅ7 ｈｈに対する血清抗体応答をつぎの固相ＥＩ Ａを用いて測定した： Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ ＥＩＡプレートを、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液ｐＨ ９．５中の４Ｍ尿素中の１０μｇ／ｍＬ溶液の０．１ｍＬ／ウエルを３７℃で２ 時間保温することによりＥ6 ／Ｅ7 hhで被覆した。 液体を除き、プレートをＰＢＳ ｐＨ７．２中の１ｍｇ／ｍＬカゼインの０． ２ｍＬ／ウエルを用いて３７℃で１時間さらに保温した。６回洗浄後、試験血清 ［ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、１ｍｇ／ｍＬカゼイン、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、０ ．００２％のａｌｐｈａｚｕｒｉｎｅ Ａ中に希釈）の０．１ｍＬ／ウエルを添 加し、かつプレートを３７℃で１時間保温した。ついでこのプレートをさらに６ ×、ＰＢＳ ｐＨ７．２、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄した。結合抗体 を検出するために、ＰＢＳ ｐＨ７．２、１ｍｇ／ｍＬカゼイン、０．５Ｔｗｅ ｅｎ ２０、０．００２％ ａｌｐｈａｚｕｒｉｎｅ Ａ中の０．１μｇ／ｍＬ ＫＰＬセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ およびＬ鎖特異的）の０．１ｍＬを各ウエル中に加えた。これらの複数プレート を２０℃で１時間保温し、ＰＢＳ ｐＨ７．２、０．５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０ を用いて６×洗浄し、ついで０．１ｍＬの酵素基質（３，３’，５，５’テトラ メチルベンジジン／Ｈ₂Ｏ₂配合物、ＫＰＬから購入）を添加した。２０℃で１０ 分間保温後、５０μＬの０．５Ｍ硫酸を添加して反応を停止させた。ついで着色 産物を垂直ビーム型分光光度計における４５０ｎｍで測定した。力価は光学密度 値０．１が生ずる血清希釈度の逆数で表示した。 表１は、グループ１および２の両方の全てのマウスがかなりの応答を、免疫に 続いて生じたことを示す。力価は３．１７ないし５．６６（上記固相ＥＩＡ中に ０．１の光学密度が生ずる逆数希釈度のｌｏｇ₁₀で表示）の範囲であった。予め 存在した抗体レベルは低いか、または検出不可能であった（接種直前の日０に得 られた血清中で測定）。 上記Ｅ6 ／Ｅ7 hh融合タンパク質はこの手順によりマウスに投与すると、高度 に免疫原性であることは明瞭である。 同時に、Ｅ6 ／Ｅ7 hhは、Ｅ6 ／Ｅ7 hhプラスＩＳＣＯＭ^TMアジュバントを含 む配合物の１用量に続いて、特定の遅延型過敏症（ＤＴＨ）を生ずることが判っ た。精製ＧＳＴ−Ｅ6 またはＧＳＴ−Ｅ7 タンパク質の小用量を用いてマウスの 耳中に抗原投与すると、Ｅ6 およびＥ7 の両方に対して特定ＤＴＨ応答が生じた 。 実施例６ Ｅ6 ／Ｅ7 遺伝子構築体の形質転換研究 Ｅ6 ／Ｅ7 融合ＤＮＡ構築体をＢａｍＨＩフラグメントとしてプラスミドベク ターｐＪ４Ω［ＷｉｌｋｉｎｓｏｎらのＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８）１６ ７：１４４２−５８］の多重クローニングサイト中にサブクローン化してｐＪ４ ΩＥ6 ／Ｅ7 を生じさせた。比較のためにＨＰＶ１６Ｅ6 （ｐＪ４ΩＥ6）およ びＨＰＶ１６Ｅ7 （ｐＪ４ΩＥ7）ＯＲＦを含むｐＪ４Ωベクターを使用した。 ネオマイシン選択が必要な場合には、ネオマイシン抵抗マーカー含有ｐｃＤＮＡ 3 ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｎ）を利用した。これらのプラスミドはＥ．ｃｏｌ ｉ中で増幅され、かつプラスミドＤＮＡをアルカリ性溶解により抽出し、かつ溶 離樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上で精製し、エタノール沈殿させ、かつ水中に再懸濁さ せた。ＤＮＡ量および純度は２６０および２８０ｎｍにおける分光光 度計による測定で決めた。ＤＮＡの完全性は１％アガロースゲルおよび臭化エチ ジウム染色中での電気泳動によりチェックした。形質転換のターゲット細胞はマ ウスＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＣＳＬ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。この細胞 を、非必須アミノ酸、２ｍＭグルタミンおよび１０％胎児ウシ血清（成長培地） を使用して補充したＭｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｅａ ｇｌｅ）上でルーチン的に増殖した。 プラスミドＤＮＡによるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフエクションをＴｆｘ^TM −５０を用いてＰｒｏｍｅｇａ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ＢｕｌｌｅｔｉｎＮｏ． ２１６に記載のように実質的に行ない、ＤＮＡ摂取量を強化した。典型的トタン スフエクション混合物は５μｇの試験プラスミド（ｐＪ４ΩＥ6 ／Ｅ7、ｐＪ４ ΩＥ7 またはｐＪ４ΩＥ6 およびｐＪ４ΩＥ7 ）を含有しており、ここで０．１ μgのｐｃＤＮＡ3 を含んでいた。ｐＪ４ΩＥ6 およびｐＪ４ΩＥ7 が共トラン スフエクションされる場合には、それぞれの２．５μｇを用いた。 細胞を約８０％集密度まで成長させ、成長培地を除き、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓ ｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ中に４：１の比率でＴｆｘ^TM−５０と混合したプ ラスミドＤＮＡを加え、この細胞を３７℃で保温した。 ３７℃における１−２時間の保温に続いて、上記トランスフェション混合物を 除き、新鮮な成長培地を添加した。３７℃で４８時間保温後、トランスフェクシ ョンした細胞をトリシニゼーション（ｔｒｙｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）により除き 、かつ軟寒天中のコロニー形成をアッセイするか、またはネオマイシン選択適用 以前の３７℃でのさらなる２４時間保温を行うかのいずれかであった。 ソフト寒天中でのコロニー形成のアッセイのために、上記トリシナイズド（ｔ ｒｙｓｉｎｉｚｅｄ）細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ Ｈ ＥＰＥＳおよび０．０８４％ＮａＨＣＯ₃（ＲＰＭＩ １６４０＋）を用いて補 足し、かつ０．４％アガロース（Sｅａｐｌａｑｕｅ 低ゲル化温度、ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＵＳＡ）を含み３７℃に維持されたＲＰＭＩ １６ ４０中に、細胞密度１−５×１０⁵細胞／ｍＬで再懸濁した。混合後、この懸濁 物の２．５ｍＬを６ウエル・トレイ（Ｎｕｎｃ）の各ウエル中に加えて放置した 。ついで上記トレイを逆方向光顕微鏡を用いてコロニーのカウントを行うに先立 って、５％ＣＯ₂の雰囲気中で３７℃で１０−１４日間保温した。 ネオマイシン抵抗コロニーの選択を、７００μｇ／ｍＬネオマイシン（Ｇｅｎ ｅｔｉｃｉｎ）を含有するＲＰＭＩ １６４０＋を用いてサブ集密的（ｓｕｂｃ ｏｎｆｌｕｅｎｔ）細胞単層上で実施した。逆方向光顕微鏡を用いたネマイシン 抵抗コロニーのカウントに先立って、この単層を５％ＣＯ₂雰囲気下、３7℃で１ ０−１４日間保温した。カウントに続いてコロニーをトリシニゼーション（ｔｒ ｙｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）により分散し、上記のようにソフト寒天中のコロニー 形成をアッセイした。各種プラスミド構築体を用いた３Ｔ３細胞のトランスフェ クションに続くネオマイシン選択実験の結果を表２に示す。 これらの結果は、Ｅ6 ／Ｅ7 融合体がＥ7 またはＥ6 ＋Ｅ7 に比較して形質転 換性は極くわずかであることを示している。上記Ｅ6 ／Ｅ7 融合のコロニー数お よび細胞成長の両方は、非融合野生型配列と比較するといずれも低い。このこと は、Ｅ6 およびＥ7 配列を融合することの結果は細胞形質転換を促進するこれら の配列の能力を劣化させることを示している。 業界における当事者であれば、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、こ こに広範囲に記載した本発明の変形および修飾をなし得ることが認められる。本 発明は、かかる変形および修飾の全てを包含するべく拡張される得ることを理解 されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 コックス，ジョン クーパー オーストラリア連邦ビクトリア州、ブリン ガロック、バッカス、マーシュ、ロード、 365 (72)発明者 ウェブ，エリザベス アン オーストラリア連邦ビクトリア州、エルサ ン、ジグ、ザグ、ロード、36 (72)発明者 フレイザー，イアン オーストラリア連邦クイーンズランド州、 セイント、ルーシア、ハイランド、テラ ス、110

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の変異体 であって、上記変異型が宿主動物中でＨＰＶに対する体液性および／または細胞 性免疫応答を引き出し得るが、上記宿主動物中で細胞形質転換性ではない変異体 。 ２． Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の完全長配列の少なくとも５０％を含むＨＰ Ｖ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の欠失変異体である、請求項１記載の変異体。 ３． 上記欠失変異体がＥ6 またはＥ7 タンパク質の完全長配列の約３分の２ に該当する、請求項２記載の変異体。 ４． 上記欠失突然変異体がＥ6 またはＥ7 タンパク質の完全長配列のＮ−末 端３分の２に該当する、請求項３記載の変異体。 ５． 上記欠失変変異体がＥ6 またはＥ7 タンパク質の完全長配列のＣ−末端 ３分の２に相当する、請求項３記載の変異体。 ６． Ｅ6 および／またはＥ7 タンパク質部分、および任意に連鎖部分を含む 融合タンパク質である、請求項１記載の変異体。 ７． 上記融合タンパク質が、融合されたＥ6 および／またはＥ7 タンパク質 部分、または外来タンパク質もしくはペプチド部分に結合したＥ6 および／また はＥ7 タンパク質部分を含む、請求項６記載の変異型。 ８． 上記外来タンパク質またはペプチド部分が、上記融合タンパク質の免疫 原性を強化するタンパク質もしくはペプチド部分または融合タンパク質の精製を 援助するタンパク質またはペプチド部分から選択される、請求項７記載の変異体 。 ９． Ｅ6 および／またはＥ7 タンパク質部分が、完全長Ｅ6 またはＥ7 タン パク質部分もしくはその非完全長失欠突然変異体から選択される、請求項６ない し８のいずれかに記載の変異型。 １０． 上記連鎖部分が、１ないし５０、好ましくは１ないし２０、および最 も好ましくは１ないし５アミノ酸残基を含む、請求項６ないし９のいずれかに記 載の変異体。 １１． 完全長Ｅ7 タンパク質部分に融合した完全長Ｅ6 タンパク質部分を含 む融合タンパク質を含んでなる、請求項６記載の変異型。 １２． Ｅ7 タンパク質のＣ末端３分の２である第２タンパク質部分に融合し たＥ6 タンパク質のＮ末端３分の２である第１タンパク質部分を含む融合タンパ ク質を含んでなる、請求項６記載の変異型。 １３． Ｅ6 タンパク質のＣ末端３分の２である第２タンパク質部分に融合し たＥ7 タンパク質のＮ末端３分の２である第１タンパク質部分を含む融合タンパ ク質を含む融合タンパク質を含む融合タンパク質を含んでなる、請求項６記載の 変異体。 １４． 上記Ｅ6 またはＥ7 タンパク質が、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、Ｈ ＰＶ−６およびＨＰＶ−１１遺伝子型から選択される、請求項１ないし１３のい ずれかに記載の変異型。 １５． 上記Ｅ6 またはＥ7 タンパク質が、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８ 遺伝子型から選択される、請求項１４記載の変異型。 １６． 宿主動物中のＨＰＶに対する体液性および／または細胞性免疫応答を 引き出すのに使用するワクチン組成物であって、上記組成物が、請求項１ないし １５のいずれかに記載のＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の変異型を薬剤的に 許容されるキヤリヤーおよび／または希釈剤と共に含む、ワクチン組成物。 １７． アジュバントをさらに含む、請求項１６記載のワクチン組成物。 １８． 宿主動物中でＨＰＶに対する体液性および／または細胞性応答を引き 出すための方法であって、この方法が、請求項１ないし１５のいずれかに記載の ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の変異体の有効量を宿主動物に投与すること を特徴とするする方法。 １９． ＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の上記変異型を組成物において薬 剤的に許容されるキヤリヤーおよび／または希釈剤と共に投与する、請求項１８ 記載の方法。 ２０． 上記組成物がアジュバントをさらに含む、請求項１９記載の方法。 ２１． 上記宿主動物がヒトである、請求項１８ないし２０のいずれかに記載 の方法。 ２２． 宿主動物中でＨＰＶに対する免疫応答を引き出すことにおける、請求 項１ないし１５のいずれかに記載のＨＰＶ Ｅ6 またはＥ7 タンパク質の変異体 の使用。