JP2003192616A

JP2003192616A - 歯周病用ｄｎａワクチン

Info

Publication number: JP2003192616A
Application number: JP2001397627A
Authority: JP
Inventors: Yoshimitsu Abiko; 宜光安孫子; Koichi Hiratsuka; 浩一平塚; Ryoichi Jinno; 良一神野
Original assignee: Nihon University
Current assignee: Nihon University
Priority date: 2001-12-27
Filing date: 2001-12-27
Publication date: 2003-07-09
Also published as: WO2003055529A1; AU2002367108A1

Abstract

(57)【要約】【課題】歯周病の予防もしくは治療用の新たなDNAワ
クチンを提供することを目的とする。【解決手段】歯周病の原因菌であるPorphyromonas gi
ngivalisの外膜蛋白質をコードする遺伝子を哺乳動物発
現系プラスミドに導入し、このプラスミドをマウスに投
与することにより、外膜蛋白質に特異的な抗体産生が誘
導され、この抗体は、歯周病の発症および進展に深く関
わっているPorphyromonas gingivalisとStreptococcus
gordoniiとの凝集を有意に阻害する。従って、この外膜
蛋白質をコードする遺伝子が歯周病の予防もしくは治療
用のDNAワクチンとして極めて有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Porphyromonas gi
ngivalisの外膜蛋白質をコードする遺伝子を有効成分と
する歯周病の予防もしくは治療用DNAワクチンに関す
る。更に詳細には、配列表の配列番号１に示す２２〜３
４５番目のアミノ酸配列からなるPorphyromonas gingiv
alisの外膜蛋白質をコードする遺伝子、あるいは配列番
号１の２２〜３４５番目のアミノ酸配列において１個も
しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換および/または
付加したアミノ酸配列を有する蛋白質であって配列番号
１に示す２２〜３４５番目のアミノ酸配列からなるPorp
hyromonas gingivalisの外膜蛋白質と同様の機能を有す
る蛋白質をコードする遺伝子を、非ウイルスベクターま
たはウイルスベクターに発現可能なように挿入された形
態で、有効成分として含有する歯周病の予防もしくは治
療用DNAワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】歯科領域における2大疾患としてう蝕と
歯周病があり、この両疾患が歯の喪失原因の多くを占め
ており、40歳代以上になると歯周病が歯の喪失原因の第
１位となる。特に高齢者のQuality of Life実現に不可
欠な口腔の健康維持が、この歯周病によって脅かされて
いるのが現状である。う蝕には原因菌としてStreptococ
cusが、歯周病には主要な原因菌としてPorphyromonas g
ingivalisが関与していることが分かっている。これら
の口腔常在菌は、同菌種間あるいは異菌種間で凝集して
存在しており、このような凝集は菌の口腔内組織への定
着に深く関わっている。またこのような凝集塊を形成す
ることにより食菌作用に対し抵抗性を持ち、菌を定着・
増殖させることから、凝集塊の形成が歯周病の進展に深
く関与している可能性も報告されている（Ochiai, K. e
t al., J. Med. Microbial. 39: 183-190, 1990)。

【０００３】また歯周病原性細菌であるPorphyromonas
gingivalisの特異的な40-KDa外膜蛋白質の遺伝子がクロ
ーニングされ、この蛋白質の様々な病原性についての報
告もなされている（Abiko, Y. et al., Arch. Oral. Bi
ol. 35: 686-695, 1990）。更に歯肉溝細胞叢がグラム
陽性球菌からグラム陰性捍菌へ変遷する際に関与すると
考えられるStreptococcus gordoniiとPorphyromonas gi
ngivalisの凝集に40-KDa外膜蛋白質が関与することが報
告されている（Kamino,Y. et al., J. Oral Biol. 40,
187-195, 1998）。またPorphyromonas gingivalisの歯
肉上皮細胞への付着能、赤血球凝集能、プロテアーゼ活
性能にも40-KDa外膜蛋白質が関与することも報告されて
いる（Katoh,M. et al., J Periodont., 71, 368-375,
2000; Saitou, S. et al., J Periodont. 70, 610-617,
1999; Shibata, Y. et al., JBio. Chem. 274, 5012-5
020, 1999; Shibata, Y. et al., Infect. Immun. 66,
2207-2213, 1998; Abiko, Y. et al., Infect. Immun.
56, 3966-3969, 1997; Saitou, S. et al., General Ph
armacol. 28, 675-680, 1997; Saitou, S. et al.,Bioc
hem. Molecular Med. 58, 184-191, 1996; Hiratsuka,
K. et al., Arch.Oral. Biol 37, 717-724, 1992; Haya
kawa,M. et al., Int. J. Biochem. 24, 945-950, 199
2; Kawamoto,Y. et al., Int. J. Biochem. 23, 1053-1
061, 1991)。このように、40-KDa外膜蛋白質はPorphyro
monas gingivalisによる歯周病の発症および進展に深く
関わる重要な蛋白質と考えられている。

【０００４】他方、１９９０年にプラスミドDNAをマウ
スの筋肉に注射すると、そのDNAの遺伝情報に基き蛋白
質が筋肉細胞内で産生され長時間発現が持続するという
新たな知見が見出された（Wolff,J.A. et al., Scienc
e, 247, 1465-1468）。これに続いて１９９３年には、
インフルエンザウイルスの核蛋白質の遺伝子を、プロモ
ーターと連結したプラスミドDNAの形態でマウスの筋肉
内に投与することにより核蛋白質に特異的な抗体産生と
細胞障害性Tリンパ球が誘導され、更に接種を受けたマ
ウスはインフルエンザウイルスに曝露されても感染が成
立しにくいことが報告された（Ulmer,J.B., et al., Im
munology, 89, 59-67, 1996）。これの報告を契機とし
て、感染症の原因となる抗原をコードする遺伝子を感染
症の予防もしくは治療に用いる、いわゆるDNAワクチン
の研究が盛んに行われるようになった。例えば、インフ
ルエンザ、ウイルス性肝炎、マラリアといった多種多様
な感染症に対するDNAワクチンの研究開発が行われてき
た（Fyna,E.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90, 11478-11482, 1993; Davis, H.L. et al., AIDS,
3,765-766, 1989; Whalen,R.G. et al., Ann NY Acad.
Sci. 772, 64-76, 1995;Hoffman,S.L. et al., Vaccin
e, 12, 1529-1533, 1994; Sedegah,M. et al., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 91, 9866-9870, 1994）。このよ
うに、DNAワクチンは抗体産生と細胞障害性Tリンパ球を
誘導することから、現在では新たなワクチンとして研究
開発が盛んに行われている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】現在DNAワクチンの研
究開発が盛んに行われているものの、これまでにDNAワ
クチンを歯周病の予防もしくは治療用に用いる試みはな
されていない。従って、本発明の目的は、歯周病の予防
もしくは治療に有効な新たなDNAワクチンを提供するこ
とにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、歯周病の予
防もしくは治療用の新たなDNAワクチンを開発すること
を目的として鋭意研究した結果、歯周病の原因菌である
Porphyromonas gingivalisの外膜蛋白質をコードする遺
伝子を哺乳動物発現系プラスミドに導入し、このプラス
ミドをマウスに投与したところ、外膜蛋白質に特異的な
抗体産生が誘導され、この抗体は、歯周病の発症および
進展に深く関わっているPorphyromonasgingivalisとStr
eptococcus gordoniiとの凝集を有意に阻害することか
ら、この外膜蛋白質をコードする遺伝子が歯周病の予防
もしくは治療用のDNAワクチンとして有効であることを
見出し本発明を完成させた。従って、本発明は、Porphy
romonas gingivalisの外膜蛋白質をコードする遺伝子を
有効成分とする歯周病の予防もしくは治療用DNAワクチ
ンに関する。

【０００７】

【発明の実施の態様】本発明においてDNAワクチンの有
効成分として使用される遺伝子は、歯周病の主要な原因
菌として知られるPorphyromonas gingivalisの外膜蛋白
質をコードする遺伝子である。具体的には、配列表の配
列番号１に示す２２〜３４５番目のアミノ酸配列からな
るPorphyromonas gingivalisの外膜蛋白質をコードする
遺伝子である。なお、配列番号１の１〜２１番目のアミ
ノ酸配列はシグナルペプチドのアミノ酸配列に相当す
る。あるいは配列番号１の２２〜３４５番目のアミノ酸
配列において１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、
置換および/または付加したアミノ酸配列を有する蛋白
質であって配列番号１に示す２２〜３４５番目のアミノ
酸配列からなるPorphyromonas gingivalisの外膜蛋白質
と同様の機能を有する蛋白質をコードする遺伝子であっ
てもよい。ここで同様の機能を有する蛋白質とは、配列
番号１に示す２２〜３４５番目のアミノ酸配列からなる
外膜蛋白質と同様の抗原性を持ち歯周病の予防もしくは
治療用のワクチンとして同様に有効な抗体の産生を誘導
する蛋白質を指す。このような遺伝子としては、具体的
には配列番号２に示す６４〜１０３５番目の塩基配列か
らなる遺伝子が挙げられる。なお、配列番号２の１〜６
３番目の塩基配列はシグナルペプチドをコードする塩基
配列に相当する。配列番号１に示すアミノ酸配列および
配列番号２に示す塩基配列は、既に知られており公知で
ある（Abiko,Y. et al., Arch. Oral. Biol. 35: 689-6
95, 1990）。配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子
は、該遺伝子が挿入された既に公知のリコンビナントプ
ラスミド、例えば、Abiko,Y. et al., Arch. Oral. Bio
l. 35: 689-695, 1990に記載されたpMD125などをテンプ
レートとしてPCRを行うことによって得ることができ
る。あるいは既に公知のPorphyromonas gingivalis遺伝
子の配列情報に基づき適当なDNA部分をPCRのプライマー
として用い、Porphyromonas gingivalis由来のmRNAに対
してRT-PCR反応を行うことなどにより、cDNAをクローニ
ングすることもできる。これらのクローニングは、例え
ばMolecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Harbor L
aboratory Press(1989)等の基本書に従い、当業者なら
ば容易に行うことができる。また、配列番号１の２２〜
３４５番目のアミノ酸配列において１個もしくは数個の
アミノ酸残基が欠失、置換および/または付加したアミ
ノ酸配列を有する蛋白質であって配列番号１に示す２２
〜３４５番目のアミノ酸配列からなるPorphyromonas gi
ngivalisの外膜蛋白質と同様の機能を有する蛋白質をコ
ードする遺伝子は、配列番号２に示す６４〜１０３５番
目の塩基配列を有する遺伝子に対して、例えば部位特異
的突然変異誘発法などを適用することにより容易に得る
ことができ、具体的には上記Molecular Cloning等の基
本書を参考にして容易に行うことができる。

【０００８】本発明のDNAワクチンにおいては、上記し
た遺伝子は、通常非ウイルスベクターあるいはウイルス
ベクターに発現可能なように挿入された形態で用いられ
る。これらの非ウイルスベクターおよびウイルスベクタ
ーの調製法、投与法などは既に当業者に公知であり、例
えば、別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、
1996；別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊
土社、1997；日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究
ハンドブック、エヌ・ティー・エス、1999などが参考と
される。非ウイルスベクターとしては、哺乳動物の生体
内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであ
れば如何なる発現ベクターであってもよく、例えばpcDN
A3.1、pZeoSV、pBK-CMV（Invitrogen社、Stratagene
社）やpCAGGS（Gene 108,193-200(1991)）などの発現ベ
クターが挙げられる。これらの発現ベクターのプロモー
ターの下流域に発現可能なように上記遺伝子を挿入する
ことにより、本発明のDNAワクチンを調製することがで
きる。ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイル
ス、レトロウイルス等のウイルスベクターが代表的なも
のである。具体的には、例えば、無毒化したレトロウイ
ルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペス
ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポ
リオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、
SV４０、免疫不全症ウイルス（HIV）等のDNAウイルスま
たはRNAウイルスを挙げることができる。これらのう
ち、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスを用いた
場合よりもはるかに高いことから、アデノウイルスベク
ター系を用いることが好ましい。これらのウイルスベク
ターに上記遺伝子を発現可能なように挿入することによ
り、本発明のDNAワクチンを調製することができる。

【０００９】本発明のDNAワクチンをヒトへ導入する方
法としては、DNAワクチンを直接体内に導入するin vivo
法やヒトからある種の細胞を取り出して体外でDNAワク
チンを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo法
などがある（日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研
究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。in
vivo法としては、例えば本発明のDNAワクチンを適当な
溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶
解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次
いで無菌的な容器に充填して注射剤を調製して、ヒトへ
注射することにより投与される。注射剤には必要に応じ
て慣用の担体等を加えてもよい。また、脂質二重膜で作
られたリポソーム中にDNAワクチンを封入し、さらにこ
のリポソームと不活化したセンダイウイルス（Hemagglu
tinating virus of Japan : HVJ）とを融合させたHVJ−
リポソームとして投与することもできる（実験医学別
冊、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、1996；遺伝子導入
＆発現解析実験法、羊土社、1994)。本発明のDNAワクチ
ンは、筋肉、皮膚、鼻腔内等に投与することができる。
ex vivo法としては、リポフェクション法、リン酸−カ
ルシウム共沈法、DEAE−デキストラン法、微小ガラス管
などを用いて細胞内へDNAワクチンを直接注入する方法
などが挙げられる。

【００１０】本発明のDNAワクチンの投与量は、投与す
る対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、通常
成人１人当たりPorphyromonas gingivalisの外膜蛋白質
をコードする遺伝子として約500μｇから約50ｍｇの範
囲、好ましくは約500μｇから1ｍｇの範囲である。本発
明のDNAワクチンは、歯周病の発症および進展に深く関
わっているPorphyromonas gingivalisとStreptococcus
gordoniiとの凝集を有意に阻害することから、歯周病の
予防もしくは治療に極めて有効である。

【００１１】以下、実施例により本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定され
るものではない。実施例１DNAワクチンの調製１．DNAワクチン用プラスミドの構築 Porphyromonas gingivalisの40-kDaの外膜蛋白質（40-k
Da OMP）をコードする遺伝子が挿入されたリコンビナン
トプラスミドpMD125(Abiko, Y. et al., Arch.Oral. Bi
ol. 35: 689-695, 1990)をテンプレートとしてPCRを行
った。このpMD125には、図１に示す塩基配列からなるオ
ープン・リーディング・フレーム（ORF）が存在する。
図１の１〜６３番目の塩基配列はシグナルペプチド領域
に相当し、配列番号２の１〜６３番目の塩基配列と同じ
である。図１の６４〜１０３５番目の塩基配列は、配列
番号２の６４〜１０３５番目の塩基配列と同じでありPo
rphyromonas gingivalisの外膜蛋白質をコードする領域
である。プライマーの設計は図２に示したように、forw
ard primerとして２種類用意した。１つは全ORF領域を
増幅するためのforward primer、40kMAPV(F1)であり、
もう１つはシグナルペプチドをコードしている部分を除
いた後のコード遺伝子部分を増幅するためのforward pr
imer、40kMAPV(F2)である。後者は5'末端側にATGコドン
を添付しておくことで蛋白質が発現できるように設計し
た。両forward primerの塩基配列は図２に示した。共に
5'末端側にクローニングのためのKpn I制限酵素部位を
付加した。Reverse primerはORF上の５’末端側にXho I
部位を付加したストップコドンを含む領域として40kMAP
V(R)を設計した。40-kDa OMPコード遺伝子配列内にKpn
I部位およびXho I部位が存在しないことはあらかじめ確
認した。PCR条件は図３に示した。ワクチン用プラスミ
ドの構築は図４に示した。ワクチン用プラスミドの構築
は図４に示した。40kMAPV(F1)と40kMAP(R)とのプライマ
ーの組み合わせによりシグナルペプチド領域を含む1064
bpのDNA断片（以後F1という）と40kMAPV(F2)と40kMAP
(R)とのプライマーの組み合わせによりシグナルペプチ
ド領域を含まない994bpのDNA断片（以後F2という）をPC
Rにより得た。これらのDNA断片F1とF2を、KpnIとXhoIの
両制限酵素にて消化後、すでに両酵素で消化されている
pcDNA3.1(+)(5.4kb, Strategene社)のヒトサイトメガロ
ウイルスのプロモーターの下流に挿入し、E.coli JM109
に塩化カルシウム法にてトランスフォームした。F1挿入
プラスミドをpMD701、F2挿入プラスミドをpMD702と命名
した。またこれらのプラスミドでトランスフォーマント
された大腸菌をそれぞれMD701およびMD702と命名した。

【００１２】２．DNAワクチン用プラスミドの精製プラスミド大量抽出および精製は、エンドドキシンの除
去用のプラスミドDNA精製キット(Promega社)を用いて行
った。一昼夜培養後の上記１で得られたリコンビナント
大腸菌ペレットにCell Resuspension Solution (50mM T
ris-HCl, pH7.5; 10mM EDTA; 100μg/ml Rnase A)を加
え、よく懸濁した。次ぎにCell LysisSolution(0.2M Na
OH; 1% SDS)を加え、6〜8回転倒し完全に混和し、室温
にて5分間放置した。更にNeutralization Solution(1.3
2 M 酢酸カリウム, pH4.8)を加え、同様に6〜8回転倒し
完全に混和し、1,000×gにて20分遠心を行い、上清を回
収した。回収した上清にEndotoxin Removal Resinを加
え攪拌し、室温にて10分間放置した。マグネットを用い
Endotoxin Resinを回収し、上清を新しいチューブに移
した。この上清に5MグアニジンチオシアネートおよびMg
neSil(R)を加え室温にて3分間放置した。上清を捨て Wa
sh Solutionにて洗浄し、更に80%エタノールWash Solut
ionにて3回洗浄を行った。上清を捨て10分間放置し、完
全に風乾した。最後に滅菌水を加え、また必要に応じて
エタノール沈殿を行った。かくしてプラスミドpMD701お
よびpMD702を調製し、本発明のDNAワクチン用プラスミ
ドを得た。

【００１３】実施例２DNAワクチン用プラスミドの効果の確認１．動物への免疫 6週齢BALB/cマウス雌を明暗サイクル12時間の環境下に
て、オリエンタル固形飼料MF（オリエンタル酵母社製）
および水道水を摂取させた。このようにして飼育したマ
ウスに、実施例１で精製して得たDNAワクチン用プラス
ミドを各15匹のマウス左側大腿四頭筋に30μg(100μl)
ずつ、2週間に1回の割合で4回接種し、その後経時的に
眼窩静脈より採血を行った。免疫スケジュールは図５に
示した。プラスミドpcDNA3.1(+)のみの接種をコントロ
ール群とし、40-kDa OMP遺伝子が挿入されたプラスミド
pMD701およびpMD702接種をプラスミド群とした。

【００１４】２．免疫動物血清における40-kDa OMPに対
する抗体価の測定（１）方法 Kawamoto,Y. et al., Int. J. Biochem. 57, 1053-106
1, 1991に記載の方法に準じて、リコンビナント40-kDA
OMPを産生するリコンビナントクローンMD125を超音波破
砕しカラムを通して、リコンビナント40-kDa OMPを精製
した。このリコンビナント40-kDa OMPを用いて、免疫マ
ウスの血清におけるリコンビナント40-kDa OMPに対する
IgG抗体価をELISA法にて測定した。まず、リコンビナン
ト40-kDa OMPをCoating solutionにて2μg/mlに調整し9
6ウエルELISAプレートに100μl加え、1時間室温にて放
置した。次ぎにBSA Diluent/Blocking Solutionを300μ
l加え、再度15分室温にて1時間放置した。上記１で免疫
したマウスから採取した血清を段階希釈し、各ウエルに
100μl加え、室温にて1時間反応させた。Wash Solution
にて3回洗浄し、二次抗体を100μl加え、更に室温にて1
時間反応させた。洗浄しSubstrate Solutionを100μl加
え、反応させた。十分に反応させ発光した後Stop Solut
ionを100μl加え、反応を停止させた。波長405nmにて吸
光度を測定した。測定は、マイクロプレートリーダーを
用い波長405nmにて行い、最終希釈濃度は同波長にて吸
光度0.1以下となった時とした。（２）結果得られた結果を図６のグラフに示した。グラフから明ら
かなように、DNAワクチン用プラスミドpMD701およびpMD
702で免疫したマウスの血清中の抗体価は、免疫後の経
過日数に応じて有意に上昇し、従ってpMD701およびpMD7
02の投与により40-kDA OMPに対する抗体産生が誘導され
たことが判る。

【００１５】３．免疫動物において誘導された抗体のPo
rphyromonas gingivalisとStreptococ cus gordoniiとの
凝集に対する阻害効果の確認（１）ベシクルの精製 Porphyromonas gingivalis381株を、ヘミン(5μg/ml)お
よびビタミンK(0.5μg/ml)添加BHI培地で嫌気状態（80%
N₂, 10%H₂,および10%CO₂）にて培養した。培養液からの
ベシクルの精製はMayrand,D. et al., Can. J. Microbi
ol 35, 607-613, 1989に記載の方法に準じて行った。培
養液を100,000×gにて30分間遠心し得られた上清をultr
afiltration system(Millipore社)を用い、250mlに濃縮
した。濃縮後、0.5mM ジチオスレイトールを含む50mM T
ris-HCl(pH7.5)で4℃、一晩透析を行った。透析後、90,
000×gにて2時間遠心を行い、得られた沈殿物をPBSにて
懸濁し、再度4℃で一晩透析を行いベシクル懸濁液とし
た。ベシクルは使用するまで-20℃にて保存した。

【００１６】（２）凝集試験 i）方法 Ellen,R.P. et al., Infect. Immun. 57, 1618-1620, 1
989に記載の方法に準じてfloculation slideを用いて凝
集試験を行った。Streptococcus gordoniiをBHI培地で
嫌気状態（80%N₂, 10%H₂,および10%CO₂）にて培養し
た。培養後PBSに懸濁し、波長550nmにて吸光度1.5に調
整した。Storeptococcus gordonii調整液100μlに上記
（１）で精製したベシクル(0.7μg/ml)50μl加え、37℃
で10分間振とうさせた(60rev/min)。マウス血清による
凝集阻害試験は、上記の方法を基にベシクルをDNAワク
チン用プラスミド接種77日目のマウス血清50μlとで37
℃で10分間振とう（60rev/min）させた後、Streptococc
us gordonii調整液100μlを作用させて判定した。凝集
の判定は、Cisar,J.O. et al., Infect. Immun. 24, 74
2-752, 1979に記載の方法を基に"0"から"+4"で示した。
判定基準は以下の通りである。 0; 肉眼的に凝集体が認められない +1; 小さい凝集体が認められる +2; 明らかな凝集体が認められるが反応液は白く懸濁
している +3; 大きな凝集体が認められるもののいくらか反応液
が白く懸濁している +4; 大きな凝集体を形成し、反応液は明らかに澄んで
いる。

【００１７】ii）結果マウス血清処理（インキュベーション）時間と凝集スコ
アとの関係を図７に示した。図７の結果から判るよう
に、DNAワクチン用プラスミド非接種マウス血清で処理
したベシクルでは、混合4分後からStreptococcus gordo
niiとの凝集体が認められ、8分後にはスコア+4に達し
た。それに対してDNAワクチン用プラスミド接種マウス
血清処理では混合4分後まで凝集体は認められなかった
が、8分後にはスコア+2に達したものの10分後でもスコ
ア+2を維持していた。以上のことからDNAワクチン用プ
ラスミドを接種したマウス血清は、Porphyromonas ging
ivalisのベシクルとStreptococcus gordoniiとの凝集を
有意に阻害することが判った。図８は、凝集状態を示し
た写真である。A)はStoreptococcus gordiniiのみの写
真であり、B)はコントロールプラスミドpcDNA3.1(+)を
接種したマウス血清で処理した場合のPorphyromonas gi
ngivalisのベシクルとStreptococcus gordoniiとの凝集
を示した写真であり、C)はプラスミドpMD701で接種した
マウス血清で処理した場合のPorphyromonas gingivalis
のベシクルとStreptococcus gordoniiとの凝集を示した
写真である。これらの写真から判るように、DNAワクチ
ン用プラスミド接種マウス血清は、凝集を有意に阻害し
た。

【００１８】

【発明の効果】以上に記載した通り、歯周病の原因菌で
あるPorphyromonas gingivalisの外膜蛋白質をコードす
る遺伝子を哺乳動物発現系プラスミドに導入し、このプ
ラスミドをラットに投与することにより、外膜蛋白質に
特異的な抗体産生が誘導され、この抗体は、歯周病の発
症および進展に深く関わっているPorphyromonas gingiv
alisとStreptococcus gordoniiとの凝集を有意に阻害す
る。従って、この外膜蛋白質をコードする遺伝子が歯周
病の予防もしくは治療用のDNAワクチンとして極めて有
効である。

【００１９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Nihon University <120> DNA Vaccine for Periodontal Disease <130> DA-03231 <160> 2 <210> 1 <211> 345 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 1 Met Lys Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Ile Leu Ser Ser Met Ala Leu 1 5 10 15 Phe Asn Val Asn Ala Gln Glu Leu Lys Thr Ser Ala Asp Met Lys Gly 20 25 30 Ser Phe Lys Lys Asn Val Val Leu Glu Val Phe Thr Ala Glu Trp Cys 35 40 45 Gly Tyr Cys Pro Gly Gly Lys Glu Arg Ile Ala Lys Ala Ile Glu Met 50 55 60 Leu Asp Asp Glu Tyr Lys Glu Arg Val Phe Gln Thr Phe Val His Tyr 65 70 75 80 Asn Asp Gly Ile Ser Lys Lys Trp Pro Arg Val Gly Gln Leu Phe Ile 85 90 95 Ala Leu Asp Gln Thr Leu Gly Ile Pro Gly Phe Pro Thr Phe Ser Val 100 105 110 Cys Arg Met Glu Lys Lys Gly Glu Asn Leu Ser Ile Gly Ala Pro Ile 115 120 125 Ala Ile Lys Asn Lys Ile Met Lys Gly Phe Gly Asp Gly Thr Ala Pro 130 135 140 Ala Glu Val Asn Leu Lys Leu Thr Lys Gly Ala Thr Pro Glu Asp Val 145 150 155 160 Cys Thr Ala Thr Phe Thr Gly Lys Val Asp Ala Asp Leu Ile Gly Lys 165 170 175 Pro Leu Met Leu Thr Ala Tyr Val Leu Lys Asn Asn Met Lys Pro Ile 180 185 190 Asn Pro Gln Asn Gly Ala Gly Asp Gly Tyr Leu His Gln His Thr Val 195 200 205 Leu Met Ile Leu Ser Thr Asp Val Lys Gly Asp Ala Leu Asn Ile Ala 210 215 220 Ala Asp Gly Ser Phe Thr Ile Lys Lys Glu Phe Lys Leu Asp Gly Phe 225 230 235 240 Glu Ile Lys Asp Thr Asp Val Leu Ala Phe Val His His Pro Met Ser 245 250 255 Asn Ala Glu Asn His Ser Ile Ile Asn Ala Gly Gln Glu Ser Leu Asp 260 265 270 Lys Ala Glu Pro Thr Ala Thr Glu Gln Ile Val Ala Thr Pro Ser Val 275 280 285 Lys Ala Tyr Val Gln Asn Gly Lys Ile Val Val Glu Glu Glu Tyr Ser 290 295 300 Lys Met Glu Val Phe Asn Ala Thr Gly Gln Leu Val Lys Asn Glu Ser 305 310 315 320 Leu Val Pro Gly Val Tyr Val Val Arg Ile Thr Ala Asn Gly Val Met 325 330 335 His Phe Leu Lys Val Leu Val Pro 340 345 <210> 2 <211> 972 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis <400> 2 atgaaaagat tattactctc tgctgctatc ctaagtagta tggctttgtt taatgtcaat 60 gcacaagagt tgaaaacctc tgctgacatg aaaggttctt ttaagaagaa tgtggtattg 120 gaggtattta ctgccgaatg gtgcggttac tgtccaggtg gtaaagagcg cattgcaaaa 180 gcaattgaaa tgttggatga tgaatataag gagcgtgttt ttcagacatt tgttcattat 240 aatgatggga tctcaaaaaa atggcctcgt gttggccaac ttttcattgc attggatcaa 300 acattgggca ttccgggttt tccgactttt tcagtttgcc gtatggagaa aaaaggtgaa 360 aatctttcaa taggtgctcc aatagcaatt aaaaataaga ttatgaaagg ttttggtgat 420 ggtacagccc ctgcagaggt aaaccttaaa ttgaccaaag gtgcaacacc ggaagatgta 480 tgtacagcta catttactgg taaagtcgat gcagacctca tagggaaacc tcttatgttg 540 actgcatatg tattgaaaaa caatatgaag cctattaatc cgcaaaatgg agctggggat 600 ggatatctcc accaacatac tgtgttaatg attctctcca cagatgtaaa aggagacgct 660 ttaaatattg cagccgatgg aagttttacc atcaagaaag aatttaagtt ggatggcttt 720 gaaataaaag atacagatgt tcttgctttc gtacaccatc caatgtccaa tgcggaaaac 780 cattctatta tcaatgccgg gcaagaaagc cttgataaag cagagcctac agctacagaa 840 caaattgttg ctaccccctc tgtcaaagca tatgttcaga atggcaaaat tgttgtagag 900 gaagagtatt ccaagatgga agtattcaat gcaactggtc aacttgtcaa aaatgaatcc 960 cttgtccccg gtgtctatgt tgtccgtata acggcaaacg gtgtaatgca tttccttaaa 1020 gtcttagttc cttga 1035

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、リコンビナントプラスミドpMD125中に
存在するPorphyromonas gingivalisの外膜蛋白質の遺伝
子のオープン・リーディング・フレーム（ORF）の塩基
配列を示す。１〜６３番目の塩基配列はシグナルペプチ
ド領域、６４〜１０３５番目の塩基配列がコード領域に
相当する。

【図２】図２は、リコンビナントプラスミドpMD125中に
挿入されているPorphyromonasgingivalisの外膜蛋白質
をコードする遺伝子をPCR法によりクローニングするた
めのプライマーの設計を示したものである。

【図３】図３は、PCR条件を示したものである。

【図４】図４は、DNAワクチン用プラスミドの構築を示
す図である。pMD701はPorphyromonas gingivalisの外膜
蛋白質遺伝子のシグナルペプチド領域とコード領域を含
むDNA断片が挿入されたプラスミドであり、pMD702はシ
グナルペプチド領域を含まずコード領域を含むDNA断片
が挿入されたプラスミドである。

【図５】図５は、DNAワクチン用プラスミドpMD701およ
びpMD702でそれぞれマウスを免疫した際の免疫スケジュ
ールを示す。

【図６】図６は、DNAワクチン用プラスミドpMD701およ
びpMD702でそれぞれ免疫したマウスから採取した血清に
おけるPorphyromonas gingivalisの外膜蛋白質に対する
抗体価を示したものである。

【図７】図７は、DNAワクチン用プラスミドを接種した
マウス血清の、Porphyromonas gingivalisのベシクルと
Streptococcus gordoniiとの凝集に対する阻害活性を示
すグラフである。

【図８】図８は、DNAワクチン用プラスミドを接種した
マウス血清で処理した時の、Porphyromonas gingivalis
のベシクルとStreptococcus gordoniiとの凝集に対する
阻害を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者神野良一東京都千代田区九段南四丁目８番24号学校法人日本大学内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 CA02 CA20 DA03 EA02 EA04 GA11 HA17 4C084 AA13 CA04 NA14 ZB351 4C085 AA03 BA07 BA14 BB11 CC02 CC07 CC08 DD42 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 MA59 MA63 MA66 NA14 ZA67 ZC41 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA67 ZC41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 Porphyromonas gingivalisの外膜蛋白質
をコードする遺伝子を有効成分とする歯周病の予防もし
くは治療用DNAワクチン。
【請求項２】該遺伝子が、配列表の配列番号１に示す
２２〜３４５番目のアミノ酸配列からなる外膜蛋白質を
コードする遺伝子、あるいは配列番号１の２２〜３４５
番目のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ
酸残基が欠失、置換および/または付加したアミノ酸配
列を有する蛋白質であって配列番号１に示す２２〜３４
５番目のアミノ酸配列からなるPorphyromonas gingival
isの外膜蛋白質と同様の機能を有する蛋白質をコードす
る遺伝子である請求項１のDNAワクチン。
【請求項３】該遺伝子が、配列表の配列番号２に示す
６４〜１０３５番目の塩基配列からなる遺伝子である請
求項１または２のDNAワクチン。
【請求項４】該遺伝子が、非ウイルスベクターまたは
ウイルスベクターに発現可能なように挿入された形態に
ある請求項１から３のいずれかのDNAワクチン。
【請求項５】ヒトの筋肉、皮膚または鼻腔内に投与す
る請求項１から４のいずれかのDNAワクチン。
【請求項６】歯肉溝細胞叢においてPorphyromonas gi
ngivalisとStreptococcus gordoniiとの凝集を阻害して
歯周病を予防もしくは治療する請求項１から５のいずれ
かのDNAワクチン。