JP2001526035A - Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓポリペプチドおよびヌクレオチド - Google Patents

Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓポリペプチドおよびヌクレオチド

Info

Publication number
JP2001526035A
JP2001526035A JP2000524441A JP2000524441A JP2001526035A JP 2001526035 A JP2001526035 A JP 2001526035A JP 2000524441 A JP2000524441 A JP 2000524441A JP 2000524441 A JP2000524441 A JP 2000524441A JP 2001526035 A JP2001526035 A JP 2001526035A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
polypeptide
amino acid
oligonucleotide primer
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000524441A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2001526035A5 (ja
Inventor
ロス，ブルース，カーター
バー，イアン，ジョージ
パターソン，ミシェル，アン
エイギアス，キャサリーン，テレセ
ロセル，リンダ，ジョイ
マーゲッツ，メイ，ブリジッド
ホッキング，ダイアナ，マーガレット
ウェッブ，エリザベス，アン
Original Assignee
シーエスエル、リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AUPP0839A external-priority patent/AUPP083997A0/en
Priority claimed from AUPP1182A external-priority patent/AUPP118297A0/en
Priority claimed from AUPP1546A external-priority patent/AUPP154698A0/en
Priority claimed from AUPP2264A external-priority patent/AUPP226498A0/en
Priority claimed from AUPP2911A external-priority patent/AUPP291198A0/en
Priority claimed from AUPP3128A external-priority patent/AUPP312898A0/en
Priority claimed from AUPP3338A external-priority patent/AUPP333898A0/en
Priority claimed from AUPP3654A external-priority patent/AUPP365498A0/en
Priority claimed from AUPP4917A external-priority patent/AUPP491798A0/en
Priority claimed from AUPP4963A external-priority patent/AUPP496398A0/en
Priority claimed from AUPP5028A external-priority patent/AUPP502898A0/en
Application filed by シーエスエル、リミテッド filed Critical シーエスエル、リミテッド
Publication of JP2001526035A publication Critical patent/JP2001526035A/ja
Publication of JP2001526035A5 publication Critical patent/JP2001526035A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Abstract

(57)【要約】 本発明は、単離されたPorphorymonas gingivalisポリペプチドおよびヌクレオチドに関する。前記ポリペプチドは、配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列；または配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも85％、好ましくは少なくとも95％同一であるアミノ酸配列；または配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択される連続アミノ酸配列と同一である少なくとも40個のアミノ酸の連続配列を有する少なくとも40アミノ酸；を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は、Porphorymonas gingivalis(ポルフォリモナス・ギンギバリス)ヌク
レオチド配列、P. gingivalisポリペプチドおよびP. gingivalis検出用のプロー
ブに関する。P. gingivalisポリペプチドおよびヌクレオチドは、P. gingivalis
に対して被験者の免疫応答を生起させて、歯周炎として知られている症状を治療
もしくは予防するための、またはその重症度を低減させるための組成物において
使用することができる。
【０００２】発明の背景 歯周病は、細菌が関係している歯の支持組織の炎症性疾患であり、比較的軽症
の歯肉炎（歯肉組織の非特異的で可逆的な炎症）から比較的進行した症状の歯周
炎（歯の支持構造の破壊を特徴とする）までの範囲にわたっている。歯周炎は、
特定のグラム陰性細菌の共同体が歯肉下に感染して歯周組織を破壊するため、公
衆衛生上重大な問題となっている。特に関心がもたれている細菌の一つにP. gin
givalisがある。この微生物の成人歯周炎病巣部からの回収率は、嫌気的に培養 可能な歯肉下の細菌叢の最大50％に達しうるが、健康な部位からはP. gingivali
sは稀にしか回収されず、回収されたとしても少数である。歯肉下プラーク中のP
. gingivalisのレベルが比例的に増加することは歯周炎の症状の悪化と関連して
おり、また、培養可能な歯肉下微生物集団から該微生物を根絶することは同時に
この疾病の消散と関連している。非ヒト霊長類における歯周炎病変部の進行は、
P. gingivalisの歯肉下植込みにより実証されている。動物とヒトの両方での上 記知見により、成体の歯周炎が発生する際にP. gingivalisが重要な役割を果た していることが示唆される。
【０００３】 P. gingivalisは、黒い色素をもち、嫌気性、非糖分解性、タンパク質分解性 のグラム陰性桿菌であり、特定のアミノ酸の代謝によりエネルギーを得ている。
この微生物は鉄、特にヘムまたはそのFe(III)酸化物ヘミンの形の鉄に対して絶 対的な生育要求性を有し、過剰のヘミンの条件下で生育させると実験動物にとっ
て非常に有毒である。P. gingivalisの病原性にはいくつかの毒性因子が関与し ており、例えば、莢膜、付着素(adhesin)、細胞毒、細胞外加水分解酵素などで ある。
【０００４】 P. gingivalisのコロニー形成を防止、排除または減少させる有効で安全なワ クチンを開発するためには、免疫原として（おそらく特異的抗体の産生を介して
）有用な、毒性に関係のある抗原を同定して生産することが必要である。P. gin
givalisの培養物から抗原を直接単離しようとする試みは、可能ではあるものの 、困難な場合が多い。例えば、上述したように、P. gingivalisは厳格な嫌気性 菌であり、分離および増殖が厄介である。また、一部の微生物では、in vitroで
培養すると、多くの毒性遺伝子がダウンレギュレートされて、コード化されたタ
ンパク質がもはや発現されなくなることが知られている。通常の化学的手法を使
用してワクチン候補を精製する場合には、潜在的に重要な（防御）分子が同定さ
れないことがある。DNA配列決定を用いると、微生物をin vitroで生育させたと きでさえ遺伝子は存在する（しかし、転写されない）ので、その遺伝子を同定し
てクローニングし、組換えDNAタンパク質として産生させることができる。同様 に、防御抗原または治療標的は微生物によってin vitroで一過性に発現されるか
、低レベルで産生され、このことが従来の方法によるこれらの分子の同定を非常
に困難にしている。
【０００５】 治療標的の血清学的同定を用いると、ウエスタンブロッティングやELISAなど の標準方法を使って検出できる応答に制限されてしまう。その際の制限としては
、動物またはヒトにより生じる応答のレベルと、その応答が防御的なのか、有害
なのか、または無関係であるのかを判定すること、の両方がある。潜在的な治療
標的または予防標的を同定する配列決定アプローチを用いる場合には、このよう
な制限がまったく存在しない。
【０００６】 さらに、P. gingivalisが広い活性を示すプロテアーゼ類を産生するというこ とは公知であり（メルボルン大学、国際特許出願PCT/AU96/00673、米国特許第5,
475,097号および第5,523,390号）、こうしたプロテアーゼ類による分解のため無
傷のタンパク質の同定が難しくなっている。
【０００７】発明の概要 本発明者らは、P. gingivalisポリペプチドの組換え生産に使用できるP. ging
ivalisヌクレオチド配列を単離して、P. gingivalisに特異的なヌクレオチドプ ローブを開発しようとした。以下に挙げたDNA配列は、多数のP. gingivalis配列
からワクチン候補としてのそれらの潜在能力に従って選択されたものである。こ
の直観的なステップは、P. gingivalis DNA配列から推定されたタンパク質配列 と既知のタンパク質配列のデータベースとの比較を含んでいた。有用なワクチン
候補の選択に使用された特徴の一部には次のものが含まれる。すなわち、予想さ
れる細胞位置（例えば、外膜タンパク質または分泌タンパク質）、類似タンパク
質の特定の機能活性（例えば、酵素活性またはタンパク質分解活性を有するもの
）、不活性化またはブロックしたとき微生物にとって有害または致死的でありう
る必須の代謝経路に関与するタンパク質、微生物による疾病発生（例えば、赤血
球溶解、細胞凝集または細胞受容体）において何らかの役割を担っていると予想
されるタンパク質、およびワクチンとしての性能が証明されているタンパク質に
類似するタンパク質である。
【０００８】 第１の態様において、本発明は、抗原性のPorphorymonas gingivalisポリペプ
チドからなり、該ポリペプチドは、 配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択される
アミノ酸配列、または 配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択される
アミノ酸配列と少なくとも85％、好ましくは少なくとも95％同一であるアミノ酸
配列、または 配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択される
連続アミノ酸配列と同一である少なくとも40個のアミノ酸の連続配列を有する少
なくとも40アミノ酸、 を含んでなる。
【０００９】 本発明の一実施形態では、前記ポリペプチドは、 配列番号386〜528および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列 、または 配列番号386〜528および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列 と少なくとも85％、好ましくは少なくとも95％同一であるアミノ酸配列、または 配列番号386〜528および配列番号532からなる群より選択される連続アミノ酸 配列と同一である少なくとも40個のアミノ酸の連続配列を有する少なくとも40ア
ミノ酸、 を含んでなる。
【００１０】 本明細書中で用いる場合、ポリペプチドについての同一性％は、標準的なタン
パク質スコアリングマトリックス(Blosum 50)を用いてNeedlemanおよびMunsch(9
)のアライメントアルゴリズムにより計算するものとする。
【００１１】 本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号386、配 列番号424、配列番号425、配列番号434、配列番号447、配列番号458、配列番号4
75、配列番号498、配列番号499、配列番号500、配列番号501、配列番号387、配 列番号400、配列番号411、配列番号419、配列番号420、配列番号427、配列番号4
29、配列番号433、配列番号437、配列番号438、配列番号443、配列番号444、配 列番号448、配列番号449、配列番号452、配列番号455、配列番号457、配列番号4
59、配列番号461、配列番号462、配列番号463、配列番号467、配列番号468、配 列番号469、配列番号482、配列番号484、配列番号485、配列番号494、配列番号5
08、配列番号509、配列番号510、配列番号520、配列番号521、配列番号522、配 列番号525、配列番号526、配列番号528、配列番号389、配列番号390、および配 列番号391からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００１２】 本発明の別の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号303 の残基422〜531、配列番号303の残基534〜582、配列番号301の残基127〜232、配
列番号301の残基240〜259、配列番号295の残基139〜156、配列番号295の残基160
〜178、配列番号295の残基180〜207、配列番号295の残基221〜257、配列番号295
の残基259〜323、配列番号299の残基885〜985、配列番号363の残基147〜259、配
列番号344の残基140〜252、配列番号353の残基247〜356、配列番号353の残基359
〜391、配列番号300の残基120〜254、配列番号286の残基287〜311、配列番号286
の残基313〜352、配列番号286の残基354〜401、配列番号287の残基208〜252、配
列番号287の残基259〜373、配列番号293の残基5〜120、配列番号293の残基123〜
139、配列番号265の残基233〜339、配列番号278の残基67〜228、配列番号274の 残基130〜172、配列番号274の残基174〜238、配列番号274の残基99〜112、配列 番号274の残基114〜128、配列番号285の残基26〜69、配列番号285の残基71〜128
、配列番号285の残基130〜146、配列番号327の残基620〜636、配列番号327の残 基638〜775、配列番号301の残基397〜505、配列番号301の残基528〜545、配列番
号301の残基556〜612、配列番号301の残基614〜631、配列番号301の残基633〜65
0、配列番号299の残基553〜687、配列番号289の残基305〜447、配列番号364の残
基1〜52、配列番号364の残基65〜74、配列番号275の残基486〜604、配列番号272
の残基158〜267、配列番号272の残基270〜282、配列番号273の残基163〜237、配
列番号273の残基240〜251、配列番号282の残基213〜344、配列番号292の残基183
〜324、配列番号292の残基327〜341、配列番号292の残基352〜372、配列番号271
の残基141〜166、配列番号271の残基168〜232、配列番号302の残基1〜13、配列 番号302の残基15〜28、配列番号302の残基30〜72、配列番号277の残基476〜529 、配列番号299の残基41〜146、配列番号299の残基149〜162、配列番号299の残基
166〜177、配列番号299の残基192〜203、配列番号290の残基71〜343、配列番号2
90の残基346〜363、配列番号331の残基36〜240、配列番号331の残基242〜270、 配列番号375の残基1〜192、配列番号375の残基266〜290、配列番号279の残基23 〜216、配列番号279の残基220〜270、配列番号279の残基285〜386、配列番号297
の残基84〜234、配列番号297の残基248〜259、配列番号297の残基261〜269、配 列番号294の残基275〜402、配列番号298の残基1〜171、配列番号307の残基403〜
417、配列番号307の残基420〜453、配列番号307の残基456〜464、配列番号307の
残基468〜690、配列番号304の残基1〜285、配列番号304の残基287〜315、配列番
号304の残基318〜336、配列番号342の残基255〜269、配列番号342の残基271〜33
7、配列番号281の残基347〜467、配列番号375の残基116〜136、配列番号375の残
基138〜357、配列番号364の残基133〜423、配列番号305の残基141〜299、配列番
号296の残基202〜365、配列番号288の残基134〜426、配列番号276の残基1〜218 、配列番号280の残基1〜246、配列番号364の残基444〜608、配列番号283の残基1
0〜686、配列番号296の残基1〜148、配列番号287の残基1〜191、配列番号287の 残基193〜204、配列番号287の残基209〜373、配列番号284の残基211〜470、配列
番号284の残基472〜482、配列番号281の残基133〜144、配列番号281の残基146〜
336、配列番号303の残基1〜264、配列番号303の残基265〜295、配列番号303の残
基297〜326、配列番号303の残基328〜338、配列番号353の残基247〜356、配列番
号353の残基358〜391、配列番号298の残基257〜288、配列番号298の残基290〜38
5、配列番号298の残基245〜256、配列番号303の残基422〜802、配列番号303の残
基803〜814、配列番号295の残基139〜156、配列番号295の残基160〜340、配列番
号282の残基145〜361、配列番号282の残基363〜387、配列番号282の残基398〜47
1、配列番号320の残基573〜679、配列番号291の残基27〜168、配列番号291の残 基170〜183、配列番号291の残基185〜415、配列番号364の残基1〜301、配列番号
337の残基114〜702、配列番号321の残基377〜412、配列番号321の残基413〜772 、配列番号265の残基14〜454、配列番号268の残基129〜614、配列番号300の残基
1〜930、配列番号300の残基932〜1046、配列番号364の残基1〜301、配列番号381
の残基1〜42、配列番号381の残基44〜973、配列番号358の残基1〜93、配列番号3
58の残基95〜179、配列番号358の残基181〜227、配列番号337の残基114〜702、 配列番号355の残基1〜659、配列番号355の残基661〜907、配列番号370の残基1〜
131、配列番号370の残基133〜601、配列番号344の残基1〜813、配列番号321の残
基377〜412、配列番号321の残基413〜772、および配列番号364の残基189〜614か
らなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【００１３】 第２の態様において、本発明は、単離された抗原性のPorphorymonas gingival
isポリペプチドからなり、該ポリペプチドは、表３に示したリーダー配列を欠く
配列番号386〜528および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列を 含んでなる。
【００１４】 第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列またはストリンジェント条件下でそれにハイブリダイズす
る配列を含む、単離されたDNA分子からなる。
【００１５】 単離されたDNA分子は配列番号１〜264、配列番号529および配列番号530からな
る群より選択されるヌクレオチド配列を含むことが好適である。
【００１６】 第４の態様において、本発明は、転写調節配列に機能しうる形で連結された本
発明の第２の態様のDNA分子を含有する組換え発現ベクターからなる。
【００１７】 本発明はまた、前記組換え発現ベクターを含有する細胞も提供する。
【００１８】 更なる態様において、本発明は、前記細胞を、前記ポリペプチドの発現を可能
にする条件下で培養することを含む、P. gingivalisポリペプチドの産生方法か らなる。
【００１９】 更に別の態様において、本発明は、被験者においてP. gingivalisに対する免 疫応答を生じさせるための組成物を提供し、該組成物は、有効量の本発明の第１
の態様のポリペプチド少なくとも１種、または本発明の第２の態様のDNA分子少 なくとも１種、または両方、および製薬上許容される担体を含有する。製薬上許
容される担体はアジュバントであることが好ましい。
【００２０】 他の態様において、本発明は、被験者のP. gingivalis感染を処置する方法を 提供し、該方法は、該被験者に前記組成物を投与することによってP. gingivali
s感染の処置を施すことを含んでなる。こうした処置は予防的または治療的処置 であり得る。
【００２１】 更に別の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のポリペプチドに対し
て誘導された抗体を提供する。この抗体はポリクローナルまたはモノクローナル
であり得る。本発明はこれらの抗体を含む組成物も提供する。かかる組成物は経
口使用に適するものが好ましく、例えば、歯みがき、うがい薬などであってよい
。
【００２２】 更に他の態様において、本発明は、少なくとも18個のヌクレオチドを含み、配
列番号１〜121、配列番号529およびそれらに相補的な配列からなる群より選択さ
れる連続ヌクレオチドと同一である少なくとも18ヌクレオチドの連続配列を有す
るヌクレオチドプローブを提供する。このプローブは検出可能な標識をさらに含
むことが好ましい。
【００２３】 さらに、本発明は、サンプル中のP. gingivalis核酸の存在を検出する方法を 提供し、該方法は、 (a) サンプルとヌクレオチドプローブとを、該プローブと該サンプル中のP. g
ingivalis核酸との間でハイブリッドが形成される条件下で接触させ、 (b) ステップ(a)で形成されたハイブリッドを検出し、その際、ハイブリッド の検出が該サンプル中のP. gingivalis核酸の存在を示す、 ことからなる。
【００２４】詳細な説明 定義 本明細書においては、精製された若しくは単離されたポリペプチドまたは実質
的に純粋なポリペプチド調製品を互換して使用するが、これらは本明細書中では
、天然に随伴するその他のタンパク質、脂質および核酸から分離されたポリペプ
チドを意味する。好ましくは、ポリペプチドはこれを精製するために使用される
物質、例えば抗体またはゲルマトリックス、例えばポリアクリルアミドからも分
離される。好ましくは、ポリペプチドは乾燥重量で少なくとも精製品の10、20、
50、70、80または95％を構成する。好ましくは、調製品はタンパク質配列決定に
十分な量で、少なくとも1、10または100 mgのポリペプチドを含有する。
【００２５】 精製された細胞調製品とは、植物または動物細胞の場合、in vitro細胞調製品
を意味し、完全な植物または動物全部を意味するものではない。培養細胞または
微生物細胞の場合、対象細胞が少なくとも10％、さらに好ましくは50％の調製品
で構成される。
【００２６】 精製された若しくは単離された、または実質的に純粋な核酸、例えば実質的に
純粋なDNA（これらは本明細書中で互換して使用される）とは、その核酸が由来
する生物の天然に存在するゲノム中では直接連続する（すなわち、5'末端側の１
個と3'末端側の１個の）コード配列の両方とは直接連続しないものか、あるいは
その核酸が由来する生物中に存在する核酸を実質的に含まないかのいずれか、ま
たはその両方である。この用語には、例えばあるベクター中、例えば自律複製プ
ラスミド若しくはウイルス中、または原核若しくは真核生物のゲノムDNA中に組
み込まれるか、あるいはその他のDNA配列とは独立した別の分子（例えばPCRまた
は制限エンドヌクレアーゼ処理によって作製されたcDNAまたはゲノムDNA断片）
として存在する、組換えDNAが含まれる。実質的に純粋なDNAとして、別のP.ging
ivalis DNA配列をもコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えDNAも含
まれる。
【００２７】 本明細書中で使用する「コンティグ(contig)」とは、ある生物のゲノム配列の
１連続部分を表す核酸の意味である。
【００２８】 本明細書でORFとも称される「オープンリーディングフレーム」とは、あるポ
リペプチドをコードする核酸の１領域である。この領域は１コード配列の一部で
も全配列を表すものでもよく、終止から終止コドンまで、または開始から終止コ
ドンまでとして確定することができる。
【００２９】 本明細書で使用する「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれた
ときに、メッセンジャーRNA中に転写され、かつ／またはポリペプチドに翻訳さ
れる核酸である。コード配列の境界は5'末端の５個の翻訳開始コドンおよび3'末
端の翻訳終止コドンによって確定される。コード配列として、限定するわけでは
ないが、メッセンジャーRNA合成DNAおよび組換え核酸配列が含まれる。
【００３０】 本明細書で使用する核酸の「相補体」とは、当初の配列とWatson-Crick塩基対
を形成する逆平行またはアンチセンス配列を意味する。
【００３１】 「遺伝子産物」とはある遺伝子によって特異的にコードされるタンパク質また
は構造RNAである。
【００３２】 本明細書で使用する用語「プローブ」は、対象とする分子に特異的に結合する
核酸、ペプチドまたはその他の化学物質の意味である。プローブは標識と結合さ
せることが多く、または結合することができるものである。標識とは検出するこ
とができる化学的部分分子である。典型的な標識は染料、放射性同位元素、発光
および化学発光部分分子、発蛍光団、酵素、沈殿剤、増幅用配列、などが含まれ
る。同様に、対象とする分子に特異的に結合してそれらの分子を固定化する核酸
、ペプチドまたはその他の化学物質は本明細書で「捕捉リガンド」と称される。
捕捉リガンドは典型的にはニトロセルロース、ガラス、ナイロン膜、ビーズ、粒
子などの支持体と結合するか、または結合することができるものである。ハイブ
リダイゼーションの特異性はヌクレオチドの塩基対組成、ならびに反応の温度お
よび塩濃度などの条件に依存する。これらの条件は、ルーチンの実験により、当
業者が容易に認識し得るものである。
【００３３】 相同性とは２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または
配列同一性を称する。比較する２つの配列のある位置が両者ともに同一の塩基ま
たはアミノ酸モノマーサブユニットで構成されている場合、例えば２つのDNA分
子のそれぞれにおけるある位置がアデニンで構成されているならば、その分子は
その位置で相同性である。２つの配列間の相同性のパーセンテージは関数：[２ つの配列に共有さ れる同一のまたは相同な位置の数／比較する位置の数]×100 、である。
【００３４】 用語、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドは、本明細書中で互換して使
用される。
【００３５】 本明細書で使用する「免疫原性成分」は、宿主動物中に体液性および／または
細胞性免疫応答を誘発する能力があるP.gingivalisポリペプチド、それらの類似
体または断片などの部分分子である。
【００３６】 本明細書で使用する「抗原性成分」は、特定の抗体に十分な高親和性で結合し
て検出し得る抗原-抗体複合体を形成する能力がある、P.gingivalisポリペプチ
ド、それらの類似体または断片などの部分分子である。
【００３７】 本明細書で使用する用語「細胞特異的プロモーター」はプロモーターとして作
用する、すなわちそのプロモーターに機能し得る形態で連結した、ある選択され
たDNA配列の発現を調節し、そしてある組織の特定の細胞中でのその選択されたD
NA配列の発現に影響を与えるDNA配列を意味する。この用語は、ある選択されたD
NAの主として１組織中での発現を調節するが、別の組織中でも同様に発現をもた
らす、いわゆる「漏出(leaky)」プロモーターをも包括する。
【００３８】 本明細書で使用する用語「制御配列」とは、宿主生物によって認識されて、こ
の配列が連結したコード配列の発現に影響を与える塩基配列を有する核酸を称す
る。こうした制御配列の性質は宿主生物によって異なる。原核生物では、こうし
た制御配列として一般的にプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター
、そして場合によってはオペレーターが含まれ、真核生物では一般的にはこうし
た制御配列として、プロモーター、ターミネーター、そして場合によってはエン
ハンサーが含まれる。用語、制御配列は最低限、その存在が発現のために必要な
成分全部を含むことを想定しており、その存在が好都合なその他の成分、例えば
リーダー配列も含まれることがある。
【００３９】 本明細書で使用する用語「機能し得る形で連結された」とは、目的とする様相
で機能するように結合または連結された配列を称する。例えば、制御配列は、制
御配列および宿主細胞が共存し得る条件下でコード配列の発現が達成されるよう
な様式の連結によってコード配列に機能し得る形で連結される。
【００４０】 本明細書で使用する「サンプル」とは、例えば（限定するわけではないが、血
漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、涙、唾液および組織切片を含む）個体から単離
された組織若しくは液体またはin vitro細胞培養物成分などの生物学的サンプル
、ならびに環境からのサンプルを意味する。
【００４１】 本発明の実施においては、別に指示しない限り、当業者に周知の、化学、分子
生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の通常の技術を利用することとする
。こうした技術は以下のような文献中に記載され、説明されている：J.Perbal,A
Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)、J.Sambr
ookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laborat
ory Press(1989)、T.A.Brown（編集）,Essential Molecular Biology:A Practic
al Approach,Volumes 1 and 2,IRL Press(1991)、D.M.Glover and B.D.Hames（
編集）,DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995 and 1
996)、ならびに F.M.Ausubelら（編集）,Current Protocols in Molecular Biol
ogy,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,現在までの最新版の
全部を含む）。これらの文献の開示を参照により本明細書中に組み入れる。
【００４２】 製薬上許容される担体 本発明の抗体、ポリペプチドおよびDNAを、担体または希釈剤を含む組成物に 含めることができる。こうした組成物として、医薬組成物が含まれ、この場合、
担体または希釈剤は製薬上許容されるものとされる。製薬上許容される担体また
は希釈剤として、経口、直腸、鼻、局所（口腔および舌下を含む）、膣、非経口
（皮下、筋内、静脈内、皮内、クモ膜下および硬膜外を含む）投与に好適な組成
物に使用されるものが含まれる。これらは使用する用量および濃度において、レ
シピエントに対して非毒性である。製薬上許容される担体または希釈剤の代表的
な例として、限定するわけではないが、水、好ましくは生理的pHに緩衝化された
等張液（リン酸塩緩衝化生理食塩水またはTris緩衝化生理食塩水など）が含まれ
、マンニトール、ラクトース、トレハロース、デキストロース、グリセロール、
エタノールまたはポリペプチド（ヒト血清アルブミンなど）の１種以上を含んで
もよい。組成物は便利なように単位投与量形態で存在させることができ、また薬
剤学の分野で公知のどんな方法で調製してもよい。
【００４３】 当業者にとって十分理解されるように、配列表に提示したアミノ酸配列に変更
を実施してもよい。これらの変更としてアミノ酸残基の欠失、挿入または置換が
ある。変更されたポリペプチドは天然に存在するもの（すなわち、天然の起源か
ら精製または単離したもの）かまたは合成品（例えば、それをコードするDNA上 に部位特異 的突然変異を起こさせた）のいずれかとすることができる。配列表 に提示した配列と少なくとも85％、好ましくは少なくとも95％の同一性を有する
、こうした変更を受けたポリペプチドが本発明の範囲内に入ることを意図する。
これらの変更されたポリペプチドに対して生起した抗体もまた配列表に提示する
配列の１つを有するポリペプチドに結合するはずである。同一性％レベルは上記
のようにして算出すべきものとする。
【００４４】 タンパク質配列が共通の祖先からの分岐によって関連しているならば、それら
は相同性である。その結果、タンパク質の種相同体は別の種中に天然に存在する
等価なタンパク質となる。どんな種中でも、相同体は多数の対立遺伝子変異型と
して存在することができ、これらはそのタンパク質の相同体とみなされる。対立
遺伝子変異型および種相同体は当業者に知られた以下の標準的技術によって取得
することができる。 対立遺伝子変異型は個々の生物中で天然に存在する変異型ということになる。
【００４５】 突然変異体、変異型および相同性-核酸 突然変異ポリヌクレオチドはヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換である
突然変異を１以上有することになる。突然変異体は天然に存在するもの（すなわ
ち、天然の起源から精製したもの）かまたは合成品（例えば、DNA上に部位特異 的 突然変異を起こさせたもの）のいずれかとすることができる。したがって、 本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するものか組換え体（すなわち、組換え
DNA技 術を使用して調製したもの）のいずれかとすることができることが明らか
である。 対立遺伝子変異型は個々の生物中で天然に存在する変異型となる。
【００４６】 ヌクレオチド配列が共通の祖先からの分岐によって関連しているならば、それ
らは相同性である。その結果、ポリヌクレオチドの種相同体は別の種中に天然に
存在する等価なポリヌクレオチドとなる。どんな種中でも、相同体は多数の対立
遺伝子変異型として存在することができ、これらはそのポリヌクレオチドの相同
体とみなされる。対立遺伝子変異型および種相同体は当業者に知られた以下の標
準的技術によって取得することができる。
【００４７】 抗体の作製 本発明のポリペプチドに対して特異的なポリクローナルまたはモノクローナル
のいずれかの抗体は標準的な技術を使用して当業者が作製することができる。こ
れらとして、限定するわけではないが、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Ma
nual,Cold Springs Harbor Laboratory Press(1988)、およびD.Catty（編集者）
,Antibodies:A Practical Approach,IRL Press(1988)によって記載されたものな
どがある。
【００４８】 あるタンパク質のエピトープに対するポリクローナル抗体の作製のためには、
当技術分野で知られた各種の操作法を使用することができる。ポリクローナル抗
体の作製のためには、ポリペプチド調製品の１回以上の注射での免疫による抗体
の産生用として、多数の宿主動物が許容される。これらとして限定するわけでは
ないが、ウサギ、マウス、ラットその他が含まれる。宿主動物の種類に応じて、
その宿主中の免疫学的応答を増強させるために、各種のアジュバントを使用する
ことができる。これらとして、限定するわけではないが、（完全および不完全）
Freund、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性剤、
プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、オイルエマルジョン、キイホールリンペ
ットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG(Bacille Calmette-Gueri
n)およびCorynebacterium parvumなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含ま
れる。
【００４９】 あるタンパク質のエピトープに対するモノクローナル抗体は、培養物中の連続
細胞系による抗体分子の産生を与える任意の技術を使用することによって、調製
することができる。これらとして限定するわけではないが、KohlerおよびMilste
in（1975,Nature 256,493-497）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術 、さらに最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kesberら、1983,Immunology To
day 4:72）ならびにEBV-ハイブリドーマ技術（Coleら、1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.pp.77-96）が含まれる。その
外、適切な抗原特異性を持つ抗体分子からの遺伝子を適切な生物学的活性を持つ
ヒト抗体分子からの遺伝子とスプライシングすることによる「キメラ抗体」の作
製のために開発された技術を使用してもよい（Morrisonら、1984,Proc.Natl.Aca
d.Sci.,81:6851-6855；Neubergerら、1984 Nature 312:604-608；Takedaら、198
5 Nature 31:452-454）。あるいは、一本鎖抗体の作製のために記載された技術 （米 国特許第4,946,778号）を４つの特異的な一本鎖抗体を作製するために応用
する ことができる。
【００５０】 組換えヒトまたはヒト化バージョンモノクローナル抗体はヒトの治療適用にと
って好ましい実施形態である。ヒト化抗体は文献中にある操作法に従って調製す
ることができる（例えば、Jonesら、1986,Nature 321:522-25；Reichmanら、198
8 Nature 332:323-27；Verhoeyenら、1988,Science 239:1534-36）。最近記載さ
れたヒト化モノクローナル抗体の作製のための「遺伝子変換真正世代交代」(gen
e conversion metagenesis)戦略も、ヒト化抗体の作製において使用することが できる（Carterら、1992 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285-89）。あるいは、
重および軽領域のランダム組合せからなる組換えフェーズ(phase)ライブラリー を作製するための技術もまた、組 換え抗体を調製するために使用することがで きる（例えば、Huseら、1989 Science 246:1275-81）。
【００５１】 FuF(ab1)およびF(ab2)などの分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメン
トを既知の技術によって作製することもできる。例えば、こうしたフラグメント
として、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：完全抗体分子のペプ
シン消化によって作製することができるF(ab)E2フラグメント；F(ab')2フラグメ
ントのジスルフィド架橋を還元することによって作製することができるFab'フラ
グメント、ならびに抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作
製することができる２つのFabフラグメント。あるいは、Fab発現ライブラリーを
構築して（Huseら、1989,Science 246:1275-1281）、あるタンパク質に対して所
望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速で容易な同定を可能
にすることができる。
【００５２】 アジュバント 「アジュバント」は、ワクチン組成物の免疫原性および効力を強化する１種以
上の物質を含む組成物を意味する。好適なアジュバントの限定するわけではない
例として以下のものが含まれる：スクワランおよびスクワレン（若しくは動物起
源のその他のオイル）；ブロックコポリマー；Tween(登録商標)-80などの界面活
性剤；Quil(登録商標)A；Drakeol若しくはMarkolなどの鉱物油；落花生油などの
植物油；Corynebacterium parvumなどのCorynebacterium由来のアジュバント；P
ropionibacterium acneなどのPropionibacterium由来のアジュバント；Mycobact
erium bovis（Bacillus Calmetic and Guerinn若しくはBCG）；インターロイキ ン2およびインターロイキン-12などのインターロイキン；インターロイキン1な どのモノカイン(monokine)；腫瘍壊死因子；ガンマインターフェロンなどのイン
ターフェロン；サポニン-水酸化アルミニウム若しくはQuil-A水酸化アルミニウ ムなどの組合せ；リポソーム；ISCOMアジュバント；マイコバクテリア細胞壁抽 出物；ムラミルジペプチド若しくはその他の誘導体などの合成グリコペプチド；
Avridine；Lipid A；硫酸デキストラン；DEAE-Dextran若しくはリン酸アルミニ ウムを含むDHAE-Dextran；Carbopol'EMAなどのカルボキシポリメチレン；Neocry
l A640（例えば米国特許第5,047,238号）などのアクリルコポリマーエマルジョ ン；ワクシニア若しくは 動物ポスウイルス(posvirus)タンパク質；コレラトキ シンなどのサブウイルス粒子アジュバント、またはこれらの混合物。
【００５３】 本明細書で使用する場合、ストリンジェント条件は（１）洗浄のために低イオ
ン強度および高温を使用する、例えば 0.015 M NaCl／0.0015 Mクエン酸ナトリ
ウム／0.1％NaDodSO4、50℃；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド
などの変性剤を使用する、例えば 0.1％ウシ血清アルブミンを含む 50％(vol/vo
l)ホルムアミド、0.1％Ficoll、0.1％ポリビニルピロリドン、750 mM NaCl、75 mMクエン酸ナトリウムを含むpH6.5の50 mMリン酸ナトリウムバッファー、42℃；
または（３）50％ホルムアミド、5ｘSSC（0.75 M NaCl、0.075 Mクエン酸ナト リウム）、50 mMリン酸ナトリウム（pH6.8)、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5ｘD
enhardt溶液、超音波処理サーモン精子 DNA（50μg/ml）、0.1％SDSならびに0.2
ｘSSCおよび0.1％SDS中 10％硫酸デキストラン、42℃を使用する、ものである。 後にわかるように、本発明はDNAワクチン接種をその範囲内に包含する。DNAワ
クチン接種に関する詳しい情報は Donnellyら、Journal of Immunological Meth
ods 176(1994)145-152から知ることができ、この開示を参照により、ここに組み
入れる。
【００５４】 この明細書において、用語「コンプライズ(comprise)＝含む」または「コンプ
ライジズ」若しくは「コンプライジング」などのその変化形は示された要素若し
くは整数または要素若しくは整数の群を包含するが、その他の要素若しくは整数
または要素若しくは整数の群のどれも排除するものではないことを意味するもの
と理解されたい。
【００５５】 配列決定のためのP.gingivalisライブラリーの作製 P.gingivalisのDNA配列を決定するため、基本的にMamur J.が記載した方法（J
.Mol.Biol.3,208-218,1961）によって、P.gingivalis株 W50（ATCC 53978）から
ゲノムDNAを単離した。基本的にFleischmannらの記載（Science;269,496-512,19
95)(2)にしたがって、DNA断片のクローニングを実施した。簡単に述べると、精
製したP.gingivalisからのゲノムDNAを霧状化してDNAを断片化し、Bal31ヌクレ
アーゼで処理して平滑末端を生成させ、次に調製用1％アガロースゲルに２回通
した。1.6-2.0 kbのDNA断片をゲルから切り取り、そのDNAを回収した。次にこの
DNAをベクターpUC18（SmaI消化および脱リン酸化；Pharmacia）に連結し、1％調
製用アガロースゲル中で電気泳動させた。線状ベクター＋１挿入物を含む断片を
切り取り、精製し、そしてこのプロセスを反復して、挿入物を含まないベクター
があればそれを減少させた。回収したベクター＋挿入DNAをT4 DNAポリメラーゼ
で平滑末端化し、次に環状DNAを作製するための最終連結を実施した。Epicurian
Coli Electroporation-Competent Cells（Stratagene）のアリコートをこの連 結したDNAで形質転換し、Ｘ-galを含有するSOBアガー抗生物質拡散プレート上に
プレーティン グし、37℃で一晩インキュベートした。挿入物を含むコロニーは 白色になり、挿入物を含まないもの（ベクターのみ）は青色になった。白色コロ
ニーを取り出すまではプレートを4℃で保存し、その後配列決定のためのプラス ミドDNAを抽出するために、拡大させた。
【００５６】 DNA配列決定 96ディープウェルプレート中、50-100 ug/mlアンピシリンを補充した LB、TB
またはSOBブロス 1.5 ml中に細菌コロニーをピッキングすることによって、プラ
スミドDNAを調製した。QIAprep SpinまたはQIAprep 96 Turbo ミニプレプ(minip
rep)キット（QIAGEN GmbH,Germany）を使用して、プラスミドDNAを単離した。DN
Aを96ウェル格子アレー中に溶離させて、-20℃で保存した。
【００５７】 M13 Universalフォワードおよびリバースシークエンシングプライマーを使用 し、ABI PRISM Dye TerminatorおよびAmpliTaq DNAポリメラーゼ FSを含むABI P
RISM BIGDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキット（PE Applied
Biosystems,Foster City,CA）を使用して、配列決定反応を実施した。配列決定
反応をPerkin-Elmer GeneAmp 9700（PE Applied Biosystems）またはHybaid PCR
Express（Hybaid,UK）熱サイクルのいずれかで実行した。ABI PRISM 377 DNAシ
ークエンサ ー（PE Applied Biosystems）で配列決定反応を分析した。
【００５８】 得られた配列を以下に示す。これらの配列間の関係を表１に示す。配列相同ア
ラインメント（FASTA）、シグナル配列予測（PSORT,SignalP）またはORF予測（G
eneMark）の組合せを使用して、開始コドンを算出した。
【００５９】
【表１】
【００６０】 DNA配列分析 FASTAフォーマットのDNAファイルをGCGフォーマットファイルに変換し、デー
タベース中に移入した。ANGIS（Australian Genomic Information Service,Univ
ersity of Sydney,Australia）から取得したプログラム、Flipを使用して、DNA
ファイルをアミノ酸ファイルに翻訳した。潜在的なワクチン候補を選択するため
、タンパク質について一連の生物学的情報(bioinformatic)分析を実施した。使 用 したプログラムはFASTA相同性検索（１）、PSORT（２、３）、SignalP（４）
、TopPred（５）、およびGeneMark（６）である。所望の特性を有するタンパク 質の検索および探索のため、これらのタンパク質およびその生物学的情報の結果
をカスタム書き込みデータベースに保存した。
【００６１】 次にこれらのタンパク質についてのFASTA相同性結果を、表面所在またはワク
チン効力を示唆するタンパク質のどちらかのアラインメントについて調べた。FA
STAアルゴリズムを使用するANGISによってコンパイルした重複していない(non-r
edundant）細菌タンパク質データベースに対する、相同性について、全タンパク
質を検索した。FASTA検索のために使用したセッティングは、Ktup＝2、ギャップ
クリエイション(creation)ペナルティ＝-12、ギャップエクステンション(extens
ion)ペナルティ＝-2、最適アラインメント誘導のための幅＝16、およびBlosum 5
0スコアリングマトリックスである。統計的確率およびアミノ酸アラインメント により、有意な相同性について、個々のFASTA検索結果を調べた。結果を表２に 示す 。
【００６２】 次に、タンパク質トリミング(trimming)プログラムの１つ（ANGIS）を使用し
て、タンパク質ファイルを第１、２、３、４および第５メチオニン残基にトリミ
ングした。次にトリミングしたタンパク質をPSORT分析にかけて、シグナル配列
の検出および細胞の所在部位の予測を行なった。外膜のPSORT確率が＞0.8を表す
タンパク質を表面に局在することを意味するものとみなした。第２のシグナル配
列検出プログラム、SignalPもまた実行したが、いくつかの例では、このプログ
ラムはPSORTと一致しないシグナルを検出した。その他の方法によ って同定され
たすべてのタンパク質もPSORTおよびSignalPによって分析した。以前から、細菌
外膜タンパク質のC-末端アミノ酸が外膜上のタンパク質の組み立てにとって重要
であることが示されている（7）。外膜タンパク質の典型的な構造 の定義がN-末
端のシグナル配列およびC-末端のチロシン若しくはフェニルアラニンの存在によ
って確定されている。多数の選択されたタンパク質がこの特徴的な構造を表示す
る。プログラム、TopPredを使用して膜スパン(spanning)ドメイン （MSD）の存 在および数を決定した。こうした配列の存在は外膜などの膜への付 着傾向を意 味する。選択されたタンパク質のC-末端アミノ酸についてのPSORT、SignalPおよ
びTopPred分析の結果を表３に示す。
【００６３】 多数のP.gingivalis外膜タンパク質のC-末端からの70アミノ酸は50-100％のタ
ンパク質配列同一性を共有している。これらのタンパク質の例はRGP1、RGP2、KG
P、HagA、HagC、HagD、prtHおよびprtTである。この保存されたモチーフがタン
パク質を外膜に付着または適合させることに関与しているらしい。このタンパク
質データセットを上記のようにFASTA相同性を使用して検索したところ、C-末端
に同様のモチーフを表示する多数の新規なタンパク質が同定された。その結果を
表４に示す。
【００６４】 TonBIIIボックスは広範な各種の細菌中のTonB外膜受容体内に存在する30アミ
ノ酸のモチーフである。P.gingivalisのTonBIIIボックス（8）を使用して、上記
のようにFASTAによる相同性について、タンパク質データセットを検索した。有
意な相同性を表示するタンパク質を表５に列挙する。
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
【表５】
【００６９】 組換えP.gingivalis遺伝子のクローニング、発現および精製 PG1 TaqPlus Precision PCR System(Stratagene)およびPTC-100(MJ Research)熱サ
イクラーまたは類似の装置を使用し、推定されるタンパク質の5'および3'領域に
ついてのオリゴヌクレオチドを使用して、P.gingivalis W50ゲノムDNAの調製品
から目的の遺伝子を増幅した。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCCATA
TGCTGGCCGAACCGGCC、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCCTCGAGTCAATTC
ATTTCCTTATAGAGである。PCR断片を精製し、NdeI、XhoI制限酵素（Promega）で消
化し、プラスミド pProEx-1（Gibco-BRL）の対応する部位に連結し、大腸菌 ER1
793細胞（Elizabeth Releigh,New England Biolabsからの寄贈品）中に形質転換
した。生成した正しい挿入物を発現するクローンを選択し、0.1 mM IPTG（Prome
ga）を存在させるかまたは存在させないで、組換えタンパク質の発現を誘導した
。上記のウサギ抗血清の１つまたはP.gingivalis組換えタンパク質に融合させた
ヘキサヒスチジンタグを検出する抗ヘキサヒスチジン抗体（Clontech）を使用し
て、SDS-PAGE分析およびウエスタンブロットによって、組換えタンパク質の発現
を確定した。結合バッファー（Novagen）中での超音波処理および最終濃度1％ま
でのサルコシル（N-ラウロイルサルコシン）を添加して可溶化することによる大
腸菌細胞の破壊によって、PG1を精製した。その後、調製物を結合バッファー中0
.1％サルコシルまで希釈し、ニッケル-ニトリロトリ酢酸カラム（Ni-NTA；Qiage
n）に結合させ、洗浄後、Qiagenの推奨にしたがって全バッファーに0.1％サルコ
シルを添加した溶離バッファー（Novagen）中の 1 Mイミダゾールで、結合した タンパク質を溶離させた。精製した後、サンプルを 500 mM NaCl、20 mM Tris、
0.1％サ ルコシル、pH 7.4に対して透析してイミダゾールを除去し、必要に応じ
て濃縮し、使用まで4℃で保存した。（上記のものから）選択した抗血清を使用 して、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットによって、精製度および抗原性を評価
し、BCAアッセイ（Pierce）によってタンパク質濃度を決定した。
【００７０】PG2 PG2のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5'オ
リゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGTATACATGAAAAGAATGACGC、3'オリゴヌク
レオチドプライマー配列はCGCGAGATCTGAAAGACAACTGAATACCであり、BstZ171およ
びBglII制限部位を使用して、PCR産物をpGex-stop RBS(IV)（特許出願 WO961949
6、JC Cox,SE Edwards,I Frazer and EA Webb.ヒト乳頭腫ウイルス抗原の変異型
）中にクローン化した。PG2を可溶化するために2％サルコシルを使用し、可溶化
バッファーおよびその他の全バッファーに8 M尿素を添加した。逐次透析（順に4
M、2 M、1 M、0.5 M、0 M尿素、すべて50 mM Tris、500 mM NaCl、0.1％サルコ
シル中、pH 7.4）によって、精製したタンパク質から尿素を除去した。精製した
タンパク質を必要になるまで4℃で保存した。
【００７１】PG3 PG3のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5'オ
リゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGTATACATGAAGAAATCAAGTGTAG、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGCGCAGATCTCTTCAGCGTACCTTGCTGTGであり、Pfu DN
Aポリメラーゼ（Stratagene）でDNAを増幅した。PCR産物を直接pCR-Blunt中にク
ローン化し、大腸菌 Top10F'（InVitrogen）中に形質転換した後、BstZ171およ
びBglII制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中にサブクロ
ーン化し、大腸菌 BL21DE3（Pharmacia Biotech）中に形質転換した。PG3の精製
のため、PG1の方法に以下の改変を実施した。組換えタンパク質を発現する細胞
を結合バッファー中での超音波処理によって破壊し、不溶性封入体を遠心分離に
よって濃縮した。次に封入体を結合バッファー中の6 M尿素（Sigma）に可溶化し
、溶離バッファーに添加した6 M尿素で溶離させた。いくつかの例においては、 こ れらのステップについて、尿素の代わりに6 M塩酸グアニジン（Sigma）を使 用した。濃度を減少させた尿素に対する 逐次透析（順に3 M、1.5 M、0.5 M、0
M尿 素、すべて50 mM Tris、500 mM NaCl、8％グリセロール中、pH 7.4）によっ
て、精製したタンパク質から尿素（または代替の塩酸グアニジン）を除去した。
精製したタンパク質を必要になるまで-80℃で冷凍保存した。Coomassie Plus タ
ンパク質アッセイ（Pierce）によってタンパク質濃度を決定した。
【００７２】PG4 PG4のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オ
リゴヌクレオチドプライマー配列はCTTCTGTATACTTACAGCGGACATCATAAAATC、3'オ リゴヌクレオチドプライマー配列はTTCCAGGAGGGTACCACGCAACTCTTCTTCGATであり 、Tth XL PCRキット（Perkin Elmer）でDNAを増幅した。BstZ171およびKpnI制限
部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中にクローン化 し、大腸菌 ER1793中に形質転換した。
【００７３】PG5 PG5のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オ
リゴヌクレオチドプライマー配列はTTGCAACATATGATCAGAACGATACTTTCA、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はAGCAATCTCGAGCGGTTCATGAGCCAAAGCであり、Tth XL
PCRキットでDNAを増幅した。NdeIおよびXhoI制限部位を使用して、PCR産物を発
現プラスミドpET24（Novagen）中にクローン化し、大腸菌 BL21（Pharmacia Bio
tech）中に形質転換した。このタンパク質は低濃度側の尿素では不溶性なので、
1 M尿素以上は尿素の除去を進めなかった。精製したタンパク質を必要になるま で4℃で保存した。
【００７４】PG6 PG6のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オ
リゴヌクレオチドプライマー配列はTAAACATATGTGCCTCGAACCCATAATTGCTCCG、3'オ
リゴヌクレオチドプライマー配列はCGTCCGCGGAAGCTTTGATCGGCCATTGCTACTであり 、Tth XL PCRキットでDNAを増幅した。NdeIおよびHindIII制限部位を使用して、
PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21中に形質転換 した。
【００７５】PG8 PG8のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オ
リゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGTATACATGGAGTTCAAGATTGTG、3'オリゴヌ
クレオチドプライマー配列はCGCGAGATCTGTTTTCTGAAAGCTTTTCであり、TaqPlus Pr
ecision PCR SystemでDNAを増幅した。NdeIおよびXhoI制限部位を使用して、PCR
産物を発現プラスミド pProEx-1中にクローン化し、大腸菌 ER1793中に形質転換
した。
【００７６】PG8A PG8AはPG8を短くしたバージョンで、最初の173アミノ酸が除去されている。PG
8Aのために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリ ゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGTATACATGGAAAACTTAAAGAAC、3'オリゴヌク
レオチドプライマー配列はCGCGAGATCTGTTTTCTGAAAGCTTTTCであり、TaqPlus Prec
ision PCR SystemでDNAを増幅した。BstZ171およびBglII制限部位を使用して、P
CR産物を発現プラスミドpGex-stop RBS(IV)中にクローン化し、大腸菌 ER1793中
に形質転換した。精製したタンパク質の透析の前に、EDTA（Sigma）を最終濃度1
0 mMとなるように添加した。
【００７７】PG10 PG10のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5' オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGATATCATGGATAAAGTGAGCTATGC、3'オリ
ゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGAGATCTTTTGTTGATACTCAATAATTCであり、Taq
Plus Precision PCR SystemでDNAを増幅した。PCR産物をEcoRVおよびBglIIで消 化し、BstZ171およびBglII制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS
(IV)中に連結し、大腸菌 ER1793中に形質転換した。
【００７８】PG11 PG11のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5' オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGTATACATGAGAGCAAACATTTGGCAGATACTTT
CCG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCAGATCTGCGCAAGCGCAGTATATCGCC
であり、Tli DNAポリメラーゼ（Promega）でDNAを増幅した。PCR産物をpCR-Blun
t中にクローン化し、大腸菌 Top10F'中に形質転換した後、BstZ171およびBglII 制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中にサブクローン化し
、大腸菌 ER1793中に形質転換した。結合バッファー（Qiagen）中の2％サルコシ
ルでの大腸菌細胞の可溶化によって、PG11を精製し、これを結合バッファー中0.
1％サルコシルまで希釈し、ニッケル-ニトリロトリ酢酸カラム（Ni-NTA；Qiagen
）に結合させ、洗浄後、Qiagenの推奨にしたがって1 Mイミダゾール（溶出バッ ファー中 0.7％CHAPS(Sigma)；Qiagen）で、結合したタンパク質を溶出させた。
精製後、サンプルを 500 mM NaCl、20 mM Tris、0.7％CHAPS、20％グリセロール
（Sigma）、pH 7.4に対して透析してイミダゾールを除去し、必要に応じて濃縮 し、使用まで4℃で保存した。
【００７９】PG12 PG12のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5' オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGTATACATGAATAGCAGACATCTGACAATCACAA
TCATTGCCGG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCAGATCTGCTGTTCTGTGAGT
GCAGTTGTTTAAGTGであり、Tli DNAポリメラーゼでDNAを増幅した。PCR産物をpCR-
Blunt中にクローン化し、大腸菌 Top10F'細胞中に形質転換した後、BstZ171およ
びBglII制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中にサブクロ ーン化し、大腸菌 BL21中に形質転換した。組換えタンパク質の精製法は、以下 を除いてPG11と基本的に同一とした：封入体を可溶化するために、サルコシルの
代わりに 50 mM Tris、50 mM NaCl、pH 8.0中の0.5％ DHPC（1,2-ジヘプタノイ ル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン；Avanti）を使用し、Ni-NTAへの添加前にDHPC を0.1％に希釈し、全バッファーに0.1％ DHPCを添加した。
【００８０】PG13 PG13のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5' オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCCATATGCGGACAAAAACTATCTTTTTTGCG、3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCCTCGAGGTTGTTGAATCGAATCGCTATTTGAGC であり、Tli DNAポリメラーゼでDNAを増幅した。NdeIおよびXhoI制限部位を使用
して、PCR産物を発現プラスミド pET24b中にクローン化し、大腸菌 BL21中に形 質転換した。組換えタンパク質の精製法は、6 M尿素を使用してPG3と基本的に同
一とし、1％ NOG（n-オクチルグルコシド；Sigma）を透析バッファーに添加した
。このタンパク質は低濃度側の尿素では不溶性なので、2 M尿素以上は尿素の除 去を進めなかった。精製したタンパク質を必要になるまで4℃で保存した。
【００８１】PG14 PG12のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5' オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGGCGCCATGACGGACAACAAACAACGTAATATCG
、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCCTCGAGTTACTTGCGTATGATCACGGACAT
ACCCであり、Tli DNAポリメラーゼでDNAを増幅した。EheIおよびXhoI制限部位を
使用して、PCR産物を発現プラスミドpProEx-1中にクローン化し、大腸菌BL21中 に形質転換した。組換えタンパク質の精製法はPG12と基本的に同一とした。
【００８２】PG15 PG15のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5' オリゴヌクレオチドプライマー配列はCAAAAGTATACTAATAAATATCATTCTCAA、3'オリ
ゴヌクレオチドプライマー配列はGCTTATGGTACCTTTGGTCTTATCTATTATであり、Tth
XL PCRキットでDNAを増幅した。BstZ171およびKpnI制限部位を使用して、PCR産 物を発現プラスミドpGex-stop RBS(IV)中にクローン化し、大腸菌ER1793中に形 質転換した。
【００８３】PG22 PG22のために使用した方法は以下の例外の他はPG1と基本的に同様である。5' オリゴヌクレオチドプライマー配列はCCCCGGATCCGATGCGACTGATCAAGGC、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はCCCCCTCGAGCGGAACGGGGTCATAGCCであり、TaqPlus
Precision PCR SystemでDNAを増幅した。BamHIおよびXhoI制限部位を使用して、
PCR産物を発現プラスミド pET24b中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質転
換した。PG22を精製した後、1 Mイミダゾールを存在させた外はPG1と同様の方法
で透析を実施した。
【００８４】PG24 PG24のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5' オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGTATACATGAATTACCTGTACATAC、3'オリ ゴヌクレオチドプライマー配列はCGCGGGATCCGTTCGATTGGTCGTCGATGGであり、TaqP
lus Precision PCR SystemでDNAを増幅した。PCR産物をBstZ171およびBamHIで消
化し、BstZ171およびBglII制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS
(IV)中に連結し、大腸菌 ER1793中に形質転換した。PG24の発現は低レベルだっ たので、小スケール以外の精製は実施しなかった。
【００８５】PG24A PG24の改変バージョンもクローン化して、発現させた。PG24AはPG24と同一で 、予測されるN-末端配列を除去したものである。PG24Aのために使用した方法は 以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5'オリゴヌクレオチドプライマー 配列はCGCGCATATGGAGATTGCTTTCCTTTCTTCG、3'オリゴヌクレオチドプライマー配 列はCGCGCTCGAGTTAGTTCGATTGGTCGTCGであり、TaqPlus Precision PCR SystemでD
NAを増幅した。NdeIおよびXhoI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pProEX-1中にクローン化し、大腸菌 ER1793中に形質転換した。組換えタンパク 質の精製法はPG3と基本的に同一としたが、封入体を可溶化するために8 M尿素を
使用し、これをNi-NTAカラム精製用バッファー中で用いた。逐次透析（順に4 M 、2 M、1 M、0.5 M、0 M尿素、すべて50 mM Tris、500 mM NaCl、8％グリセロー
ル中、pH 7.4）によって尿素を除去した。精製したタンパク質を必要になるまで
-80℃に凍結して保存した。
【００８６】PG29 PG29のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。5' オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGATATCGCTAGCATGAAAAAGCTATTTCTC、3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCAGATCTCTCGAGTTTGCCATCGGATTGCGGATTG
であり、Pfu DNAポリメラーゼを使用してDNAを増幅した。PCR産物をpCR-Blunt（
InVitrogen）中にクローン化し、大腸菌 Top10F'中に形質転換した後、EcoRVお よびBglII制限部位を使用して、発現プラスミド pGex-stop RBS(IV)中にサブク ローン化し、大腸菌 BL21中に形質転換した。精製過程中、6 M尿素を使用した。
【００８７】PG30 PG30のために使用した方法は以下の例外の他はPG3と基本的に同様である。組 換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はTACGGAATTCGTGACCCCCGTCAGAAATGTGCGC、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTTTGATCCTCAAGGCTTTGCCCGGであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して
、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。PG30の全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実
施した。テリフィック(terrific)ブロス中、組換え大腸菌の培養物10 mlをOD 2.
0（A600nm）まで増殖させ、 0.5 mM IPTGで細胞を誘導し、誘導後４時間目のサ ンプルを分析用に使用した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００８８】PG31 PG31のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はCGGGGAATTCGCAAAAATCAATTTCTATGCTGAA、3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTGTATGCAATAGGGAAAGCTCCGAで
あり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部
位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL2
1DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試
験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００８９】PG32 PG32のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCGCAGAATTCCAGGAGAATACTGTACCGGCAACG、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTTGGAGCGAACGATTACAACACであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して 、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９０】PG33 PG33のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はTGCAGAATTCCAAGAAGCTACTACACAGAACAAA、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTTCCGCTGCAGTCATTACTACAAであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して 、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９１】PG35 PG35のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGAATTCATGAAACAACTAAACATTATCAGC、3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGTGCGGCCGCGAAATTGATCTTTGTACCGACGAで あり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部
位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL2
1DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試
験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９２】PG36 PG36のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はAAAGGAATTCTACAAAAAGATTATTGCCGTAGCA、3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAACTCCTGTCCGAGCACAAAGTで あり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部
位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL2
1DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試
験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９３】PG37 PG37のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGGCGAATTCAAACGGTTTTTGATTTTGATCGGC、3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTTGCTAAAGCCCATCTTGCTCAGで
あり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部
位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL2
1DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試
験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９４】PG38 PG38のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCCTCGAATTCCAAAAGGTGGCAGTGGTAAACACT、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTTGATTCCGAGTTTCGCTTTTACであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して
、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９５】PG39 PG39のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はAGCTGGATCCCAAGGCGTCAGGGTATCGGGCTAT、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAATTCGACGAGGAGACGCAGGTであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用して
、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９６】PG40 PG40のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGGCTGAATTCAAGACGGACAACGTCCCGACAGAT、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAAGTTGACCATAACCTTACCCAであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して
、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９７】PG41 PG41のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGACTGAATTCCAAAACGCCTCCGAAACGACGGTA、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTTGTTCGGGAATCCCCATGCCGTTであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して
、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９８】PG42 PG42のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はGTTTGAATTCGCAAATAATACTCTTTTGGCGAAG、3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTGCCGGACATCGAAGAGATCGTC であり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限
部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 B
L21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性
試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【００９９】PG43 PG43のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はGCGCGAATTCAAAAAAGAAAAACTTTGGATTGCG、3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTTCAAAGCGAAAGAAGCCTTAACで
あり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部
位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL2
1DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試
験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１００】PG44 PG44のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はAGCCGAATTCTGTAAGAAAAATGCTGACACTACC、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTTTTTCCCGGGCTTGATCCCGATであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して
、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０１】PG45 PG45のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGACAGGATCCTGCTCCACCACAAAGAATCTGCCG、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAAGGGATAGCCGACAGCCAAATであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用して 、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０２】PG46 PG46のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTCGGAATTCCGTTATGTGCCGGACGGTAGCAGA、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAACGGATAGCCTACTGCAATGTであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して 、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０３】PG47 PG47のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCGCCGAATTCCAAACAGTGGTGACCGGTAAGGTGATCGATTCAGAA、3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAAGTTTACACGAATACCGGTAGACC
AAGTGCGGCCであり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよ
びNotI制限部位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し
、大腸菌 BL21DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および
免疫反応性試験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０４】PG48 PG48のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAAAAATCCAAGCAGGTACAGCGA、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTCGTAACCATAGTCTTGGGTTTTGであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して
、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０５】PG49 PG49のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGAACGGATCCAACGAGCCGGTGGAAGACAGATCC、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTAATCTCGACTTCATACTTGTACCAであり、Tth X
L PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用し て、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形
質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施し
た。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０６】PG50 PG50のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGCTGGGATCCGCGACAGACACTGAGTTCAAGTAC、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAACTTCACTACCAAGCCCATGTであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用して 、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０７】PG51 PG51のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はTCTTGAATTCGCGCAAAGTCTTTTCAGCACCGAA、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCACTTTTTCGTGGGATCACTCTCTTであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して
、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０８】PG52 PG52のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はAGAAGAATTCAAACGGACAATCCTCCTGACGGCA、3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGAAGTCTTTGCCCTGATAGAAATCで
あり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部
位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL2
1DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試
験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１０９】PG53 PG53のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGGCTGAATTCGCGAATCCCCTTACGGGCCAATCG、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCGTCCGAAAGGCAGCCGTAATAGGであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して 、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１０】PG54 PG54のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCGCTGAATTCCAGATTTCGTTCGGAGGGGAACCC、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCCTGCTTCACGATCTTTTGGCTCAであり、Tth XL
PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用して 、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形質
転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施した
。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１１】PG55 PG55のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCGAGGGATCCGAGCTCTCTATTTGCGATGGCGAG、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCTTACCTGACTTCTTGTCACGAATであり、Tth X
L PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用し て、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形
質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施し
た。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１２】PG56 PG56のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。5'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はAAATGGATCCCGAAAAATTTTGAGCTTTTTGATG、3'
オリゴヌクレオチドプライマー配列はCTATGCGGCCGCTTTGATTCGTAATTTTTCCGTATCで
あり、Tth XL PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部
位を使用して、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL2
1DE3中に形質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試
験を実施した。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１３】PG57 PG57のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はTGCTGGATCCCAAGAGATCTCAGGCATGAATGCA、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCGGCCTCTTTATCTCTACCTTTTCであり、Tth X
L PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。BamHIおよびNotI制限部位を使用し て、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形
質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施し
た。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１４】PG58 PG58のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はCGGTGAATTCCAAACCCCACGAAATACAGAAACC、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAAGTCCAGCTAAAACCGGCGAAであり、Tth X
L PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用し て、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形
質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施し
た。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１５】PG59 PG59のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAACAAGAGAAGCAGGTGTTTCAT、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAGATGCTCTTATCGTCCAAACGであり、Tth X
L PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用し て、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形
質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施し
た。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１６】PG60 PG60のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGGCGGAATTCCAGATGCTCAATACTCCTTTCGAG、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAGAGGTAGGAGATATTGCAGATであり、Tth X
L PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用し て、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形
質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施し
た。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１７】PG61 PG61のために使用した方法は以下の例外の他はPG30と基本的に同様である。組
換えタンパク質から予測されるN-末端シグナル配列を除去した。5'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はAGCAGAATTCCCCGTCTCCAACAGCGAGATAGAT、3'オリゴヌクレ
オチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAATCGATTGTCAGACTACCCAGであり、Tth X
L PCRキットを使用して、DNAを増幅させた。EcoRIおよびNotI制限部位を使用し て、PCR産物を発現プラスミド pET24a中にクローン化し、大腸菌 BL21DE3中に形
質転換した。全大腸菌溶解物について、発現試験および免疫反応性試験を実施し
た。これらの試験では精製を実施しなかった。
【０１１８】PG62 PG62用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAGCGGTTTCCGATGGTGCAGGGAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAGTGAAATCCGACACGCAGCTGであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１１９】PG63 PG63用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCAGAATTCCAAGAAGCAAACACTGCATCTGACであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAAGTGTACGCAACACCCACGCCであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２０】PG64 PG64用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAGAGTCGTCCTGCTCTTAGACTGであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAGCGAACACCGAGACCCACAAAであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２１】PG65 PG65用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCCGGATCCATCGGACAAAGCCGCCCGGCACTTであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTAAAGCGGTAACCTATGCCCACGAAであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam
HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２２】PG66 PG66用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGTTTGAATTCCAAGACGTTATCAGACCATGGTCAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTAAAATGAGTGGAGAGCGTGGCCATであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２３】PG67 PG67用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGAACGAGCTCGCGGAACGTCCTATGGCCGGAGCAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATACCAAGTATTCGTGATGGGACGであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にSac
IおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21D
E3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解 物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２４】PG68 PG68用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGCTTGCGGCCGCCCTTATGAAAGATTTGCAGATであり、3'オリゴ ヌクレオチドプライマー配列はGGTGCTCGAGTATACTCAACAAGCACCTTATGCACであり、D
NAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にNot Iお
よびXho I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21DE3 中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物 について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２５】PG69 PG69用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAGGAAGGGGAGGGGAGTGCCCGAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAAGCTGTAGCGGGCTTTGAACCAであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２６】PG70 PG70用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はCGGTGGATCCTCGCAAATGCTCTTCTCAGAGAATであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTAAACGAAATATCGATACCAACATCであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam
HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２７】PG71 PG71用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAGAACAATACCCTCGATGTACACであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATTGCCGGTAGGATTTCCTTGTCCであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１２８】PG72 PG72用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGAATTCGGAGAGCGACTGGAGACGGACAGCであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATGATTGCCTTTCAGAAAAGCTATであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli）BL2
1DE3中にTGCTGAATTCGGAGAGCGACTGGAGACGGACAGCを形質転換した。発現研究および
免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究の ために精製は行わなかった。
【０１２９】PG73 PG73用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はCGGTGAATTCCAACAGACAGGACCGGCCGAACGCであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTAAGAAAGGTATCTGATAGATCAGであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３０】PG74 PG74用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAAGAAAATAATACAGAAAAGTCAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGAGGTTTAATCCTATGCCAATACTであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３１】PG75 PG75用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCGGGATCCGCTCAGGAGCAACTGAATGTGGTAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGTGGAACAAATTGCGCAATCCATCであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam
HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３２】PG76 PG76用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はAGCAGAATTCGGAAACGCACAGAGCTTTTGGGAAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTACCTGCACCTTATGACTGAATACであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３３】PG77 PG77用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAAGAGAAAAAGGATAGTCTCTCTであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCTTCTTATCGCCATAGAATACAGGであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３４】PG78 PG78用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCAGAATTCCAGGATTCTTCCCACGGTAGCAATであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATCATGATAGTAAAGACTGGTTCTであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３５】PG79 PG79用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCGTAGTGACGCTGCTCGTAATTGTCで
あり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGCCGTCCTGCCTTTCTG
CCTGACGであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドp
ET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌
（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌
（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった 。
【０１３６】PG80 PG80用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCCGAATTCCAAAACGTGCAGTTGCACTACGATであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGTTGAAAGTCCATTTGACCGCAAGであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３７】PG81 PG81用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGTTTGAATTCCAGGATTTTCTCTATGAAATAGGAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTGTTTATTACAAAAAGTCTTACGであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３８】PG82 PG82用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGAACGAATTCCAGAACAACAACTTTACCGAGTCGであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGTTCAGTTTCAGCTTTTTAAACCAであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１３９】PG84 PG84用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGGATCCCAGAATGATGACATCTTCGAAGATであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATTGCGTCCCCGGCCACTACGTCCであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam
HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４０】PG85 PG85用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はCGGTGAATTCGTACCAACGGACAGCACGGAATCGであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCAGATTGGTGCTATAAGAAAGGTAであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４１】PG86 PG86用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGGATCCCAAACGCATGATCATCTCATCGAAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGTGGTTCAGGCCGTGGGCAAATCTであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam
HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４２】PG87 PG87用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCGGAATTCCAGAGCTATGTGGACTACGTCGATであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATTACTGTGATTAGCGCGACGCTGであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４３】PG88 PG88用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はAGCAGAATTCGCCGAATCGAAGTCTGTCTCTTTCであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCGGCAAGTAACGCTTTAGTGGGGAであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４４】PG89 PG89用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAATCGAAGTTAAAGATCAAGAGCであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTATTAGTCCAAAGACCCACGGTAAAであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４５】PG90 PG90用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCAGAATTCCAAACAACGACGAACAGTAGCCGGであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTTTTGTTGTGATACTGTTTGGGCであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４６】PG91 PG91用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGAATTCCAGACGATGGGAGGAGATGATGTCであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTCCACGATGAGCTTCTCTACGAAであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４７】PG92 PG92用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCCGAATTCGCCGATGCACAAAGCTCTGTCTCTであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTCGAGGACGATTGCTTAGTTCGTAであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４８】PG93 PG93用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCCGAGCTCCAAGAGGAAGGTATTTGGAATACCであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGCGAATCACTGCGAAGCGAATTAGであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にSac
IおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21D
E3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解 物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１４９】PG94 PG94用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCCGAGCTCCAAGAGGAAGGTATTTGGAATACCであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTGTCCTACCACGATCATTTTCTTであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５０】PG95 PG95用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCCGAGCTCTGTGGAAAAAAAGAAAAACACTCTであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTAACTGTCTCCTTGTCGCTCCCCGGであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にSac
IおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21D
E3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解 物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５１】PG96 PG96用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGAGCTCCAAACGCAAATGCAAGCAGACCGAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTTTGAGAATTTTCATTGTCTCACGであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にSac
IおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21D
E3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解 物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５２】PG97 PG97用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はGGCGGGATCCCAGTTTGTTCCGGCTCCCACCACAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCTGTTTGATGAGCTTAGTGGTATAであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBam
HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５３】PG98 PG98用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はAGCAGAATTCCAAGAAAGAGTCGATGAAAAAGTAであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTAGCTGTGTAACATTAAGTTTTTTATTGAT であり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中
にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.col
i)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.col
i)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５４】PG99 PG99用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった。
予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌクレ オチドプライマー配列はTGCTGAATTCAAGGACAATTCTTCTTACAAACCTであり、3'オリゴ
ヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTCGAATCACGACTTTTCTCACAAAであり 、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEco
RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL21
DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶解
物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５５】PG100 PG100用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった 。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌク レオチドプライマー配列はGGCAGAATTCCAGTCTTTGAGCACAATCAAAGTAであり、3'オリ
ゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTGATAGCCAGCTTGATGCTCTTAGCであ り、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEc
o RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL
21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶
解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５６】PG101 PG101用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった 。5'オリゴヌクレオチドプライマー配列はTGCTGAATTCAAAGGCAAGGGCGATCTGGTCGGG
であり、3'オリゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTCTCTTCTCGAACTT
GGCCGAGTAであり、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミ ドpET24a中にEco RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大 腸菌（E.coli)BL21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大
腸菌（E.coli)溶解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなか った。
【０１５７】PG102 PG102用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった 。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌク レオチドプライマー配列はGGCCGAATTCCAGATGGATATTGGTGGAGACGATであり、3'オリ
ゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTCTCTACAATGATTTTTTCCACGAAであ り、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にEc
o RIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL
21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶
解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５８】PG104 PG104用に使った方法は、以下を除くとPG30用の方法と本質的に同じであった 。予測したN末端シグナル配列を組換えタンパク質から除去した。5'オリゴヌク レオチドプライマー配列はGAACGGATCCAACGTGTCTGCTCAGTCACCCCGAであり、3'オリ
ゴヌクレオチドプライマー配列はGAGTGCGGCCGCTTCTGAGCGATACTTTTGCACGTATであ り、DNAはTth XL PCRキットで増幅した。PCR産物を発現プラスミドpET24a中にBa
m HIおよびNot I制限酵素切断部位を使ってクローニングし、大腸菌（E.coli)BL
21DE3中に形質転換した。発現研究および免疫活性研究を、全大腸菌（E.coli)溶
解物について実施した。これらの研究のために精製は行わなかった。
【０１５９】動物抗血清およびヒト患者血清 組換えP.gingivalisタンパク質の発現および再生（refolding）を検出するた め、様々な抗血清を産生させた。ニュージーランドシロウサギに、タンパク質約
2mgを含有する超音波処理したP.gingivalis（株W50）の３つの用量を注射するこ
とによって全細胞抗血清を産生させた。第１用量はフロイント（Freund）の完全
アジュバント（FCA）に入れて、また第２用量および第３用量はフロイントの不 完全アジュバント（IFA）に入れて、3週間隔で与えた。用量（1ml）は後脚の筋 内に与え、最後の用量投与の7日後にウサギから採血し、血液を凝固させ、血清 を除去して必要時まで-20℃で貯蔵した。第２のウサギ抗血清は、免疫原として 、ドイジおよびトラスト（DoidgおよびTrust Tら, 1994）の方法によりP.gingiv
alis W50から誘導したサルコシル（sarkosyl）不溶画分（各用量はタンパク質0.
69mgであった）を使ったが、その他は同様な方法で作製した。第３のウサギ抗血
清は、免疫原として、ドイジおよびトラスト（Doidg P.およびTrust TJ, 1994 I
nfect Immun 62:4526-33）の方法により誘導したP.gingivalis W50から誘導した
サルコシル（sarkosyl）可溶画分（用量当たりタンパク質1mg）を使ったが、そ の他は最初と同様な方法で作製した。
【０１６０】 これらの研究では「防御ラット血清」プールも使い、このプールはFIA中のホ ルマリン死滅全P.gingivalis細胞（ATCC 33277株；2 x 109細胞の２用量、3週隔
にて）を用いて免疫感作したラットから得た。その後、ラットは、最後の用量投
与の2週後に、先に記載したように（Klaussen B.ら, 1991, Oral Microbiol Imm
unol 6:193-201）生P.gingivalis細胞（33277株）を経口投与してチャレンジし 、最後のチャレンジ接種の6週後、犠牲にした時にこれらのラットから血清を得 た。
【０１６１】 ヒト血清は、外来患者の診療所で歯周病の治療または評価を受けている成人患
者から得た。これらの患者は、6mmの接着損失(attachment loss)をもつ歯が6本 以上あり、かつP.gingivalis特異的DNAプローブを使って歯肉下プラーク中にP.g
ingivalisの存在が検出された。これらの患者から血清のプールを作り、歯周の 健康な患者から得た血清のプールと比較した。
【０１６２】免疫感作およびマウス病変モデルプロトコル マウス膿瘍モデルを使って、マウスを皮下膿瘍の形成から防御する上で、組換
えP.gingivalisタンパク質を用いてマウスを免疫感作することの有効性を評価し
た。このモデルは、他研究者も歯周病に対する可能性をもつワクチンの予測体と
して使っている（Bird PSら, 1995 J. Periodontol. 66:351-362）。6-8週齢のB
ALB/cマウスに、不完全フロイントアジュバント（IFA；Sigma）中に乳化した、 組換えP.gingivalisタンパク質10または20μg、大腸菌（E.coli）溶解物タンパ ク質20μg、またはP.gingivalis 33277株ホルマリン死滅細胞2 x 109のいずれか
を含有する0.1 mlを皮下注射して、第0日に免疫感作した。第21日に、マウスに 同じ用量を再注射し、そして、1週後に採血し、抗体レベルを評価した。第35日 に、全マウスに、生P.gingivalis（ATCC33277）の約2 x 109細胞を腹部に皮下注
射してチャレンジした。チャレンジ後、次の10日間、毎日、マウスの体重減少お
よび病変のサイズをモニターした。病変サイズの長さおよび巾を測定し、mm2で 表現した。群をクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析（Kruskal-Wallis one
-way ANOVA）を使って統計解析し、また個別にも、インスタット（Instat）統計
パッケージを使って、アンペアード(unpaired) t検定またはマン・ホィットニー
順位和検定（Mann-Whitney rank sum test）を使い試験した。
【０１６３】 図１は、チャレンジ後４日の１つの実験結果を示す（この時点で病変は最大サ
イズであった）。大腸菌（E.coli）溶解物で免疫感作した対照マウスは大きな病
変を示したが、P.gingivalis 33277株の死滅細胞で免疫感作したマウスは完全に
防御された。これは、全細胞がP.gingivalisに対して防御を与えるが、大腸菌（
E.coli）タンパク質で免疫感作したマウスは防御されなかったことを示す。様々
なPG組換えタンパク質を与えたマウスは、PG2、PG22、PG24およびPG29について は、有意な防御レベル（p<0.05、アンペアードt検定）を示したが、PG8Aは大腸 菌（E.coli）対照群と比較して有意とは言えなかった（p=0.07）。
【０１６４】 図２は、組換えタンパク質の組合わせを使った別の実験結果を示す。PG1+PG2 を与えたマウスは、大腸菌（E.coli)溶解物を与えた対照マウスと比較して、有 意な防御レベル（p<0.026アンペアードt検定）を示した。
【０１６５】免疫スクリーニング クローニングした候補物をテリフィック・ブロス（Terrific broth）15ml中で
培養し、IPTGで誘導し、誘導の4時間後にサンプリングした。培養物の１mlを取 り出し、ペレット化し、該細胞を、培養物のOD A600nmを8で除して決定したPBS の容積中に再懸濁した。溶解物のアリコート（100μl）の１つを、2xサンプル還
元バッファー（125mM Tris pH 6.8、20%グリセロール、4% SDS、80mM DTT、0.03
%ブロモフェノールブルー）の100μlに加え、10分間煮沸した。SDS-PAGEを、ラ エムリ（Laemmli UK, 1970, Nature 227:680-685）の方法により、製造業者の推
奨に従い4-20% 1.0mm Tris-グリシンゲル（Novex）を使って実施した。タンパク
質を、トランスブロッティングによりHybond-C Extraニトロセルロースメンブラ
ン（Amersham）上に移し、その後、該メンブランを2時間、室温（RT）で、20mM
Tris、0.5M NaCl、0.05% Tween-20、pH7.5(TTBS)中の5%スキムミルクでブロック
した。
【０１６６】 免疫スクリーニングは、別々に、ウサギ抗P.gingivalis全細胞血清、ラット防
御血清、ヒト歯周病患者血清のプール、および多くの場合、抗T7タグ抗体HRPコ ンジュゲート（Novagen）を用いて実施した。使用前に、ウサギ、ラットおよび ヒト血清は、TTBS中の5%スキムミルクにそれぞれ1/5000、1/1000および1/500に 希釈し、100μl（ウサギ血清の場合）または250μl（ラットおよびヒト血清の場
合）の大腸菌（E.coli)抽出物（20mg/ml；Promega）に6時間、室温で吸収させた
。
【０１６７】 メンブランを、吸収させた抗血清とともに室温で一夜、または1/5000に希釈し
た抗T7タグコンジュゲートとともに室温で1時間、インキュベートした。TTBSで3
x 10分間洗浄した後、TTBS中の5%スキムミルクで1/5000に希釈したHRPコンジュ
ゲート抗ウサギ（Silenus）、抗マウス（Silenus）または抗ヒト（KPL）抗体を1
時間室温で加えた。メンブランを先のように洗浄した後、免疫反応性タンパク質
検出のためのTMBメンブランペルオキシダーゼ基質（KPL）を添加した。組換えP.
gingivalisタンパク質の反応性の結果を表７に示す。
【０１６８】 さらに、P.gingivalis組換えタンパク質で免疫感作した（チャレンジ前の）マ
ウスからの複数の血清（1/1000に希釈したプールの血清）を、全天然のW50 P.gi
ngivalisタンパク質のウェスタンブロットに対する反応性について、上に概説し
たのと同様な技術を使って分析した。PG2、PG8A、PG29およびPG3は全て、天然の
W50ブロットの組換えPGタンパク質の分子量と類似の分子量のバンドを示した。 これは、PGタンパク質がW50株で発現し、組換えタンパク質が天然タンパク質と 少なくともいくらか同一の免疫原性を有することを示す。
【０１６９】mRNA分析 熱フェノールRNA抽出 P.gingivalis W50細胞（150ml培養物）を嫌気的に中間対数期（OD A600=0.18 ）まで増殖させ、50%グリセロールと混合し、RNA抽出まで-70℃で貯蔵した。細 胞を6000gで遠心分離してペレット化し、8ml ASE(20mM NaOAc, 0.5% SDS, 1mM E
DTA)中に再懸濁した。等容積の20mM NaOAc(pH 4.5)飽和フェノールを加え、30秒
間振とうして混合し、65℃で5分間インキュベートし、さらに5秒間振とうし、イ
ンキュベーションを繰り返した。冷却後、2mlクロロホルムを加え、5秒間振とう
して混合し、該混合物を10000gで10分間4℃で回転させた。上部水相を移し、フ ェノールおよびクロロホルム工程を繰返して再抽出した。該水相を再び移し、10
0U RNase阻害剤（RNAsin；Promega）を加えた。RNAを、3容積の100%エタノール を用いて、-20℃で一夜沈降させた。RNA沈降物を、10000gで4℃で15分間、遠心 分離して回収し、その後、100%エタノールで洗浄し、乾燥し、そして、600μlの
無菌、脱イオンdH2O中に1μlの新しいRNase阻害剤と共に再懸濁した。RNAのアリ
コートをとり、-70℃で貯蔵した。RNA濃度を分光光度法により定量した。ホルム
アルデヒドRNAゲルによりRNA純度を確かめた（Sambrook J.ら, 1989, Molecular
Cloning. A laboratory manual（分子クローニング 実験室マニュアル）. Col
d Spring Laboratory Press, New York,第2版）。
【０１７０】RT-PCR 単離したRNAを逆転写（RT）用鋳型として使い、cDNAを作った。各RNA転写物が
様々なレベルで存在しうるように、RTに使うRNA濃度を変化させた。続いてcDNA の増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使って実施した。RT-PCRは、次のPCR
条件を除いて、製造業者のプロトコルに従いGeneAmp（登録商標）RNA PCRキット
（Perkin Elmer）を使って実施した；次のPCR条件で35サイクルを実施した：融 解期（melt phase）は95℃で30秒、アニール期（anneal phase）は50-60℃の間 で変化させて30秒、伸長期（extension phase）は72℃で1分間。増幅は、PTC-10
0プログラマブルサーマルコントローラー（MJ Research Inc.）中で実施した。 増幅産物が汚染DNAから生じなかったことを実証するための対照として、平行チ ューブはリバーストランスクリプターゼ（RTase）を省略した。該PCR産物を、エ
チジウムブロマイドで染色した1%アガロースゲル上でDNAマーカー（GIBCO 1kB ラダー）に対して試験した。
【０１７１】 以下の変更を除くと、先に記載の「組換えP.gingivalis遺伝子のクローニング
、発現および精製（Cloning,expression and purification of recombinant P.g
ingivalis genes）」の節で使ったオリゴヌクレオチドプライマーを使って実施 したRT-PCR結果を表６に示す。PG1に対して使った3'リバースプライマーは、GCG
CCTCGAGATTCATTTCCTTATAGAGであり、PG4に対する5'フォワードプライマーはCTTC
TTGTCGACTACAGCGGACATCATAAAATCでありかつ3'リバースプライマーはTTCCACCTCGA
GTTAACGCAACTCTTCTTCGATであり、PG6に対する5'フォワードプライマーはTAAAGAA
TTCTGCCTCGAACCCATAATTGCTCCGであり、PG10に対する5'フォワードプライマーはC
GCGCATATGGATAAAGTGAGCTATGCでありかつ3'リバースプライマーはCGCGCTCGAGTTTG
TTGATACTCAATAATTCであり、PG13に対する5'フォワードプライマーはGCCCGGCGCCA
TGCGGACAAAAACTATCTTTTTTGCGでありかつ3'リバースプライマーはGCCCGGCGCCTTAG
TTGTTGAATCGAATCGCTATTTGAGCであった。P.gingivalis転写物の増幅は、特定の候
補に対するRNAが存在しそのタンパク質が産生される見込みのあることを示して いる。しかし、増幅が達成されない場合、この遺伝子が決して転写されないこと
を示すのでなく、培養条件または収穫時の細胞の状態の結果でありうる。
【０１７２】
【表６】
【０１７３】
【表７】
【０１７４】 当業者であれば、広く記載した本発明の精神または範囲から外れることなく、
特定の実施様態で示したように多数の変更および／または改変を本発明に行いう
ることが理解されよう。それ故に、本発明の実施様態は、全ての点で、説明とし
て考えられるべきであり、限定として考えられるべきでない。
【０１７５】参考文献 １． Lipman DJ, Pearson WR. 1985. 迅速かつ高感度のタンパク質類 似性の探索（Rapid and sensitive protein similarity searches.）。 Science 277:1435-1441. ２． Horton, P. and Nakai, K. (1996). タンパク質の細胞における局在部 位を予測するための確率論的な分類システム（A probabilistic classification system for predicting the cellular localization sites of proteins.）。Intellig. Syst. Mol. Biol. 4: 109115. ３． Nakai K, Kanehisa M. 1991. グラム陰性細菌におけるタンパク 質局在部位を予測するための専門的なシステム（Expert systems for predicting protein localization sites in Gram-negative bacteria.）。Proteins: Structure, Function, and Genetics 11:95- 110. ４． Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S and von Heijne G. 1997. 原核細 胞および真核細胞シグナルペプチドの同定およびそれらの切断部位の予測 (Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites.）。Protein Engineering 10,1-6. ５． Claros MG and G von Heijne. (1994). TopPred II: 膜タンパク質 の構造予測のための改良されたソフトウェア（an improved software for mbrane protein structure predictions.）。Comput. Appl. Biosci. 10: 685-686. ６． Borodovsky M, Rudd KE, and EV Koonin. (1994). 細菌ゲノム遺伝 子を検出するための内因性および外因性の方法（Intrinsic and extrinsic approaches for detecting genes in a bacterial genome.)。 Nucleic Acids Res. 22:4756-4767. ７． Struvye M, Moons M, Tommassen J. 1991.カルボキシ末端のフェニ ルアラニンは細菌外膜タンパク質の正確な構築に重要である （Carboxy-terminal phenylalanine is essential for the correct assembly of a bacterial outer membrane protein）。J. Mol. Biol. 218:141-148. ８． Aduse-Opoku J, Slaney JM, Rangarajan M, Muir J, Young KA, Curtis MA. 1997. Porphyromonas gingivalis W50のTlaレセプ タータンパク質（The Tla receptor protein of Porphyromonas gingivalis W50）:RI前駆体の相同物（PrpRI)は低レベルのヘミ ン上での増殖に必要な外膜受容体である（a homolog of the RI precursor (PrpRI) is an outer membrane receptor required for growth on low levels of hemin.）。 J. Bacteriol. 179:4778-4788. ９． Needleman SB, Munsch CD. 1970. ２つのタンパク質のアミノ 酸配列の類似性の探索に応用できる一般的な方法（A general method applicable to the search of similarity in the amino acid sequence of two proteins.）。J. Molec. Biol. 48: 443-453.
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/195 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８５ 16/12 1/19 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ＰＰ １５４６ (32)優先日 平成10年１月30日(1998．1．30) (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (31)優先権主張番号 ＰＰ ２２６４ (32)優先日 平成10年３月10日(1998．3．10) (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (31)優先権主張番号 ＰＰ ２９１１ (32)優先日 平成10年４月９日(1998．4．9) (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (31)優先権主張番号 ＰＰ ３１２８ (32)優先日 平成10年４月23日(1998．4．23) (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (31)優先権主張番号 ＰＰ ３３３８ (32)優先日 平成10年５月５日(1998．5．5) (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (31)優先権主張番号 ＰＰ ３６５４ (32)優先日 平成10年５月22日(1998．5．22) (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (31)優先権主張番号 ＰＰ ４９１７ (32)優先日 平成10年７月29日(1998．7．29) (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (31)優先権主張番号 ＰＰ ４９６３ (32)優先日 平成10年７月30日(1998．7．30) (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (31)優先権主張番号 ＰＰ ５０２８ (32)優先日 平成10年８月４日(1998．8．4) (33)優先権主張国 オーストラリア（ＡＵ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 パターソン，ミシェル，アン オーストラリア国 3028 ヴィクトリア 州，レイバートン，コッタール ウェイ 14 (72)発明者 エイギアス，キャサリーン，テレセ オーストラリア国 3128 ヴィクトリア 州，ボックス ヒル サウス，エルガー ロード 250 (72)発明者 ロセル，リンダ，ジョイ オーストラリア国 3163 ヴィクトリア 州，グレン ハントリー，ロスチャイルド ストリート 10 (72)発明者 マーゲッツ，メイ，ブリジッド オーストラリア国 3039 ヴィクトリア 州，ムーニー ポンズ，ベント ストリー ト 92 (72)発明者 ホッキング，ダイアナ，マーガレット オーストラリア国 3031 ヴィクトリア 州，フレミントン，アイラワラ ロード 49 (72)発明者 ウェッブ，エリザベス，アン オーストラリア国 3422 ヴィクトリア 州，エルサム，ジッグザグ ロード 36 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA31 BA50 CA04 CA09 DA06 EA04 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QQ06 QR32 QR55 QS32 QS33 4B064 AG01 AG27 CA02 CA19 CC24 DA01 DA15 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 AC15 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA18 BA19 BA20 BA21 BA22 BA44 CA53 DA33 DA39 DC01 ZA672 ZB092 4C085 AA03 AA13 AA14 BA15 BB22 DD62 DD63 DD88 GG02 GG03 GG04 GG05 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA11 DA76 DA86 EA29 EA31 EA52 FA74

Claims (34)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次のアミノ酸配列： 配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択される
    アミノ酸配列、または 配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択される
    アミノ酸配列と少なくとも85％、好ましくは少なくとも95％同一であるアミノ酸
    配列、または 配列番号265〜528、配列番号531および配列番号532からなる群より選択される
    連続アミノ酸配列と同一である少なくとも40個のアミノ酸の連続配列を有する少
    なくとも40アミノ酸、 を含んでなる、単離された抗原性Porphorymonas gingivalisポリペプチド。
  2. 【請求項２】 前記ポリペプチドが配列番号265〜528、配列番号531および 配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記 載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】 前記ポリペプチドが配列番号265〜528、配列番号531および 配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも85％、好まし くは少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のポリ
    ペプチド。
  4. 【請求項４】 前記ポリペプチドが配列番号265〜528、配列番号531および 配列番号532からなる群より選択される連続アミノ酸配列と同一である少なくと も40個のアミノ酸の連続配列を有する少なくとも40アミノ酸を含んでなる、請求
    項１記載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】 前記ポリペプチドが、 配列番号386〜528および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列 、または 配列番号386〜528および配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列 と少なくとも85％、好ましくは少なくとも95％同一であるアミノ酸配列、または 配列番号386〜528および配列番号532からなる群より選択される連続アミノ酸 配列と同一である少なくとも40個のアミノ酸の連続配列を有する少なくとも40ア
    ミノ酸、 を含んでなる、請求項１記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】 前記ポリペプチドが配列番号386〜528および配列番号532か らなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のポリペプチ
    ド。
  7. 【請求項７】 前記ポリペプチドが配列番号386〜528および配列番号532か らなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも85％、好ましくは少なくとも
    95％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 前記ポリペプチドが配列番号386〜528および配列番号532か らなる群より選択される連続アミノ酸配列と同一である少なくとも40個のアミノ
    酸の連続配列を有する少なくとも40アミノ酸を含んでなる、請求項１記載のポリ
    ペプチド。
  9. 【請求項９】 前記ポリペプチドが配列番号386、配列番号424、配列番号42
    5、配列番号434、配列番号447、配列番号458、配列番号475、配列番号498、配列
    番号499、配列番号500、配列番号501、配列番号387、配列番号400、配列番号411
    、配列番号419、配列番号420、配列番号427、配列番号429、配列番号433、配列 番号437、配列番号438、配列番号443、配列番号444、配列番号448、配列番号449
    、配列番号452、配列番号455、配列番号457、配列番号459、配列番号461、配列 番号462、配列番号463、配列番号467、配列番号468、配列番号469、配列番号482
    、配列番号484、配列番号485、配列番号494、配列番号508、配列番号509、配列 番号510、配列番号520、配列番号521、配列番号522、配列番号525、配列番号526
    、配列番号528、配列番号389、配列番号390、および配列番号391からなる群より
    選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項６記載のポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 表３に示したリーダー配列を欠く配列番号386〜528および
    配列番号532からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、単離された 抗原性Porphorymonas gingivalisポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチドをコー
    ドするヌクレオチド配列またはストリンジェント条件下でそれにハイブリダイズ
    する配列を含んでなる、単離されたDNA分子。
  12. 【請求項１２】 前記DNA分子が配列番号１〜264、配列番号529および配列 番号530からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１１ 記載の単離されたDNA分子。
  13. 【請求項１３】 転写調節配列に機能しうる形で連結された請求項１１また
    は１２記載のDNA分子を含有する組換え発現ベクター。
  14. 【請求項１４】 請求項１３記載の組換え発現ベクターを含有する細胞。
  15. 【請求項１５】 請求項１４記載の細胞をポリペプチドの発現を可能にする
    条件下で培養することを含んでなる、P. gingivalisポリペプチドの産生方法。
  16. 【請求項１６】 有効量の請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチ
    ド少なくとも１種および製薬上許容される担体を含有する、被験者においてP. g
    ingivalisに対する免疫応答を引き出すための組成物。
  17. 【請求項１７】 前記組成物が請求項１１または１２記載のDNA分子少なく とも１種をさらに含有する、請求項１６記載の組成物。
  18. 【請求項１８】 製薬上許容される担体がアジュバントである、請求項１６
    または１７記載の組成物。
  19. 【請求項１９】 被験者に請求項１６〜１８のいずれか１項記載の組成物を
    投与することによってP. gingivalis感染の処置を施すことを含んでなる、被験 者のP. gingivalis感染を処置する方法。
  20. 【請求項２０】 前記処置が予防的処置である、請求項１９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記処置が治療的処置である、請求項１９記載の方法。
  22. 【請求項２２】 有効量の請求項１１または１２記載のDNA分子少なくとも １種および製薬上許容される担体を含有する、被験者においてP. gingivalisに 対する免疫応答を引き出すための組成物。
  23. 【請求項２３】 製薬上許容される担体がアジュバントである、請求項２２
    記載の組成物。
  24. 【請求項２４】 被験者に請求項２２または２３記載の組成物を投与するこ
    とによってP. gingivalis感染の処置を施すことを含んでなる、被験者のP. ging
    ivalis感染を処置する方法。
  25. 【請求項２５】 前記処置が予防的処置である、請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記処置が治療的処置である、請求項２４記載の方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリペプチドに対し
    て誘導された抗体。
  28. 【請求項２８】 ポリクローナルである、請求項２７記載の抗体。
  29. 【請求項２９】 モノクローナルである、請求項２７記載の抗体。
  30. 【請求項３０】 請求項２７〜２９のいずれか１項記載の抗体少なくとも１
    種を含有する組成物。
  31. 【請求項３１】 経口使用に適している、請求項３０記載の組成物。
  32. 【請求項３２】 少なくとも18個のヌクレオチドを含み、配列番号１〜121 、配列番号529およびそれらに相補的な配列からなる群より選択される連続ヌク レオチドと同一である少なくとも18ヌクレオチドの連続配列を有するヌクレオチ
    ドプローブ。
  33. 【請求項３３】 検出可能な標識をさらに含む、請求項３２記載のヌクレオ
    チドプローブ。
  34. 【請求項３４】 サンプル中のP. gingivalis核酸の存在を検出する方法で あって (a) サンプルと請求項３２または３３記載のヌクレオチドプローブとを、該プ
    ローブと該サンプル中のP. gingivalis核酸との間でハイブリッドが形成される 条件下で接触させ、 (b) ステップ(a)で形成されたハイブリッドを検出し、その際、ハイブリッド の検出が該サンプル中のP. gingivalis核酸の存在を示す、 ことからなる方法。
JP2000524441A 1997-12-10 1998-12-10 Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓポリペプチドおよびヌクレオチド Pending JP2001526035A (ja)

Applications Claiming Priority (23)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2911 1985-10-15
AUPP0839A AUPP083997A0 (en) 1997-12-10 1997-12-10 Porphyromonas gingivalis nucleotides
AUPP1182A AUPP118297A0 (en) 1997-12-31 1997-12-31 P. gingivalis sequences
AUPP1546A AUPP154698A0 (en) 1998-01-30 1998-01-30 P. gingivalis sequences
AUPP2264A AUPP226498A0 (en) 1998-03-10 1998-03-10 Porphyromonas gingivalis probes and polypeptides
AUPP2911A AUPP291198A0 (en) 1998-04-09 1998-04-09 P. gingivalis sequences
AUPP3128A AUPP312898A0 (en) 1998-04-23 1998-04-23 Porphyromonas gingivalis antigens and probes
AUPP3338A AUPP333898A0 (en) 1998-05-05 1998-05-05 P. gingivalis sequences
AUPP3654A AUPP365498A0 (en) 1998-05-22 1998-05-22 P. gingivalis sequences
AUPP4917A AUPP491798A0 (en) 1998-07-29 1998-07-29 P.gingivalis nucleotides and polypeptides
AUPP4963A AUPP496398A0 (en) 1998-07-30 1998-07-30 P.gingivalis polypeptides
AU3654 1998-08-04
AU4963 1998-08-04
AUPP5028A AUPP502898A0 (en) 1998-08-04 1998-08-04 P.gingivalis antigens
AU3128 1998-08-04
AU1546 1998-08-04
AU4917 1998-08-04
AU2264 1998-08-04
AU1182 1998-08-04
AU5028 1998-08-04
AU0839 1998-08-04
PCT/AU1998/001023 WO1999029870A1 (en) 1997-12-10 1998-12-10 Porphorymonas gingivalis polypeptides and nucleotides
AU3338 1999-11-15

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009029661A Division JP5349070B2 (ja) 1997-12-10 2009-02-12 Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓポリペプチドおよびヌクレオチド

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2001526035A true JP2001526035A (ja) 2001-12-18
JP2001526035A5 JP2001526035A5 (ja) 2006-01-05

Family

ID=27581380

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000524441A Pending JP2001526035A (ja) 1997-12-10 1998-12-10 Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓポリペプチドおよびヌクレオチド
JP2009029661A Expired - Fee Related JP5349070B2 (ja) 1997-12-10 2009-02-12 Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓポリペプチドおよびヌクレオチド

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009029661A Expired - Fee Related JP5349070B2 (ja) 1997-12-10 2009-02-12 Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓポリペプチドおよびヌクレオチド

Country Status (10)

Country Link
EP (10) EP2256205B1 (ja)
JP (2) JP2001526035A (ja)
KR (1) KR100603552B1 (ja)
AT (1) ATE534742T1 (ja)
AU (1) AU1648799A (ja)
CA (1) CA2313823A1 (ja)
DK (2) DK1908772T3 (ja)
ES (2) ES2377751T3 (ja)
NZ (1) NZ504811A (ja)
WO (1) WO1999029870A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007529195A (ja) * 2003-08-15 2007-10-25 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション，インク． 歯周病の診断，治療，およびモニタリングのためのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ毒性ポリヌクレオチドの同定
JP2010532766A (ja) * 2007-07-12 2010-10-14 オーラル ヘルス オーストラリア ピーティーワイ リミテッド バイオフィルムに対する免疫学的治療
WO2012081306A1 (ja) * 2010-12-15 2012-06-21 サンスター株式会社 歯周病原菌血漿または血清抗体価検査キット
JP2015178533A (ja) * 2009-08-02 2015-10-08 サノフィ パストゥール リミテッドＳａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチド

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6833262B1 (en) 1999-04-21 2004-12-21 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Polypeptide having amidolytic activity for a serpin
WO2000063394A2 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. A polypeptide having amidolytic activity for a serpin
AUPQ485999A0 (en) * 1999-12-24 2000-02-03 Csl Limited P. gingivalis antigenic composition
AUPQ718200A0 (en) 2000-04-28 2000-05-25 Csl Limited Porphyromonas gingivalis recombinant proteins and truncations
AU2001252042B2 (en) * 2000-04-28 2005-12-01 Csl Limited Porphyromonas gingivalis recombinant proteins and truncations
JP2003192616A (ja) * 2001-12-27 2003-07-09 Univ Nihon 歯周病用ｄｎａワクチン
GB0411150D0 (en) * 2004-05-19 2004-06-23 Queen Mary & Westfield College Vaccine
JP2009544279A (ja) * 2006-06-27 2009-12-17 オーラル ヘルス オーストラリア ピーティーワイ リミテッド 歯周病の予防に有用なポルフィロモナス・ジンジバリスポリペプチド
AU2013203250B2 (en) * 2007-07-12 2014-11-13 Oral Health Australia Pty Ltd Immunology treatment for biofilms
ES2432690T3 (es) 2007-07-12 2013-12-04 Oral Health Australia Pty Ltd Tratamiento de biopelícula
JP6310631B2 (ja) * 2011-10-18 2018-04-11 サンスター株式会社 歯周病原菌血漿または血清抗体価検査キット
BR112019005935A2 (pt) 2016-09-29 2019-06-11 Meharry Medical College inibidores bacterianos
CN111172177B (zh) * 2019-07-30 2023-08-08 镇江市江澜绿洲生物技术有限公司 cra4S1基因及其编码的蛋白和应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5047238A (en) 1983-06-15 1991-09-10 American Home Products Corporation Adjuvants for vaccines
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5830710A (en) * 1988-09-08 1998-11-03 University Of Florida Cloned porphyromonas gingivalis genes and probes for the detection of periodontal disease
US5798224A (en) * 1992-12-29 1998-08-25 Doheny Eye Institute Nucleic acids encoding protocadherin
US5643781A (en) * 1992-12-29 1997-07-01 Doheny Eye Institute DNA encoding protocadherin-42
US5475097A (en) 1993-10-21 1995-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Lysine-specific Porphyromonas gingivalis proteinase
US5523390A (en) 1993-09-10 1996-06-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Porphyromonas gingivalis arginine-specific proteinase
AU7822394A (en) * 1993-10-08 1995-05-04 Lion Corporation Fimbrillin protein of porphyromonas gingivalis
AUPN015794A0 (en) 1994-12-20 1995-01-19 Csl Limited Variants of human papilloma virus antigens
AUPN627595A0 (en) * 1995-10-30 1995-11-23 University Of Melbourne, The Diagnostics and treatments of periodontal disease
AU742668B2 (en) * 1996-03-22 2002-01-10 Morehouse School Of Medicine Immunogenic compositions comprising porphyromonas gingivalis peptides and methods
AUPN901296A0 (en) * 1996-03-29 1996-04-26 University Of Melbourne, The Porphyromonas gingivalis antigens for the diagnosis and treatment of periodontitis
AUPO652897A0 (en) * 1997-04-30 1997-05-29 University Of Melbourne, The Synthetic peptide constructs for the diagnosis and treatment of periodontitis

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007529195A (ja) * 2003-08-15 2007-10-25 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション，インク． 歯周病の診断，治療，およびモニタリングのためのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ毒性ポリヌクレオチドの同定
JP2010532766A (ja) * 2007-07-12 2010-10-14 オーラル ヘルス オーストラリア ピーティーワイ リミテッド バイオフィルムに対する免疫学的治療
JP2014058541A (ja) * 2007-07-12 2014-04-03 Oral Health Australia Pty Ltd バイオフィルムに対する免疫学的治療
JP2015178533A (ja) * 2009-08-02 2015-10-08 サノフィ パストゥール リミテッドＳａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ポリペプチド
WO2012081306A1 (ja) * 2010-12-15 2012-06-21 サンスター株式会社 歯周病原菌血漿または血清抗体価検査キット
JPWO2012081306A1 (ja) * 2010-12-15 2014-05-22 サンスター株式会社 歯周病原菌血漿または血清抗体価検査キット
US8975032B2 (en) 2010-12-15 2015-03-10 Sunstar Inc. Test kit for plasma or serum antibody titer against periodontal disease-causing bacteria

Also Published As

Publication number Publication date
EP2256204A1 (en) 2010-12-01
ES2377751T3 (es) 2012-03-30
KR20010033030A (ko) 2001-04-25
EP2283853A3 (en) 2011-05-11
EP1908772A3 (en) 2008-12-03
EP2283852A3 (en) 2011-05-04
EP2256205B1 (en) 2013-04-03
EP1908772A2 (en) 2008-04-09
KR100603552B1 (ko) 2006-07-20
EP1681350A3 (en) 2007-07-18
ATE534742T1 (de) 2011-12-15
CA2313823A1 (en) 1999-06-17
EP1681350A2 (en) 2006-07-19
AU1648799A (en) 1999-06-28
NZ504811A (en) 2003-10-31
EP2283854A3 (en) 2011-04-06
EP2283855A3 (en) 2011-05-04
EP1037999A4 (en) 2005-03-23
EP2283855A2 (en) 2011-02-16
EP1908772B1 (en) 2011-11-23
JP2009136300A (ja) 2009-06-25
EP2256205A1 (en) 2010-12-01
EP2283854A2 (en) 2011-02-16
DK1908772T3 (da) 2012-03-19
JP5349070B2 (ja) 2013-11-20
EP2283853A2 (en) 2011-02-16
DK2256205T3 (da) 2013-07-08
EP2264176A1 (en) 2010-12-22
EP1037999A1 (en) 2000-09-27
EP2283852A2 (en) 2011-02-16
ES2419664T3 (es) 2013-08-21
WO1999029870A1 (en) 1999-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5349070B2 (ja) Ｐｏｒｐｈｏｒｙｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓポリペプチドおよびヌクレオチド
US8642731B2 (en) Porphyromonas gingivalis polypeptides and nucleotides
EZZELL et al. Serum protease cleavage of Bacillus anthracis protective antigen
JP2004135679A (ja) Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓポリヌクレオチドおよび配列
JP2002529046A (ja) Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのポリヌクレオチドおよびポリペプチド
US7544777B2 (en) Porphorymonas gingivalis polypeptides and nucleotides
US6444799B1 (en) P. gingivalis polynucleotides and uses thereof
EP0946730B1 (en) Mutants of streptococcal toxin c and methods of use
US6669940B2 (en) Recombinant fusobacterium necrophorum leukotoxin vaccine and preparation thereof
WO1998024911A2 (en) Mutants of streptococcal toxin a and methods of use
US20040047871A1 (en) Recombinant fusobacterium necrophorum leukotoxin vaccine and prepaation thereof
AU6128900A (en) Nucleic acids and proteins of the mycoplasma hyopneumoniae mph3 gene and uses thereof
AU2010200996B2 (en) Porphyromonas gingivalis polypeptides and nucleotides
Barr et al. Ross et a1.
JP2012505209A (ja) Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの新規毒力因子

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20050831

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050831

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080415

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080714

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080812

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20081106

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20081113

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090317

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20090615

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20090615