ES2419664T3 - Polipéptidos y polinucleótidos de Porphyromonas gingivalis - Google Patents

Abstract

Un polipéptido antigénico de Porphyromonas gingivalis aislado que puede provocar una respuesta inmunitariacontra P. gingivalis, polipéptido que comprende: una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383; o una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % o al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO. 526 o la SEQ IDNO. 383; o al menos 40 aminoácidos que tengan una secuencia contigua de al menos 40 aminoácidos idéntica a una secuenciacontigua de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383.

Description

Polipéptidos y polinucleótidos de Porphyromonas gingivalis

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos de P. gingivalis, polipéptidos de P. gingivalis y sondas para la detección de P. gingivalis. Los polipéptidos y nucleótidos de P. gingivalis se pueden usar en composiciones para su uso en la obtención de una respuesta inmunitaria contra P. gingivalis en un sujeto y tratar o evitar o reducir la gravedad de la afección conocida como periodontitis.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades periodontales son enfermedades inflamatorias asociadas con bacterias de los tejidos de soporte

15 de los dientes y varían desde la forma de gingivitis relativamente leve, la inflamación inespecífica reversible del tejido gingival hasta las formas de periodontitis más agresivas que se caracterizan por la destrucción de las estructuras de soporte del diente. La periodontitis se asocia con una infección subgingival de un grupo de bacterias gramnegativas específicas que conduce a la destrucción del periodonto y es un gran problema de salud pública. Una bacteria que ha atraído un interés considerable es P. gingivalis, dado que la recuperación de este microorganismo de lesiones de periodontitis en adultos puede ser hasta el 50 % de la flora subgingival cultivable anaeróbicamente, mientras que rara vez se recupera P. gingivalis, y cuando se hace es en pocas cantidades, de sitios sanos. Se ha asociado un aumento proporcional en el nivel de P. gingivalis en la placa subgingival con un aumento de la gravedad de la periodontitis y la erradicación del microorganismo de la población microbiana subgingival cultivable va acompañada de la resolución de la enfermedad. Se ha demostrado la progresión de las lesiones por periodontitis en primates no

25 humanos con la implantación subgingival de P. gingivalis. Estos descubrimientos tanto en animales como en seres humanos apuntan a una función principal de P. gingivalis en el desarrollo de la periodontitis en adultos.

P. gingivalis es un bacilo gramnegativo proteolítico, asacarolítico, anaerobio, de pigmentación negra que obtiene energía del metabolismo de aminoácidos específicos. El microorganismo requiere indispensablemente para su proliferación hierro, preferentemente en forma de hemo o su producto de oxidación de Fe (III) hemina, y cuando prolifera en condiciones de exceso de hemina es altamente virulento en animales de experimentación. Se han implicado una serie de factores de virulencia en la patogenicidad de P. gingivalis, incluidos la cápsula, adhesinas, citotoxinas y enzimas hidrolíticas extracelulares.

35 Con el fin de desarrollar una vacuna segura y eficaz para evitar, eliminar o reducir la colonización por P. gingivalis es necesario identificar y producir antígenos que estén implicados en la virulencia que tengan utilidad como inmunógenos posiblemente a través de la generación de anticuerpos específicos. Aunque es posible intentar aislar los antígenos directamente de cultivos de P. gingivalis, con frecuencia es difícil. Por ejemplo como se menciona anteriormente, P. gingivalis es un anaerobio estricto y puede ser difícil de aislar y cultivar. También se sabe que, para una serie de organismos, cuando se cultivan in vitro, muchos genes de virulencia se regulan por disminución y las proteínas codificadas dejan de expresarse. Si se aplican técnicas de química convencionales para purificar candidatos de vacuna, puede que no se identifiquen moléculas (protectoras) potencialmente importantes. Con la secuenciación de ADN, como el gen está presente (pero no transcrito) aun cuando el organismo se cultiva in vitro, se puede identificar, clonar y producir como una proteína de ADN recombinante. De forma similar, el organismo in vitro

45 puede expresar de forma transitoria un antígeno protector u objetivo terapéutico o se pueden producir en bajos niveles que hacen la identificación de estas moléculas extremadamente difícil por métodos convencionales.

Con la identificación serológica de los objetivos terapéuticos se limitan las respuestas a las que son detectables utilizando métodos comunes tales como transferencia de bandas western o ELISA. La limitación en este caso es tanto el nivel de respuesta que genera el animal o ser humano como determinar si esta respuesta es protectora, dañina o irrelevante. Con un enfoque de secuenciación para la identificación de posibles objetivos profilácticos o terapéuticos no existen limitaciones de este tipo.

También es bien conocido que P. gingivalis produce una variedad de proteasas ampliamente activas (solicitud de

55 patente internacional N. º WO97/16542 de la Universidad de Melbourne, patentes de Estados Unidos N os 5.475.097 y 5.523.390), lo que dificulta la identificación de proteínas intactas debido a su degradación por estas proteasas.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han intentado aislar secuencias de nucleótidos de P. gingivalis que se pueden usar para la producción recombinante de polipéptidos de P. gingivalis y para desarrollar sondas nucleotídicas específicas para P. gingivalis. Las secuencias de ADN que se enumeran más adelante se han seleccionado de entre una gran cantidad de secuencias de P. gingivalis de acuerdo con su potencial indicador como candidatos de vacuna. Esta etapa intuitiva implicó la comparación de la secuencia proteínica deducida de las secuencias de ADN de P. gingivalis con 65 las bases de datos de secuencias proteínicas conocidas. Algunas de las características usadas para seleccionar candidatos de vacuna útiles incluyen: la ubicación celular esperada, tal como proteínas de membrana externa o

proteínas secretadas, actividades funcionales particulares de proteínas similares tales como aquellas con una actividad enzimática o proteolítica, proteínas implicadas en rutas metabólicas esenciales que, cuando se inactivan o bloquean, pueden ser perjudiciales o letales para el organismo, proteínas que se podría esperar que desempeñen una función en la patogenia del microorganismo, p. ej., lisis de glóbulos rojos, aglutinación celular, o receptores

5 celulares y proteínas que son parálogas a proteínas con eficacia de vacuna demostrada.

En un primer aspecto la presente invención proporciona un polipéptido antigénico de Porphyromonas gingivalis aislado, polipéptido que comprende;

10 una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383; o

una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % o al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO. 526 o la SEQ ID NO. 383; o

15 al menos 40 aminoácidos que tengan una secuencia contigua de al menos 40 aminoácidos idéntica a una secuencia contigua de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383.

Tal como se usa en el presente documento, el % de identidad para polipéptidos se ha de calcular usando el algoritmo de alineación de Needleman y Munsch (9) usando una matriz de puntuación de proteínas estándar 20 (Blosum 50).

En un segundo aspecto, la presente invención consiste en un polipéptido antigénico de Porphyromonas gingivalis aislado, comprendiendo el polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383, descritas en la tabla 3.

25 En un tercer aspecto, la presente invención consiste en una molécula de ADN aislada, molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del primer aspecto de la presente invención.

La molécula de ADN puede comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 119 o SEQ ID NO. 262.

30 En un cuarto aspecto, la presente invención consiste en un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ADN del tercer aspecto de la presente invención enlazado de forma funcional a un elemento regulador de la transcripción.

35 La presente invención también proporciona una célula aislada que comprende este vector de expresión recombinante.

En un aspecto adicional, la presente invención consiste en un método para producir una polipéptido de P. gingivalis que comprende cultivar la célula en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.

40 En un aspecto adicional más, la presente invención proporciona una composición para su uso en la obtención de una respuesta inmunitaria dirigida contra P. gingivalis en un sujeto, composición que comprende una cantidad eficaz de al menos un polipéptido del primer aspecto de la presente invención, o al menos una molécula de ADN del tercer aspecto de la presente invención, o ambos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se prefiere que el vehículo

45 farmacéuticamente aceptable sea un adyuvante. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición de este tipo para su uso en el tratamiento de la infección por P. gingivalis. El tratamiento puede ser profiláctico o terapéutico.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un anticuerpo obtenido contra un polipéptido del primer

50 aspecto de la invención. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. La presente invención también proporciona composiciones que incluyen estos anticuerpos. Se prefiere que estas composiciones estén adaptadas para uso oral y puedan ser, por ejemplo, dentífricos, colutorios, etc.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia de una molécula 55 de ADN del tercer aspecto de la invención en una muestra, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra con una sonda nucleotídica que comprende al menos 18 nucleótidos y que tiene una secuencia contigua de al menos 18 nucleótidos idéntica a una secuencia contigua de nucleótidos de SEQ. ID. NO. 119 o SEQ ID NO. 262 en condiciones en las que se pueda formar un híbrido entre la sonda y la molécula de

60 ADN del tercer aspecto de la invención en la muestra; y

(b) detectar el híbrido formado en la etapa (a), en el que la detección de un híbrido indica la presencia de una molécula de ADN del tercer aspecto de la invención en la muestra.

65 Se prefiere que la sonda comprenda además una marca detectable.

Descripción detallada

Definiciones

5 En el presente documento se usan indistintamente un polipéptido purificado o aislado o una preparación sustancialmente pura de un polipéptido y, tal como se usan en el presente documento, significan un polipéptido que se ha separado de otras proteínas, lípidos y ácidos nucleicos con los que se encuentra en la naturaleza. Preferentemente, el polipéptido también se separa de las sustancias, p. ej., anticuerpos o matriz de gel, p. ej., poliacrilamida, que se usan para purificarlo. Preferentemente, el polipéptido constituye al menos el 10, 20, 50, 70, 80

o 95 % en peso seco de la preparación purificada. Preferentemente, la preparación contiene: suficiente polipéptido para permitir la secuenciación de la proteína; al menos 1, 10 o 100 mg del polipéptido.

Una preparación de células purificada se refiere, en el caso de células vegetales o animales, a una preparación in vitro de células y no a una planta o un animal enteros intactos. En el caso de células cultivadas o células

15 microbianas, consiste de una preparación de al menos el 10 %, y más preferentemente del 50 %, de las células del sujeto.

Un ácido nucleico purificado o aislado o sustancialmente puro, p. ej., un ADN sustancialmente puro (son términos usados indistintamente en el presente documento), es un ácido nucleico que es uno o ambos de los siguientes: no inmediatamente contiguo con ambas secuencias codificantes con las que es inmediatamente contiguo (es decir, una en el extremo 5’ y una en el extremo 3’) en el genoma natural del organismo del que se obtiene el ácido nucleico; o que no tiene, sustancialmente, un ácido nucleico con el que se encuentra en el organismo del que se obtiene el ácido nucleico. El término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante incorporado en un vector, p. ej., en un plásmido o virus que se replica de forma autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe

25 como una molécula separada (p. ej., un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias de ADN. El ADN sustancialmente puro también incluye un ADN recombinante que forma parte de un gen híbrido que codifica una secuencia de ADN adicional de P. gingivalis.

Tal como se usa en el presente documento, un "cóntigo" es un ácido nucleico que representa un tramo contiguo de secuencia genómica de un organismo.

Un "marco de lectura abierto", también denominado en el presente documento ORF, es una región de ácido nucleico que codifica un polipéptido. Esta región puede representar una porción de una secuencia codificante o una

35 secuencia total y se puede determinar desde un codón de parada hasta un codón de parada o desde un codón de inicio hasta un codón de parada.

Tal como se usa en el presente documento, una "secuencia codificante" es un ácido nucleico que se transcribe en ARN mensajero y/o se traduce en un polipéptido cuando se sitúa bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio de la traducción en el extremo cinco prima y un codón de parada de la traducción en el extremo tres prima. Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, ARN mensajero, ADN sintético y secuencias de ácido nucleico recombinante.

Tal como se usa en el presente documento, un "complemento" de un ácido nucleico se refiere a una secuencia 45 antiparalela o no codificante que participa en el apareamiento de bases de Watson-Crick con la secuencia original.

Un "producto génico" es una proteína o ARN estructural codificados específicamente por un gen.

Tal como se usa en el presente documento, el término "sonda" se refiere a un ácido nucleico, péptido u otra entidad química que se une específicamente a una molécula de interés. Frecuentemente, las sondas se asocian o pueden asociarse con una marca. Una marca es un resto químico que se puede detectar. Las marcas típicas comprenden tintes, radioisótopos, restos luminiscentes y quimioluminiscentes, fluoróforos, enzimas, agentes de precipitación, secuencias de amplificación y similares. Análogamente, un ácido nucleico, péptido u otra entidad química que se une específicamente a una molécula de interés e inmoviliza esa molécula se denomina en el presente documento

55 "ligando de captura". Típicamente, los ligandos de captura se asocian o se pueden asociar con un soporte tal como nitrocelulosa, vidrio, membranas de nailon, perlas, partículas y similares. La especificidad de hibridación depende de condiciones tales como la composición de pares de bases de los nucleótidos y la temperatura y concentración salina de la reacción. Estas condiciones son fácilmente discernibles para un experto en la técnica usando experimentación de rutina.

Homólogo se refieren a la similitud de secuencia o identidad de secuencia entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. Cuando una posición de las dos secuencias comparadas la ocupa la misma base o subunidad monomérica de aminoácido, p. ej., si una posición de cada una de las dos moléculas de ADN la ocupa una adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre las dos

65 secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las dos secuencias dividido entre el número de posiciones comparadas x 100.

En el presente documento, los términos péptidos, proteínas y polipéptidos se usan indistintamente.

Tal como se usa en el presente documento un "componente inmunógeno" es un resto, tal como un polipéptido, 5 análogo o fragmento del mismo, de P. gingivalis, que puede provocar una respuesta inmunitaria humoral y/o celular en un animal huésped.

Tal como se usa en el presente documento, un "componente antigénico" es un resto, tal como un polipéptido, análogo o fragmento del mismo, de P. gingivalis, que puede unirse a un anticuerpo específico con afinidad suficientemente alta para formar un complejo antígeno-anticuerpo detectable.

Tal como se usa en el presente documento, el término "promotor específico de célula" significa una secuencia de ADN que funciona como promotor, es decir, regula la expresión de una secuencia de ADN seleccionada enlazada de forma funcional al promotor, y que efectúa la expresión de la secuencia de ADN seleccionada en células específicas

15 de un tejido. El término también engloba los llamados promotores "de fuga", que regulan la expresión de un ADN seleccionado principalmente en un tejido, pero que provocan la expresión también en otros tejidos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "secuencia de control" se refiere a un ácido nucleico que tiene una secuencia de bases que reconoce el organismo huésped para efectuar la expresión de secuencias codificadas a las que están enlazada. La naturaleza de tales secuencias de control difiere en función del organismo huésped; en procariotas, tales secuencias de control incluyen en general un promotor, sitio de unión de ribosomas, terminadores y, en algunos casos, operadores; en eucariotas, en general tales secuencias de control incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores. Se pretende que el término secuencia de control incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir

25 componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder.

Tal como se usa en el presente documento, el término "enlazado de forma funcional" se refiere a secuencias unidas

o enlazadas para que funcionen del modo pretendido. Por ejemplo, una secuencia de control se une de forma funcional a la secuencia codificante mediante un enlace de tal forma que se logra la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con la secuencia de control y la célula huésped.

Tal como se usa en el presente documento, una "muestra" se refiere a una muestra biológica, tal como, por ejemplo, tejido o fluido aislado a partir de un individuo (incluidos, sin limitación, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, linfa, lágrimas, saliva y secciones tisulares) o a partir de constituyentes de cultivo celular in vitro, así como muestras del

35 entorno.

En la puesta en práctica de la invención se emplearán, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología bien conocidas por los expertos en la técnica. Técnicas de este tipo se describen y se explican en la literatura en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996) y F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluidas todas las actualizaciones hasta el

45 momento). La divulgación de estos textos se incorpora en el presente documento por referencia.

Vehículos farmacéuticamente aceptables

Los anticuerpos, polipéptidos y ADN de la presente invención se pueden incluir en composiciones que incluyen un vehículo o diluyente. Estas composiciones incluyen composiciones farmacéuticas donde el vehículo o el diluyente serán farmacéuticamente aceptables. Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen los usados en composiciones adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (incluidas bucal y sublingual), vaginal, parenteral (incluidas subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal y epidural). No son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Los ejemplos representativos de vehículos o

55 diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, agua, soluciones isotónicas preferentemente tamponadas a un pH fisiológico (tal como solución salina tamponada con fosfato o solución salina tamponada con Tris) y también pueden contener uno o más de, manitol, lactosa, trehalosa, dextrosa, glicerol, etanol o polipéptidos (tales como seroalbúmina humana). Las composiciones se pueden presentar convenientemente en formas farmacéuticas unitarias y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia.

Como entenderán bien los expertos en la técnica, se pueden hacer modificaciones en las secuencias de aminoácidos establecidas en los listados de secuencias. Estas modificaciones pueden ser deleciones, inserciones, o sustituciones de residuos de aminoácido. Los polipéptidos modificados pueden ser naturales (es decir, purificados o 65 aislados a partir de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, mediante la realización de mutagénesis dirigida a sitio en el ADN codificante). Se pretende que estos polipéptidos modificados que tienen al menos el 85 %,

preferentemente al menos el 95 %, de identidad con las secuencias establecidas en el listado de secuencias estén dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos obtenidos contra estos polipéptidos modificados también se unirán a los polipéptidos que tienen una de las secuencias establecidas en los listados de secuencias. El nivel de % de identidad se ha de calcular como se establece anteriormente.

5 Las secuencias proteínicas son homólogas si están relacionadas por divergencia a partir de un ancestro común. En consecuencia, un homólogo de especie de la proteína será la proteína equivalente natural en otra especie. Dentro de cualquier especie un homólogo puede existir como numerosas variantes alélicas, y éstas se considerarán homólogos de la proteína. Se pueden obtener variantes alélicas y homólogos de especie mediante las siguientes técnicas comunes conocidas por los expertos en la técnica.

Una variante alélica será una variante natural dentro de un organismo individual.

Mutantes, variantes y homología - Ácidos nucleicos

15 Los polinucleótidos mutantes tendrán una o más mutaciones que son deleciones, inserciones, o sustituciones de residuos de nucleótido. Los mutantes pueden ser naturales (es decir, aislados a partir de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, mediante la realización de mutagénesis dirigida a sitio en el ADN). Por tanto, resulta evidente que los polinucleótidos de la invención pueden ser naturales o recombinantes (es decir, preparados usando técnicas de ADN recombinante).

Una variante alélica será una variante natural dentro de un organismo individual.

Las secuencias de nucleótidos son homólogas si están relacionadas por divergencia a partir de un ancestro común.

25 En consecuencia, un homólogo de especie del polinucleótido será el polinucleótido equivalente natural en otra especie. Dentro de cualquier especie un homólogo puede existir como numerosas variantes alélicas, y éstas se considerarán homólogos del polinucleótido. Se pueden obtener variantes alélicas y homólogos de especies mediante las siguientes técnicas comunes conocidas por los expertos en la técnica.

Producción de anticuerpos

Un experto en la técnica puede producir anticuerpos, policlonales o monoclonales, que son específicos para un polipéptido de la presente invención usando técnicas comunes tales como, pero sin limitación, las descritas por Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press (1988), y D. Catty (editor),

35 Antibodies: A Practical Approach, IRL Press (1988).

Se pueden usar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales frente a epítopos de una proteína. Para la producción de anticuerpos policlonales, son aceptables una serie de animales huésped para la generación de anticuerpos por inmunización con una o más inyecciones de una preparación de polipéptido, incluidos, pero sin limitación, conejos, ratones, ratas, etc. En función de la especie huésped, se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica en el animal huésped, incluidos, pero sin limitación, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa de California, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG

45 (bacilo de Calmette-Guérin) y Corynebacterium parvum.

Se puede preparar un anticuerpo monoclonal frente a un epítopo de una proteína usando cualquier técnica que permita la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975, Nature 256, 493-497) y las más recientes técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kesber et al. 1983, Immunology Today 4:72) y técnica de hibridoma de VEB (Cole et al. 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. págs. 77-96). Adicionalmente, se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" mediante corte y empalme de los genes de la molécula de anticuerpo de especificidad de antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada (Morrison et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.,

55 81:6851-6855; Neuberger et al. 1984 Nature 312:604-608; Takeda et al. 1985 Nature 31: 452-454). De forma alternativa, se pueden adaptar técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (en la patente de EE. UU. 4.946.778) para producir anticuerpos monocatenarios con 4 especificidades.

Las versiones humanas o humanizadas recombinantes de anticuerpos monoclonales son un modo de realización preferente para aplicaciones terapéuticas humanas. Se puede preparar anticuerpos humanizados de acuerdo con procedimientos de la literatura (p. ej., Jones et al. 1986, Nature 321:522-25; Reichman et al. 1988 Nature 332:32327; Verhoeyen et al. 1988, Science 239:1534-36). También se puede emplear en la producción de anticuerpos humanizados la estrategia de "mutagénesis por conversión génica" recientemente descrita para la producción de anticuerpos monoclonales humanizados (Carter et al. 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4285-89). De forma

65 alternativa, se pueden usar técnicas para generar la colección de fase recombinante de combinaciones aleatorias de regiones pesadas y ligeras para preparar anticuerpos recombinantes (p. ej., Huse et al. 1989 Science 246:1275-81).

Se pueden generar fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula tal como Fu F(ab1) y F(ab2) mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero sin limitación: el fragmento F(ab) E2 que se puede producir por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo intacta; los fragmentos Fab’ que se

5 pueden generar mediante la reducción de los puentes disulfuro del fragmento F(ab’)2, y los dos fragmentos Fab que se pueden generar tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor. De forma alternativa, se pueden construir colecciones de expresión de Fab (Huse et al. 1989, Science 246:1275-1281) para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada por una proteína.

Adyuvantes

"Adyuvante" significa una composición que comprende una o más sustancias que potencian la inmunogenicidad y eficacia de una composición de vacuna. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes adecuados incluyen escualano y escualeno (u otros aceites de origen animal); copolímeros de bloque; detergentes tales como Tween®-80; Quil® A,

15 aceites minerales tales como Drakeol o Marcol, aceites vegetables tales como aceite de cacahuete; adyuvantes derivados de corinebacterias tales como Corynebacterium parvum; adyuvantes derivados de propionibacterias tales como Propionibacterium acne; Mycobacterium bovis (bacilo de Calmette y Guérin o BCG); interleucinas tales como interleucina 2 e interleucina-12; monocinas tales como interleucina 1; factor de necrosis tumoral; interferones tales como interferón gamma; combinaciones tales como saponina-hidróxido de aluminio o Quil A hidróxido de aluminio; liposomas; adyuvante ISCOM; extracto de pared celular micobacteriana; glucopéptidos sintéticos tales como dipéptidos muramilo u otros derivados; Avridine; lípido A; sulfato de dextrano; DEAE-dextrano o DHAE-dextrano con fosfato de aluminio; carboxipolimetileno tal como Carbopol’ EMA; emulsiones de copolímero acrílico tales como Neocryl A640 (p. ej., en la patente de EE. UU. N. º 5.047.238); proteínas de virus de la vaccinia o poxvirus animales; adyuvantes de partículas subvíricas tales como toxina del cólera, o mezclas de los mismos.

25 Tal como se usa en el presente documento, son condiciones rigurosas aquellas que (1) emplean fuerza iónica baja y temperatura alta para el lavado, por ejemplo, NaCl 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/ NaDodSO4 al 0,1 % a 50 °C;

(2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50 % (vol/vol) con seroalbúmina bovina al 0,1 %, Ficoll al 0,1 %, povidona al 0,1 %, tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplean formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1 %, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 μg/ml), SDS al 0,1 % y sulfato de dextrano al 10 % a 42 °C en 0,2 x SSC y SDS al 0,1 %.

35 Como se entenderá, la presente invención incluye dentro de su alcance la vacunación con ADN. Se puede encontrar información adicional referente a la vacunación con ADN en Donnelly et al, Journal of Immunological Methods 176(1994) 145-152.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, se entenderá que la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un elemento indicado o un número entero o grupo de elementos o números enteros, pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero, o grupo de elementos

o números enteros.

Preparación de la colección de P. gingivalis para su secuenciación

45 Para determinar la secuencia de ADN de P. gingivalis se aisló ADN genómico de la cepa W50 de P. gingivalis (ATCC 53978) esencialmente por el método descrito por Mamur J. (J. Mol. Biol. 3, 208-218, 1961). La clonación de fragmentos de ADN se realizó esencialmente como describen Fleischmann et al. (Science; 269, 496-512, 1995) (2). Brevemente, se nebulizó ADN genómico de P. gingivalis purificado para fragmentar el ADN y se trató con nucleasa Bal31 para crear extremos romos; después se pasó dos veces por geles de agarosa al 1 % preparativos. Se extrajeron del gel fragmentos de ADN de 1,6-2,0 kb y se recuperó el ADN. A continuación, se ligó este ADN al vector pUC18 (digerido con SmaI y desfosforilado; Pharmacia) y se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa al 1 % preparativo. Se escindió el fragmento que comprendía el vector lineal más un inserto, se purificó y se repitió este método para eliminar cualquier contaminación con vector sin inserto. Se crearon extremos romos en el vector

55 con inserto de ADN recuperado con polimerasa de ADN T4, después se realizó una ligadura final para producir ADN circular. Se transformaron alícuotas de células competentes para electroporación Epicurian Coli (Stratagene) con el ADN ligado y se plaquearon en placas de agar SOB con difusión de antibiótico que contenían X-gal y se incubaron a 37 °C durante la noche. Las colonias con insertos aparecieron blancas y aquellas sin insertos (vector solo) aparecieron azules. Se almacenaron las placas 4 °C hasta que se recogieron los clones blancos y se expandieron para la extracción del ADN plasmídico para su secuenciación.

Secuenciación de ADN

Se preparó ADN plasmídico mediante la recogida de colonias bacterianas en 1,5 ml de caldo de cultivo LB, TB o

65 SOB complementado con 50-100 ug/ml de ampicilina en placas de 96 pocillos profundos. Se aisló el ADN plasmídico usando los kits de miniprep QIAprep Spin o QIAprep 96 Turbo (QIAGEN GmbH, Alemania). Se eluyó el ADN en una matriz cuadriculada de 96 pocillos -20 C.

Se realizaron reacciones de secuenciación usando kits de reacción preparados para secuenciación cíclica ABI PRISM Dye Terminator y ABI PRISM BIGDye Terminator con polimerasa de ADN FS AmpliTaq (PE Applied

5 Biosystems, Foster City, CA) usando los cebadores de secuenciación directos e inversos universales M13. Las reacciones de secuencia se llevaron a cabo en termocicladores GeneAmp 9700 de Perkin-Elmer (PE Applied Biosystems) o PCR Express de Hybaid (Hybaid, Reino Unido). Las reacciones de secuenciación se analizaron en secuenciadores de ADN ABI PRISM 377 (PE Applied Biosystems).

10 A continuación se establecen varias de las secuencias obtenidas. La relación entre estas secuencias se establece en la tabla 1. Cabe destacar que la presente invención se refiere a PG97. El codón de inicio se calculó usando una combinación de alineación de homología de secuencia (FASTA), predicción de la secuencia señal (PSORT, SignalP)

o predicción del ORF (GeneMark).

15 Tabla 1: Tabla de referencia que indica las relaciones de cada ID de secuencia con las proteínas seleccionadas.

Nombre de la proteína

Secuencia de ADN del ORF completo Secuencia de aminoácidos del ORF completo Secuencia de ADN de la proteína Secuencia de aminoácidos de la proteína

PG1

1 265 122 386

PG3

45 309 170 434

PG30

46 310 171 435

PG75

95 359 229 493

PG96

118 382 261 525

PG97

119 383 262 526

Análisis de secuencia de ADN

Se convirtieron archivos de ADN en formato FASTA en archivos de formato GCG y se importaron a una base de

20 datos. Se tradujeron los archivos de ADN a archivos de aminoácidos usando el programa Flip obtenido del ANGIS (Australian Genomic Information Service, University of Sydney, Australia). Se realizaron una serie de análisis bioinformáticos en las proteínas con el fin de seleccionar posibles candidatos de vacuna. Los programas usados fueron búsqueda de homología FASTA (1), PSORT (2,3), SignalP (4), TopPred (5) y GeneMark (6). Se almacenaron las proteínas y sus resultados bioinformáticos en la base de datos creada para ello para buscar y recuperar

25 proteínas con las características deseadas.

Después, se examinaron los resultados de homología FASTA para estas proteínas para cualquier alineación con una proteína que indicara ubicación de superficie o eficacia de vacuna. Se realizó una búsqueda de homología de todas las proteínas frente a una base de datos de proteínas bacterianas no redundante recopilada por el ANGIS usando el

30 algoritmo FASTA. La configuración usada para las búsquedas FASTA fue Ktup = 2, penalización creación de hueco = -12, penalización por extensión de hueco = -2, anchura para derivar la alineación en opt = 16 y la matriz de puntuación Blosum 50. Se examinaron los resultados de búsqueda FASTA individuales para determinar la homología significativa por probabilidad estadística y alineaciones de aminoácidos. Los resultados se establecen en la tabla 2.

35 Después, se recortaron los archivos de proteínas en el primer, segundo, tercero, cuarto y quinto residuo de metionina usando un programa de recorte de proteínas (ANGIS). Después, se sometieron las proteínas recortadas a análisis con PSORT para la detección de secuencias señal y la predicción de la ubicación celular. Las proteínas que mostraron una probabilidad PSORT de membrana externa >0,8 se consideraron indicativas de ubicación de

40 superficie. También se realizó una segunda detección de secuencias señal con el programa SignalP y, en determinados casos, este programa detectó señales no identificadas con PSORT. Todas las proteínas identificadas por otros métodos también se analizan con PSORT y SignalP. Anteriormente, se ha mostrado que el aminoácido Cterminal de las proteínas de membrana externa bacteriana es importante para el ensamblado de la proteína en la membrana externa (7). Se ha determinado una definición de estructura típica para proteínas de membrana externa

45 como la presencia de una secuencia señal en el extremo N-terminal y una tirosina o fenilalanina en el extremo Cterminal. Varias de las proteínas seleccionadas presentan esta estructura característica. Se usó el programa TopPred para determinar la presencia y número de dominios transmembranarios (MSD) y la presencia de tales secuencias indica una preferencia de unión a membranas tales como la membrana externa. Los resultados de los análisis con PSORT, SignalP y TopPred con los aminoácidos C-terminales de las proteínas seleccionados se

50 establecen en la tabla 3.

Los 70 aminoácidos del extremo C-terminal de una serie de proteínas de membrana externa de P. gingivalis comparten el 50-100 % de identidad de secuencia de proteína. Estas proteínas incluyen RGP1, RGP2, KGP, HagA, HagC, HagD, prtH y prtT. Este motivo conservado puede estar implicado en la unión o selección de proteínas a la membrana externa. Los datos de proteínas se buscaron usando homología FASTA como se describe anteriormente y los resultados para PG96 y PG97 se recogen en la tabla 4.

Tabla 2: Resultados de homología de proteínas FASTA de ORF completos frente a una base de datos de proteínas no redundante.

Nombre de la proteína

Descripción de la homología Número de acceso de Genbank Longitud de homólgo Longitud de proteína de P. gingivalis Resultados de homología FASTA

% de identidad

Solapamiento Valor de E

PG1

Proteína de membrana externa de 48 kD, Actinobacillus pleuropneumoniae U24492 449 aa 451 aa 32 454 aa 1,40E-42

PG3

Adhesina F de porina de membrana externa, Pseudomonas fluorescens U19743 317 aa 223 aa 35 187 aa 1,10E-10

PG30

Supuesta lipoproteína NlpD, Aquifex aeolicus AE000754 187 aa 337 aa 42 142 aa 1,80E-12

PG75

Porina de membrana externa de clase 3 (porB), Neisseria meningitidis U07191 332 aa 391 aa 23 239 aa 4,60E-01

Tabla 3: Resultados de los análisis de las proteínas por PSORT, SignalP y TopPred. La columna de señal presente indica la presencia de una secuencia señal detectada con PSORT o SignalP. Los términos entre paréntesis indican

10 el tipo de secuencia señal determinada por PSORT. Los valores de ubicación celular y probabilidad se generan mediante PSORT y representan la probabilidad de que la proteína esté en los compartimentos celulares de la membrana externa (ME), la membrana interna (MI), el espacio periplásmico (EP) o el citoplasma (C). El número de dominios transmembranarios (DTM) se determinó por TopPred y no incluye secuencias señal no escindibles.

Nombre de la proteína

Número de SEQ ID de la proteína Longitud de la proteína Señal presente Metionina en el ORF Sitio de escisión de SignaIP Sitio de escisión de PSORT Ubicación celular y probabilidad Aminoacido de Cterminal Número de DTM

ME MI EP C

PG1

386 451 aa Y 1 24 34 0 0 0 0,22 N 0

PG3

434 223 aa Y (lipoproteína) 1 - 18 0,79 0,76 0 0 K 3

PG30

435 337 aa Y 1 21 21 0,24 0 0,4 0 K 0

PG75

493 391 aa Y 1 26 26 0,94 0 0,3 0 H 1

PG96

525 563 aa Y 1 23 23 0,40 0 0,33 0 K 0

PG97

526 437 aa Y 1 23 23 0,32 0 0,65 0 Q 0

15 Tabla 4: Porcentaje de identidad y porcentaje de similitud de diversas proteínas con los 70 aminoácidos del extremo C-terminal de la arginina proteasa 1 (RGP1), la arginina proteasa 2 (RGP2) y la cisteín proteasa/hemaglutinina (prtT) de P. gingivalis.

Nombre de la proteína

Porcentaje de identidad Porcentaje de similitud

RGP1

RGP2 prtT RGP1 RGP2 prtT

PG96

0 13 20 0 24 43

PG97

10 26 33 14 47 61

Clonación, expresión y purificación de genes recombinantes de P. gingivalis PG1 Se usaron oligonucleótidos para las regiones 5’ y 3’ de la proteína deducida para amplificar el gen de interés a partir

de una preparación del ADN genómico de P. gingivalis W50 usando el sistema de PCR de precisión TaqPlus

(Stratagene) y un termociclador PTC-100 (MJ Research) o un dispositivo similar. La secuencia del cebador oligonucleotídico 5’ era GCGCCATATGCTGGCCGAACCGGCC, la secuencia del cebador oligonucleotídico 3’ era GCGCCTCGAGTCAATTCATTTCCTTATAGAG. Se purifició el fragmento de PCR, se digirió con enzimas de restricción Nde I, Xho I (Promega) y se ligó en los sitios correspondientes del plásmido pProEx-1 (Gibco-BRL) y se 5 transformó en células ER1793 de E. coli (un regalo de Elizabeth Raleigh, New England Biolabs). Se seleccionó un clon resultante que expresaba el inserto correcto y se indujo con o sin IPTG 0,1 mM (Promega) para la expresión de la proteína recombinante. Se determinó la expresión de la proteína recombinante mediante análisis de SDS-PAGE y transferencia de bandas western usando uno de los antisueros de conejo descritos anteriormente o un anticuerpo anti-hexahistidina (Clontech) que detecta la marca de hexahistidina que se fusionó con la proteína recombinante de

P. gingivalis. Se purificó PG1 mediante rotura de las células de E. coli por sonicación en tampón de unión (Novagen) y solubilización por adición de sarcosil (N-lauroíl sarcosina) hasta una concentración final del 1 %. A continuación, se diluyó la preparación al 0,1 % de sarcosil en tampón de unión, se unió a una columna de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA; Qiagen), después del lavado se eluyeron las proteínas unidas con imidazol 1 M en tampón de elución (Novagen) de acuerdo con las recomendaciones de Qiagen con sarcosil al 0,1 % añadido a todos los tampones.

15 Después de la purificación, se dializaron las muestras frente a NaCl 500 mM, Tris 20 mM, sarcosil al 0,1 % a pH 7,4 para eliminar el imidazol, se concentraron según fuera necesario y se almacenaron a 4 °C hasta su utilización. Se evaluaron la pureza y antigenicidad por SDS-PAGE y transferencia de bandas western usando antisueros seleccionados (de entre los descritos anteriormente) y se determinó la concentración de proteína mediante el ensayo BCA (Pierce).

PG3

Los métodos usados para PG3 fueron esencialmente los mismos que para PG1 con las siguientes excepciones. La secuencia del cebador oligonucleotídico 5’ era GCGCGTATACATGAAGAAATCAAGTGTAG, la secuencia del 25 cebador oligonucleotídico 3’ era GCGCAGATCTCTTCAGCGTACCTTGCTGTG y el ADN se amplificó con polimerasa de ADN Pfu (Stratagene). El producto de PCR se clonó directamente en pCR-Blunt y se transformó en Top10F’ de E. coli (InVitrogen) antes de subclonarlo en el plásmido de expresión pGex-stop RBS(IV) usando los sitios de restricción Bst Z171 y Bgl II y se transformó en BL21DE3 de E. coli (Pharmacia Biotech). Se realizaron las siguientes modificaciones en la purificación de PG3 a partir del método para PG1. Las células que expresaban la proteína recombinante se rompieron por sonicación en tampón de unión y se concentraron por centrifugación los cuerpos de inclusión insolubles. Después, se solubilizaron los cuerpos de inclusión en urea 6 M (Sigma) en tampón de unión y se eluyeron con urea 6 M añadido al tampón de elución. En algunos casos se usó clorhidrato de guanidina 6 M (Sigma) en lugar de urea para estas etapas. Se eliminó la urea (o el clorhidrato de guanidina cuando se sustituyó) de la proteína purificada mediante diálisis secuencial frente a concentraciones decrecientes de urea

35 (urea 3 M, después 1,5 M, después 0,5 M, después 0 M, todas en Tris 50 mM, NaCl 500 mM, glicerol al 8 %, pH 7,4). La proteína purificada se almacenó congelada a -80 °C hasta que se necesitara. Se determinó la concentración de proteína mediante ensayo de proteínas Coomassie Plus (Pierce).

PG30

Los métodos usado para PG30 fueron esencialmente los mismos que para PG3 con las siguientes excepciones. Se eliminó la secuencia señal N-terminal predicha de la proteína recombinante. La secuencia del cebador oligonucleotídico 5’ era TACGGAATTCGTGACCCCCGTCAGAAATGTGCGC, la secuencia del cebador oligonucleotídico 3’ era CTATGCGGCCGCTTTGATCCTCAAGGCTTTGCCCGG y se amplificó el ADN con el kit de

45 PCR Tth XL. El producto de PCR se clonó en el plásmido de expresión pET24a usando los sitios de restricción Eco RI y Not I y se transformó en BL21DE3 de E. coli. Se llevaron a cabo estudios de expresión e inmunorreactividad en lisados de E. coli completos de PG30. Se hicieron proliferar cultivos de 10 ml de E. coli recombinante hasta una DO de 2,0 (A600 nm) en caldo de cultivo Terrific y se indujeron las células con IPTG 0,5 mM y se tomaron muestras para análisis 4 horas después de la inducción. No se realizó purificación para estos estudios.

PG75

Los métodos usados para PG75 fueron esencialmente los mismos que para PG30 con las siguientes excepciones. Se eliminó la secuencia señal N-terminal predicha de la proteína recombinante. La secuencia del cebador

55 oligonucleotídico 5’ era GGCGGGATCCGCTCAGGAGCAACTGAATGTGGTA, la secuencia del cebador oligonucleotídico 3’ era GAGTGCGGCCGCTGTGGAACAAATTGCGCAATCCATC y se amplificó el ADN con el kit de PCR Tth XL. El producto PCR se clonó en el plásmido de expresión pET24a usando los sitios de restricción Bam HI y Not I y se transformó en BL21DE3 de E. coli. Se llevaron a cabo estudios de expresión e inmunorreactividad en lisados de E. coli completos. No se realizó purificación para estos estudios.

PG96

Los métodos usados para PG96 fueron esencialmente los mismos que para PG30 con las siguientes excepciones. Se eliminó la secuencia señal N-terminal predicha de la proteína recombinante. La secuencia del cebador 65 oligonucleotídico 5’ era TGCTGAGCTCCAAACGCAAATGCAAGCAGACCGA, la secuencia del cebador oligonucleotídico 3’ era GAGTGCGGCCGCTTTTGAGAATTTTCATTGTCTCACG y se amplificó el ADN con el kit de

PCR Tth XL. El producto PCR se clonó en el plásmido de expresión pET24a usando los sitios de restricción Sac I y Not I y se transformó en BL21DE3 de E. coli. Se llevaron a cabo estudios de expresión e inmunorreactividad en lisados de E. coli completos. No se realizó purificación para estos estudios.

5 PG97

Los métodos usados para PG97 fueron esencialmente los mismos que para PG30 con las siguientes excepciones. Se eliminó la secuencia señal N-terminal predicha de la proteína recombinante. La secuencia del oligonucleotídico 5’ era GGCGGGATCCCAGTTTGTTCCGGCTCCCACCACA, la secuencia del cebador oligonucleotídico 3’ era GAGTGCGGCCGCTCTGTTTGATGAGCTTAGTGGTATA y se amplificó el ADN con el kit de PCR Tth XL. El producto PCR se clonó en el plásmido de expresión pET24a usando los sitios de restricción Bam HI y Not I y se transformó en BL21DE3 de E. coli. Se llevaron a cabo estudios de expresión e inmunorreactividad en lisados de E. coli completos. No se realizó purificación para estos estudios.

15 Antisueros animales y sueros de pacientes humanos

Se obtuvieron diversos antisueros para detectar la expresión y el replegamiento de las proteínas de P. gingivalis recombinantes. Se obtuvo un antisuero de células completas inyectando en conejos blanco de Nueva Zelanda 3 dosis de P. gingivalis (cepa W50) sonicadas que contenían aproximadamente 2 mg de proteína. La primera dosis se dio en adyuvante completo de Freund (ACF) y la segunda y tercera dosis se dieron en adyuvante incompleto de Freund (AIF) en intervalos de 3 semanas. Las dosis (1 ml) se administraron por vía intramuscular en las patas traseras y se sangró a los conejos 7 días después de la última dosis, se coaguló la sangre y se eliminó el suero y se almacenó a -20 °C hasta que se necesitara. Se produjo un segundo antisuero de conejo de forma similar pero usando como inmunógeno una fracción insoluble en sarcosil (cada dosis era de 0,69 mg de proteína) obtenida de P.

25 gingivalis W50 de acuerdo con el método de Doidg y Trust T. et al., 1994. Se produjo un tercer antisuero de conejo de forma similar al primero, excepto porque se usó como inmunógeno la fracción soluble en sarcosil (1 mg de proteína por dosis) obtenida de células W50 de P. gingivalis de acuerdo con el método de Doidg P. y Trust TJ. (1994 Infect Immun 62:4526-33).

En estos estudios también se usó una reserva de "suero de rata protegido" y se obtuvo de ratas inmunizadas con células de P. gingivalis completas inactivadas con formalina en FIA (cepa ATCC 33277; 2 dosis de 2x109 células, separadas 3 semanas). 2 semanas después de la última dosis, se expuso a las ratas a células de P. gingivalis (cepa 33277) vivas administradas por vía oral como se describe anteriormente (Klaussen B. et al. 1991, Oral Microbiol Immunol 6:193-201) y, en el momento de sacrificarlas, al suero obtenido de estas ratas 6 semanas después de la

35 inoculación de exposición final.

Se obtuvieron sueros humanos de pacientes adultos sometidos a tratamiento o exploración para periodontitis en una policlínica. Estos pacientes tenían al menos 6 dientes con pérdida de adhesión de 6 mm y tenían P. gingivalis presente en la placa subgingival, detectada usando una sonda de ADN específica para P. gingivalis. Se agruparon los sueros de estos pacientes y se compararon con una reserva de sueros de pacientes periodontalmente sanos.

Protocolos de inmunización y de modelo de lesión murino

Se usó el modelo de absceso de ratón mouse para evaluar la eficacia inmunizar ratones con proteínas

45 recombinantes de P. gingivalis para proteger a los ratones de la formación de un absceso subcutáneo. Este modelo ya se ha usado como predictor de posibles vacunas contra enfermedades periodontales (Bird PS, et al. 1995 J. Periodontol. 66:351-362). Se inmunizaron ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad mediante inyección por vía subcutánea en el día 0 de 0,1 ml que contenían 10 o 20 μg de proteína recombinante de P. gingivalis, 20 μg de proteína de lisado de E. coli, 2 x 109 células inactivadas con formalina de la cepa 33277 de P. gingivalis emulsionadas en adyuvante incompleto de Freund (AIF; Sigma). En el día 21, se volvió a inyectar a los ratones la misma dosis y después se sangraron 1 semana más tarde y se evaluaron los niveles de anticuerpos. En el día 35, se expuso a todos los ratones a aproximadamente 2 x 109 células de P. gingivalis (ATCC 33277) vivas mediante inyección subcutánea en el abdomen. Después de la exposición se realizó un seguimiento de la pérdida de peso de los ratones y se midió el tamaño de la lesión durante los 10 días siguientes. Los tamaños de la lesión se midieron en

55 longitud y anchura y se expresaron en mm2. Se realizó el análisis estadístico de los grupos usando un ANOVA de una vía Kruskal-Wallis y también se estudiaron individualmente usando la prueba de la t no pareada o la prueba de la suma de los rangos o de Mann-Whitney usando el paquete estadístico Instat.

La figura 1 muestra los resultados de un experimento en el día 4 después de la exposición (las lesiones tenían el tamaño máximo en este punto temporal). Los ratones de control inmunizados con lisado de E. coli mostraban lesiones grandes, mientras que los ratones inmunizados con células inactivadas de la cepa 33277 de P. gingivalis estaban totalmente protegidos. Esto indica que las células completas proporcionan protección frente a P. gingivalis, mientras que los ratones inmunizados con proteína de E. coli no estaban protegidos. Los ratones a los que se les administraron las diversas proteínas recombinantes de PG mostraron niveles significativos de protección para PG2,

65 PG22, PG24 y PG29 (p<0,05 prueba de la t no pareada) mientras que PG8A no fue significativamente diferente (p=0,07) en comparación con el grupo de control de E. coli.

La figura 2 muestra los resultados de un experimento independiente que emplea combinaciones de proteínas recombinantes. Los ratones a los que se les administró PG1 + PG2 mostraron un nivel significativo de protección en comparación con los ratones de control a los que se les administró lisado de E. coli (p<0,026 prueba de la t no

5 pareada).

Inmunodetección

Se cultivaron candidatos clonados en 15 ml de caldo de cultivo Terrific, se indujeron con IPTG y se tomaron

10 muestras 4 h después de la inducción. Se retiró un ml de cultivo, se sedimentó y se resuspendieron las células en un volumen de PBS determinado dividiendo la DO A600nm del cultivo entre 8. Se añadió una alícuota de lisado (100 μl) a 100 μl de 2x tampón de muestra reductor (Tris 125 mM a pH 6,8, glicerol al 20 %, SDS al 4 %, DTT 80 mM, azul de bromofenol al 0,03 %) y se llevó a ebullición durante 10 min. Se realizó una SDS-PAGE de acuerdo con el método de Laemmli UK. 1970 (Nature 227:680-685) usando geles de Tris-Glicina al 4-20 % de 1,0 mm (Novex) de acuerdo

15 con las recomendaciones de los fabricantes. Se transfirieron las proteínas a membranas de nitrocelulosa Hybond-C Extra (Amersham) por transferencia de bandas y después se bloquearon las membranas 2 h a temperatura ambiente (TA) en leche desnatada al 5 % en Tris 20 mM, NaCl 0,5 M, Tween-20 al 0,05 %, a pH 7,5 (TTBS).

Las inmunodetección se realizó por separado con el suero de conejo anti-células completas de P. gingivalis, el suero

20 protector de rata, una reserva de suero de pacientes periodontales humanos y, en muchos casos, un conjugado de anticuerpo anti-marca T7 y HRP (Novagen). Antes de su uso, se diluyeron los sueros de conejo, rata y humano 1/5000, 1/1000 y 1/500 respectivamente en leche desnatada al 5 % en TTBS y se absorbieron con 100 μl (para el suero de conejo) o 250 μl (para el suero de rata y humano) de extracto de E. coli (20 mg/ml; Promega) durante 6 h a TA.

25 Se incuban durante la noche membranas a TA con el antisuero absorbido, o durante 1 hr a YA con 1/5000 de conjugado anti-T7-Tag diluido. Luego de lavados de 3x10 min con TTBS, anticuerpo anti-conejo (Silenus), anti-ratón (Silenus) o anti-humano (KPL) conjugado con HRP, se diluye 1/5000 en 5 % de leche descremada en TTBS, se agrega durante 1h a TA. Las membranas se lavan como anteriormente, antes de la adición del sustrato de

30 peroxidasa de membrana TMB (KPL) para la detección de las proteínas inmunoreactivas. Los resultados de reactividad de las proteínas P. gingivalis recombinantes se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5: Resultados de inmunotransferencia de proteínas expresadas en E.coli contra antisueros de conejo, rata y humano. El PM deducido se calculó a partir de la secuencia de aminoácidos de las proteínas de P. gingivalis, de

35 algunas de las cuales se había eliminado la secuencia señal N-terminal. El PM aparente se determinó a partir de geles de SDS-PAGE. Las marcas N- y C-terminales añadían aproximadamente 2,5 KDa al PM deducido de las proteínas recombinantes. Los símbolos son + positivo, - negativo, +/- positivo débil, NR no realizado.

Número de la proteína

PM deducido (KDa) PM aparente (KDa) Reactividad de los antisueros

T7

Conejo Rata Humano

PG1

47,5 63 NR - - -

PG3

22,6 18,3 NR -a - -

PG30

35,1 46,9 + - - -

PG75

40,7 46,7 + - - -

PG96

59,3 70,3 + + + +

PG97

44,4 57,5 + - + +

a. Reacción positiva detectada con el antisuero de conejo frente al antígeno de P. gingivalis insoluble en sarcosil. 40 Referencias

1. Lipman DJ, Pearson WR. 1985. Rapid and sensitive protein similarity searches. Science 277:1435-1441.

2. Horton, P. y Nakai, K. (1996). A probabilistic classification system for predicting the cellular localization sites of 45 proteins. Intellig. Syst. Mol. Biol. 4: 109-115.

3. Nakai K, Kanehisa M. 1991. Expert systems for predicting protein localization sites in Gram-negative bacteria. Proteins: Structure, Function, and Genetics 11:95-110.

50 4. Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S y von Heijne G. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10, 1-6.

5.

Claros MG y G von Heijne. (1994). TopPred II: an improved software for membrane protein structure predictions.

Comput. Appl. Biosci. 10: 685-686.

6.

Borodovsky M, Rudd KE y EV Koonin. (1994). Intrinsic and extrinsic approaches for detecting genes in a bacterial

genome. Nucleic Acids Res. 22: 4756-4767. 5

7.

Struvye M, Moons M, Tommassen J. 1991. Carboxy-terminal phenylalanine is essential for the correct assembly of a bacterial outer membrane protein J. Mol. Biol. 218:141-148.

8.

Aduse-Opoku J, Slaney JM, Rangarajan M, Muir J, Young KA, Curtis MA. 1997. The TIa receptor protein of Porphyromonas gingivalis W50: a homolog of the RI precursor (PrpRI) is an outer membrane receptor required for growth on low levels of hemin. J. Bacteriol. 179:4778-4788.

9.

Needleman SB, Munsch CD. 1970. A general method applicable to the search of similarity in the amino acid

sequence of two proteins. J. Molec. Biol. 48: 443-453. 15

Listado de secuencias

Solicitante: CSL Limited Inventores: ROSS, Bruce, Carter BARR, Ian, George PATTERSON, Michelle, Anne

25 ROTHEL, Linda, Joy MARGETTES, Mai, Brigid HOCKING, Dianna, Margaret WEBB, Elizabeth, Ann Título: POLIPÉPTIDOS Y POLINUCLEÓTIDOS DE PORPHYROMONAS GINGIVALIS 35

N. º de Solicitud: EP 06008722.8 Fecha de presentación: Ref. del agente: P30594EP1/NJL Divisional de: EP 98960880.7

45 Datos de prioridad AU PP 0839 AU PP 1182 AU PP 1546 55 AU PP 2264 AU PP 2911 65 AU PP 3128

AU PP 3338

AU PP 3654

10 AU PP 4917

AU PP 4963

20 AY PP 5028

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1

(i)CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1362 pares de bases 30 (B) TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: circular

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO 40 (iv) NO CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc 50 (B) UBICACIÓN 1...1362

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 690 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: circular 15 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) NO CODIFICANTE: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS 25 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...690

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45

35 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46

(1)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1026 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: circular 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

NO CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS 20 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...1026

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46

30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 95

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1218 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble 40 (D) TOPOLOGÍA: circular

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) NO CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 50 (A) MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...1218

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 95

45 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 118

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1689 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble 20 (D) TOPOLOGÍA: circular

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) NO CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 30 (A) MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...1689

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 118

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 119 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1311 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: circular 15 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) NO CODIFICANTE: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS 25 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...1311

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 119

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 122

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1353 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico 10 (C) CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: circular

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

NO CODIFICANTE: NO 20 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...1353 30 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 122

(iv)

NO CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTERÍSTICA: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...669

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 170

35

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 170 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 669 pares de bases

40

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) CADENA: doble

45

(D) TOPOLOGÍA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 171

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1011 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble 30 (D) TOPOLOGÍA: circular

(11) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) NO CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 40 (A) MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...1311

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 171

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 229 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1173 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: circular 15 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) NO CODIFICANTE: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(A) MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS 25 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...1173

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 229

35 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 261

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1668 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble

(D)

TOPOLOGÍA: circular 10 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

NO CODIFICANTE: NO

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS 20 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...1668

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 261

30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 262

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 1284 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

CADENA: doble 40 (D) TOPOLOGÍA: circular

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

NO CODIFICANTE: NO 5 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: PORPHYROMONAS GINGIVALIS

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...1284 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 662

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 265

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 454 aminoácidos 25 (B) TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SÍ

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 35 (A) MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...454

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 265

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 309

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 230 aminoácidos 10 (B) TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SÍ 5 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...230 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 309

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 310

(1)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 25 (A) LONGITUD: 342 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SÍ 35 (vi) FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...342

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 310

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 359

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 406 aminoácidos 15 (B) TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SÍ

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 25 (A) MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...406

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 359

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 382 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 563 aminoácidos

(D)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 20 (iii) HIPOTÉTICO: SÍ

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc 10 (B) UBICACIÓN 1...563

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 382

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 383 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 437 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 15 (iii) HIPOTÉTICO: SÍ

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

20 15 5 10

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc 25 (B) UBICACIÓN 1...437

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 383

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 386

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 451 aminoácidos 10 (B) TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICO: SÍ

(vi)

FUENTE ORIGINAL: 20 (A) MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...451

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 386

(iii) HIPOTÉTICO: SÍ

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

(ix)

CARACTERÍSTICA: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...223

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 434

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 435 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 337 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 30 (iii) HIPOTÉTICO: SÍ

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc 40 (B) UBICACIÓN 1...337

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 435

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 493 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 391 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 15 (iii) HIPOTÉTICO: SÍ

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

10

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 434

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

15

(A) LONGITUD: 223 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

20

(D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

35 10

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc 25 (B) UBICACIÓN 1...391

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 493

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 525 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 556 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 15 (iii) HIPOTÉTICO: SÍ

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

(ix)

CARACTERÍSTICA:

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc

(B)

UBICACIÓN 1...556

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 525

(2)

INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 526 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 428 aminoácidos

(B)

TIPO: aminoácido

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína 10 (iii) HIPOTÉTICO: SÍ

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

(A)

MICROORGANISMO: Porphyromonas gingivalis

(ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOMBRE/CLAVE: característica_misc 20 (B) UBICACIÓN 1...428

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 526

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido antigénico de Porphyromonas gingivalis aislado que puede provocar una respuesta inmunitaria contra P. gingivalis, polipéptido que comprende:

   5 una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383; o

   una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % o al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO. 526 o la SEQ ID NO. 383; o

   10 al menos 40 aminoácidos que tengan una secuencia contigua de al menos 40 aminoácidos idéntica a una secuencia contigua de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383.
2. 2. Una molécula de ADN aislada, molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el 15 polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1.
3. 3. Una molécula de ADN aislada como se reivindica en la reivindicación 2 que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 119 o SEQ ID NO. 262.

   20 4. Un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 2 o 3, enlazada de forma funcional a un elemento regulador de la transcripción.

4. 5. Una célula aislada que comprende el vector de expresión recombinante como se reivindica en la reivindicación 4.

   25 6. Un método para producir un polipéptido de P. gingivalis que comprende cultivar la célula como se reivindica en la reivindicación 5 en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.

5. 7. Una composición para su uso en la obtención de una respuesta inmunitaria dirigida contra P. gingivalis en un sujeto, composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de al menos un

   30 polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 y/o al menos una molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 3 o la reivindicación 4.
6. 8. Una composición como se reivindica en la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de infecciones por P.

   gingivalis. 35

7. 9.

   Una composición como se reivindica en la reivindicación 8, en la que el tratamiento es un tratamiento profiláctico.

8. 10.

   Un anticuerpo obtenido contra un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1.

   40 11. Una composición que comprende al menos un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 10.
9. 12. Un método para detectar la presencia de una molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 2 o la reivindicación 3 en una muestra, que comprende:

   45 poner en contacto una muestra con una sonda nucleotídica que comprende al menos 18 nucleótidos y que tiene una secuencia contigua de al menos 18 nucleótidos idéntica a una secuencia contigua de nucleótidos de SEQ ID NO. 37 en condiciones en las que se pueda formar un híbrido entre la sonda y la molécula de ADN como se define en la reivindicación 2 o la reivindicación 3 en la muestra; y

   50 detectar el híbrido formado en la etapa (a), en el que la detección de un híbrido indica la presencia de una molécula de ADN como se define en la reivindicación 2 o la reivindicación 3 en la muestra.
10. 13. Un método como se reivindica en la reivindicación 12, en el que la sonda comprende además una marca detectable.