KR20220042116A

KR20220042116A - B형 간염 바이러스(HBV) 백신 및 HBV-타케팅 RNAi의 조합

Info

Publication number: KR20220042116A
Application number: KR1020227001641A
Authority: KR
Inventors: 헬렌 호튼; 안 마르틴 엠 드 크레우스; 잔 마틴 버크
Original assignee: 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니
Priority date: 2019-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2022-04-04
Also published as: CA3143418A1; WO2020255007A1; AU2020295796A1; TW202114731A; JP2022536945A; EP3986562A1; US20220305117A1; CN114340664A

Abstract

B형 간염 바이러스(HBV) 백신과 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제의 치료적 조합물이 기술된다. 구체적으로 만성 HBV 감염을 갖는 개인에서 개시된 치료적 조합물을 사용하여 HBV에 대한 면역 반응을 유도하거나 HBV-유도 질환을 치료하는 방법이 또한 기술된다.

Description

B형 간염 바이러스(HBV) 백신 및 HBV-타케팅 RNAi의 조합

전자 제출된 서열 목록에 대한 참조

본 출원은 EFS-Web을 통해 전자 제출된 ASCII 형식 서열 목록으로서 2020년 6월 15일에 작성되고, 47 kb 크기의 파일명 "065814_12WO1_Sequence_Listing"인 서열 목록을 포함한다. 상기 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 본 명세서에 전체가 참조로 통합된다.

관련 출원에 관한 상호 참조

본 출원은 2019년 6월 18일자로 출원된 미국 가출원 제62/862,754호의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 기재사항은 전체가 본 명세서에 참조로 통합된다.

발명의 배경

B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)는 4 개의 개방형 해독틀(open reading frame) 및 7 개의 단백질을 인코딩하는 3.2-kb의 작은 간친화성(hepatotropic) DNA 바이러스이다. 대략 2억 4000만 인구가 만성 B형 간염(만성 HBV)에 감염되었으며, 6 개월 이상 동안 혈액 내 지속적 바이러스 및 서브바이러스 입자로 특징지어진다(Cohen et al. J. Viral Hepat. (2011) 18(6), 377-83). 지속적 HBV 감염은 HBV-특이적 T 세포 수용체의 바이러스 펩티드 및 순환 항원에 의한 만성적인 자극을 통해 순환 T 세포 및 간내 HBV-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 소진으로 이어진다. 결과적으로 T 세포 다기능성이 감소된다(즉, IL-2, 종양괴사인자(TNF)-α, IFN-γ 수준 감소, 및 증식 부족).

HBV 감염에 대한 안전하고 효과적인 예방 백신은 1980년대 이래로 활용 가능하였으며 B형 간염 예방의 중심이다(World Health Organization, Hepatitis B: Fact sheet No. 204 [Internet] 2015 March.). 세계보건기구는 모든 유아의 백신접종, 그리고 B형 간염의 풍토성이 낮거나 중도인 국가에서는 모든 어린이 및 사춘기(18세 미만), 및 특정 취약 개체군 카테고리에 속하는 인구의 백신접종을 권장한다. 백신접종 덕분에 세계 감염률은 극적으로 감소해왔다. 그러나 예방 백신은 수립된 HBV 감염을 치유하지 않는다.

만성 HBV는 현재 IFN-α 및 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체로 치료되지만, 바이러스 RNA의 주형, 및 따라서 새로운 비리온으로서 기본적인 역할을 하며 감염된 간세포 내의 세포내 바이러스 복제 중간체, 소위 공유결합 폐환형 DNA(ccc DNA)의 잔존으로 인하여 궁극적 치유는 없다. 유도된 바이러스 특이적 T-세포 및 B-세포 반응이 효과적으로 cccDNA-보유 간세포를 제거할 수 있을 것으로 생각된다. 현재의 HBV 폴리머라제를 표적화하는 요법들은 바이러스 혈증을 억제하지만, 핵에 존재하는 cccDNA 및 관련된 순환 항원의 생산에는 제한된 효과를 제공한다. 가장 철저한 치유 형태는 유기체로부터 HBV cccDNA를 제거하는 것일 수 있지만, 이는 천연 결과로서 또는 임의의 치료적 개입의 결과로서 모두 관찰된 바 없다. 그러나, 질환 재발은 오로지 심각한 면역억제의 경우에만 발생하며 이는 이후 예방적 치료에 의해 예방될 수 있기 때문에, HBV 표면 항원(HBsAg)의 손실은 임상적으로 치유의 신뢰성 있게 상당한다. 따라서 적어도 임상적 관점에서, HBsAg의 손실은 가장 엄격한 형태의 HBV에 대한 면역 재구성과 연관된다.

예를 들어, 유한형 치료 과정의 지속된 치료 중단 반응의 면에서 페길화 인터페론(pegIFN)-α로의 면역 조절은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 요법과 비교하여 더 나은 것으로 입증되어 왔다. 직접적 항바이러스 효과는 물론, IFN-α는 세포 배양 및 인간화 마우스에서 cccDNA의 후성유전적 억제를 가하여 비리온 생산 및 전사의 감소에 이르게 하는 것으로 보고되었다(Belloni et al. J. Clin. Invest. (2012) 122(2), 529-537). 그러나 이 요법은 여전히 부작용을 안고 있으며 전반적 반응은 상당히 낮은데, 그 이유는 어느 정도 IFN-α가 HBV 특이적 T-세포에 부족한 조절적 영향만을 주기 때문이다. 구체적으로, 치유율은 낮고(< 10%) 독성은 높다. 유사하게, 직접적으로 작용하는 HBV 항바이러스제, 즉 HBV 폴리머라제 억제제인 엔테카비르(entecavir) 및 테노포비르(tenofovir)는 약제 내성 돌연변이 발생에 대한 높은 유전적 장벽 및 간질환 진행에 대한 연속 예방을 갖는 바이러스 억제 유도에서 단일 요법으로서 효과적이다. 그러나, HBsAg 손실 또는 혈청전환에 의해 규정되는 만성 B형 간염의 치유는, 이러한 HBV 폴리머라제 저해제에 의해서는 드물게 달성된다. 따라서, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 항레트로바이러스 요법과 유사하게, 이론상 이들 항바이러스제는 간 질환의 재발을 예방하기 위해서는 무한정으로 투여될 필요가 있다.

치료적 백신접종은 만성적 감염 환자로부터 HBV를 제거할 잠재성을 갖는다(Michel et al. J. Hepatol. (2011) 54(6), 1286-1296). 많은 전략들이 탐색되어왔지만, 지금까지 치료적 백신접종은 성공적이라고 입증되지 않았다.

발명의 간략한 요약

따라서, B형 간염 바이러스(HBV), 특히 만성 HBV의 치료에서 보다 높은 치유율을 갖는 유한형의 내약성이 우수한 치료를 위한 충족되지 않은 의학적 요구가 존재한다. 본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염에 대한 면역 반응을 유도하는 치료적 조합물 또는 조성물 및 방법을 제공함으로써 이 요구를 만족시킨다. 본 발명의 면역원적 조성물/조합물 및 방법은 대상체, 예컨대, 만성 HBV 감염을 갖는 대상체에 치료적 면역성을 제공하기 위해 사용될 수 있다.

일반적 양태에서, 본 출원은 HBV 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 HBV 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 하나 이상의 HBV 항원, 또는 HBV 항원을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 및 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 포함하는 치료적 조합물 또는 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 치료적 조합물은

i) a) 서열번호 2와 적어도 95%, 예컨대, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원,

b) 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자,

c) 서열번호 7과 적어도 90%, 예컨대, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 HBV 폴리머라제 항원으로서, 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 갖지 않는, HBV 폴리머라제 항원, 및

d) HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자

중 적어도 하나; 및

ii) HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제, 예컨대, 본 명세서에 기술된 것들을 포함한다.

일 구현예에서, 절두된 HBV 코어 항원은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고, HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한다.

일 구현예에서, 치료적 조합물은 HBV 폴리머라제 항원 및 절두된 HBV 코어 항원 중 적어도 하나를 포함한다. 특정 구현예에서, 치료적 조합물은 HBV 폴리머라제 항원 및 절두된 HBV 코어 항원을 포함한다.

일 구현예에서, 치료적 조합물은 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자, 및 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자 중 적어도 하나를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 비-천연 핵산 분자는 절두된 HBV 코어 항원의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 제2 비-천연 핵산 분자는 HBV 폴리머라제 항원의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게 신호 서열은 독립적으로 서열번호 9 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, 보다 바람직하게 신호 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 각각 인코딩된다.

특정 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 적어도 90%, 예컨대, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

특정 구현예에서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6에 적어도 90%, 예컨대, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명에 유용한 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제, 뿐만 아니라 이의 구조, 생산, 생물학적 활성, 치료적 적용, 투여 또는 전달 등과 같은 관련 정보는 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합되는 US20130005793, WO2013003520 또는 WO2018027106에 기재되어 있다.

구현예에서, 치료적 조합물은

a) 서열번호 2와 적어도 95%, 예컨대, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자;

b) 서열번호 7과 적어도 90%, 예컨대, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자로서, HBV 폴리머라제 항원이 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 갖지 않는, 제2 비-천연 핵산 분자, 및

c) 1) 표 2에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제;

2) 표 3에 나타나 있는 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제;

3) 표 4에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제, 바람직하게 표 4에 나타나 있는 변형된 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi;

4) 표 5에 나타나 있는 표적 서열을 표적화하는 RNAi 제제;

5) 표 6에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제;

6) 표 7에 나타나 있는 코어 안티센스 서열 및 표 8에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제, 바람직하게 표 7에 나타나 있는 변형된 센스 가닥 서열 및 표 8에 나타나 있는 변형된 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi; 및

7) 표 9에 나타나 있는 안티센스 가닥과 센스 가닥의 이중체를 갖는 RNAi 제제, 바람직하게 표 9에 나타나 있는 이중체를 포함하는 RNAi 제제

로 이루어진 군으로부터 선택된 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 포함한다.

특정 구현예에서, RNAi 제제는 지질 조성물 또는 지질 나노입자에 의해 이를 필요로 하는 대상체에게 전달된다. 다른 구현예에서, RNAi는 표적화 리간드, 예컨대, N-아세틸-갈락토사민을 포함하는 표적화 리간드에 접합함으로써 이를 필요로 하는 대상체에게 전달된다. 바람직하게, RNAi는 본 명세서에 기술된 표적화 리간드, 예컨대, N-아세틸-갈락토사민을 포함하는 표적화 리간드에 접합함으로써 이를 필요로 하는 대상체에게 전달된다.

바람직하게, 치료적 조합물은 a) 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자; b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자, 및 (c) 본 명세서에 기술된 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 포함한다. 바람직하게, RNAi 제제는 표 9에 나타나 있는 이중체를 포함한다. 각각의 이중체는 바람직하게 표적화 리간드, 바람직하게 N-아세틸-갈락토사민을 포함하는 표적화 리간드, 보다 바람직하게 표 10에 나타나 있는 구조를 포함하는 표적화 리간드에 접합된다.

바람직하게, 치료적 조합물은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 적어도 90%, 예컨대, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자, 및 서열번호 5 또는 서열번호 6에 적어도 90%, 예컨대, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자를 포함한다.

보다 바람직하게, 치료적 조합물은 a) 서열번호 1 또는 서열번호 3의 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자; b) 서열번호 5 또는 서열번호 6의 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자; 및 c) 본 명세서에 기술된 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 포함한다.

구현예에서, 각각의 제1 및 제2 비-천연 핵산 분자는 DNA 분자이고, 바람직하게 DNA 분자는 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 존재한다.

다른 구현예에서, 각각의 제1 및 제2 비-천연 핵산 분자는 RNA 분자, 바람직하게 mRNA 또는 자기-복제 RNA 분자이다.

몇몇 구현예에서, 각각의 제1 및 제2 비-천연 핵산 분자는 독립적으로 지질 나노입자(LNP)와 제형화된다.

다른 일반적 양태에서, 본 출원은 본 출원의 치료적 조합물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 출원은 또한 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 면역 반응 유도에 사용하기 위한 본 출원의 치료적 조합물 또는 키트; 및 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 면역 반응 유도를 위한 의약의 제조에서의 본 출원의 치료적 조합물, 조성물 또는 키트의 용도에 관한 것이다. 상기 용도는 또 다른 면역원적 또는 치료적 제제, 바람직하게 또 다른 HBV 항원 또는 또 다른 HBV 요법제와의 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 대상체는 만성 HBV 감염을 갖는다.

본 출원은 추가로 HBV-유도 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 HBV-유도 질환의 치료에 사용하기 위한 본 출원의 치료적 조합물 또는 키트; 및 HBV-유도 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 HBV-유도 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 본 출원의 치료적 조합물 또는 키트의 용도에 관한 것이다. 상기 용도는 또 다른 치료적 제제, 바람직하게 또 다른 항-HBV 항원과의 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 대상체는 만성 HBV 감염을 가지며, 상기 HBV-유도 질환은 진행성 섬유증(advanced fibrosis), 간경변(cirrhosis), 및 간세포 암종(hepatocellular carcinoma, HCC)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 출원은 또한 HBV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법 또는 HBV 감염 또는 HBV-유도 질환을 치료하는 방법으로서, 본 발명의 구현예에 따른 치료적 조합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태들, 특징들 및 유리점들은 발명의 상세한 설명 및 그 바람직한 구현예 및 첨부된 청구항을 포함하는 이하의 개시로부터 명백할 것이다.

전술한 요지뿐만 아니라 뒤따르는 본 출원의 바람직한 구현예의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 해석하는 경우 보다 잘 이해될 것이다. 그러나 본 출원은 도면에 나타난 엄밀한 구현예에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도 1a 및 도 1b는 본 출원의 구현예에 따른 DNA 플라스미드의 개략적 표현을 나타낸 것이고; 도 1a는 본 출원의 구현예에 따른 HBV 코어 항원을 인코딩하는 DNA 플라스미드를 나타낸 것이고; 도 1b는 본 출원의 구현예에 따른 HBV 폴리머라제(pol) 항원을 인코딩하는 DNA 플라스미드를 나타낸 것이고; HBV 코어 및 pol 항원은 세포로부터의 분비 시 발현된 항원으로부터 절단되는 N-말단 시스타틴 S 신호 펩티드를 갖는 CMV 프로모터의 조절 하에 발현되고; 플라스미드의 전사 조절 요소는 CMV 프로모터와 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 위치한 인핸서 서열 및 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 하류에 위치한 bGH 폴리아데닐화 서열을 포함하고; 제2 발현 카세트는 Amp(bla) 프로모터의 조절 하의 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 역 배향의 플라스미드에 포함되고; 복제 기점(pUC)는 또한 역 배향에 포함된다.
도 2a 및 도 2b는 본 출원의 구현예들에 따른 아데노바이러스 벡터의 발현 카세트의 개략적 표현이고; 도 2a는 CMV 프로모터, 인트론(ApoAI 제2 인트론을 함유하는, 인간 ApoAI 유전자(GenBank 수탁 X01038 염기쌍 295 - 523) 유래의 단편), 인간 면역글로불린 분비 신호, 뒤이어 절두된 HBV 코어 항원을 위한 코딩 서열 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 절두된 HBV 코어 항원을 위한 발현 카세트를 나타내고; 도 2b는 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원의 융합 단백질을 위한 발현 카세트를 나타내며, 이는 달리 HBV 항원을 제외하고는 절두된 HBV 코어 항원을 위한 발현 카세트와 동일하다.
도 3은 실시예 3에 기술된 바와 같은 HBV 코어 항원 또는 HBV pol 항원을 발현하는 상이한 DNA 플라스미드로 면역화된 Balb/c 마우스의 ELISPOT 반응을 나타낸 것이고; 다양한 백신접종된 동물 그룹으로부터 단리된 비장세포를 자극하기 위해 사용된 펩티드 풀은 회색 스케일로 표시되고; 반응성-T 세포의 수는 10⁶ 개 비장세포 당 반점-형성 세포(spotforming cell, SFC)로서 표현되어 있는 y-축에 나타나 있다.
도 4는 US20130005793에 보다 상세히 기술된 본 발명에 유용한 HBV 유전자를 표적화하는 RNAi 제제의 코어 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 US20130005793에 보다 상세히 기술된 본 발명에 유용한 HBV 유전자를 표적화하는 RNAi 제제의 변형된 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 US20130005793에 보다 상세히 기술된 본 발명에 유용한 HBV 유전자 및 이의 변형된 상대물을 표적화하는 RNAi 제제의 코어 서열을 나타낸 것이다.
도 7은 WO2018027106에 보다 상세히 기재된 HBV 서브타입 ADW2, 유전자형 A, 완전 게놈 GenBank AM282986.1로부터 취해진 본 발명에 유용한 HBV RNAi 제제에 대한 예시적인 19-량체 HBV cDNA 표적 서열을 나타낸 것이다.
도 8은 WO2018027106에 보다 상세히 기술된 본 발명에 유용한 HBV RNAi 제제 안티센스 및 센스 가닥 코어 스트레치 서열을 나타낸 것이다.
도 9는 WO2018027106에 보다 상세히 기술된 본 발명에 유용한 HBV RNAi 제제 안티센스 서열을 나타낸 것이다.
도 10은 WO2018027106에 보다 상세히 기술된 본 발명에 유용한 HBV RNAi 제제 센스 서열을 나타낸 것이다.
도 11은 WO2018027106에 보다 상세히 기술된 본 발명에 유용한 HBV RNAi 제제 이중체의 예를 나타낸 것이다.
도 12는 WO2018027106에 보다 상세히 기술된 본 발명에 유용한 표적화 리간드의 예를 나타낸 것이다.

발명의 상세한 설명

다양한 간행물, 논문 및 특허가 배경 및 명세서 전반에 걸쳐 인용되거나 기재되고, 이들 참고문헌은 각각 그 전체가 본 명세서에 참조로서 통합된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 물질, 장치, 또는 물품 등의 논의는 본 발명의 맥락을 제공하는 목적을 위한 것이다. 이러한 논의는 이들 대상의 임의의 것이나 전부가 개시되거나 청구되는 임의의 발명에 대해 선행 발명의 일부를 형성한다는 인정이 아니다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다르게는, 본 명세서에서 사용되는 특정 용어는 명세서에 나타낸 의미를 갖는다. 본 명세서에서 인용되는 모든 특허, 특허 출원 공보 및 간행물은 본원에 완전히 명시된 것처럼 참조로 통합된다.

본 명세서 및 첨부되는 청구항에서 사용되는 단수 형태인 부정관사 및 정관사는 문맥상 명백히 달리 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함함이 주지되어야 한다.

달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소들 앞에 있는 "적어도"라는 용어는 일련의 모든 요소들을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 통상의 실험만을 사용하여 본원에 기술된 본 발명의 구체적 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본 명세서 및 이하의 청구항 전반에서, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다(comprise)" 라는 단어 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 활용형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 본 명세서에서 용어 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(including)" 또는 때로는 용어 "갖는(having)"과 함께 사용될 때 대체될 수 있다.

본 명세서에서 "~로 이루어지는(consisting　of)"을 사용할 때 청구항 구성요소에서 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본 명세서에 사용될 때, "본질적으로 이루어진(consisting　essentially of)"은 청구항의 기본 및 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. "포함하는(comprising)", "함유하는(containing)", "포함하는(including)" 및 "갖는(having)"의 전술한 임의의 용어는 본 출원의 양태 또는 구현예의 문맥에서 사용될 때마다 개시의 범위를 변경하기 위해 "이루어진(consisting　of)" 또는 "본질적으로 이루어진(consisting　essentially of)"의 용어로 대체할 수 있다.

본 명세서에 사용되는, 여러 언급된 요소들 간의 연결 용어 "및/또는"은 개별 옵션과 결합된 옵션 둘 다를 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"으로 결합된 경우, 첫 번째 옵션은 두 번째 요소가 없는 첫 번째 요소가 적용될 수 있음을 나타낸다. 두 번째 옵션은 첫 번째 요소 없이 두 번째 요소가 적용될 수 있음을 나타낸다. 세 번째 옵션은 첫 번째 요소와 두 번째 요소가 함께 적용될 수 있음을 나타낸다. 이들 옵션들 중 어느 하나는 의미 내에 속하는 것으로 이해되고, 따라서 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"이라는 용어의 요구 사항을 만족시킨다. 하나 보다 많은 옵션에 대한 동시 적용 가능성은 또한 그 의미 내에 해당되므로 "및/또는"이라는 용어의 요구 사항을 만족시키는 것으로 이해된다.

달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 기술된 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치 값은 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 수치 값은 전형적으로, 인용된 값의 ± 10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1 mg/mL 내지 10 mg/mL의 농도 범위는 0.9 mg/mL 내지 11 mg/mL를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 수치 범위의 사용은 문맥상 명백히 달리 나타내지 않은 한, 모든 가능한 하위 범위, 상기 범위 내의 정수를 포함한 그 범위 내의 모든 개별 수치 값 및 그 값의 분수를 명백히 포함한다.

아미노산 서열과의 관계에서 사용될 경우 문구 "퍼센트(%) 서열 동일성" 또는 "% 동일성" 또는 "와 % 동일한"은 아미노산 서열 전체 길이를 이루는 아미노산 잔기의 개수와 비교하여 둘 이상의 정렬된 아미노산 서열의 동일한 아미노산의 매칭("히트") 개수를 기술한다. 달리 말하면, 둘 이상의 서열을 위해, 서열이 기술 분야에 알려져 있는 서열 대비 알고리즘을 이용하여 측정된 최대 유사성을 위해 비교 및 정렬될 경우, 또는 수동으로 정렬되고 시각적으로 검사될 경우, 정렬을 이용하여, 동일한 아미노산 잔기의 백분율(예를 들어, 아미노산 서열 총장에 대한 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성)가 판별될 수 있다. 따라서, 대비하여 서열 동일성을 판별할 서열은 아미노산의 치환(들), 삽입(들) 또는 결실(들)에 의해 다를 수 있다. 숙련자에게 단백질 서열을 정렬하기 위한 적합한 프로그램이 알려져 있다. 단백질 서열의 서열 동일성 백분율은, 예컨대, CLUSTALW, Clustal Omega, FASTA 또는 BLAST와 같은 프로그램으로, 예를 들어, NCBI BLAST 알고리즘(Altschul SF, et al (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)을 사용하여 판별될 수 있다.

본 명세서에서 둘 이상의 요법제 또는 구성요소를 대상체에게 투여하는 문맥에서 사용되는 용어 및 문구 "조합으로", "와 조합하여", "공동-전달" 및 "와 함께 투여"는 둘 이상의 요법제 또는 구성요소, 예컨대, 두 개의 벡터, 예를 들어, DNA 플라스미드, 펩티드 또는 치료적 조합물 및 애주번트의 일제 투여(simultaneous administration) 또는 후속 투여를 지칭한다. 일제 투여(simultaneous administration)"는 둘 이상의 요법제 또는 구성요소를 적어도 같은 날 내에 투여하는 것일 수 있다. 두 개의 구성요소가 "함께 투여" 또는 "조합으로 투여"되는 경우, 이들은 개별 조성물 내에 순차적으로 짧은 시간 간격, 예컨대, 24 시간, 20 시간, 16 시간, 12 시간, 8 시간 또는 4 시간 이내에, 또는 1 시간 이내에 투여될 수 있거나, 이들은 단일 조성물 내에 동시에 투여될 수 있다. "후속 투여"는 동일한 날에 또는 별개의 날에 둘 이상의 요법제 또는 구성요소를 투여하는 것일 수 있다. 용어 "와 조합으로"의 사용은 요법제 또는 구성요소가 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 예를 들어, 제1 요법제 또는 구성요소(예를 들어, HBV 항원을 인코딩하는 제1 DNA 플라스미드)는 제2 요법제 또는 구성요소(예를 들어, HBV 항원을 인코딩하는 제2 DNA 플라스미드), 및/또는 제3 요법제 또는 구성요소(예를 들어, HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제)의 투여에 앞서(예를 들어, 5 분 내지 1 시간 전), 이와 수반하여 또는 일제히, 또는 이후(예를 들어, 5 분 내지 1 시간 후)에 투여될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 제1 요법제 또는 구성요소(예를 들어, HBV 항원을 인코딩하는 제1 DNA 플라스미드), 제2 요법제 또는 구성요소(예를 들어, HBV 항원을 인코딩하는 제2 DNA 플라스미드), 및 제3 요법제 또는 구성요소(예를 들어, HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제)는 동일 조성물로 투여된다. 다른 구현예에서, 제1 요법제 또는 구성요소(예를 들어, HBV 항원을 인코딩하는 제1 DNA 플라스미드), 제2 요법제 또는 구성요소(예를 들어, HBV 항원을 인코딩하는 제2 DNA 플라스미드), 및 제3 요법제 또는 구성요소(예를 들어, HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제)는 별개의 조성물로, 예컨대, 두 개 또는 세 개의 별개의 조성물로 투여된다.

본 명세서에서 사용되는 "비-천연" 핵산 또는 폴리펩티드는 자연에서 발생하지 않은 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭한다. "비-천연" 핵산 또는 폴리펩티드는 실험실 및/또는 제조 환경에서 합성, 처리, 제작 및/또는 그 외 조작될 수 있다. 몇몇 경우, 비-천연 핵산 또는 폴리펩티드는 처리 전 천연 핵산 또는 폴리펩티드에 존재하지 않는 물성을 나타내도록 처리, 프로세싱 또는 조작되어 천연 핵산 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "비-천연" 핵산 또는 폴리펩티드는 이는 발견된 자연 공급원으로부터 단리되거나 분리된 핵산 또는 폴리펩티드일 수 있으며, 이것은 자연 공급원에 연합되었던 서열에 대한 공유결합을 결여한다. "비-천연" 핵산 또는 폴리펩티드는 재조합적으로 또는 다른 방법, 예컨대, 화학적 합성을 통해 제조될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 "대상체"는 그에 대해 본 출원의 구현예에 따른 방법에 의해 처치될 것이거나 처치된 임의의 동물, 바람직하게 포유동물, 가장 바람직하게 인간을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포유동물"는 임의의 포유동물를 포괄한다. 포유동물의 예는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니아피그, 비-인간 영장류(non-human primate, NHP), 예컨대, 원숭이 또는 유인원 등, 보다 바람직하게 인간을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결된"은 그렇게 기술된 구성요소가 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 관계에 있는 연결 또는 병치를 지칭한다. 예를 들어, 관심 핵산 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열은 관심 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있거나, 관심 아미노산 서열에 작동적으로 연결된 신호 서열은 관심 아미노산 서열을 막을 넘어 분비 또는 이동시킬 수 있다.

본 출원의 독자를 돕기 위해, 본 기술은 다양한 단락 또는 섹션으로 분리되거나, 본 출원의 다양한 구현예를 지시한다. 이러한 분리는 단락 또는 섹션 또는 구현예의 내용을 다른 단락 또는 섹션 또는 구현예의 내용으로부터 분리시키는 것으로 간주되어서는 안된다. 반대로, 당업자는 이 기술이 광범위하게 적용되며 고려될 수 있는 다양한 섹션, 단락 및 문장의 모든 조합을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 임의의 구현예에 대한 논의는 단지 예시적인 것으로 의도되며 청구항을 포함하는 본 개시의 범위가 이들 예시로 제한됨을 제안하려는 의도가 아니다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 본 출원의 HBV 벡터(예를 들어, 플라스미드 DNA 또는 바이러스 벡터)의 구현예는 특정 순서로 배열된 소정 프로모터 서열, 인핸서 또는 조절 서열, 신호 펩티드, 및 HBV 항원의 코딩 펩티드, 폴리아데닐화 신호 서열 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 특정 성분을 포함할 수 있으나, 당업자는 본 명세서에 개시된 개념이 본 출원의 HBV 벡터에 사용될 수 있는 다른 순서로 배열된 다른 성분에도 동일하게 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 본 출원은 특정 조합이 명시적으로 기술되거나 아니거나, 본 출원의 HBV 벡터에 사용될 수 있는 임의의 서열을 갖는 임의의 조합으로 임의의 적용 가능한 성분의 사용을 고려한다. 본 발명은 일반적으로 하나 이상의 HBV 항원 및 하나 이상의 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 포함하는 치료적 조합물에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)

본 명세서에서 사용되는 "B형 간염 바이러스" 또는 "HBV"는 헤파드나바이러스과 패밀리의 바이러스를 지칭한다. HBV는 4 개의 개방형 해독틀 및 7 개의 단백질을 인코딩하는 작은(예를 들어, 3.2-kb) 간친화성 DNA 바이러스이다. HBV에 의해 인코딩되는 7 개의 단백질은 소형(S), 중형(M), 및 대형(L) 표면 항원(HBsAg) 또는 외피(Env) 단백질, 프리-코어 단백질(pre-Core protein), 코어 단백질, 바이러스 폴리머라제(Pol) 및 HBx 단백질을 포함한다. HBV는 3 개의 표면 항원, 또는 외피 단백질, L, M 및 S을 발현하며, S는 가장 작고 L이 가장 크다. M 및 L 단백질의 엑스트라 도메인은 각각 Pre-S2 및 Pre-S1으로 명명된다. 코어 단백질은 바이러스 뉴클레오캡시드의 서브유닛이다. Pol은 감염된 간세포의 세포질에 국부화된 뉴클레오캡시드에서 일어나는 바이러스 DNA(역전사효소, RNaseH 및 프라이머) 합성을 위해 필요하다. 프리코어(PreCore)는 소위 B형 간염 e-항원(HBeAg)와 같이, N-말단 신호 펩티드를 가지며 감염된 세포로부터 분비되기 전에 그 N 및 C 말단에서 단백분해적 프로세싱된 코어 단백질이다. HBx 단백질은 공유 결합 폐환형 DNA(cccDNA)의 효율적인 전사를 위해 필요하다. HBx는 바이러스 구조 단백질이 아니다. HBV의 모든 바이러스 단백질은 mRNA를 공유하는 코어 및 폴리머라제 이외에 그 자신의 mRNA를 갖는다. 단백질 프리코어 이외에, 모든 HBV 바이러스 단백질은 모두 후-전사 단백분해 프로세싱을 거치지 않는다.

HBV 비리온은 바이러스 외피, 뉴클레오캡시드 및 부분적 이중 가닥 DNA 게놈의 단일 카피를 포함한다. 뉴클레오캡시드는 코어 단백질의 120 이량체를 포함하며, S, M 및 L 바이러스 외피 또는 표면 항원 단백질이 내포된 캡시드 멤브레인에 의해 싸여 있다. 세포 내로 진입한 후, 바이러스는 탈각되고 공유 결합된 바이러스 폴리머라제를 갖는 캡시드-함유 이완된 환형 DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)는 핵으로 이동한다. 이 공정 중 코어 단백질의 포스포릴화는 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, NLS)를 노출시켜 캡시드의 소위 임포틴(importin)과의 상호작용을 가능하게 하는 구조적 변화를 유도한다. 이들 임포틴은 코어 단백질이, 캡시드가 분해되는 핵공 복합체(nuclear pore complex)에 결합하는 것을 매개하며, 폴리머라제/rcDNA 복합체는 핵 내로 방출된다. 핵 내에서 rcDNA는 탈단백질되고(폴리머라제 제거) 숙주 DNA 복구 기구에 의해, 이로부터 중복 전사체가 HBeAg, HBsAg, 코어 단백질, 바이러스 폴리머라제 및 HBx 단백질을 인코딩하는 공유 결합 폐환형 DNA(cccDNA) 게놈으로 전환된다. 코어 단백질, 바이러스 폴리머라제, 및 전-게놈 RNA(pre-genomic RNA, pgRNA)은 세포질에 연합하고 미성숙 pgRNA-함유 캡시드 입자 내로 자가조립되어, 추가적으로 성숙 rcDNA-캡시드로 전환되고, 피복되어 감염성 바이러스 입자로서 분비되거나 핵으로 반송되어 안정된 cccDNA 풀을 보충 및 유지하는 둘 다의 공통 중간체로서 기능한다.

지금까지, HBV는 외피 단백질 상에 존재하는 항원성 에피토프를 기초로 4가지 혈청형(adr, adw, ayr, ayw)으로 구분되고, 바이러스 게놈의 서열을 기초로 8가지 유전자형(A, B, C, D, E, F, G, 및 H)으로 구분되었다. HBV 유전자형은 상이한 지리적 영역에 따라 분포된다. 예를 들어, 아시아에서 가장 보편적인 유전자형은 유전자형 B 및 C 이다. 유전자형 D는 아프리카, 중동 및 인도에서 우세한 반면, 유전자형 A는 북부 유럽, 사하라 이남 아프리카, 및 서부 아프리카에 널리 퍼져있다.

HBV 항원

본 명세서에서 사용되는 용어 "HBV 항원", "HBV의 항원성 폴리펩티드", "HBV 항원성 폴리펩티드", "HBV 항원성 단백질", "HBV 면역원적 폴리펩티드" 및 "HBV 면역원"은 모두 면역 반응, 예를 들어, 대상체에서 HBV에 대한 체액성 및/또는 세포성 매개 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. HBV 항원은 HBV의 폴리펩티드, 이들의 단편 또는 에피토프, 또는 복수의 HBV 폴리펩티드의 조합, 이들의 일부 또는 유도체일 수 있다. HBV 항원은 숙주에서 보호 면역 반응을 일으킬 수 있는, 예를 들어, 바이러스 질환 또는 감염에 대해 면역 반응을 유도하고/유도하거나 바이러스 질환 또는 감염에 대해 대상체를 보호하는, 바이러스 질환 또는 감염에 대해 대상체에 면역을 생성(즉, 백신접종)할 수 있다. 예를 들어, HBV 항원은 임의의 HBV 단백질로부터의 폴리펩티드 또는 이들의 면역원적 단편(들), 예컨대, 임의의 HBV 유전자형, 예컨대, 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, 및/또는 H, 또는 이들의 조합 유래의, HBeAg, 프리-코어 단백질, HBsAg(S, M, 또는 L 단백질), 코어 단백질, 바이러스 폴리머라제, 또는 HBx 단백질을 포함할 수 있다.

(1) HBV 코어 항원

본 명세서에서 사용되는 각각의 용어 "HBV 코어 항원", "HBc", 및 "코어 항원"은 면역 반응, 예를 들어, 대상체에서 HBV 코어 단백질에 대한 체액성 및/또는 세포성 매개 반응을 유도할 수 있는 HBV 항원을 지칭한다. 각각의 용어 "코어", "코어 폴리펩티드" 및 "코어 단백질"은 HBV 바이러스 코어 단백질을 지칭한다. 전장(full length) 코어 항원은 전형적으로 183 개 아미노산 길이이고 조립 도메인(아미노산 1 내지 149) 및 핵산 결합 도메인(아미노산 150 내지 183)을 포함한다. 34-잔기 핵산 결합 도메인은 프리게놈 RNA 캡시드화를 위해 필요하다. 상기 도메인은 또한 핵 유입 신호(nuclear import signal)로서 기능한다. 이는 17 개 아르기닌 잔기를 포함하고 매우 염기성이고 그 기능에 일관된다. HBV 코어 단백질은 용액 내에서 이량체성이고, 이량체는 20면체(icosahedral) 캡시드로 자가조립된다. 코어 단백질의 각각의 이량체는 양쪽에 α-나선 도메인이 측접된 4 개의 α-나선 번들을 갖는다. 핵산 결합 도메인 결여된 절두된 HBV 코어 단백질 또한 캡시드를 형성할 수 있다.

본 출원의 일 구현예에서, HBV 항원은 절두된 HBV 코어 항원이다. 본 명세서에서 사용되는 "절두된 HBV 코어 항원"은 HBV 코어 단백질의 전체 길이를 포함하지는 않지만 대상체에서 HBV 코어 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 HBV 항원을 지칭한다. 예를 들어, HBV 코어 항원은 전형적으로 17 개 아르기닌(R) 잔기를 포함하는, 코어 항원의 고도로 양전하를 띄는(아르기닌 풍부) C-말단 핵산 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산을 결실하도록 변형될 수 있다. 본 출원의 절두된 HBV 코어 항원은 바람직하게 HBV 코어 핵 유입 신호를 포함하지 않는 C-말단 절두된 HBV 코어 단백질 및/또는 C-말단 HBV 코어 핵 유입 신호가 결실된 절두된 HBV 코어 단백질이다. 일 구현예에서, 절두된 HBV 코어 항원은 C-말단 핵산 결합 도메인에 결실, 예컨대, C-말단 핵산 결합 도메인의 1 개 내지 34 개 아미노산 잔기, 예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 26 개, 27 개, 28 개, 29 개, 30 개, 31 개, 32 개, 33 개, 또는 34 개 아미노산 잔기의 결실, 바람직하게 34 개 아미노산 잔기 모두의 결실을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 절두된 HBV 코어 항원은 C-말단 핵산 결합 도메인에 결실, 바람직하게 34 개 아미노산 잔기 전부의 결실을 포함한다.

본 출원의 HBV 코어 항원은 복수의 HBV 유전자형(예를 들어, 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, 및 H)으로부터 유래한 컨센서스 서열(consensus sequence)일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "컨센서스 서열"은, 예를 들어, 동종성 단백질의 아미노산 서열의 정렬(예를 들어, Clustal Omega를 사용하여)에 의해 결정된 바와 같은 동종성 단백질의 아미노산 서열의 정렬에 기초한 아미노산의 인공 서열을 의미한다. 이는 적어도 100 개의 천연 HBV 단리체로부터의 HBV 항원(예를 들어, 코어, pol, 등)의 서열을 기초로 서열 정렬의 각 위치에서 발견되는 가장 빈번한 아미노산 잔기의 계산된 순서일 수 있다. 컨센서스 서열은 비-천연이며 천연형 바이러스 서열과 상이할 수 있다. 컨센서스 서열은 복수의 서열 정렬 툴을 사용한 상이한 공급원으로부터의 복수의 HBV 항원 서열을 정렬하고, 다양한 정렬 위치에서 가장 빈번한 아미노산을 선택하여 설계될 수 있다. 바람직하게, HBV 항원의 컨센서스 서열은 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한다. 용어 "컨센서스 항원"은 컨센서스 서열을 갖는 항원을 지칭하기 위해 사용된다.

본 출원에 따른 예시적인 절두된 HBV 코어 항원은 핵산 결합 기능이 결여되고 포유동물에서 적어도 2 개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게 절두된 HBV 코어 항원은 포유동물에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 보다 바람직하게, 절두된 HBV 코어 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다.

바람직하게, 본 출원의 HBV 코어 항원은 컨센서스 항원이고, 바람직하게 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 컨센서스 항원이고, 보다 바람직하게 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 절두된 컨센선스 항원이다. 본 출원에 따른 예시적 절두된 HBV 코어 컨센서스 항원은 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진다. 서열번호 2 및 서열번호 4는 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 코어 컨센서스 항원이다. 서열번호 2 및 서열번호 4는 각각 천연형 코어 항원의 고도로 양전하를 띄는(아르기닌 풍부) 핵산 결합 도메인의 34-아미노산 C-말단 결실을 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, HBV 코어 항원은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 항원이다. 다른 구현예에서, HBV 코어 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 항원이다. 다른 구현예에서, HBV 코어 항원은 성숙 HBV 코어 항원 서열, 예컨대, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열을 추가로 함유한다. 바람직하게, 신호 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는다.

(2) HBV 폴리머라제 항원

본 명세서에서 사용되는 용어 "HBV 폴리머라제 항원", "HBV Pol 항원", 또는 "HBV pol 항원"은 대상체에서 HBV 폴리머라제에 대한 면역 반응, 예를 들어, 체액성 및/또는 세포성 매개 반응을 유도할 수 있는 HBV 항원을 지칭한다. 각각의 용어 "폴리머라제", "폴리머라제 폴리펩티드", "Pol" 및 "pol"은 HBV 바이러스 DNA 폴리머라제를 지칭한다. HBV 바이러스 DNA 폴리머라제는 N 말단으로부터 C 말단으로, 마이너스-가닥 DNA 합성을 위한 프라이머로 작용하는 말단 단백질(TP) 도메인; 폴리머라제 기능에 비필수 스페이서; 전사를 위한 역전사효소(RT) 도메인; 및 RNase H 도메인을 포함하는 4 개의 도메인을 갖는다.

본 출원의 일 구현예에서, HBV 항원은 HBV Pol 항원, 또는 이들의 임의의 면역원적 단편 또는 이들의 조합을 포함한다. HBV Pol 항원은, 예컨대, 폴리머라제 및/또는 RNase 도메인의 활성 부위에 돌연변이를 도입하여 소정 효소 활성을 감소시키거나 실질적으로 제거함으로써 항원의 면역원성을 향상시키기 위한 추가 변형을 함유할 수 있다.

바람직하게, 본 출원의 HBV Pol 항원은 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않으며, 포유동물에서 적어도 2 개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게 HBV Pol 항원은 포유동물에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 보다 바람직하게, HBV Pol 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다.

따라서, 몇몇 구현예에서, HBV Pol 항원은 불활성화 Pol 항원이다. 일 구현예에서, 불활성화 HBV Pol 항원은 폴리머라제 도메인의 활성 부위에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 불활성화 HBV Pol 항원은 RNaseH 도메인의 활성 부위에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 불활성화 HBV Pol 항원은 폴리머라제 도메인과 RNaseH 도메인 둘 다의 활성 부위에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드/금속 이온 결합을 위해 필요할 수 있는 HBV pol 항원의 폴리머라제 도메인의 "YXDD" 모티프는, 예를 들어, 하나 이상의 아스파테이트 잔기(D)를 아스파라긴 잔기(N)로 교체하여 금속 배위 기능을 제거 또는 감소시킴으로써 돌연변이될 수 있으며, 이에 의해 역전사효소 기능을 감소 또는 실질적으로 제거한다. 대안적으로, 또는 상기 "YXDD" 모티프의 돌연변이에 더하여, Mg2+ 배위를 위해 필요한 HBV pol 항원의 RNaseH 도메인의 "DEDD" 모티프는, 예를 들어, 하나 이상의 아스파테이트 잔기(D)를 아스파라긴 잔기(N)로 교체하고/교체하거나 제1 글루타메이트 잔기(E)를 글루타민(Q)으로 교체함으로써 돌연변이될 수 있으며, 이에 의해 RNasH 기능을 감소 또는 실질적으로 제거할 수 있다. 구체적 구현예에서, HBV pol 항원은 (1) 폴리머라제 도메인의 "YXDD" 모티프에서 아스파테이트 잔기(D)를 아스파라긴 잔기(N)로 돌연변이시키고; (2) RNaseH 도메인의 "DEDD" 모티프에서 첫 번째 아스파테이트 잔기(D)를 아스파라긴 잔기(N)로 교체하고 첫 번째 글루타메이트 잔기(E)를 글루타민 잔기(N)로 돌연변이시킴으로써 변형되어, pol 항원의 역전사효소와 RNaseH 기능 둘 다를 감소 또는 실질적으로 제거한다.

본 출원의 바람직한 구현예에서, HBV pol 항원은 컨센서스 항원이고, 바람직하게 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 컨센서스 항원이고, 보다 바람직하게 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 불활성화 컨센선스 항원이다. 본 출원에 따른 예시적 HBV pol 컨센서스 항원은 서열번호 7과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 7과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한, 바람직하게, 서열번호 7과 적어도 98%, 예컨대, 서열번호 7과 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 7은 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 폴리머라제 및 RNaseH 도메인의 활성 부위에 위치한 4 개의 돌연변이를 포함하는 pol 컨센서스 항원이다. 구체적으로, 상기 4 개의 돌연변이는 폴리머라제 도메인의 "YXDD" 모티프에서 아스파르트산 잔기(D)의 아스파라긴 잔기(N)로의 돌연변이; 및 RNaseH 도메인의 "DEDD" 모티프에서 첫 번째 아스파테이트 잔기(D)의 아스파라긴 잔기(N)로의 돌연변이 및 글루타메이트 잔기(E)의 글루타민 잔기(Q)로의 돌연변이를 포함한다.

본 출원의 구체적 구현예에서, HBV pol 항원은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 본 출원의 다른 구현예에서, HBV pol 항원은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진다. 추가의 구현예에서, HBV pol 항원은 성숙 HBV pol 항원 서열, 예컨대, 서열번호 7의 아미노산 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열을 추가로 함유한다. 바람직하게, 신호 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는다.

(3) HBV 코어 항원 및 HBV 폴리머라제 항원의 융합

본 명세서에서 사용되는 용어 "융합 단백질" 또는 "융합"은 단일, 천연 폴리펩티드에서 정상적으로 존재하지 않는 적어도 2 개의 폴리펩티드 도메인을 갖는 단일 폴리펩티드 사슬을 지칭한다.

본 출원의 일 구현예에서, HBV 항원은, 바람직하게 링커를 통해, HBV Pol 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원, 또는 절두된 HBV 코어 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.

예를 들어, 제1 폴리펩티드 및 제2 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질에서, 링커는 주로 제1 및 제2 폴리펩티드 사이의 스페이서로서 작용한다. 일 구현예에서, 링커는 펩티드 결합으로 서로 연결된 아미노산, 바람직하게 펩티드 결합으로 연결된 1 개 내지 20 개 아미노산으로 구성되고, 상기 아미노산은 20 개의 천연 아미노산으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 상기 1 개 내지 20 개 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 및 리신으로부터 선택된다. 바람직하게, 링커는 대부분 입체적 장애가 없는 아미노산, 예컨대, 글리신 및 알라닌으로 구성된다. 예시적 링커는 폴리글리신, 구체적으로 (Gly)5, (Gly)8; poly(Gly-Ala), 및 폴리알라닌이다. 이하의 실시예에 나타난 바와 같은 일 예시적 적합한 링커는 (AlaGly)n이고, 여기서 n은 2 내지 5의 정수이다.

바람직하게, 본 출원의 융합 단백질은 포유동물에서 적어도 2 개의 HBV 유전자형의 HBV 코어 및 HBV Pol에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게 융합 단백질은 포유동물에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 보다 바람직하게, 융합 단백질은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다.

본 출원의 일 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90%, 예컨대, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 절두된 HBV 코어 항원, 링커, 및 서열번호 7과 적어도 90%, 예컨대, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 HBV Pol 항원을 포함한다.

본 출원의 바람직한 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원, (AlaGly)n을 포함하고 n은 2 내지 5의 정수인 링커, 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 HBV Pol 항원을 포함한다. 보다 바람직하게, 본 출원의 구현예에 따른 융합 단백질은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열을 추가로 포함한다. 바람직하게, 신호 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에 사용될 수 있는 HBV 백신에 대한 추가 개시는 2018년 12월 18일에 출원된 미국 특허 출원 제16/223,251호에 기재되어 있으며, 출원의 내용, 보다 바람직하게 출원의 실시예는 그 전체가 본 명세서에 참조로 통합된다.

폴리뉴클레오티드 및 벡터

다른 일반적 양태에서, 본 출원은 본 출원의 구현예에 따른 본 발명에 유용한 HBV 항원을 인코딩하는 비-천연 핵산 분자, 및 비-천연 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 제1 또는 제2 비-천연 핵산 분자는 본 개시의 관점에서의 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있는, 본 출원에 유용한 HBV 항원을 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드는 본 출원의 절두된 HBV 코어 항원 및 HBV 폴리머라제 항원 중 적어도 하나를 인코딩한다. 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술(예를 들어, 클로닝)에 의해 얻어지거나 합성적으로(예를 들어, 화학적 합성) 생산된 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. 상기 DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥과 단일 가닥 서열 둘 다의 부분을 포함할 수 있다. 상기 DNA는, 예를 들어, 게놈 DNA, cDNA 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 DNA/RNA 하이브리드일 수 있다. 본 출원의 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 재조합 단백질 생산, 숙주 세포 내에서의 단백질 발현, 또는 바이러스 입자 생산을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다.

본 출원의 일 구현예에서, 제1 비-천연 핵산 분자는 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 2 또는 서열번호 4와 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 출원의 구체적 구현예에서, 제1 비-천연 핵산 분자는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 예는 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 1 또는 서열번호 3과 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 예시적인 비-천연 핵산 분자는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다.

다른 구현예에서, 제1 비-천연 핵산 분자는 HBV 코어 항원 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함한다. 바람직하게, 신호 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직하게, 신호 서열에 대한 코딩 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, 제2 비-천연 핵산 분자는 서열번호 7과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 7과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 7과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 출원의 구체적 구현예에서, 제2 비-천연 핵산 분자는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

서열번호 7과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV Pol 항원을 인코딩하는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 예는 서열번호 5 또는 서열번호 6과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 5 또는 서열번호 6과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 5 또는 서열번호 6과 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. HBV pol 항원을 인코딩하는 예시적인 비-천연 핵산 분자는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는다.

다른 구현예에서, 제2 비-천연 핵산 분자는 HBV pol 항원 서열, 예컨대, 서열번호 7의 아미노산 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함한다. 바람직하게, 신호 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직하게, 신호 서열에 대한 코딩 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 출원의 다른 구현예에서, 비-천연 핵산 분자는 HBV Pol 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원, 또는 절두된 HBV 코어 항원에 작동적으로 연결된 HBV Pol 항원을 포함하는 HBV 항원 융합 단백질을 인코딩한다. 구체적 구현예에서, 본 출원의 비-천연 핵산 분자는 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 더욱 바람직하게 서열번호 2 또는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원; 링커; 및 서열번호 7과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 7과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 7과 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩한다. 본 출원의 구체적 구현예에서, 비-천연 핵산 분자는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원, (AlaGly)n을 포함하고 n은 2 내지 5의 정수인 링커; 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HBV Pol 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 본 출원의 구체적 구현예에서, 비-천연 핵산 분자는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HBV 항원 융합 단백질을 인코딩한다.

HBV 항원 융합 단백질을 인코딩하는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 예는 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 1 또는 서열번호 3과 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이로 제한되지 않고, 이는 서열번호 11과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 11과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 11과 98%, 99% 또는 100% 동일한 링커 코딩 서열에 작동적으로 연결되고, 이는 서열번호 5 또는 서열번호 6과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 5 또는 서열번호 6과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 5 또는 서열번호 6과 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열과 추가적으로 작동적으로 연결된다. 본 출원의 구체적 구현예에서, HBV 항원 융합 단백질을 인코딩하는 비-천연 핵산 분자는 서열번호 1 또는 서열번호 3을 포함하고, 이는 서열번호 11에 작동적으로 연결되고, 이는 추가적으로 서열번호 5 또는 서열번호 6에 작동적으로 연결된다.

다른 구현예에서, HBV 융합을 인코딩하는 비-천연 핵산 분자는 HBV 융합 서열, 예컨대, 서열번호 16의 아미노산 서열의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열에 대한 코딩 서열을 추가로 포함한다. 바람직하게, 신호 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직하게, 신호 서열에 대한 코딩 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 신호 서열을 갖는 인코딩된 융합 단백질은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함한다.

본 출원은 또한 제1 및/또는 제2 비-천연 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "벡터"는 유전적 물질을 그것이 복제 및/또는 발현될 수 있는 다른 세포로 수송하기 위해 사용되는 핵산 분자이다. 본 개시의 관점에서 당업자에게 알려져 있는 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 벡터의 예는 플라스미드, 바이러스 벡터(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 코스미드 및 인공 염색체(예를 들어, YAC)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게, 벡터는 DNA 플라스미드이다. 벡터는 DNA 벡터 또는 RNA 벡터일 수 있다. 당업자는 본 개시의 관점에서 표준 재조합 기술을 통해 본 출원의 벡터를 작제할 수 있다.

본 출원의 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 RNA에 대해 코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 유형의 유전적 작제물를 지칭한다. 발현 벡터는 재조합 단백질 발현을 위한 벡터, 예컨대, DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 및 대상체 조직에서의 발현을 위해 대상체로 핵산을 전달하기 위한 벡터, 예컨대, DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 당업자는 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 요망되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 의존될 수 있음을 이해할 것이다.

본 출원의 벡터는 다양한 조절 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "조절 서열"은 복제(replication), 중첩(duplication), 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성(stability) 및/또는 핵산분자 또는 이의 유도체(즉, mRNA) 중 하나의 숙주 세포 또는 유기체로의 수송을 포함하는 핵산 분자의 기능적 조절을 허용, 기여 또는 조절하는 임의의 서열을 지칭한다. 본 개시의 문맥에서, 이 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호 및 mRNA 안정성에 영향을 미치는 요소)를 포괄한다.

본 출원의 몇몇 구현예에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 비-바이러스 벡터의 예는 DNA 플라스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파지 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 비-바이러스 벡터의 예는 RNA 레플리콘, mRNA 레플리콘, 변형된 mRNA 레플리콘 또는 자기-증폭 mRNA, 폐선형 데옥시리보핵산, 예컨대, 선형 공유결합 폐쇄형 DNA, 예컨대, 선형 공유결합 폐쇄형 이중 가닥 DNA 분자를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게, 비-바이러스 벡터는 DNA 플라스미드이다. "DNA 플라스미드"는, "DNA 플라스미드 벡터", "플라스미드 DNA" 또는 "플라스미드 DNA 벡터"와 상호 교환적으로 사용되며, 적합한 숙주 세포에서 자율 복제가 가능한 이중 가닥 및 일반적으로 원형인 DNA 서열을 지칭한다. 인코딩된 폴리뉴클레오티드의 발현에 사용되는 DNA 플라스미드는 전형적으로 복제 기점, 다중 클로닝 부위, 및 예를 들어 항생제 내성 유전자일 수 있는 선택 가능한 마커를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 DNA 플라스미드의 예는 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)의 단백질의 생산 및/또는 발현에 사용될 수 있는 pSE420(Invitrogen, San Diego, Calif.); 효모의 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주에서의 생산 및/또는 발현에 사용될 수 있는 pYES2(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific); 곤충 세포에서의 생산 및/또는 발현에 사용될 수 있는 MAXBAC® 완전 바큘로바이러스 발현 시스템(Thermo Fisher Scientific); 포유동물 세포에서 고수준 구성 단백질 발현에 사용될 수 있는 pcDNATM 또는 pcDNA3TM(Life Technologies, Thermo Fisher Scientific); 및 대부분의 포유동물 세포에서 관심 단백질의 고수준 일시적 발현에 사용될 수 있는 pVAX 또는 pVAX-1(Life Technologies, Thermo Fisher Scientific)과 같은 잘 알려져 있는 발현 시스템(원핵생물 및 진핵생물 시스템 둘 다 포함)에 사용하기 위한 상업적으로 이용 가능한 발현 벡터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 임의의 상업적으로 입수 가능한 DNA 플라스미드의 백본은 숙주 세포에서 단백질 발현을 최적화하도록, 예컨대, 특정 요소(예를 들어, 복제 기점 및/또는 항생제 내성 카세트)의 배향 역전, 플라스미드에 내인성인 프로모터의 대체(예를 들어, 항생제 내성 카세트의 프로모터), 및/또는 통상적인 기술 및 용이하게 입수 가능한 출발 물질을 사용하여 전사된 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 항생제 내성 유전자의 코딩 서열)의 대체를 위해 변형될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)] 참조).

바람직하게, DNA 플라스미드는 포유동물 숙주 세포에서의 단백질 발현에 적합한 발현 벡터이다. 포유동물 숙주 세포에서의 단백질 발현에 적합한 발현 벡터는 pcDNATM, pcDNA3TM, pVAX, pVAX-1, ADVAX, NTC8454 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게, 발현 벡터는 pVAX-1에 기초하며, 이는 포유동물 세포에서의 단백질 발현을 최적화하도록 추가적으로 변형될 수 있다. pVAX-1은 DNA 백신에서 통상적으로 사용되는 플라스미드이며, 강력한 인간 급초기 사이토메갈로바이러스(human immediate early cytomegalovirus, CMV-IE) 프로모터와 뒤이어 소 성장 호르몬(bovine growth hormone, bGH)-유래 폴리아데닐화 서열(pA)을 포함한다. pVAX-1는 pUC 복제 기점 및 박테리아 플라스미드 증식을 가능하게 하는 소형 원핵 프로모터에 의해 구동되는 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 추가로 포함한다.

또한 본 출원의 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 일반적으로 바이러스 벡터는 비-감염성으로 만들었으나, 바이러스 프로모터 및 전이유전자를 여전히 포함하여 바이러스 프로모터를 통한 전이유전자의 번역이 가능하게 한 변형된 바이러스 DNA 또는 RNA를 보유하는 유전공학적으로 조작된 바이러스이다. 바이러스 벡터는 흔히 감염 서열을 결여하기 때문에 헬퍼바이러스나 대규모 형질감염을 위한 팩키징 라인을 필요로 한다. 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 폭스-바이러스 벡터, 창자(enteric) 바이러스 벡터, 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan Equine Encephalitis) 바이러스 벡터, 셈리키 삼림(Semliki Forest) 바이러스 벡터, 담배 모자이크 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 예는 아레나바이러스 바이러스 벡터, 복제-결함 아레나바이러스 바이러스 벡터 또는 복제-경합 아레나바이러스 바이러스 벡터, 이절편화(bi-segmented) 또는 삼절편화(tri-segmented) 아레나바이러스, 감염성 아레나바이러스 바이러스 벡터, 게놈 절편의 하나의 개방형 해독틀이 결실되거나 기능적으로 불활성화된(그리고 본 명세서에 기술된 바와 같은 HBV 항원을 인코딩하는 핵산으로 교체된) 아레나바이러스 게놈 절편을 포함하는 핵산, 림프구성 맥락 수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitidis virus, LCMV), 예를 들어, 클론 13 균주 또는 MP 균주와 같은 아레나바이러스, 및 주닌 바이러스(Junin virus) 예컨대 Candid #1와 같은 아레나바이러스 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 벡터는 또한 비-바이러스 벡터일 수 있다.

바람직하게, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, 재조합 아데노바이러스 벡터이다. 재조합 아데노바이러스 벡터는, 예컨대, 인간 아데노바이러스(HAdV, 또는 AdHu), 또는 침팬지 또는 고릴라 아데노바이러스(ChAd, AdCh, 또는 SAdV)와 같은 시미안(simian) 아데노바이러스 또는 레서스(rhesus) 아데노바이러스(rhAd)로부터 유래할 수 있다. 바람직하게, 아데노바이러스 벡터는 재조합 인간 아데노바이러스 벡터, 예컨대, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26, 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5, 4, 35, 7, 48 등 중 어느 하나 등이다. 다른 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 rhAd 벡터, 예컨대, rhAd51, rhAd52 또는 rhAd53이다.

벡터는 또한 선형 공유결합 폐쇄형 이중 가닥 DNA 벡터일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "선형 공유결합 폐쇄형 이중 가닥 DNA 벡터"는 플라스미드 DNA와 구조적으로 별개인 폐쇄 선형 데옥시리보핵산(DNA)을 지칭한다. 이는 플라스미드 DNA의 다수 이점뿐만 아니라 RNA 전략과 유사한 최소 카세트 크기를 갖는다. 예를 들어, 이는 일반적으로 인코딩된 항원 서열, 프로모터, 폴리아데닐화 서열 및 텔로머 말단을 포함하는 벡터 카세트일 수 있다. 플라스미드-비함유 작제물은 박테리아 서열에 대한 필요 없이 효소 과정을 통해 합성될 수 있다. 적합한 선형 공유결합 폐쇄형 이중 가닥 DNA 벡터의 예는 상업적으로 입수 가능한 발현 벡터, 예컨대, Doggybone™ 폐쇄 선형 DNA'(dbDNA™)(Touchlight Genetics Ltd.; 런던, 영국)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합되는 문헌[Scott et al, Hum Vaccin Immunother. 2015 Aug; 11(8): 1972-1982]을 참조한다. 선형 공유결합 폐쇄형 이중 가닥 DNA 벡터, 본 발명의 활성 분자와 같은 DNA 분자를 전달하기 위한 이러한 벡터의 조성물 및 생성 및 사용 방법의 몇몇 예는 각각 전체 관련 내용이 본 명세서에 참조로 통합되는 US2012/0282283, US2013/0216562, 및 US2018/0037943에 기재되어 있다.

본 출원에 유용한 재조합 벡터는 본 개시의 관점에서 기술 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)의 관점에서, 동일 폴리펩티드를 인코딩하는 여러 핵산 서열이 설계될 수 있다. 본 출원의 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 숙주 세포(예를 들어, 박테리아 또는 포유동물 세포)에서의 적절한 발현을 보장하도록 코돈-최적화될 수 있다. 코돈-최적화는 기술분야에 널리 적용되는 기술이고, 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드를 얻는 방법은 본 개시의 관점에서 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다.

본 출원의 벡터, 예를 들어, DNA 플라스미드, 바이러스 벡터(구체적으로 아데노바이러스 벡터), RNA 벡터(예컨대, 자기-복제 RNA 레플리콘), 또는 선형 공유결합 폐쇄형 이중 가닥 DNA 벡터는 벡터의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 HBV 항원(들)의 복제 및 발현을 포함하지만 이로 제한되지 않는 종래의 벡터의 기능(들)을 확립하기 위한 임의의 조절 요소를 포함할 수 있다. 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 번역 정지 코돈, 리보솜 결합 요소, 전사 종결자, 선택 마커, 복제 기점 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 벡터는 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. "발현 카세트"는 세포 기구로 하여금 RNA 및 단백질을 만들도록 지시하는 벡터의 부분이다. 발현 카세트는 전형적으로 3 개의 요소를 포함한다: 프로모터 서열, 개방형 해독틀, 및 선택적으로 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3'-비번역 영역(UTR). 개방형 해독틀(ORF)은 관심 단백질(예를 들어, HBV 항원)의 개시 코돈부터 정지 코돈까지 코딩 서열을 포함하는 해독틀이다. 발현 카세트의 조절 요소는 관심 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결된"은 이의 가장 널리 합리적 맥락에서 해석되어야 하며 기능적 관련성을 갖는 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레오티드와 기능적 관련성을 갖는 경우 "작동적으로 연결"된다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미친다면 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 기술된 발현 카세트에 사용하기에 적합한 임의의 구성요소는 본 출원의 벡터를 제조하기 위해 임의의 조합 및 임의의 순서로 사용될 수 있다.

벡터는 프로모터 서열을, 바람직하게 발현 카세트 내에 포함할 수 있어 관심 HBV 항원의 발현을 조절한다. 용어 "프로모터"는 그 관습적 의미에서 사용되며, 작동적으로 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터는 이것이 전사하는 뉴클레오티드 서열 인근의 동일 가닥 상에 위치한다. 프로모터는 구성성, 유도성 또는 억제성일 수 있다. 프로모터는 천연 또는 합성일 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 균류, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래할 수 있다. 프로모터는 동종성 프로모터(즉, 벡터로서 동일 유전적 공급원 유래) 또는 이종성 프로모터(즉, 상이한 벡터 또는 유전적 공급원 유래)일 수 있다. 예를 들어, 사용될 벡터가 DNA 플라스미드인 경우, 프로모터는 플라스미드에 내인성(동종성)이거나 다른 공급원 유래(이종성)일 수 있다. 바람직하게, 프로모터는 발현 카세트 내에 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한다.

사용될 수 있는 프로모터는 시미안 바이러스 40(simian virus 40, SV40) 유래의 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(mouse mammary tumor virus, MMTV) 프로모터, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로모터, 예컨대, 소과 면역결핍 바이러스(bovine immunodeficiency virus, BIV) 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스(Moloney virus) 프로모터, 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus, ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 예컨대, CMV 급초기 프로모터(CMV immediate early promoter, CMV-IE), 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus, EBV) 프로모터, 또는 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) 프로모터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 또한 프로모터는 인간 유전자, 예컨대, 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 인간 메탈로티오닌으로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 천연 또는 합성의, 조직 특이적 프로모터, 예컨대, 근육 또는 피부 특이적 프로모터일 수 있다.

바람직하게, 프로모터는 강력한 진핵 프로모터, 바람직하게 사이토메갈로바이러스 급초기(CMV-IE) 프로모터이다. 예시적 CMV-IE 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18 또는 서열번호 19에 나타나 있다.

벡터는 발현된 전사체를 안정화시키고, RNA 전사체의 핵 유출을 증진하고 및/또는 전사-번역 커플링을 향상하는 추가적인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 폴리아데닐화 신호 및 인핸서 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 전형적으로 벡터의 발현 카세트 내의 관심 단백질(예를 들어, HBV 항원)의 코딩 서열의 하류에 위치한다. 인핸서 서열은 전사 인자에 의해 결합되면 연관 유전자의 전사를 증진하는 조절 DNA 서열이다. 인핸서 서열은 바람직하게 벡터의 발현 카세트 내의 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 상류이지만 프로모터 서열의 하류에 위치한다.

본 개시의 관점에서 당업자에게 알려져 있는 임의의 폴리아데닐화 신호가 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 신호, 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 바람직하게, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호 또는 SV40 폴리아데닐화 신호이다. 예시적 bGH 폴리아데닐화 신호의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 20에 나타나 있다. 예시적 SV40 폴리아데닐화 신호의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 13에 나타나 있다.

본 개시의 관점에서 당업자에게 알려져 있는 임의의 인핸서 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인핸서 서열은 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 CMV, HA, RSV, 또는 EBV 중 하나와 같은 바이러스 인핸서일 수 있다. 특정 인핸서의 예는 우드척 HBV 후-전사 조절 요소(Woodchuck HBV Posttranscriptional regulatory element, WPRE), 인간 아포리포단백질 A1 전구체(human apolipoprotein A1 precursor, ApoAI) 유래 인트론/엑손 서열, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1(human T-cell leukemia virus type 1, HTLV-1)의 긴 말단 반복부(LTR)의 비번역 R-U5 도메인, 스플라이싱 인핸서, 합성 토끼 β-글로빈 인트론, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게, 인핸서 서열은 HTLV-1 LTR의 비번역 R-U5 도메인, 토끼 β-글로빈 인트론 및 스플라이싱 인핸서의 3 개의 연속 요소의 복합체 서열이고, 이는 본 명세서에서 "삼중 인핸서 서열"로 지칭된다. 예시적 삼중 인핸서 서열의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10에 나타나 있다. 다른 예시적 인핸서 서열은 서열번호 12에 나타나는 ApoAI 유전자 단편이다.

벡터는 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 상류에 위치한다. 신호 펩티드는 전형적으로 단백질의 국부화를 지시하고, 단백질이 이것이 생산된 세포로부터의 분비되는 것을 촉진하고, 및/또는 항원 발현 및 항원-제시 세포에 대한 상호-제시를 증진한다. 신호 펩티드는 벡터로부터 발현될 때 HBV 항원의 N-말단에 존재할 수 있으나, 이는, 예를 들어, 상기 세포로부터의 분비 직후, 신호 펩티드에 의해 절단된다. 신호 펩티드가 절단된 발현된 단백질은 흔히 "성숙 단백질"이라 지칭된다. 본 개시의 관점에서 기술분야에 알려져 있는 임의의 신호 펩티드를 사용할 수 있다. 예를 들어, 신호 펩티드는 시스타틴 S 신호 펩티드; 면역글로불린(Ig) 분비 신호, 예컨대, Ig 중쇄 감마 신호 펩티드 SPIgG 또는 Ig 중쇄 엡실론 신호 펩티드 SPIgE일 수 있다.

바람직하게, 신호 펩티드 서열은 시스타틴 S 신호 펩티드이다. 시스타틴 S 신호 펩티드의 예시적 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 8 및 서열번호 9에 나타나 있다. 면역글로불린 분비 신호의 예시적 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 14 및 서열번호 15에 나타나 있다.

벡터, 예컨대, DNA 플라스미드는 또한 박테리아 복제 기점 및 박테리아 세포, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)의 플라스미드의 선택 및 유지를 위한 항생제 내성 발현 카세트를 포함할 수 있다. 박테리아 복제 기점 및 항생제 내성 카세트는 HBV 항원을 인코딩하는 발현 카세트와 동일 배향으로 또는 반대(역) 배향으로 벡터에 위치할 수 있다. 복제 기점(ORI)은 복제가 개시되는 서열이며 플라스미드가 세포 내에서 재생산되고 생존할 수 있게 한다. 본 출원에서 사용되기에 적합한 ORI의 예는 ColE1, pMB1, pUC, pSC101, R6K, 및 15A, 바람직하게 pUC를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. pUC ORI의 예시적인 뉴클레오티드 서열은 서열번호 21에 나타나 있다.

박테리아 세포의 선택 및 유지를 위한 발현 카세트는 전형적으로 항생제 내성 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함한다. 바람직하게, 항생제 내성 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터 서열은 관심 단백질, 예를들어, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열과 상이하다. 항생제 내성 유전자는 코돈 최적화될 수 있고, 항생제 내성 유전자의 서열 조성물은 일반적으로 박테리아, 예를 들어, 이. 콜라이, 코돈 사용에 조정된다. 본 개시의 관점에서 당업자에게 알려져 있는 임의의 항생제 내성 유전자를 사용할 수 있으며, 카나마이신 내성 유전자(kanamycin resistance gene, Kanr), 암피실린 내성 유전자(ampicillin resistance gene, Ampr), 및 테트라사이클린 내성 유전자(tetracycline resistance gene, Tetr), 뿐만 아니라 클로르암페니콜(chloramphenicol), 블레오마이신(bleomycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 카르베니실린(carbenicillin) 등에 내성을 부여하는 유전자를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

바람직하게, 벡터의 항생제 발현 카세트 내의 항생제 내성 유전자는 카나마이신 내성 유전자(Kanr)이다. Kanr 유전자의 서열은 서열번호 22에 나타나 있다. 바람직하게, Kanr 유전자는 코돈 최적화된다. 코돈 최적화된 Kanr 유전자의 예시적 핵산 서열은 서열번호 23에 나타나 있다. 상기 Kanr는 그 천연형 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있거나, Kanr 유전자는 이종성 프로모터에 연결될 수 있다. 구체적 구현예에서, Kanr 유전자는, bla 프로모터로 알려진 암피실린 내성 유전자(Ampr) 프로모터에 작동적으로 연결된다. bla 프로모터의 예시적 뉴클레오티드 서열은 서열번호 24에 나타나 있다.

본 출원의 구체적 구현예에서, 벡터는 서열번호 7과 적어도 90%, 예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96, 97%, 바람직하게 적어도 98%, 예컨대, 적어도 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV pol 항원, 및 서열번호 2 또는 서열번호 4의 적어도 95%, 예컨대, 95%, 96, 97%, 바람직하게 적어도 98%, 예컨대, 적어도 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HBV 항원 중 적어도 하나를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 5' 말단으로부터 3' 말단으로, 프로모터 서열, 바람직하게 서열번호 18의 CMV 프로모터 서열, 인핸서 서열, 바람직하게 서열번호 10의 삼중 인핸서 서열, 및 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 시스타틴 S 신호 펩티드를 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 상류 서열; 및 폴리아데닐화 신호, 바람직하게 서열번호 20의 bGH 폴리아데닐화 신호를 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 하류 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 DNA 플라스미드이다. 이러한 벡터는 추가적으로 항생제 내성 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상류이고 이에 작동적으로 연결된 서열번호 24의 Amp^r(bla) 프로모터에 작동적으로 연결된, 항생제 내성 유전자, 바람직하게 Kan^r 유전자, 보다 바람직하게 서열번호 23과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 23과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 23과 100% 동일한, 코돈 최적화된 Kan^r 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항생제 내성 발현 카세트; 및 복제 기점, 바람직하게 서열번호 21의 pUC ori를 포함한다. 바람직하게, 상기 항생제 내성 카세트 및 복제 기점은 HBV 항원 발현 카세트와 비교하여 반대 배향(orientation)으로 플라스미드 내에 존재한다.

본 출원의 다른 구체적 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 바람직하게 아데노바이러스 벡터, 보다 바람직하게 Ad26 또는 Ad35 벡터이고, 서열번호 7과 적어도 90%, 예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96, 97%, 바람직하게 적어도 98%, 예컨대, 적어도 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV pol 항원, 및 서열번호 2 또는 서열번호 4의 적어도 95%, 예컨대, 95%, 96, 97%, 바람직하게 적어도 98%, 예컨대, 적어도 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HBV 항원 중 적어도 하나를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 5' 말단으로부터 3' 말단으로, 바람직하게 서열번호 19의 CMV 프로모터 서열인 프로모터 서열, 바람직하게 서열번호 12의 ApoAI 유전자 단편 서열인 인핸서 서열, 및 바람직하게 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분비 신호를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열인 신호 서열을 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 상류 서열; 및 폴리아데닐화 신호, 바람직하게 서열번호 13의 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 하류 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, 벡터, 예컨대, 플라스미드 DNA 벡터 또는 바이러스 벡터(바람직하게 아데노바이러스 벡터, 보다 바람직하게 Ad26 또는 Ad35 벡터)는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 HBV Pol 항원을 인코딩한다. 바람직하게 상기 벡터는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 5 또는 서열번호 6과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 5 또는 서열번호 6과 100% 동일한 HBV Pol 항원을 위한 코딩 서열을 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, 벡터, 예컨대, 플라스미드 DNA 벡터 또는 바이러스 벡터(바람직하게 아데노바이러스 벡터, 보다 바람직하게 Ad26 또는 Ad35 벡터)는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩한다. 바람직하게, 상기 벡터는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 1 또는 서열번호 3과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 1 또는 서열번호 3과 100% 동일한 절두된 HBV 코어 항원을 위한 코딩 서열을 포함한다.

본 출원의 추가의 다른 구현예에서, 벡터, 예컨대, 플라스미드 DNA 벡터 또는 바이러스 벡터(바람직하게 아데노바이러스 벡터, 보다 바람직하게 Ad26 또는 Ad35 벡터)는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 HBV Pol 항원 및 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 바람직하게, 상기 벡터는 융합을 위한 코딩 서열을 포함하되, 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 1 또는 서열번호 3과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 1 또는 서열번호 3과 98%, 99% 또는 100% 동일한, 보다 바람직하게 서열번호 1 또는 서열번호 3과 동일한 절두된 HBV 코어 항원을 위한 코딩 서열을 포함하고, 이는 서열번호 5 또는 서열번호 6과 적어도 90%, 예컨대, 서열번호 5 또는 서열번호 6과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 5 또는 서열번호 6과 98%, 99% 또는 100% 동일한, 보다 바람직하게 서열번호 5 또는 서열번호 6과 동일한 HBV Pol 항원을 위한 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 바람직하게, 상기 절두된 HBV 코어 항원을 위한 코딩 서열은 서열번호 11과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 11과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 11과 98%, 99% 또는 100% 동일한 링커를 위한 코딩 서열을 통해 HBV Pol 항원을 위한 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 본 출원의 구체적 구현예에서, 벡터는 서열번호 1 또는 서열번호 3을 갖는 융합을 위한 코딩 서열을 포함하고, 이는 서열번호 11에 작동적으로 연결되고, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 추가적으로 작동적으로 연결된다.

본 출원의 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터는 본 개시의 관점에서 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클로레오티드는, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 등, 당업자에게 잘 알려져 있는 표준 분자생물학 기술을 사용하여 발현 벡터 내로 도입 또는 "클로닝"될 수 있다.

세포, 폴리펩티드 및 항체

본 출원은 또한 본 명세서에서 기술된 폴리뉴클레오티드 및 벡터 중 임의의 것을 포함하는, 세포, 바람직하게 단리된 세포를 제공한다. 상기 세포는, 예를 들어, 재조합 단백질 생산을 위해, 또는 바이러스 입자의 생산을 위해 사용될 수 있다.

따라서 본 출원의 구현예들은 또한 본 출원의 HBV 항원을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 프로모터에 작동적으로 연결된 본 출원의 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계, HBV 항원의 발현에 적합한 조건 하에 형질감염된 세포를 성장시키는 단계, 및 선택적으로 세포 내에서 발현된 HBV 항원을 정제하거나 단리하는 단계를 포함한다. 상기 HBV 항원은 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 등을 포함하는 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의하여 세포로부터 단리되거나 수집될 수 있다. 재조합 단백질 발현을 위해 사용되는 기술은 본 개시의 관점에서 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. 발현된 HBV 항원은 또한 발현된 단백질을 정제하거나 단리하지 않고, 예를 들어, HBV 항원을 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염되고 HBV 항원의 발현에 적합한 조건 하에서 성장된 세포의 상청액을 분석하여, 연구될 수 있다.

따라서, 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 비-천연 또는 재조합 폴리펩티드가 또한 제공된다. 상기 및 이하에 기술되는 바와 같이, 이들 서열을 인코딩하는 단리된 핵산 분자, 프로모터에 작동적으로 연결된 이들 서열을 포함하는 벡터, 및 상기 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조성물이 또한 본 출원에 의해 고려된다.

본 출원의 일 구현예에서, 재조합 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 2와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 비-천연 또는 재조합 폴리펩티드는 서열번호 2로 이루어진다.

본 출원의 다른 구현예에서, 비-천연 또는 재조합 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 4와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 비-천연 또는 재조합 폴리펩티드는 서열번호 4를 포함한다.

본 출원의 다른 구현예에서, 비-천연 또는 재조합 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한, 예컨대, 서열번호 7과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 비-천연 또는 재조합 폴리펩티드는 서열번호 7로 이루어진다.

또한 본 출원의 비-천연 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다. 본 출원의 일 구현예에서, 본 출원의 비-천연 HBV 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 다른 HBV 항원에 특이적으로 결합하지 않는다. 예를 들어, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 HBV Pol 항원에 특이적으로 결합하는 본 출원의 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖지 않는 HBV Pol 항원에 특이적으로 결합하지 않을 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 다클론, 단클론, 키메릭, 인간화, Fv, Fab 및 F(ab')2; 이작용성 하이브리드(예를 들어, 문헌[Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105, 1987]), 단일쇄(Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988); 및 변경된(altered) 불변 영역을 갖는 항체(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호)를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체는 1×10^-7 M 이하의 KD로 항원에 결합하는 항체를 지칭한다. 바람직하게, 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체는 1×10^-8 M 이하, 보다 바람직하게 5×10^-9M 이하, 1×10^-9 M 이하, 5×10^-10 M 이하, 또는 1×10^-10 M 이하의 KD로 항원에 결합한다. 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하며, Ka에 대한 Kd의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지며 몰 농도(M)으로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 본 개시의 관점에서 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 판별될 수 있다. 예를 들어, 항체의 KD는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 사용하여, 예컨대, 생체센서 시스템, 예컨대, Biacore® 시스템을 사용하여, 또는 생물층 간섭측정(bio-layer interferometry) 기술, 예컨대, Octet RED96 시스템을 사용하여 판별될 수 있다.

항체의 KD 값이 작을수록 표적 항원에 대한 항체의 결합 친화도는 높아진다.

RNAi 제제

본 출원은 또한 본 명세서에서 "HBV RNAi 분자" 또는 "HBV RNAi 제제"로도 지칭되는 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제의 치료적 적용에 관한 것이다.

HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제는 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제는 각각의 전체 내용이 본 명세서에 통합되는 US20130005793, WO2013003520 및 WO2018027106에 기재되어 있는 것들을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

각각의 HBV RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 16 개 내지 30 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 각각은 17 개 내지 26 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 길이일 수 있거나, 이들은 상이한 길이일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 각각은 독립적으로 17 개 내지 26 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥 각각은 독립적으로 17 개 내지 21 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다는 각각 독립적으로 21 개 내지 26 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 약 19 개 뉴클레오티드 길이인 반면, 안티센스 가닥은 약 21 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 약 21 개 뉴클레오티드 길이인 반면, 안티센스 가닥은 약 23 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다는 각각 26 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제 센스 및 안티센스 가닥 각각은 독립적으로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 또는 26 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 제제는 약 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개 뉴클레오티드의 이중체 길이를 갖는다. 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 이러한 완벽한 또는 실질적 상보성 영역은 전형적으로 15 개 내지 25 개(예를 들어, 15 개, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 또는 25 개) 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥의 5' 말단 또는 그 부근에서 발생한다(예를 들어, 이러한 영역은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 완벽하게 또는 실질적으로 상보적이지 않은 0 개, 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개의 뉴클레오티드만큼 떨어져 있을 수 있음).

센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각 16 개 내지 23 개의 핵염기 길이인 코어 스트레치 서열을 함유한다. 안티센스 가닥의 코어 스트레치 서열은 HBV mRNA 표적에 존재하는 뉴클레오티드 서열(때때로 예를 들어, 표적 서열로 지칭됨)에 100%(완벽하게) 상보적이거나 적어도 약 85%(실질적으로) 상보적이다. 센스 가닥의 코어 스트레치 서열은 안티센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열에 100%(완벽하게) 상보적이거나 적어도 약 85%(실질적으로) 상보적이고, 이에 따라 센스 가닥의 코어 스트레치 서열은 HBV mRNA 표적에 존재하는 뉴클레오티드 서열(표적 서열)과 완벽하게 동일하거나 적어도 약 85% 동일하다. 센스 가닥의 코어 스트레치 서열은 상응하는 안티센스 코어 서열과 동일한 길이일 수 있거나 상이한 길이일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열은 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 또는 23 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 또는 23 개 뉴클레오티드 길이이다.

본 명세서에서 사용되는 "RNA 간섭 제제", "RNAi 제제", "RNA 간섭 분자" 또는 "RNAi 분자"는 서열 특이적 방식으로 표적 mRNA의 메신저 RNA(mRNA) 전사체의 번역을 분해하거나 저해할 수 있는 RNA 또는 RNA 유사(예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA) 올리고뉴클레오티드 분자를 함유하는 조성물을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 RNAi 제제는 RNA 간섭 메커니즘을 통해(즉, 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 기구(RNA 유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex) 또는 RISC)와의 상호작용을 통해 RNA 간섭을 유도함), 또는 임의의 대안적인 메커니즘(들) 또는 경로(들)에 의해 작용할 수 있다. RNAi 제제는, 이 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, RNA 간섭 메커니즘을 통해 주로 작용하는 것으로 여겨지지만, 개시된 RNAi 제제는 임의의 특정 경로 또는 작용 메커니즘에 의해 구속되거나 이로 제한되지 않는다. 본 명세서에 개시된 RNAi 제제는 센스 가닥과 안티센스 가닥으로 구성되고, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 및 다이서 기질(dicer substrate)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 출원의 RNAi 제제는 바람직하게 dsRNA이다. 본 명세서에 기술된 RNAi 제제의 안티센스 가닥은 표적화되는 mRNA에 적어도 부분적으로 상보적이다. RNAi 제제는 변형된 뉴클레오티드 및/또는 하나 이상의 비-포스포디에스테르 결합으로 구성될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "이중 가닥 RNA", "dsRNA 분자", 또는 "dsRNA"는 두 개의 병렬방지 및 실질적으로 상보성 핵산 가닥을 포함하는 이중체 구조를 갖는 리보핵산 분자, 또는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 이중체 구조를 형성하는 두 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있거나, 이들은 별개의 RNA 분자일 수 있다. 두 가닥이 하나의 더 큰 분자의 일부이고 따라서 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 한 5'-말단 사이에 뉴클레오티드의 중단되지 않은 사슬에 의해 연결되어 이중체를 형성하는 경우, 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프"로 지칭된다. 두 가닥이 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 뉴클레오티드의 중단되지 않은 사슬 이외의 수단에 의해 공유 연결되어 이중체 구조를 형성하는 경우, 연결 구조는 "링커"로 지칭된다. RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 이중체 구조에 추가하여, dsRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있거나 블런트 말단일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 주어진 유전자의 발현을 지칭할 때의 용어 "침묵", "감소", "저해", "하향 조절", 또는 "녹다운(knockdown)"은, 그 유전자로부터 전사되는 RNA의 수준 또는 그 유전자가 전사되는 세포, 세포의 군, 조직, 또는 대상체에서 mRNA로부터 번역되는 폴리펩티드, 단백질 또는 단백질 서브유닛의 수준에 의해 측정하는 경우, 세포, 세포의 군, 조직, 기관, 또는 대상체가 본 명세서에 기술된 RNAi 제제와 같은 올리고머 화합물로 처리될 때 그렇게 처리되지 않은 제2 세포, 세포의 군, 조직, 기관, 또는 대상체와 비교하여 그 유전자의 발현이 감소함을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "B형 간염 바이러스 유전자"는 B형 간염 바이러스의 복제 및 발병에 필요한 유전자, 특히 코어 단백질, 바이러스 폴리머라제, 표면 항원, e-항원 및 X 단백질을 인코딩하는 유전자, 및 이의 기능적 단편을 인코딩하는 유전자와 관련된다. 용어 "B형 간염 바이러스 유전자/서열"은 야생형 서열(들)뿐만 아니라 상기 유전자/서열에 포함될 수 있는 변형 및 변경을 지칭한다. 따라서, 본 출원은 본 명세서에 제공된 특정 RNAi 제제로 제한되지 않는다. 본 출원은 또한 그러한 변형/변경을 포함하는 B형 간염 바이러스 유전자의 RNA 전사체의 상응하는 뉴클레오티드 스트레치와 적어도 85% 상보적인 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 제제에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "컨센서스 서열"은 유전자형 A, B, C 및 D의 B형 간염 바이러스 게놈 서열들 중에서 고도로 보존된 적어도 13 개 인접 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 17 개 인접 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 적어도 19 개 인접 뉴클레오티드를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "표적 서열"은 1차 전사 산물의 RNA 프로세싱의 산물인 mRNA를 포함하여, B형 간염 바이러스 유전자의 전사 중에 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 인접 부분을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오티드 명명을 사용하는 것으로 언급되는 서열에 의해 나타낸 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 그러나, 본 명세서에서 상세히 기재되는 바와 같이, 이러한 "서열을 포함하는 가닥"은 또한 변형된 뉴클레오티드와 같은 변형을 포함할 수 있다.

RNAi 제제는 B형 간염 바이러스의 발현을 시험관내 검정에서, 즉, 시험관내에서 적어도 약 60%까지, 바람직하게 적어도 70%까지, 가장 바람직하게 적어도 80%까지 억제할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "시험관내"는 세포 배양 검정을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 당업자는 특히 본 명세서에 제공된 검정에 비추어 이러한 억제율 및 관련 효과를 용이하게 결정할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 외"는 서열 상보성에 기초하여 기술된 RNAi 제제에 혼성화시키는 인 실리코 방법에 의해 예측되는 전사체의 모든 비-표적 mRNA를 지칭한다. 본 출원의 RNAi 제제는 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는데, 즉, 임의의 표적 외의 발현을 억제하지 않는다.

본 출원의 RNAi 제제는 표적 서열에 하나 이상의 미스매치를 함유할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 출원의 RNAi 제제는 13 개 이하의 미스매치를 함유한다. RNAi 제제의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대해 미스매치를 함유하는 경우, 미스매치의 영역은 안티센스 가닥의 5' 말단의 뉴클레오티드 2 내지 7 내에 위치하지 않는 것이 바람직하다. 다른 구현예에서, 미스매치의 영역은 안티센스 가닥의 5' 말단의 뉴클레오티드 2 내지 9 내에 위치하지 않는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 그리고 달리 나타내지 않는 한, 용어 "상보적"은 제2 뉴클레오티드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오티드 서열을 설명하기 사용되는 경우, 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 특정 조건 하에 혼성화되고 이중체 구조를 형성하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 능력을 지칭한다. 상보적 서열은 또한 비-왓슨-크릭 염기 쌍 및/또는 혼성화하는 이들의 능력에 대하여 상기 요건이 충족되는 정도까지 비-천연 및 변형된 뉴클레오티드로부터 형성된 염기 쌍을 포함하거나 오로지 이로부터만 형성될 수 있다.

용어 "안티센스 가닥"은 표적 서열에 대해 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적 영역"은 서열, 예를 들어, 표적 서열에 대해 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보적 영역이 표적 서열에 대해 완전 상보적이 아닌 경우, 미스매치는 안티센스 가닥의 5' 말단의 뉴클레오티드 2 내지 7 외에서 가장 용인된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "센스 가닥"은 안티센스 가닥의 영역에 대해 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 지칭한다. "실질적으로 상보적"은 센스 및 안티센스 가닥에서 중첩되는 뉴클레오티드의 바람직하게 적어도 85%가 상보적인 것을 의미한다.

HBV RNAi 제제를 형성하는 데 사용되는 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 예는 전체 내용이 본 명세서에 통합되는 US20130005793 및 WO2018027106으로부터 재현되는 도 4 내지 도 6 및 도 8 내지 도 10에 제공된다.

HBV RNAi 제제 센스 및 안티센스 가닥은 어닐링되어 이중체를 형성한다. HBV RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 서로 부분적으로, 실질적으로, 또는 완전히 상보적일 수 있다. 상보적 이중체 영역 내에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 안티센스 코어 스트레치 서열에 대해 적어도 약 85% 상보적 또는 100% 상보적이다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥 코어 스트레치 서열은 안티센스 가닥 코어 스트레치 서열의 상응하는 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 또는 21 개 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 85% 또는 100% 상보적인 적어도 16 개, 적어도 17 개, 적어도 18 개, 적어도 19 개, 적어도 20 개, 또는 적어도 21 개 뉴클레오티드의 서열을 함유한다(즉, HBV RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 코어 스트레치 서열은 적어도 85%의 쌍을 이룬 염기 또는 100%의 쌍을 이룬 염기인 적어도 16 개, 적어도 17 개, 적어도 18 개, 적어도 19 개, 적어도 20 개, 또는 적어도 21 개 뉴클레오티드의 영역을 가짐).

몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 HBV RNAi 제제의 안티센스 가닥은 본 명세서에 기술된 임의의 안티센스 가닥 서열로부터 0 개, 1 개, 2 개, 또는 3 개 뉴클레오티드가 상이하다. 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 HBV RNAi 제제의 센스 가닥은 본 명세서에 기술된 임의의 센스 가닥 서열로부터 0 개, 1 개, 2 개, 또는 3 개 뉴클레오티드가 상이하다.

본 명세서에 기술된 HBV RNAi 제제 센스 및 안티센스 가닥의 길이는 독립적으로 16 개 내지 30 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 17 개 내지 26 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥은 19 개 내지 26 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 본원에 기술된 RNAi 제제 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개, 24 개, 25 개, 또는 26 개 뉴클레오티드 길이이다. 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 길이일 수 있거나, 이들은 상이한 길이일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각 26 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 23 개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 21 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 22 개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 21 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 21 개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 21 개 뉴클레오티드 길이이다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥은 19 개 뉴클레오티드 길이이고, 안티센스 가닥은 21 개 뉴클레오티드 길이이다.

센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 선택적으로 그리고 독립적으로 코어 서열의 3' 말단, 5' 말단, 또는 3' 말단과 5' 말단 둘 다에 추가의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 뉴클레오티드(연장부(extension))를 함유할 수 있다. 존재하는 경우, 안티센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는 HBV mRNA 내의 상응하는 서열에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다. 존재하는 경우, 센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는 HBV mRNA 내의 상응하는 서열에 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 존재하는 경우, 안티센스 가닥의 추가의 뉴클레오티드는 존재하는 경우 상응하는 센스 가닥의 추가 뉴클레오티드에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 연장부는 센스 가닥의 코어 스트레치 서열 및/또는 안티센스 가닥의 코어 스트레치 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 센스 가닥 상의 연장부 뉴클레오티드는 상응하는 안티센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열 뉴클레오티드 또는 연장부 뉴클레오티드인 뉴클레오티드에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다. 반대로, 안티센스 가닥 상의 연장부 뉴클레오티드는 상응하는 센스 가닥 내의 코어 스트레치 서열 뉴클레오티드 또는 연장부 뉴클레오티드인 뉴클레오티드에 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다는 3' 연장부 및 5' 연장부를 함유한다. 몇몇 구현예에서, 하나의 가닥의 3' 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 다른 하나의 가닥의 하나 이상의 5' 연장부 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룬다. 다른 구현예에서, 하나의 가닥의 3' 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 다른 하나의 가닥의 하나 이상의 5' 연장부 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 3' 연장부를 갖는 안티센스 가닥 및 5' 연장부를 갖는 센스 가닥을 갖는다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개 뉴클레오티드 길이인 3' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 다른 구현예에서, HBV RNAi 제제는 1 개, 2 개, 또는 3 개 뉴클레오티드 길이인 3' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 안티센스 가닥의 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 우라실 또는 티미딘 뉴클레오티드, 또는 상응하는 HBV mRNA 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 3' 안티센스 가닥 연장부는 AUA, UGCUU, CUG, UG, UGCC, CUGCC, CGU, CUU, UGCCUA, CUGCCU, UGCCU, UGAUU, GCCUAU, T, TT, U, UU(각각은 5'로부터 3'로 나열됨)를 포함하거나 이로 이루어지지만, 이로 제한되지 않는다. 몇몇 구현예에서, 안티센스 가닥 3' 말단은 추가의 무염기성 뉴클레오시드(Ab)를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, Ab 또는 AbAb는 안티센스 가닥의 3' 말단에 첨가될 수 있다.

몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 뉴클레오티드 길이인 5' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 다른 구현예에서, HBV RNAi 제제는 1 개 또는 2 개 뉴클레오티드 길이인 5' 연장부를 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 안티센스 가닥의 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 우라실 또는 티미딘 뉴클레오티드, 또는 상응하는 HBV mRNA 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 5' 안티센스 가닥의 연장부는 UA, TU, U, T, UU, TT, CUC (각각 5'로부터 3'로 나열됨)를 포함하거나 이로 이루어지지만, 이로 제한되지 않는다. 안티센스 가닥은, 존재하는 경우, 기재된 임의의 5' 안티센스 가닥의 연장부와 함께 상기 기재된 임의의 3' 연장부를 가질 수 있다.

몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 뉴클레오티드 길이인 3' 연장부를 갖는 센스 가닥을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥의 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 아데노신, 우라실, 또는 티미딘 뉴클레오티드, AT 다이뉴클레오티드, 또는 HBV mRNA 서열 내의 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 3' 센스 가닥의 연장부는 T, UT, TT, UU, UUT, TTT, 또는 TTTT(각각 5'로부터 3'로 나열됨)를 포함하거나 이로 이루어지지만, 이로 제한되지 않는다.

몇몇 구현예에서, 센스 가닥의 3' 말단은 추가의 무염기성 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, UUAb, UAb, 또는 Ab는 센스 가닥의 3' 말단에 첨가될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥의 3' 말단에 첨가된 하나 이상의 무염기성 뉴클레오시드는 역전될 수 있다(invAb). 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 역전된 무염기성 뉴클레오시드는 RNAi 제제의 표적화 리간드와 센스 가닥의 핵염기 서열 사이에 삽입될 수 있다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥의 종결 말단(들)에 또는 그 부근에 하나 이상의 역전된 무염기성 뉴클레오시드를 포함하는 것은 RNAi 제제의 활성 또는 다른 요망되는 특성을 향상시킬 수 있다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개 뉴클레오티드 길이인 5' 연장부를 갖는 센스 가닥을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥의 연장부 뉴클레오티드 중 하나 이상은 우라실 또는 아데노신 뉴클레오티드, 또는 HBV mRNA 서열 내의 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥 5' 연장부는 CA, AUAGGC, AUAGG, AUAG, AUA, A, AA, AC, GCA, GGCA, GGC, UAUCA, UAUC, UCA, UAU, U, UU(각각 5'로부터 3'로 나열됨)일 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 센스 가닥은 3' 연장부 및/또는 5' 연장부를 가질 수 있다.

몇몇 구현예에서, 센스 가닥의 5' 말단은 추가의 무염기성 뉴클레오시드(Ab) 또는 뉴클레오시드(AbAb)를 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 센스 가닥의 5' 말단에 첨가된 하나 이상의 무염기성 뉴클레오시드는 역전될 수 있다(invAb). 몇몇 구현예에서, 하나 이상의 역전된 무염기성 뉴클레오시드는 RNAi 제제의 표적화 리간드와 센스 가닥의 핵염기 서열 사이에 삽입될 수 있다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥의 종결 말단 또는 종결 말단들에 또는 그 부근에 하나 이상의 역전된 무염기성 뉴클레오시드를 포함하는 것은 RNAi 제제의 활성 또는 다른 요망되는 특성을 향상시킬 수 있다.

HBV RNAi 제제를 형성하는 데 사용되는 뉴클레오티드 서열의 예는 US20130005793 및 WO2018027106으로부터 재현되는 도 4 내지 도 6 및 도 8 내지 도 10에 제공된다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제 안티센스 가닥은 도 4 내지 도 6, 도 8 또는 도 9에서 임의의 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제 안티센스 가닥은 도 4 내지 도 6, 도 8 또는 도 9에서 임의의 서열의 뉴클레오티드 1-17, 2-15, 2-17, 1-18, 2-18, 1-19, 2-19, 1-20, 2-20, 1-21, 2-21, 1-22, 2-22, 1-23, 2-23, 1-24, 2-24, 1-25, 2-25, 1-26, 또는 2-26의 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제 센스 가닥은 도 4 내지 도 6, 도 8 또는 도 10에서 임의의 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제 센스 가닥은 도 4 내지 도 6, 도 8 또는 도 10에서 임의의 서열의 뉴클레오티드 1-18, 1-19, 1-20, 1-21, 1-22, 1-23, 1-24, 1-25, 1-26, 2-19, 2-20, 2-21, 2-22, 2-23, 2-24, 2-25, 2-26, 3-20, 3-21, 3-22, 3-23, 3-24, 3-25, 3-26, 4-21, 4-22, 4-23, 4-24, 4-25, 4-26, 5-22, 5-23, 5-24, 5-25, 5-26, 6-23, 6-24, 6-25, 6-26, 7-24, 7-25, 7-25, 8-25, 8-26의 서열을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 기술된 RNAi 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 기술된 RNAi 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 상이한 수의 뉴클레오티드를 함유한다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥 5' 말단 및 안티센스 가닥 3' 말단은 블런트 말단을 형성한다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥 3' 말단 및 안티센스 가닥 5' 말단은 블런트 말단을 형성한다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 양 말단은 블런트 말단을 형성한다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 어느 말단도 블런트 말단이 아니다. 본 명세서에서 사용되는 블런트 말단은 2 개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드가 상보적인(상보적 염기 쌍을 형성하는) 이중 가닥 RNAi 제제의 말단을 지칭한다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥 5' 말단 및 안티센스 가닥 3' 말단은 프레이드(frayed) 말단을 형성한다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 센스 가닥 3' 말단 및 안티센스 가닥 5' 말단은 프레이드 말단을 형성한다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 양 말단은 프레이드 말단을 형성한다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 어느 말단도 프레이드 말단이 아니다. 본 명세서에서 사용되는 프레이드 말단은 2 개의 어닐링된 가닥의 말단 뉴클레오티드가 쌍을 형성하지만(즉, 오버행(overhang)을 형성하지 않지만) 상보적이지 않은(즉, 비상보적인 쌍을 형성하는) 이중 가닥 RNAi 제제의 말단을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 오버행은 이중 가닥 RNAi 제제의 한 가닥의 말단에 있는 하나 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 스트레치이다. 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상에 존재하여, 3' 오버행 또는 5' 오버행을 생성할 수 있다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제는 다음을 함유한다: 블런트 말단과 프레이드 말단, 블런트 말단과 5' 오버행 말단, 블런트 말단과 3' 오버행 말단, 프레이드 말단과 5' 오버행 말단, 프레이드 말단과 3' 오버행 말단, 2 개의 5' 오버행 말단, 2 개의 3' 오버행 말단, 5' 오버행 말단과 3' 오버행 말단, 2 개의 프레이드 말단, 또는 2 개의 블런트 말단.

뉴클레오티드 염기(또는 핵염기)는 모든 핵산의 구성요소인 헤테로사이클릭 피리미딘 또는 퓨린 화합물이고, 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T), 및 우라실(U)을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드"는 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 뉴클레오티드 모방체, 무염기성 부위(Ab), 또는 대용의 대체 모이어티와 같은)를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는, 다양한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 작제물에 사용될 때, 세포에서 화합물의 활성을 보존함과 동시에 이들 화합물의 혈청 안정성을 증가시킬 수 있고, 또한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 작제물의 투여시에 인간에서 인터페론 활성을 활성화시킬 가능성을 최소화할 수 있다.

몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 염, 혼합 염, 또는 유리 산으로서 제조되거나 제공된다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 나트륨 염으로서 제조된다. 그러한 형태는 본 명세서에 개시된 본 출원의 범주 내에 있다.

RNAi 제제를 언급할 때, "세포로 도입하는"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 세포로의 흡수 또는 통합을 용이하게 하는 것을 의미한다. RNAi 제제의 통합 또는 흡수는 비보조 확산 또는 활성 세포 과정을 통해, 또는 보조 제제 또는 장치에 의해 발생할 수 있다. 이 용어의 의미는 시험관내 세포로 제한되지 않으며; RNAi 제제는 또한 "세포로 도입"될 수 있으며, 여기서 세포는 살아 있는 유기체의 일부이다. 그러한 예에서, 세포로의 도입은 유기체로의 전달을 포함할 것이다. 예를 들어, 생체내 전달을 위해, RNAi 제제는 조직 부위에 주사되거나 전신 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 RNAi 제제는 의학적 개입이 필요한 대상체에게 투여되는 것이 예상된다. 이러한 투여는 본 출원의 RNAi 제제, 벡터 또는 세포를 상기 대상체의 질환이 있는 부위, 예를 들어, 간 조직/세포 또는 간암 조직과 같은 암성 간 조직/세포로 주사하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 주사는 바람직하게 예상되는 질환이 있는 조직에 매우 근접하게 된다. 세포로의 시험관내 도입은 전기천공법 및 리포펙션과 같은 당업계에 알려져 있는 방법을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "반감기"는 화합물 또는 분자의 안정성의 척도이고, 특히 본 명세서에 제공된 검정에 비추어 당업자에게 알려져 있는 방법에 의해 평가될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "비-면역자극성"은 기재된 RNAi 제제에 의한 면역 반응의 임의의 유도의 부재를 지칭한다. 면역 반응을 결정하는 방법은, 예를 들어, 실시예 섹션에 기재된 바와 같이 사이토카인의 방출의 평가에 의해서와 같이 당업자에게 잘 알려져 있다.

변형된 뉴클레오티드

몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 본 출원의 핵산은 당업계에 널리 확립된 방법에 의해 합성되고/합성되거나 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "변형된 뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드(2'-하이드록실 뉴클레오티드) 이외의 뉴클레오티드이다. 몇몇 구현예에서, 뉴클레오티드의 적어도 50%(예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)는 변형된 뉴클레오티드이다. 본 명세서에서 사용되는 변형된 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모방체, 무염기성 뉴클레오티드(본 명세서에서 Ab로 표현됨), 2'-변형된 뉴클레오티드, 3' 대 3' 결합(역전된) 뉴클레오티드(본 명세서에서 invdN, invN, invn, invAb로 표시됨), 비-천연 염기 포함 뉴클레오티드, 가교된 뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA), 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체(비잠금 핵염기 유사체, 본 명세서에서 NUNA로 표시됨), 잠금 뉴클레오티드(본 명세서에서 NLNA로 표시됨), 3'-O-메톡시(2' 뉴클레오시드간 결합된) 뉴클레오티드(본 명세서에서 3'-OMen로 표시됨), 2'-F-아라비노 뉴클레오티드(본 명세서에서 NfANA로 표시됨), 5'-Me, 2'-플루오로 뉴클레오티드(본 명세서에서 5Me-Nf로 표시됨), 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드(본 명세서에서 vpdN으로 표시됨), 비닐 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 및 사이클로프로필 포스포네이트 함유 뉴클레오티드(cPrpN)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 2'-변형된 뉴클레오티드(즉, 5-원 당 고리의 2' 위치에 하이드록실 기 이외의 기를 갖는 뉴클레오티드)는 2'-O-메틸 뉴클레오티드(뉴클레오티드 서열에서 소문자 'n'으로 표시됨), 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드(본 명세서에서 Nf로 표시되고, 또한 본 명세서에서 2'-플루오로 뉴클레오티드로 표시됨), 2'-데옥시 뉴클레오티드(본 명세서에서 dN으로 표시됨), 2'-메톡시에틸(2'-O-2-메톡시에틸) 뉴클레오티드(본 명세서에서 NM 또는 2'-MOE로 표시됨), 2'-아미노 뉴클레오티드, 및 2'-알킬 뉴클레오티드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 주어진 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없다. 반대로, 하나 초과의 변형이 단일 HBV RNAi 제제에 또는 심지어 이의 단일 뉴클레오티드에 포함될 수 있다. HBV RNAi 제제의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 합성되고/합성되거나 변형될 수 있다. 한 뉴클레오티드에서의 변형은 다른 뉴클레오티드에서의 변형과 무관하다.

변형된 핵염기는 합성 및 천연 핵염기, 예컨대, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린(예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 또는 5-프로피닐시토신), 5-메틸시토신(5-meC), 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-알킬(예를 들어, 6-메틸, 6-에틸, 6-아이소프로필, 또는 6-n-부틸) 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-알킬(예를 들어, 2-메틸, 2-에틸, 2-아이소프로필, 또는 2-n-부틸) 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 5-할로우라실, 시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-설프하이드릴, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로(예를 들어, 5-브로모), 5-트라이플루오로메틸, 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 뉴클레오티드의 전부 또는 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 존재하는 뉴클레오티드의 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드인 RNAi 제제는 리보뉴클레오티드인 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다에서 4 개 이하(즉, 0 개, 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개)의 뉴클레오티드를 갖는 RNAi 제제이다 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 존재하는 뉴클레오티드의 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드인 센스 가닥은 리보뉴클레오티드인 센스 가닥에서 2 개 이하(즉, 0 개, 1 개, 또는 2 개)의 뉴클레오티드를 갖는 센스 가닥이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 존재하는 뉴클레오티드의 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드인 안티센스 센스 가닥은 리보뉴클레오티드인 안티센스 가닥에서 2 개 이하(즉, 0 개, 1 개, 또는 2 개)의 뉴클레오티드를 갖는 안티센스 가닥이다. 몇몇 구현예에서, RNAi 제제의 하나 이상의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "당 치환기" 또는 "2'-치환기"는 산소 원자가 있는 또는 없는 리보퓨라노실 모이어티의 2'-위치에 결합된 기를 포함한다. 당 치환기는 플루오로, O-알킬, O-알킬아미노, O-알킬알콕시, 보호된 O-알킬아미노, O-알킬아미노알킬, O-알킬 이미다졸 및 화학식 (O-알킬)m의 폴리에테르(여기서, m은 1 내지 약 10임)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 폴리에테르 중에서 바람직한 것은 선형 및 고리형 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 크라운 에테르와 같은 (PEG)-함유 기, 특히 문헌[Delgardo et. al. (Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems (1992) 9:249)]에 개시된 것들이다. 추가 당 변형은 문헌[Cook (Anti-fibrosis Drug Design, (1991) 6:585-607)]에 개시되어 있다. 플루오로, O-알킬, O-알킬아미노, O-알킬 이미다졸, O-알킬 아미노알킬, 및 알킬 아미노 치환은 전체가 본 명세서에 참조로 통합되는 "Oligomeric Compounds having Pyrimidinc Nucleotide(s) with 2' and 5' Substitutions"라는 명칭의 미국 특허 제6,166,197호에 기재되어 있다.

본 출원에 대해 보정할 수 있는 추가 당 치환기는 2'-SR 및 2'-NR₂ 기를 포함하며, 여기서 각 R은 독립적으로 수소, 보호기 또는 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐이다. 2'-SR 뉴클레오시드는 그 전체가 본 명세서에 참조로 통합되는 US5670633에 개시되어 있다. 2'-SR 단량체 합성단위체(synthons)의 결합은 문헌[Hamm et al. (J. Org. Chem., (1997) 62:3415-3420)]에 개시되어 있다. 2'-NR 뉴클레오시드는 문헌[Thomson JB, J. Org. Chem., (1996) 61 :6273-6281; 및 Polushin et al., Tetrahedron Lett., (1996) 37:3227-3230]에 개시되어 있다. 본 출원에 대해 보정할 수 있는 추가 대표적인 2'-치환기는 화학식 I 또는 II 중 하나를 갖는 것들을 포함한다:

상기 식에서,

E는 C₁-C₁₀ 알킬, N(Q3)(Q4) 또는 C(Q3)(Q4)이고; 각 Q3 및 Q4는 독립적으로 H, C₁-C₁₀ 알킬, 디알킬아미노알킬, 질소 보호기, 매어있는(tethered) 또는 매이지 않은(untethered) 접합체 기, 고체 지지체에 대한 링커이거나; Q3 및 Q4는 함께 질소 보호기 또는 N 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 추가 헤테로원자를 선택적으로 포함하는 고리 구조를 형성하고;

q1은 1 내지 10의 정수이고;

q2는 1 내지 10의 정수이고;

q3는 0 또는 1이고;

q4는 0, 1 또는 2이고;

각 Z1, Z2, 및 Z3는 독립적으로 C₄-C₇ 시클로알킬, C₅-C₁₄ 아릴 또는 C₃-C₁₅ 헤테로시클릴이며, 여기서 상기 헤테로시클릴 기 내 헤테로원자는 산소, 질소 및 황으로부터 선택되고;

Z4는 OM1, SM1, 또는 N(M1)₂이며; 각 M1은 독립적으로 H, C₁-C₈ 알킬, C₁-C₈ 할로알킬, C(=NH)N(H)M2, C(=0)N(H)M2 또는 OC(=0)N(H)M2이고; M2는 H 또는 C₁-C₈ 알킬이고;

Z5는 C₁-C₁₀ 알킬, C₁-C₁₀ 할로알킬, C₂-C₁₀ 알케닐, C₂-C₁₀ 알키닐, C₆-C₁₄ 아릴, N(Q3)(Q4), OQ3, 할로, SQ3 또는 CN이다.

화학식 I의 대표적인 2'-O-당 치환기는 그 전체가 본 명세서에 참조로 통합되는 "Capped 2'-Oxyethoxy Oligonucleotides"라는 명칭의 US6172209에 개시되어 있다. 화학식 II의 대표적인 고리형 2'-O-당 치환기는 전체가 본 명세서에 참조로 통합되는 "RNA Targeted 2'-Modified Oligonucleotides that are Conformationally Preorganized"라는 명칭의 US6271358에 개시되어 있다.

또한, 리보실 고리 위에서 O-치환을 갖는 당은 본 출원에 대해 보정할 수 있다. 고리 O에 대한 대표적인 치환은 S, CH₂, CHF, 및 CF₂를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

또한, 올리고뉴클레오티드는 펜토퓨라노실 당 대신에 시클로부틸 부분과 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당의 제조와 관련되는 대표적인 미국 특허는 전체가 본 명세서에 참조로 통합되는 US5359044, US5466786, US5519134, US5591722, US5597909, US5646,265, 및 US5700920을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

변형된 뉴클레오시드간 결합

몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제의 하나 이상의 뉴클레오티드는 비표준 결합 또는 골격(즉, 변형된 뉴클레오시드간 결합 또는 변형된 골격)에 의해 연결된다. 몇몇 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드간 결합은 비-포스페이트-함유 공유 뉴클레오시드간 결합이다. 변형된 뉴클레오시드간 결합 또는 골격은 5'-포스포로티오에이트 기(본 명세서에서 소문자 "s"로 표시됨), 키랄 포스포로티오에이트, 티오포스페이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포트라이에스테르, 아미노알킬-포스포트라이에스테르, 알킬 포스포네이트(예를 들어, 메틸 포스포네이트 또는 3'-알킬렌 포스포네이트), 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트(예를 들어, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 또는 티오노포스포르아미데이트), 티오노알킬-포스포네이트, 티오노알킬포스포트라이에스테르, 모르폴리노 결합, 정상적인 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 보라노포스페이트의 2'-5' 연결된 유사체, 또는 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5' 대 5'-3' 또는 2'-5' 대 5'-2'로 연결되는 역전된 극성을 갖는 보라노포스페이트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 몇몇 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드간 결합 또는 골격은 인 원자를 결여한다. 인 원자를 결여하는 변형된 뉴클레오시드간 결합은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 당간 결합, 혼합 헤테로 원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 당간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로 원자 또는 헤테로사이클릭 당간 결합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 몇몇 구현예에서, 변형된 뉴클레오시드간 골격은 실록산 골격, 설파이드 골격, 설폭사이드골격, 설폰 골격, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격, 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격, 알켄-함유 골격, 설파메이트 골격, 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격, 설포네이트 및 설폰아미드 골격, 아미드 골격, 및 혼합 N, O, S 및 CH2 성분을 갖는 다른 골격을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제의 센스 가닥은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있거나, HBV RNAi 제제의 안티센스 가닥은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있거나, 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다는 독립적으로 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 또는 6 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제의 센스 가닥은 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있거나, HBV RNAi 제제의 안티센스 가닥은 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있거나, 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다는 독립적으로 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제의 센스 가닥은 적어도 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 함유한다. 몇몇 구현예에서, 적어도 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합은 센스 가닥의 3' 말단으로부터 위치 1-3에 있는 뉴클레오티드들 사이에 있다. 몇몇 구현예에서, 적어도 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합은 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 4-5, 또는 6-8에 있는 뉴클레오티드들 사이에 있다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제의 안티센스 가닥은 4 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 함유한다. 몇몇 구현예에서, 4 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합은 센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 1-3에 있는 뉴클레오티드 사이에 그리고 5' 말단으로부터 위치 19-21, 20-22, 21-23, 22-24, 23-25, 또는 24-26에 있는 뉴클레오티드들 사이에 있다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 센스 가닥에 적어도 2 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합 및 3 개 또는 4 개를 함유한다.

몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 결합을 함유한다. 몇몇 구현예에서, 2'-변형된 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드간 결합과 조합된다.

화학적 변형

본 출원의 RNAi 제제는 또한 안정성을 향상시키기 위해 화학적으로 변형시킬 수 있다. 본 출원의 핵산은 당업계에서 널리 확립된 방법에 의해 합성될 수 있고/합성될 수 있거나 변형될 수 있다. 화학적 변형은 2' 변형, 비-천연 염기의 도입, 리간드에 공유결합, 및 포스페이트 결합을 티오포스페이트 결합으로 대체, 역전된 데옥시티미딘을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 이 실시예에서, 이중체 구조의 온전성은 적어도 1 개, 바람직하게 2 개의 화학적 결합에 의해 강화된다. 화학적 결합은 다양한 잘 알려져 있는 기술 중 어느 기술에 의해, 예를 들어, 공유 결합, 이온 결합 또는 수소 결합; 소수성 상호작용, 반 데르 발스 또는 적층 상호작용(stacking interaction)의 도입에 의해; 금속-이온 배위에 의해, 또는 퓨린 유사체의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 바람직하게, RNAi 제제를 변형시키는 데 사용될 수 있는 화학적 기는, 제한 없이, 메틸렌 블루; 이작용기, 바람직하게 비스-(2-클로로에틸)아민; -아세틸-N'-(p-글리옥시벤조일)시스타민; 4-티오우라실; 및 프소랄렌(psoralen)을 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 링커는 헥사-에틸렌 글리콜 링커이다. 이 경우, RNAi 제제는 고체상 합성에 의해 생산되고, 헥사-에틸렌 글리콜 링커는 표준 방법에 따라 혼입된다(예를 들어, 문헌[Williams DJ and Hall KB, Biochem. (1996) 35: 14665-14670]). 구체적 구현예에서, 안티센스 가닥의 5'-말단 및 센스 가닥의 3'-말단은 헥사에틸렌 글리콜 링커를 통해 화학적으로 결합된다. 다른 구현예에서, RNAi 제제의 적어도 하나의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 기를 포함한다. RNAi 제제의 말단에서 화학적 결합은 삼중-나선 결합(triple-helix bond)에 의해 형성되는 것이 바람직하다.

HBV RNAi 제제

몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 HBV RNAi 제제는 도 7에 나타나 있는 HBV 게놈의 위치에 또는 그 부근의 HBV 유전자를 표적화한다. 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 HBV RNAi 제제의 안티센스 가닥은 도 7에 개시된 표적 HBV 19-량체 서열에 완전히, 실질적으로, 또는 적어도 부분적으로 상보적인 코어 스트레치 서열을 포함한다.

몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥의 19 번 위치(5'→3')는 도 7에 개시된 19-량체 표적 서열의 1 번 위치와 염기쌍을 형성할 수 있다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥의 1 번 위치(5'→3')는 도 7에 개시된 19-량체 표적 서열의 19 번 위치 와 염기쌍을 형성할 수 있다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥의 2 번 위치(5'→3')는 도 7에 개시된 19-량체 표적 서열의 18 번 위치와 염기쌍을 형성할 수 있다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 안티센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥의 2 번 내지 18 번 위치(5'→3')는 도 7에 개시된 19-량체 표적 서열의 18 번 내지 2 번 위치에 위치한 각각의 상보적 염기와 각각 염기쌍을 형성할 수 있다.

몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 도 4 내지 도 6 또는 도 8에 나타나 있는 코어 19-량체 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 도 4 내지 도 6 또는 도 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 HBV RNAi 제제의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 변형된 뉴클레오티드 또는 비변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 도 4 내지 도 6 또는 도 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 센스 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 HBV RNAi 제제의 전부 또는 실질적으로 전부가 변형된 뉴클레오티드이다. 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 HBV RNAi 제제의 안티센스 가닥은 도 4 내지 도 6 또는 도 8의 임의의 안티센스 가닥 서열과 0 개, 1 개, 2 개, 또는 3 개의 뉴클레오티드가 상이하다. 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 개시된 HBV RNAi 제제의 센스 가닥은 도 4 내지 도 6 또는 도 8의 임의의 센스 가닥 서열과 0 개, 1 개, 2 개, 또는 3 개의 뉴클레오티드가 상이하다.

변형된 HBV RNAi 제제의 안티센스 가닥 서열뿐만 아니라 이들의 기초가 되는 비변형된 서열이 도 6 및 도 9에 제공되어 있다. 변형된 HBV RNAi 제제의 센스 가닥뿐만 아니라 이들의 기초가 되는 비변형된 서열이 도 6 및 도 10에 제공되어 있다. HBV RNAi 제제를 형성함에 있어서, 도 6 및 도 9 내지 도 10에 나열된 각각의 비변형된 서열 내의 각각의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.

본 명세서(도 9 내지 도 10을 포함함)에 사용되는 바와 같이, 변형된 뉴클레오티드, 표적화 기, 및 연결 기를 나타내기 위해 하기 표기가 사용된다. 당업자는, 서열에 의해 달리 지시되지 않는 한, 올리고뉴클레오티드에 존재할 때, 단량체가 5'-3'-포스포다이에스테르 결합에 의해 상호 연결됨을 용이하게 이해할 것이다:

A = 아데노신-3'-포스페이트;

C = 시티딘-3'-포스페이트;

G = 구아노신-3'-포스페이트;

U = 우리딘-3'-포스페이트

n = 임의의 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드

a = 2'-0-메틸아데노신-3'-포스페이트

as = 2'-0-메틸아데노신-3'-포스포로티오에이트

c = 2'-0-메틸시티딘-3'-포스페이트

cs = 2'-0-메틸시티딘-3'-포스포로티오에이트

g = 2'-0-메틸구아노신-3'-포스페이트

gs = 2'-0-메틸구아노신-3'-포스포로티오에이트

t = 2'-0-메틸-5-메틸우리딘-3'-포스페이트

ts = 2'-0-메틸-5-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트

u = 2'-0-메틸우리딘-3'-포스페이트

us = 2'-0-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트

Nf = 임의의 2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드

Af = 2'-플루오로아데노신-3'-포스페이트

Afs = 2'-플루오로아데노신-3'-포스포로티오에이트

Cf = 2'-플루오로시티딘-3'-포스페이트

Cfs = 2'-플루오로시티딘-3'-포스포로티오에이트

Gf = 2'-플루오로구아노신-3'-포스페이트

Gfs = 2'-플루오로구아노신-3'-포스포로티오에이트

Tf = 2'-플루오로-5'-메틸우리딘-3'-포스페이트

Tfs = 2'-플루오로-5'-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트

Uf = 2'-플루오로우리딘-3'-포스페이트

Ufs = 2'-플루오로우리딘-3'-포스포로티오에이트

dN = 임의의 2'-데옥시리보뉴클레오티드

dT = 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트

NuNA = 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체(비잠금 핵염기 유사체)

NLNA = 잠금 뉴클레오티드

NfANA = 2'-F-아라비노 뉴클레오티드

NM = 2'-메톡시에틸 뉴클레오티드

AM = 2'-메톡시에틸아데노신-3'-포스페이트

AMs = 2'-메톡시에틸아데노신-3'-포스포로티오에이트

TM = 2'-메톡시에틸티미딘-3'-포스페이트

TMs = 2'-메톡시에틸티미딘-3'-포스포로티오에이트

R = 리비톨

(invdN) = 임의의 역전된 데옥시리보뉴클레오티드(3'-3' 연결 뉴클레오티드)

(invAb) = 역전된 (3'-3' 연결) 무염기성 데옥시리보뉴클레오티드, 표 참조

(invAb)s = 역전된 (3'-3' 연결) 무염기성 데옥시리보뉴클레오티드-5'- 포스포로티오에이트, 표 6 참조

(invn) = 임의의 역전된 2'-OMe 뉴클레오티드(3'-3' 연결 뉴클레오티드) s = 포스포로티오에이트 연결

vpdN = 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드

(5Me-Nf) = 5'-Me, 2'-플루오로 뉴클레오티드

cPrp = 사이클로프로필 포스포네이트, WO2018027106의 표 6 참조

epTcPr = WO2018027106의 표 6 참조

epTM = WO2018027106의 표 6 참조

당업자는 주어진 올리고뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 있는 말단 뉴클레오티드가 전형적으로 생체외에서 주어진 단량체의 각각의 3' 위치에 포스페이트 모이어티 대신 하이드록실(-OH) 기를 가질 것임을 용이하게 이해할 것이다.

표적화 기 및 연결 기는 다음을 포함하며, 이들의 화학적 구조는 WO2018027106의 표 6에서 하기에서 제공되며 일부는 표 10(도 12)에 도시된다: (PAZ), (NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), (NAG39)s. 각각의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 상기 나열된 임의의 표적화 기 또는 연결 기뿐만 아니라 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 접합된 다른 표적화 또는 연결 기를 가질 수 있다.

본 명세서에 기술된 HBV RNAi 제제는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 어닐링시킴으로써 형성된다. 대표적인 서열 쌍형성은 도 11에 나타나 있는 이중체 ID 번호에 의해 예시된다.

본 명세서에 개시된 HBV RNAi 제제의 경우, 안티센스 가닥의 1 번 위치(5' 말단 → 3' 말단 방향으로)의 뉴클레오티드는 HBV 유전자에 완벽하게 상보적일 수 있거나, HBV 유전자에 대해 비상보적일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 안티센스 가닥의 1 번 위치(5' 말단 → 3' 말단 방향으로)의 뉴클레오티드는 U, A, 또는 dT 이다. 몇몇 구현예에서, 안티센스 가닥의 1 번 위치(5' 말단 → 3' 말단 방향으로)의 뉴클레오티드는 센스 가닥과 함께 A:U 또는 U:A 염기쌍을 형성한다.

몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 본 명세서에 기술된 임의의 이중체의 임의의 안티센스 가닥 및/또는 센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 변형된 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하고, 아시알로당단백질 수용체 리간드 표적화 기를 추가로 포함한다.

HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제는 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제는 전체 내용이 본 명세서에 통합되는 US20130005793, WO2013003520, 및 WO2018027106에 기재된 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제의 예는, 예를 들어, US20130005793의 표 1, 표 2 및 표 4(본 명세서에서 표 2 내지 표 4(도 4 내지 도 6)로서 재현됨), 또는 WO2018027106의 표 1 내지 표 5(본 명세서에서 표 5 내지 표 9(도 7 내지 도 11)로 재현됨)의 서열 중 하나를 포함하는 RNAi 제제를 포함한다.

HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제의 예는, 예를 들어, 표 9에 나타나 있는 이중체를 포함하는 RNAi 제제를 포함한다. 구체적 구현예에 따르면, RNAi 제제는 이중체 AD04872(본 명세서의 서열번호 25 내지 서열번호 26) (WO2018027106의 AM06282-AS(서열번호 126 및 서열번호 171) 및 AM06288-SS(서열번호 252 및 서열번호 302)) 및 AD05070(본 명세서의 서열번호 27 내지 서열번호 28)(WO2018027106의 AM06606-AS(서열번호 140 및 서열번호 188) 및 AM06605-SS(서열번호 262 및 서열번호 328)) 중 적어도 하나를 포함하고, 이들 각각은 표 10에 도시된 구조를 갖는 것들 중 하나, 예를 들어, NAG37와 같은 표적화 리간드에 접합된다.

표적화 기, 연결 기, 및 전달 비히클

몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 표적화 기, 연결 기, 전달 폴리머, 또는 전달 비히클을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 비-뉴클레오티드 기에 접합된다. 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 제제의 표적화, 전달 또는 부착을 향상시킬 수 있다. 표적화 기 및 연결 기의 예가 WO2018027106의 표 6에 제공되어 있다. 비-뉴클레오티드 기는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 공유적으로 연결될 수 있다. 몇몇 구현예에서, HBV RNAi 제제는 센스 가닥의 3' 말단 및/또는 5' 말단에 연결된 비-뉴클레오티드 기를 함유한다. 몇몇 구현예에서, 비-뉴클레오티드 기는 HBV RNAi 제제의 센스 가닥의 5' 말단에 연결된다. 비-뉴클레오티드 기는 링커/연결 기를 통해 RNAi 제제에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 비-뉴클레오티드 기는 불안정한, 절단가능한, 또는 가역적인 결합 또는 링커를 통해 RNAi 제제에 연결된다.

몇몇 구현예에서, 비-뉴클레오티드 기는 이것이 부착되는 RNAi 제제 또는 접합체의 약동학적 또는 생체분포 특성을 향상시켜서 접합체의 세포- 또는 조직-특이적 분포 및 세포-특이적 흡수를 개선한다. 몇몇 구현예에서, 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 제제의 내포작용을 향상시킨다.

표적화 기 또는 표적화 모이어티는 이들이 부착되는 접합체의 약동학적 또는 생체분포 특성을 향상시켜서 접합체의 세포-특이적 분포 및 세포-특이적 흡수를 개선한다. 표적화 기는 1가, 2가, 3가, 4가, 또는 더 높은 원자가를 가질 수 있다. 대표적인 표적화 기는, 제한 없이, 세포 표면 분자에 대한 친화도를 갖는 화합물, 세포 수용체 리간드, 합텐, 항체, 단클론성 항체, 항체 단편, 및 세포 표면 분자에 대한 친화도를 갖는 항체 모방체를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 표적화 기는 PEG 링커와 같은 링커 또는 1 개, 2 개, 또는 3 개의 무염기성 및/또는 리비톨(무염기성 리보스) 기를 사용하여 RNAi 제제에 연결된다. 몇몇 구현예에서, 표적화 기는 갈락토스 유도체 클러스터를 포함한다. 본 명세서에 기술된 HBV RNAi 제제는 5'-말단에 아민 기와 같은 반응성 기를 가지면서 합성될 수 있다. 반응성 기는 당업계에서 전형적인 방법을 이용하여 표적화 모이어티를 후속적으로 부착하는 데 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 표적화 기는 아시알로글리코단백질 수용체 리간드를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 아시알로당단백질 수용체 리간드는 하나 이상의 갈락토스 유도체를 포함하거나 이로 이루어진다. 본 명세서에 사용되는 갈락토스 유도체라는 용어는 갈락토스, 및 갈락토스와 동일하거나 그보다 큰 아시알로당단백질 수용체에 대한 친화도를 갖는 갈락토스의 유도체 둘 다를 포함한다. 갈락토스 유도체는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 갈락토스, 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-아세틸-갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민, 및 N-아이소-부타노일갈락토사아민(예를 들어, 문헌[Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 277, 6686] 참조). 간으로의 올리고뉴클레오티드 및 다른 분자의 생체내 표적화에 유용한 갈락토스 유도체, 및 갈락토스 유도체의 클러스터는 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem, 257, 939-945] 참조). 갈락토스 유도체는 간세포의 표면 상에 발현된 아시알로당단백질 수용체(ASGPr)로의 결합을 통해 생체내에서 분자를 간세포로 표적화하는 데 사용되어 왔다. ASGPr(들)로의 ASGPr 리간드의 결합은 간세포로의 세포-특이적 표적화 및 간세포 내로의 분자의 내포작용을 용이하게 한다. ASGPr 리간드는 단량체성(예를 들어, 단일 갈락토스 유도체를 가짐) 또는 다량체성(예를 들어, 다수의 갈락토스 유도체를 가짐)일 수 있다. 갈락토스 유도체 또는 갈락토스 유도체 클러스터는 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 RNAi 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 부착될 수 있다. 갈락토스 유도체 클러스터와 같은 표적화 기의 제조는, 예를 들어, 둘 다의 전체 내용이 본 명세서에 통합되는 US20180064819 및 US20170253875에 기재되어 있다.

본 명세서에 사용되는 갈락토스 유도체 클러스터는 2 내지 4 개의 말단 갈락토스 유도체를 갖는 분자를 포함한다. 말단 갈락토스 유도체는 이의 C-1 탄소를 통해 분자에 부착된다. 몇몇 구현예에서, 갈락토스 유도체 클러스터는 갈락토스 유도체 삼량체(트라이안테나리(tri-antennary) 갈락토스 유도체 또는 3가 갈락토스 유도체로도 지칭됨)이다. 몇몇 구현예에서, 갈락토스 유도체 클러스터는 N-아세틸-갈락토사민을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 갈락토스 유도체 클러스터는 3 개의 N-아세틸-갈락토사민을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 갈락토스 유도체 클러스터는 갈락토스 유도체 사량체(테트라안테나리(tetra-antennary) 갈락토스 유도체 또는 4가 갈락토스 유도체로도 지칭됨)이다. 몇몇 구현예에서, 갈락토스 유도체 클러스터는 4 개의 N-아세틸-갈락토사민을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 갈락토스 유도체 삼량체는 각각 중심 분지점에 연결된 3 개의 갈락토스 유도체를 함유한다. 본 명세서에 사용되는 갈락토스 유도체 사량체는 각각 중심 분지점에 연결된 4 개의 갈락토스 유도체를 함유한다. 갈락토스 유도체는 당류의 C-1 탄소를 통해 중앙 분지점에 부착될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 갈락토스 유도체는 링커 또는 스페이서를 통해 분지점에 연결된다. 몇몇 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 PEG 기와 같은 가요성 친수성 스페이서이다(예를 들어, 미국 특허 제5,885,968호; 문헌[Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538- 1546] 참조). 몇몇 구현예에서, PEG 스페이서는 PEG3 스페이서이다. 분지점은 3 개의 갈락토스 유도체의 부착을 허용하고 RNAi 제제로의 그 분지점의 부착을 추가로 허용하는 임의의 소분자일 수 있다. 분지점 기의 예는 다이-라이신 또는 다이-글루타메이트이다. RNAi 제제로의 분지점의 부착은 링커 또는 스페이서를 통해 일어날 수 있다. 몇몇 구현예에서, 링커 또는 스페이서는 PEG 스페이서와 같은 그러나 이로 제한되지 않는 가요성 친수성 스페이서를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 링커는 사이클릭 기와 같은 견고한 링커를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 갈락토스 유도체는 N-아세틸-갈락토사민을 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 구현예에서, 갈락토스 유도체 클러스터는 예를 들어, N-아세틸-갈락토사민 사량체일 수 있는 갈락토스 유도체 사량체로 구성된다.

몇몇 구현예에서, 연결 기는 RNAi 제제에 접합된다. 연결 기는 표적화 기 또는 전달 폴리머 또는 전달 비히클로의 제제의 공유 결합을 용이하게 한다. 연결 기는 RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에 연결될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 연결 기는 RNAi 제제의 센스 가닥에 연결된다. 몇몇 구현예에서, 연결 기는 RNAi 제제의 센스 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단에 접합된다. 몇몇 구현예에서, 연결 기는 RNAi 제제의 센스 가닥의 5' 말단에 접합된다. 연결 기의 예는 다음을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 반응성 기, 예컨대, 1차 아민 및 알킨, 알킬 기, 무염기성 뉴클레오시드, 리비톨(무염기성 리보스), 및/또는 PEG 기.

링커 또는 연결 기는 하나 이상의 공유 결합을 통해 하나의 화학적 기(예컨대, RNAi 제제) 또는 관심 세그먼트를 다른 화학적 기(예를 들어, 표적화 기 또는 전달 폴리머) 또는 관심 세그먼트에 연결하는 2 개의 원자 사이의 연결부이다. 불안정한 결합부(linkage)는 불안정한 결합을 함유한다. 결합부는 2 개의 연결된 원자들 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 선택적으로 포함할 수 있다. 스페이서는 그 결합부에 가요성 및/또는 길이를 추가로 부가할 수 있다. 스페이서는 알킬 기, 알케닐 기, 알키닐 기, 아릴 기, 아르알킬 기, 아르알케닐 기, 및 아르알키닐 기를 포함하지만, 이로 제한되지 않으며, 이들 각각은 하나 이상의 헤테로 원자, 헤테로사이클, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 당류를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 당업계에 잘 알려져 있고, 전술한 목록은 설명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니다.

전달 비히클

몇몇 구현예에서, 전달 비히클은 세포 또는 조직에 RNAi 제제를 전달하는 데 사용될 수 있다. 전달 비히클은 세포 또는 조직으로의 RNAi 제제의 전달을 개선하는 화합물이다. 전달 비히클은 다음을 포함하거나 이로 이루어질 수 있지만, 이로 제한되지 않는다: 폴리머, 예를 들어 양친매성 폴리머, 막 활성 폴리머, 펩티드, 멜리틴 펩티드(melittin peptide), 멜리틴 유사 펩티드(melittin-like peptide, MLP), 지질, 가역적으로 변형된 폴리머 또는 펩티드, 또는 가역적으로 변형된 막 활성 폴리아민.

몇몇 구현예에서, RNAi 제제는 지질, 나노입자, 폴리머, 리포좀, 미셀, DPC 또는 당업계에서 이용 가능한 다른 전달 시스템과 조합될 수 있다. RNAi 제제는 또한 표적화 기, 지질(콜레스테롤 및 콜레스테릴 유도체를 포함하지만 이로 제한되지 않음), 나노입자, 폴리머, 리포좀, 미셀, DPC(예를 들어, 각각 본 명세서에 참조로 통합되는, WO 2000/053722, WO 2008/0022309, WO 2011/104169, 및 WO 2012/083185, WO 2013/032829, WO 2013/158141 참조), 또는 당업계에서 이용 가능한 다른 전달 시스템에 화학적으로 접합될 수 있다.

올리고뉴클레오티드에 접합된 다른 친유성 화합물은 1-피렌 부티르산, l,3-비스-0-(헥사데실)글리세롤, 및 멘톨을 포함한다. 수용체-매개 내포작용에 대한 리간드의 하나의 예는 엽산(folic acid)이다. 엽산은 폴레이트(folate)-수용체-매개 내포작용에 의해 세포에 들어간다. 엽산을 갖는 RNAi 제제는 폴레이트-수용체-매개 내포작용을 통해 세포에 효율적으로 수송될 것이다. 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 엽산의 결합은 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수의 증가를 야기한다(Li S, Deshmukh HM, and Huang L, Pharm. Res. (1998) 15: 1540). 올리고뉴클레오티드에 접합된 다른 리간드는 폴리에틸렌 글리콜, 탄수화물 클러스터, 가교-결합제, 포피린 접합체, 및 전달 펩티드를 포함한다. 특정 경우에, 올리고뉴클레오티드에 양이온성 리간드의 결합은 흔히 뉴클레아제에 대한 내성의 개선을 야기한다. 양이온성 리간드의 대표적인 예는 프로필암모늄 및 디메틸프로필암모늄이다. 흥미롭게도, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 양이온성 리간드가 올리고뉴클레오티드를 통해 분산되었을 때 mRNA에 대해 이의 높은 결합 친화도를 유지한다고 보고되었다. 문헌[Manoharan M, Antisense & Nucleic Acid Drug Development (2002) 12: 103] 및 이의 참고문헌을 참조한다.

또한, 추가 변형은 올리고뉴클레오티드 위의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 위의 당의 3' 위치에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 리간드-접합 올리고뉴클레오티드의 하나의 추가 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 추가 비-리간드 모이어티 또는 접합체에 화학적으로 결합하는 것을 포함한다. 이러한 모이어티는 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989) 86:6553), 콜산(Manoharan et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., (1994) 4: 1053), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. N Y. Acad. Sci., (1992) 660:306; Manoharan et al, Bioorg. Med. Chem. Let., (1993 ) 3:2765), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl Acids Res., (1992) 20:533), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison- Behmoaras et al., EMBO J., (1991) 10: 1 1 1 ; Kabanov et al, FEBS Lett., (1990) 259:327; Svinarchuk et al, Biochimie, (1993) 75:49), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-0-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al, Tetrahedron Lett., (1995) 36:3651; Shea et al, Nucl Acids Res., (1990) 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, (1995) 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., (1995) 36:3651), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, (1995) 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., (1996) 277:923)와 같은 지질 모이어티를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본 출원은 또한 올리고뉴클레오티드 내 특정 위치에 대하여 실질적으로 순수한 키랄인 올리고뉴클레오티드를 사용하는 조성물을 포함한다.

실질적으로 순수한 키랄 올리고뉴클레오티드의 예는 적어도 75% Sp 또는 Rp인 포스포로티오에이트 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드(Cook et al., US5587361) 및 실질적으로 순수한 키랄(Sp 또는 Rp) 알킬포스포네이트, 포스포르아미데이트 또는 포스포트리에스테르 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드(Cook, US5212295 및 US5521302)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

임의의 경우에, 올리고뉴클레오티드는 비-리간드 기에 의해 변형될 수 있다. 다수의 비-리간드 분자는 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포분포 또는 세포 흡수를 향상시키기 위해 올리고뉴클레오티드에 접합되고, 이러한 접합을 수행하기 위한 과정은 과학 문헌에서 이용 가능하다. 이러한 비-리간드 모이어티는 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989, 86:6553), 콜산(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., (1994, 4: 1053), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al, Ann. N. Y. Acad. Sci , (1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., (1993, 3:2765), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl Acids Res., (1992) 20:533), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., (1991) 10:111; Kabanov et al, FEBS Lett., (1990) 259:327; Svinarchuk et al, Biochimie, (1993) 75:49), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-0-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al, Tetrahedron Lett., (1995) 36:3651; Shea et al, Nucl Acids Res., (1990) 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, (1995) 14:969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., (1995) 36:3651), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, (1995) 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., (1996) 277:923)와 같은 지질 모이어티를 포함하였다. 전형적인 접합 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 지닌 올리고뉴클레오티드의 합성을 포함한다. 그 다음, 아미노 기를 적당한 커플링 또는 활성화 시약을 이용하여 접합된 분자와 반응시킨다. 접합 반응은 고체 지지체에 여전히 결합된 올리고뉴클레오티드와 함께 또는 용액 상에서 올리고뉴클레오티드의 절단 후에 수행될 수 있다. 전형적으로 HPLC에 의한 올리고뉴클레오티드 접합체의 정제로 순수한 접합체가 수득된다.

대안적으로, 접합된 분자는 분자 내에 존재하는 알콜 기를 통해 또는 인산화될 수 있는 알콜 기를 지닌 링커의 결합에 의해, 포스포르아미디트와 같은 빌딩 블록으로 변환될 수 있다. 중요하게, 각각의 이들 접근법은 리간드 접합된 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용될 수 있다. 아미노 결합된 올리고뉴클레오티드는 커플링 시약의 사용을 통해 또는 NHS 또는 펜타플루오로페놀레이트 에스테르와 같은 리간드의 활성화 후에 리간드와 직접 커플링될 수 있다. 리간드 포스포르아미디트는 카복실 기 중 하나에 아미노헥산올 링커를 결합한 다음 말단 알콜 기능성의 인산화를 통해 합성될 수 있다. 또한, 시스테아민과 같은 다른 링커는 합성된 올리고뉴클레오티드 위에 존재하는 클로로아세틸 링커에 접합하기 위해 이용될 수 있다.

당업자는 본 출원의 분자를 세포, 조직 또는 유기체에 도입하는 방법을 쉽게 알고 있다. 또한, 상응하는 예는 상기 출원의 상세한 설명에서 제공되었다. 예를 들어, 기술된 RNAi 제제의 적어도 하나의 가닥을 인코딩하는 본 출원의 핵산 분자 또는 벡터는 형질감염 등과 같은 기술분야에서 알려져 있는 방법에 의해 세포 또는 조직에 도입될 수 있다.

또한, RNAi 제제의 도입 수단 및 방법이 제공되었다. 예를 들어, 갈락토스 및 락토스와 같은 리간드와 함께 고분자 담체의 사용 또는 엽산을 다양한 거대분자에 결합하는 것을 포함하는 글리코실화 및 폴레이트-변형된 분자에 의한 표적 전달은 전달될 분자를 폴레이트 수용체에 결합하는 것을 허용한다. 예를 들어, 생체내에서 siRNA를 전달하기 위해 RGD-변형된 나노입자를 포함하는 항체 외에 펩티드 및 단백질에 의한 표적 전달 또는 짧은 시클로덱스트린, 아다만틴-PEG를 포함하는 다성분(비바이러스성) 전달 시스템이 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 항체의 (1가) Fab-단편 (또는 이러한 항체의 다른 단편)을 포함하는 항체 단편 또는 단일-사슬 항체를 이용한 표적 전달도 예상된다. 표적 지향 전달을 위한 주사 방법은 특히 유체역학 정맥 주사를 포함한다. 또한, RNAi 제제의 콜레스테롤 접합체는 친유성 기에의 접합이 세포 흡수를 개선하고 올리고뉴클레오티드의 약동학적 및 조직 생체분포를 향상시키는 표적 전달을 위해 사용될 수 있다. 또한, 양이온성 전달 시스템은 폴리음이온성 핵산과 함께 복합체 형성 및 음전하 세포막과의 상호작용을 촉진시키기 위해 순 양성(양이온성) 전하를 갖는 합성 벡터에 의하여 알려져 있다. 또한, 이러한 양이온성 전달 시스템은 양이온성 리포좀 전달 시스템, 양이온성 고분자 및 펩티드 전달 시스템을 포함한다. dsRNA/siRNA의 세포 흡수를 위한 다른 전달 시스템은 압타머-ds/siRNA 이다. 또한, 유전자 요법은 이를 인코딩하는 기술된 RNAi 제제 또는 핵산 분자를 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 나노입자 또는 리포좀과 함께 전달뿐만 아니라 비-병원성 바이러스, 변형된 바이러스 벡터의 사용을 포함한다. RNAi 제제의 세포 흡수를 위한 다른 전달 방법은 체외(extracorporeal), 예를 들어, 세포, 장기 또는 조직의 생체외 처리이다. 이들 기술 중 어떤 것은 문헌[Akhtar, Journal of Clinical Investigation (2007) 1 17:3623-3632, Nguyen et al, Current Opinion in Molecular Therapeutics (2008) 10: 158- 167, Zambon i, Clin Cancer Res (2005) 1 1 :8230- 8234 or Ikeda et al, Pharmaceutical Research (2006) 23 : 1631 -1640]와 같이 간행물에 기재되고 요약되어 있다.

RNAi 제제 및 이의 접합체를 제조하고 사용하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 임의의 이러한 알려져 있는 방법은 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제 및 이의 접합체를 제조하고 사용하기 위해 본 출원의 맥락에서 사용될 수 있다. RNAi 제제 및 이의 접합체를 제조하고 사용하는 방법은, 예를 들어, 모두 그 전체가 본 명세서에 참조로 통합되는 US20130005793, WO2013003520, WO2018027106, US5218105, US5541307, US5521302, US5539082, US5554746, US5571902, US5578718, US5587361, US5506351, US5587469, US5587470, US5608046, US5610289, US6262241, WO9307883에 기재되어 있다.

조성물, 치료적 조합물, 및 백신

본 출원은 또한 하나 이상의 HBV 항원, 본 출원에 따른 하나 이상의 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터, 및/또는 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 하나 이상의 RNAi 제제를 포함하는, 조성물, 치료적 조합물, 보다 구체적으로 키트, 및 백신에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 본 출원의 HBV 항원, 폴리뉴클레오티드(RNA 및 DNA 포함), 및/또는 벡터, 및 본 명세서에 기술된 본 출원의 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제 중 임의의 것이 본 출원의 조성물, 치료적 조합물 또는 키트, 및 백신에 사용될 수 있다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원 또는 서열번호 7과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 또는 비-천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA), 상기 단리된 또는 비-천연 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및/또는 상기 단리된 또는 비-천연 핵산 분자에 의해 인코딩되는 단리된 또는 비-천연 폴리펩티드를 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 7과 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 7과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 또는 비-천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 2 또는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 단리된 또는 비-천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 2 또는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 또는 비-천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA); 및 서열번호 7과 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 7과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV Pol 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 또는 비-천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 포함한다. 절두된 HBV 코어 항원 및 HBV Pol 항원을 위한 코딩 서열은 동일한 단리된 또는 비-천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA) 내에 또는 두 개의 상이한 단리된 또는 비-천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA) 내에 존재할 수 있다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은, 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 2 또는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터, 바람직하게 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터)를 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은, 서열번호 7과 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 7과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV Pol 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터, 바람직하게 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터)를 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은, 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 2 또는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터, 바람직하게 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터); 및 서열번호 7과 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 7과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV Pol 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터, 바람직하게 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터)를 포함한다. 상기 절두된 HBV 코어 항원을 위한 코딩 서열을 포함하는 벡터 및 HBV Pol 항원을 위한 코딩 서열을 포함하는 벡터는 동일한 벡터 또는 두 개의 상이한 벡터일 수 있다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은, 서열번호 7과 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 7과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV Pol 항원에 작동적으로 연결된, 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 2 또는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 바람직하게 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터)를 포함하거나, 그 반대로 마찬가지이다. 바람직하게, 상기 융합 단백질은 절두된 HBV 코어 항원을 HBV Pol 항원에 작동적으로 연결시키거나, 그 반대로 마찬가지인 링커를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 링커는 (AlaGly)n의 아미노산 서열을 갖고, n은 2 내지 5의 정수이다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 2 또는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 단리된 또는 비-천연 절두된 HBV 코어 항원을 포함한다.

본 출원의 일 구현에에서, 조성물은 서열번호 7과 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 7과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 또는 비-천연 HBV Pol 항원을 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 2 또는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 단리된 또는 비-천연 절두된 HBV 코어 항원; 및 서열번호 7과 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 7과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 또는 비-천연 절두된 HBV pol 항원을 포함한다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 7과 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 7과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV Pol 항원에 작동적으로 연결된, 서열번호 2 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게 서열번호 2 또는 서열번호 14와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 포함하거나, 그 반대도 마찬가지로 포함하는, 단리된 또는 비-천연 융합 단백질을 포함한다. 바람직하게, 상기 융합 단백질은 절두된 HBV 코어 항원을 HBV Pol 항원에 작동적으로 연결시키거나, 그 반대로 마찬가지인 링커를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 링커는 (AlaGly)n의 아미노산 서열을 갖고, n은 2 내지 5의 정수이다.

본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제, 예컨대, US20130005793, WO2013003520 또는 WO2018027106에 기재된 것들을 포함한다.

본 출원은 또한 본 출원의 구현예에 따른 절두된 HBV 코어 항원 및 HBV pol 항원을 발현하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 출원의 구현예에 따른 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 포함하는 치료적 조합물 또는 키트에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 본 출원의 HBV 코어 및 pol 항원을 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터는 본 출원의 치료적 조합물 또는 키트에 사용될 수 있고, 본 명세서에 기술된 본 출원의 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 임의의 RNAi 제제는 본 출원의 치료적 조합물 또는 키트에 사용될 수 있다.

본 출원의 구현예에 따르면, HBV 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 HBV 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 치료적 조합물 또는 키트는

i) a) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원, 및

c) 서열번호 7과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 HBV 폴리머라제 항원으로서, 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 갖지 않는, HBV 폴리머라제 항원, 및

중 적어도 하나; 및

본 출원의 구체적 구현예에서, 치료적 조합물 또는 키트는 i) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴크레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자; ii) 서열번호 7과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자로서, HBV 폴리머라제 항원이 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 갖지 않는, 제2 비-천연 핵산 분자; 및 iii) HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제, 바람직하게 표 9에 나타나 있는 이중체를 포함하는 RNAi 제제, 보다 바람직하게 각각 표적화 리간드에 접합된, 예컨대, NAG37와 같이 표 10에 도시된 구조를 갖는 이중체 AD04872(서열번호 25 내지 서열번호 26) 및 AD05070(서열번호 27 내지 서열번호 28) 중 적어도 하나를 포함하는 RNAi 제제를 포함한다.

본 출원의 구현예에 따르면, 백신 조합물 또는 키트 내의 폴리뉴클레오티드는 연결되거나 또는 별개일 수 있어, 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는지의 여부에 상관 없이, 이러한 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 HBV 항원이 서로 융합되거나 별개 단백질로서 생산된다. 일 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동일한 또는 별개의 조성물에서 조합되어 사용되는 별개의 벡터, 예를 들어, DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 존재하여, 발현된 단백질이 또한 별개의 단백질이지만 조합되어 사용된다. 다른 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 HBV 항원은 동일한 벡터로부터 발현될 수 있어, HBV 코어-pol 융합 항원이 생산된다. 선택적으로, 코어 및 pol 항원은 짧은 링커에 의해 서로 연결 또는 융합될 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 HBV 항원은 코어 및 pol 항원 코딩 서열 사이의 리보좀 슬리파지(slippage) 부위(시스-하이드롤라제 부위로도 알려짐)를 사용하여 단일 벡터로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 이 전략은 단일 mRNA 전사체로부터 개별 코어 및 pol 항원이 내부에서 생산되는 바이시스트로닉(bicistronic) 발현 벡터를 초래한다. 이러한 바이시스트로닉 발현 벡터로부터 생산된 코어 및 pol 항원은 mRNA 전사체 상의 코딩 서열의 배치에 의존하여 추가적인 N 또는 C-말단 잔기를 가질 수 있다. 이 목적을 위해 사용될 수 있는 리보좀 슬리파지 부위의 예는 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV)로부터의 FA2 슬리파지 부위를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 다른 가능성은 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 HBV 항원이 하나는 HBV 코어 항원을 인코딩하고 하나는 HBV pol 항원을 인코딩하는, 두 개의 별개의 벡터로부터 독립적으로 발현될 수 있는 것이다.

바람직한 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 별개의 벡터, 예를 들어, DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 존재한다. 바람직하게, 별개의 벡터는 동일한 조성물에 존재한다.

본 출원의 바람직한 구현예에 따르면, 치료적 조합물 또는 키트는 제1 벡터에 존재하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 벡터에 존재하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 제1 및 제2 벡터는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게, 상기 벡터는 DNA 플라스미드이다.

본 출원의 구체적인 구현예에서, 제1 벡터는 제1 DNA 플라스미드이고 제2 벡터는 제2 DNA 플라스미드이다. 제1 및 제2 DNA 플라스미드 각각은 복제 기점, 바람직하게 서열번호 21의 pUC ORI, 및 바람직하게 서열번호 23과 적어도 90% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 코돈 최적화된 Kanr 유전자를 포함하는, 바람직하게 bla 프로모터, 예컨대, 서열번호 24에 나타나 있는 bla 프로모터의 조절 하에 놓인, 항생제 내성 카세트를 포함한다. 각각의 제1 및 제2 DNA 플라스미드는 독립적으로 프로모터 서열, 인핸서 서열 및 제1 폴리뉴클레오티드 서열 또는 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. 바람직하게, 각각의 제1 및 제2 DNA 플라스미드는 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 상류 서열을 포함하며, 상기 상류 서열은, 5' 말단으로부터 3' 말단으로, 서열번호 18 또는 서열번호 19의 프로모터 서열, 인핸서 서열, 및 서열번호 9 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 각각의 제1 및 제2 DNA 플라스미드는 또한 HBV 항원의 코딩 서열의 하류에 위치한 서열번호 20의 bGH 폴리아데닐화 신호와 같은 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.

본 출원의 구체적 일 구현예에서, 제1 벡터는 바이러스 벡터이고 제2 벡터는 바이러스 벡터이다. 바람직하게, 각각의 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 보다 바람직하게 Ad26 또는 Ad35 벡터이고, 본 출원의 HBV pol 항원 또는 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 5' 말단으로부터 3' 말단으로, 바람직하게 서열번호 19의 CMV 프로모터 서열인 프로모터 서열, 바람직하게 서열번호 12의 ApoAI 유전자 단편 서열인 인핸서 서열, 및 바람직하게 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분비 신호인 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 상류 서열; 및 폴리아데닐화 신호로서 바람직하게 서열번호 13의 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하는 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 하류 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.

본 출원의 다른 바람직한 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 단일 벡터, 예를 들어, DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 존재한다. 바람직하게, 단일 벡터는 본 출원의 HBV pol 항원 및 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는, 바람직하게 융합 단백질로서 본 출원의 HBV pol 항원 및 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 5' 말단으로부터 3' 말단으로, 바람직하게 서열번호 19의 CMV 프로모터 서열인 프로모터 서열, 바람직하게 서열번호 12의 ApoAI 유전자 단편 서열인 인핸서 서열, 및 바람직하게 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분비 신호인 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, HBV pol 및 절두된 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 상류 서열; 및 폴리아데닐화 신호로서 바람직하게 서열번호 13의 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하는 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 하류 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 아데노바이러스 벡터, 더욱 바람직하게 Ad26 벡터이다.

본 출원의 치료적 조합물이 제1 벡터, 예컨대, DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 및 제2 벡터, 예컨대, DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함할 경우, 각각의 제1 및 제2 벡터의 양은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 제1 DNA 플라스미드 및 제2 DNA 플라스미드는 중량비로 10:1 내지 1:10, 예컨대, 중량비로 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10의 비율로 존재할 수 있다. 바람직하게, 제1 및 제2 DNA 플라스미드는 중량비로 1:1의 비율로 존재한다. 본 출원의 치료적 조합물은 HBV 감염을 치료하는 데 유용한 제3 활성제를 인코딩하는 제3 벡터를 추가로 포함할 수 있다.

본 출원의 조성물 및 치료적 조합물은 추가적 HBV 항원 및/또는 추가적 HBV 항원 또는 그 면역원적 단편, 예컨대, HBsAg, HBV L 단백질 또는 HBV 외피 단백질, 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 인코딩하는 추가적 폴리뉴클레오티드 또는 벡터, 또는 본 출원의 구현예에 따른 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 포함할 수 있다. 그러나, 구체적 구현예에서, 본 출원의 상기 조성물 및 치료적 조합물은 특정 항원을 포함하지 않는다.

구체적 구현예에서, 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물 또는 키트는 HBsAg 또는 HBsAg를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.

다른 구체적 구현예에서, 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물 또는 키트는 HBV L 단백질 또는 HBV L 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.

본 출원의 추가의 다른 구체적 구현예에서, 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물은 HBV 외피 단백질 또는 HBV 외피 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.

본 출원의 조성물 및 치료적 조합물은 약학적으로 허용되는 담체를 또한 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 비-독성이고 활성 성분의 효능과 경합하지 않아야 한다. 약학적으로 허용되는 담체는 하나 이상의 부형제, 예컨대, 결합제, 붕해제, 팽윤제, 현탁화제, 유화제, 수화제, 윤활제, 풍미제, 감미제, 보존제, 염료, 가용화제 및 코팅을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 비히클, 예컨대, 지질 나노입자(LNP)를 포함할 수 있다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로, 예를 들어, 근육내, 피내, 피하, 경구, 정맥내, 피부, 점막내(예를 들어, 장), 비내 또는 복강내 경로에 의존할 수 있다. 액체 주사 조제물에 있어서, 예를 들어, 현탁액 및 용액, 적합한 담체 및 첨가제는 물, 글리콜, 오일, 알콜, 보존제, 착색제 등을 포함한다. 고체 경구 조제물에 있어서, 예를 들어, 분말, 캡슐, 캐플릿, 젤캡 및 정제, 적합한 담체 및 첨가제는 전분, 당, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 포함한다. 비강 스프레이/흡입제 혼합물에 있어서, 수용액/현탁액은 물, 글리콜, 오일, 연화제, 안정화제, 수화제, 보존제, 방향제, 풍미제 등을 적합한 담체 및 첨가제로서 포함할 수 있다.

본 출원의 조성물 및 치료적 조합물은 경구(장관) 투여 및 비경구 주사를 포함하지만, 이로 제않되지 않으며, 투여를 촉진하고 유효성을 향상하기 위한 대상체에 대한 투여에 적합한 임의의 물질로 제형화될 수 있다. 비경구 주사는 정맥내 주사 또는 주입, 피하 주사, 피내 주사, 및 근육내 주사를 포함한다. 본 출원의 조성물은 또한 점막통과, 눈, 직장, 장기 작용 이식, 설하 투여, 혀 아래, 경구 점막으로부터 문맥 순환, 흡입, 또는 비강내를 포함하는 다른 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다.

본 출원의 바람직한 구현예에서, 본 출원의 조성물 및 치료적 조합물은 비경구 주사, 바람직하게 피하, 피내 주사 또는 근육내 주사, 보다 바람직하게 근육내 주사로 제형화된다.

본 출원의 구현예에 따르면, 투여를 위한 조성물 및 치료적 조합물은 전형적으로 약학적으로 허용되는 담체 내의 완충 용액, 예를 들어, 완충 식염수와 같은 수성 담체 등, 예를 들어, 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함할 것이다. 상기 조성물 및 치료적 조합물은 또한 pH 조절제 및 완충제와 같은 생리학적 조건을 근사화하기 위해 요구되는 약학적으로 허용되는 물질을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 플라스미드 DNA를 포함하는 조성물 또는 치료적 조합물은 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 약학적으로 허용되는 담체로서 함유할 수 있다. 상기 플라스미드 DNA는, 예를 들어, 0.5 mg/mL 내지 5 mg/mL, 예컨대, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 또는 5 mg/mL, 바람직하게 1 mg/mL의 농도로 존재할 수 있다.

본 출원의 조성물 및 치료적 조합물은 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 따라 백신("면역원적 조성물"로도 지칭됨)으로 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 면역 반응을 증진하기 위해 애주번트를 포함할 수 있다. 제형 내 각 성분의 최적 비율은 본 개시의 관점에서 당업자에게 잘 알려져 있는 기술에 의해 결정될 수 있다.

본 출원의 구체적 구현예에서, 조성물 또는 치료적 조합물은 DNA 백신이다. DNA 백신은 전형적으로 강력한 진핵생물 프로모터의 조절 하에 관심 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 박테리아 플라스미드를 포함한다. 숙주의 세포의 세포질로 플라스미드가 전달되면, 인코딩되는 항원은 내생적으로 생산 및 프로세싱된다. 결과물 항원은 전형적으로 체액 및 세포-매개 면역 반응 둘 다를 유도한다. DNA 백신은 적어도 이들이 개선된 안전성을 제공하고, 온도 안정성이고, 항원성 변이체를 발현하기 위해 용이하게 개조되고, 생산이 간단하기 때문에 유리하다. 본 출원의 임의의 DNA 플라스미드를 이러한 DNA 백신을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

본 출원의 다른 구체적 구현예에서, 조성물 또는 치료적 조합물은 RNA 백신이다. RNA 백신은 전형적으로 관심 항원, 예를 들어, 본 출원에 따른 융합 단백질 또는 HBV 항원을 인코딩하는 적어도 하나의 단일 가닥 RNA 분자를 포함한다. DNA 백신과 유사하게 숙주의 세포의 세포질로 RNA가 전달되면, 인코딩되는 항원은 내생적으로 생산 및 프로세싱되며, 체액 및 세포-매개 면역 반응 둘 다를 유도한다. RNA 서열은 번역 효율성을 향상시키기 위해 코돈 최적화될 수 있다. RNA 분자는 안정성 및/또는 번역을 증진시키기 위해 본 개시의 관점에서 기술분야에 알려져 있는 임의의 방법에 의하여 변형, 예컨대, 폴리A 꼬리, 예를 들어, 적어도 30 아데노신 잔기를 첨가하여; 및/또는 5-말단을 변형된 리보뉴클레오티드로, 예를 들어, 7-메틸구아노신 캡으로 캡핑하여 변형될 수 있으며, 이는 RNA 합성 도중에 포함되거나 RNA 전사 후 효소적으로 조작될 수 있다. RNA 백신은 또한 알파바이러스 발현 벡터로부터 개발된 자기-복제 RNA 백신일 수 있다. 자기-복제 RNA 백신은 융합 단백질 또는 HBV 항원 RNA의 복제를 조절하는 서브게놈 프로모터와 뒤이어 복제효소의 하류에 위치한 합성 폴리 A 꼬리를 갖는 알파바이러스 패밀리에 속하는 바이러스 유래의 복제효소 RNA 분자를 포함한다.

특정 구현예에서, 추가의 애주번트는 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물에 포함되거나, 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물과 공동-투여된다. 또 다른 애주번트의 사용은 선택적이며, 조성물이 백신접종 목적을 위해 사용될 때 면역 반응을 보다 증진할 수 있다. 공동-투여 또는 본 출원에 따른 조성물 내에 포함시키기에 적합한 애주번트는 인간에게 잠재적으로 안전하고 내약성이 우수하며 효과적인 것이 바람직할 것이다. 애주번트는 소분자 또는 항체로서, 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-PD1, 항-TIM-3 등), 톨-유사 수용체 효능제(예를 들어, TLR7 효능제 및/또는 TLR8 효능제), RIG-1 효능제, IL-15 수퍼효능제(Altor Bioscience), 돌연변이 IRF3 및 IRF7 유전적 애주번트, STING 효능제(Aduro), FLT3L 유전적 애주번트, 및 IL-7-hyFc를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 애주번트는, 예를 들어, 다음 항-HBV 제제 중에서 선택될 수 있다: HBV DNA 폴리머라제 억제제; 면역조절제; 톨-유사 수용체 7 조절제; 톨-유사 수용체 8 조절제; 톨-유사 수용체 3 조절제; 인터페론 알파 수용체 리간드; 히알루로니다제 억제제; IL-10의 조절제; HBsAg 억제제; 톨-유사 수용체 9 조절제; 사이클로필린 억제제; HBV 예방 백신; HBV 치료 백신; HBV 바이러스 진입 억제제; 바이러스 mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 보다 구체적으로 항-HBV 안티센스 올리고뉴클레오티드; 단(short) 경합 RNA(siRNA), 보다 구체적으로 항-HBV siRNA; 엔도뉴클레아제 조절제; 리보뉴클레오티드 리덕타제의 억제제; B형 간염 E 항원 억제제; B형 간염 바이러스의 표면 항원을 표적화하는 HBV 항체; HBV 항체; CCR2 케모카인 길항제; 티모신 효능제; 사이토킨, 예컨대, IL12; 캡시드 조립 조절제, 핵단백질 억제제(HBV 코어 또는 캡시드 단백질 억제제); 핵산 폴리머(NAP); 레티노산-유도성 유전자 1의 자극제; NOD2의 자극제; 재조합 티모신 알파-1; B형 간염 바이러스 복제 억제제; PI3K 억제제; cccDNA 억제제; 면역 체크포인트 억제제, 예컨대, PD-L1 억제제, PD-1 억제제, TIM-3 억제제, TIGIT 억제제, Lag3 억제제, 및 CTLA-4 억제제; 면역 세포(보다 구체적으로 T 세포) 상에 발현되는 공동-자극 수용체의 효능제, 예컨대, CD27 및 CD28; BTK 억제제; HBV 치료를 위한 기타 약제; IDO 억제제; 아르기나제 억제제; 및 KDM5 억제제.

특정 구현예에서, 각각의 제1 및 제2 비-천연 핵산 분자는 독립적으로 지질 나노입자(LNP)와 제형화된다.

본 출원은 또한 본 출원의 조성물 및 치료적 조합물의 제조 방법을 제공한다. 조성물 또는 치료적 조합물의 제조 방법은 본 출원의 HBV 항원, 벡터 및/또는 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 것을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 이러한 조성물의 제조에 사용되는 통상적인 기술에 익숙할 것이다.

면역 반응을 유도하거나 HBV 감염을 치료하는 방법

본 출원은 또한 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에서 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 면역원적 유효량의 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 본 명세서에 기술된 본 출원의 임의의 조성물 및 치료적 조합물이 본 출원의 방법에 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "감염"은 질환을 야기하는 인자에 의한 숙주의 침입을 지칭한다. 질환을 야기하는 인자는 숙주에 침입할 수 있고, 숙주 내에서 복제 또는 증식할 수 있을 때 "감염성"이라 여겨진다. 감염성 인자의 예는 바이러스, 예를 들어, HBV 및 아데노바이러스의 특정 종, 프리온, 박테리아, 균류, 원생동물 등을 포함한다. "HBV 감염"은 특히 숙주 유기체, 예컨대, 숙주 유기체의 세포 및 조직의 HBV에 의한 침입을 지칭한다.

본 명세서에 기술된 방법에 관하여 사용될 때의 문구 "면역 반응을 유도하는"은 감염, 예를 들어, HBV 감염에 대하여 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에서 요망하는 면역 반응 또는 효과를 야기하는 것을 포함한다. "면역 반응을 유도하는"은 또한 병원체, 예를 들어, HBV에 대하여 치료를 위한 치료적 면역을 제공하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적 면역" 또는 "치료적 면역 반응"은 백신접종된 대상체가 대항하여 백신접종된 병원체로의 감염을 제어할 수 있는 것, 예컨대, HBV 백신의 백신접종에 의해 부여된 HBV 감염에 대한 면역, 을 의미한다. 일 구현예에서, "면역 반응을 유도하는"은 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에 면역을 생산하는 것, 예컨대, 질환, 예를 들어, HBV 감염에 대하여 치료적 효과를 제공하는 것을 의미한다. 구체적 구현예에서, "면역 반응을 유도하는"은 HBV 감염에 대하여, 세포 면역, 예컨대, T 세포 반응을 야기 또는 향상하는 것을 지칭한다. 특정 구현예에서, "면역 반응을 유도하는"은 HBV 감염에 대하여, 체액 면역 반응을 야기하거나 개선하는 것을 지칭한다. 특정 구현예에서, "면역 반응을 유도하는"은 HBV 감염에 대하여 세포 및 체액 면역 반응을 야기하거나 개선하는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "보호 면역성" 또는 "보호 면역 반응"은 백신접종된 대상체가 백신접종된 병원체에 대항하여 감염을 조절할 수 있는 것을 의미한다. 통상, 전개된 "보호 면역 반응"을 갖는 대상체는 단지 경증 내지 중등도 임상 증상만을 전개하거나 증상이 전혀 없다. 통상, 특정 병원체에 대항하여 "보호 면역 반응" 또는 "보호 면역성"을 갖는 대상체는 상기 병원체로의 감염 결과로 사망하지 않을 것이다.

전형적으로, 본 출원의 조성물 및 치료적 조합물을 투여하는 것은 HBV 감염 또는 HBV 감염의 특징적 증상의 전개 후에 HBV에 대한 면역 반응을 생성하는, 예를 들어, 치료적 백신접종을 위한, 치료적 목표를 가질 것이다.

본 명세서에서 사용되는 "면역원적 유효량" 또는 "면역학적 유효량"은 이를 필요로 하는 대상체에서 요망되는 효과 또는 면역 반응을 충분히 유도하는 조성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 항원의 양을 의미한다. 면역원적 유효량은 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 양일 수 있다. 면역원적 유효량은 이를 필요로 하는 대상체에서 면역을 생산, 예를 들어, HBV 감염과 같은 질환에 대한 치료적 효과를 제공하기에 충분한 양일 수 있다. 면역원적 유효량은 다양한 요인, 예컨대, 대상체의 신체 상태, 연령, 체중, 건강 등; 특정 적용, 예를 들어, 보호 면역 또는 치료적 면역을 제공하는지; 및 그에 대한 면역성이 요망되는 특정 질환, 예를 들어, 바이러스 감염에 따라 다를 수 있다. 면역원적 유효량은 본 개시의 관점에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 출원의 구체적 구현예에서, 면역원적 유효량은 다음 효과 중 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 이상을 달성하기에 충분한 조성물 또는 치료적 조합물의 양을 지칭한다: (i) HBV 감염 또는 이와 연관된 증상의 중증도를 감소 또는 개선; (ii) HBV 감염 또는 이와 연관된 증상의 지속기간을 감소; (iii) HBV 감염 또는 이와 연관된 증상의 진행을 예방; (iv) HBV 감염 또는 이와 연관된 증상의 퇴행을 야기; (v) HBV 감염, 또는 이와 연관된 증상의 전개 또는 시작을 예방; (vi) HBV 감염 또는 이와 연관된 증상의 재발을 예방; (vii) HBV 감염을 갖는 대상체의 입원 감소; (viii) HBV 감염을 갖는 대상체의 입원 기간 감소; (ix) HBV 감염이 있는 대상체의 생존을 증가; (x) 대상체 내의 HBV 감염을 제거; (xi) 대상체 내의 HBV 복제를 억제 또는 감소; 및/또는 (xii) 다른 요법의 예방적 또는 치료적 효과(들)를 증진 또는 향상.

면역원적 유효량은 또한 임상적 혈청전환으로의 진전과 일관되는 HBsAg 수준을 감소; 대상체의 면역계에 의한 감염된 간세포의 감소와 관련이 있는 일관된 HBsAg 제거를 달성; HBV-항원 특이적 활성 T-세포 개체군의 유도; 및/또는 12 개월 이내에 HBsAg의 지속적 손실을 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 표적 지표의 예는 500 개 카피의 HBsAg 국제단위(IU)의 역치 미만의 보다 낮은 HBsAg 및/또는 보다 높은 CD8 수를 포함한다.

일반 지침으로서, 면역학적 유효량은 DNA 플라스미드와 관련하여 사용되는 경우 총 DNA 플라스미드의 약 0.1 mg/mL 내지 10 mg/mL 범위, 예컨대, 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL. 0.75 mg/mL 1 mg/mL, 1.5 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 또는 10 mg/mL일 수 있다. 바람직하게, DNA 플라스미드의 면역원적 유효량은 8 mg/mL 미만, 보다 바람직하게 6 mg/mL 미만, 보다 더 바람직하게 3 mg/mL 내지 4 mg/mL이다. 면역원적 유효량은 하나의 벡터 또는 플라스미드로부터 또는 복수의 벡터 또는 플라스미드로부터일 수 있다. 추가의 일반 지침으로서, 면역원적 유효량은 펩티드와 관련하여 사용되는 경우 투여 당 10 μg 내지 1 mg, 예컨대, 투여 당 10 μg, 20 μg, 50 μg, 100 μg, 200 μg, 300 μg, 400 μg, 500 μg, 600 μg, 700 μg, 800 μg, 9000 μg, 또는 1000 μg의 범위일 수 있다. 면역원적 유효량은 단일 조성물에서 또는 복수의 조성물, 예컨대, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개 또는 10 개 조성물(예를 들어, 정제, 캡슐 또는 주사제, 또는 근육내 전달, 예컨대, 근육내 전달 패치를 사용한 근육내 전달을 위해 개조된 임의의 조성물)로 투여될 수 있으며, 복수의 캡슐 또는 주사의 투여는 종합적으로 대상체에 면역원적 유효량을 제공한다. 예를 들어, 두 개의 DNA 플라스미드가 사용될 경우, 면역원적 유효량은 3 mg/mL 내지 4 mg/mL, 각 플라스미드 당 1.5 mg/mL 내지 2 mg/mL일 수 있다. 또한 소위 프라임-부스트 요법으로, 대상체에 면역원적 유효량을 투여하고, 후속적으로 동일한 대상체에 하나 더(another)의 면역원적 유효량의 용량을 투여할 수 있다. 이러한 프라임-부스트 요법의 일반적 개념은 백신 분야의 당업자에 잘 알려져 있다. 추가적 부스터 투여는 필요한 경우 상기 요법에 선택적으로 추가될 수 있다.

두 개의 DNA 플라스미드, 예를 들어, HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 DNA 플라스미드 및 HBV pol 항원을 인코딩하는 제2 DNA 플라스미드를 포함하는 치료적 조합물은 둘 다의 플라스미드를 혼합하고 혼합물을 단일 해부학적 부위에 전달하여 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 단일 발현 플라스미드를 각각 전달하는 두 별개의 면역화가 수행될 수 있다. 이러한 구현예에서, 둘 다의 플라스미드가 두 별개의 면역화의 혼합으로서 단일 면역화로 투여되는지의 여부에 따라, 제1 DNA 플라스미드 및 제2 DNA 플라스미드는 중량비로 10:1 내지 1:10, 예컨대, 중량비로 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10의 비율로 투여될 수 있다. 바람직하게, 상기 제1 및 제2 DNA 플라스미드는 중량비로 1:1의 비율로 투여된다.

일반 지침으로서, 면역학적 유효량은 RNAi 제제와 관련하여 사용되는 경우 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 예를 들어, 약 0.05 mg 내지 약 4 mg/kg 또는 약 1 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 또는 예를 들어 약 0.05 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4 mg/kg, 4.5 mg/kg 또는 5 mg/kg의 범위일 수 있지만, 예를 들어, 약 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg 또는 100 mg/kg와 같이 더욱 더 높을 수 있다. 고정 단위 용량은 또한, 예를 들어, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg 또는 1000 mg로 주어질 수 있거나, 용량은 환자의 표면적, 예를 들어, 500 mg/m², 400 mg/m², 300 mg/m², 250 mg/m², 200 mg/m², 또는 100 mg/m²에 기초할 수 있다. 환자를 치료하기 위해 통상 1 회 내지 8 회 용량(예를 들어, 1 회, 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 7 회 또는 8 회)이 투여될 수 있지만, 9 회, 10 회, 11 회, 12 회, 13 회, 14 회, 15 회, 16 회, 17 회, 18 회, 19 회, 20 회 또는 그 초과의 용량이 주어질 수 있다.

본 출원의 RNAi 제제의 투여는 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 5 주, 6 주, 7 주, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월 이상 후에 반복될 수 있다. 반복된 치료 과정이 만성 투여이므로 또한 가능하다. 반복 투여는 동일한 용량 또는 상이한 용량일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 RNAi 제제는 단일 용량 또는 24 시간, 12 시간, 8 시간, 6 시간, 4 시간, 또는 2 시간 마다의 분할 용량, 또는 이들의 조합을 이용하여 치료 개시 후 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일, 21 일, 22 일, 23 일, 24 일, 25 일, 26 일, 27 일, 28 일, 29 일, 30 일, 31 일, 32 일, 33 일, 34 일, 35 일, 36 일, 37 일, 38 일, 39 일, 또는 40 일 중 적어도 하나, 또는 대안적으로 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 13 주, 14 주, 15 주, 16 주, 17 주, 18 주, 19 주 또는 20 주 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합으로 일당 약 0.05 mg/kg 내지 5 mg/kg, 예컨대, 0.05 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4 mg/kg, 4.5 mg/kg 또는 5 mg/kg의 양의 일일 투여량으로 제공될 수 있다.

몇몇 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 AD04872 대 AD05070의 비는 약 2:1이다. 몇몇 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 AD04872 대 AD05070의 비는 약 3:1이다. 몇몇 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 AD04872 대 AD05070의 비는 약 1:1이다. 몇몇 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 AD04872 대 AD05070의 비는 약 4:1이다. 몇몇 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 AD04872 대 AD05070의 비는 약 5:1이다. 몇몇 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 AD04872 대 AD05070의 비는 약 1:2이다.

바람직하게, 본 출원의 방법에 따라 치료되는 대상체는 HBV-감염된 대상체, 구체적으로 만성 HBV 감염을 갖는 대상체이다. 급성 HBV 감염은 후속하는 광범위 적응 면역 반응(예를 들어, HBV-특이적 T 세포, 중화 항체)에 의해 보완되는 선천 면역계의 효율적인 활성을 특징으로 하며, 이는 통상 성공적인 복제 저해 또는 감염된 간세포의 제거를 야기한다. 반대로, 이러한 반응은 높은 바이러스 및 항원 로드(load)로 인해 손상 또는 약화되며, 예를 들어, HBV 외피 단백질이 풍부하게 생산되며 감염성 바이러스의 1,000배 과량의 서브바이러스 입자로 방출될 수 있다.

만성 HBV 감염은 바이러스 로드, 간 효소 수준(괴사염증(necroinflammatory) 활성), HBeAg, 또는 HBsAg 로드 또는 이들 항원에 대한 항체의 존재를 특징으로 하는 시기(phase)들로 기술된다. 바이러스 혈증은 상당히 다양할 수 있지만, cccDNA 수준은 세포 당 대략 10 내지 50 카피로 비교적 일정하게 유지된다. cccDNA 종의 지속은 만성성에 이르게 한다. 보다 구체적으로, 만성 HBV 감염의 시기는: (i) 높은 바이러스 로드 및 정상 또는 최소 상승된 간 효소를 특징으로 하는 면역-내성 시기; (ii) 현저하게 상승되는 간 효소가 관찰되면서 바이러스 복제 수준이 보다 낮거나 감소하는 면역 활성 HBeAg-양성 시기; (iii) HBeAg 혈청전환에 뒤따를 수 있는 낮은 바이러스 로드 및 혈청 내 정상 간 효소 수준을 갖는 저 복제 상태인 비활성 HBsAg 담체 시기; 및 (iv) 바이러스 복제가 간 효소 수준의 수반 변동(concomitant fluctuation)으로 주기적으로(재활성화) 일어나고, 프리-코어(pre-core) 및/또는 기저 코어(basal core) 프로모터의 돌연변이가 통상적이어서 HBeAg가 감염된 세포에 의해 생산되지 않는, HBeAg-음성 시기를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "만성 HBV 감염"은 6 개월 넘게 HBV 존재가 검출 가능한 대상체를 지칭한다. 만성 HBV 감염을 갖는 대상체는 만성 HBV 감염의 임의의 시기에 있을 수 있다. 만성 HBV 감염은 기술 분야에서 보편적 의미에 따라 이해된다. 만성 HBV 감염은, 예를 들어, 급성 HBV 감염 후 6 개월 이상 동안 HBsAg의 지속에 의해 특정지어질 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 지칭되는 만성 HBV 감염은 질병 통제 예방 센터(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)에 의해 출간된 정의를 따르며, 이에 따르면 만성 HBV 감염은 다음과 같은 실험실 기준을 특징으로 할 수 있다: (i) B형 간염 코어 항원에 대한 IgM 항체(IgM 항-HBc)에 음성 및 B형 간염 표면 항원(HBsAg), B형 간염 e 항원(HBeAg), 또는 B형 간염 바이러스 DNA를 위한 핵산 시험에 양성 또는 (ii) HBsAg 또는 HBV DNA를 위한 핵산 시험에 양성, 또는 HBeAg에 대해 적어도 6 개월 간격으로 2 회 양성.

바람직하게, 면역원적 유효량은 만성 HBV 감염을 치료하기에 충분한 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물의 양을 지칭한다.

몇몇 구현예에서, 만성 HBV 감염을 갖는 대상체는 뉴클레오시드 유사체(NUC) 치료를 받고, NUC-저해된다. 본 명세서에서 사용되는 "NUC-저해된"은 적어도 6 개월 동안 검출불능 HBV 바이러스 수준 및 안정된 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT) 수준을 갖는 대상체를 지칭한다. 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 치료의 예는 HBV 폴리머라제 억제제, 예컨대, 엔타카비르 및 테노포비르를 포함한다. 바람직하게, 만성 HBV 감염을 갖는 대상체는 진행성 간 섬유증 또는 간경변를 갖지 않는다. 이러한 대상체는 전형적으로 간 섬유증에서 3 미만의 METAVIR 스코어 및 9 kPa 미만의 파이브로스캔(fibroscan) 결과를 갖는다. METAVIR 스코어는 B형 간염을 갖는 환자의 간 생검에서 조직병리학적 평가에 의해 염증 및 섬유증의 정도를 평가하기 위해 통상적으로 사용되는 평점 시스템이다. 상기 평점 시스템은 2 개의 표준화된 수치를 부여한다: 염증 정도를 나타내는 것 및 섬유증 정도를 나타내는 것.

만성 HBV의 제거 또는 감소는 바이러스-유도 간경변 및 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)을 포함하는 중증 간 질환의 조기 질환 차단을 가능하게 할 수 있는 것으로 사료된다. 따라서, 본 출원의 방법은 또한 HBV-유도 질환을 치료하는 요법으로서 사용될 수 있다. HBV-유도 질환의 예는 간경변, 암(예를 들어, 간세포 암종), 및 섬유증, 구체적으로 간 섬유증에서 METAVIR 스코어 3 이상을 특징으로 하는 진행성 섬유증을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 구현예에서, 면역원적 유효량은 12 개월 이내 HBsAg의 지속적인 손실 및 임상 질환(예를 들어, 간경변, 간세포 암종 등)의 현저한 감소를 달성하기에 충분한 양이다.

본 출원의 구현예에 따른 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 본 출원의 조성물과 조합하여 또 다른 면역원적 제제(예컨대, 또 다른 HBV 항원 또는 다른 항원) 또는 또 다른 항-HBV 항원(예컨대, 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항-HBV 제제)를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 또 다른 항-HBV 제제 또는 면역원적 제제는 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-PD1, 항-TIM-3, 등), 톨-유사 수용체 효능제(예를 들어, TLR7 효능제 및/또는 TLR8 효능제), RIG-1 효능제, IL-15 초효능제(Altor Bioscience), 돌연변이 IRF3 및 IRF7 유전적 애주번트, STING 효능제(Aduro), FLT3L 유전적 애주번트, IL-12 유전적 애주번트, IL-7-hyFc; HBV env를 결합하는 CAR-T(S-CAR 세포); 캡시드 조립 조절제; cccDNA 억제제, HBV 폴리머라제 억제제(예를 들어, 엔테카비르 및 테노포비르)를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 소분자 또는 항체일 수 있다. 하나 이상의 다른 항-HBV 활성제는, 예를 들어, 소분자, 항체 또는 그 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산일 수 있다. 하나 또는 다른 항-HBV 제제는, 예를 들어, HBV DNA 폴리머라제 억제제; 면역조절제; 톨-유사 수용체 효능제 7 조절제; 톨-유사 수용체 8 조절제; 톨-유사 수용체 3 조절제; 인터페론 알파 수용체 리간드; 히알루로니다제 억제제; IL-10의 조절제; HBsAg 억제제; 톨-유사 수용체 9 조절제; 사이클로필린 억제제; HBV 예방 백신; HBV 치료 백신; HBV 바이러스 진입 억제제; 바이러스 mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 보다 구체적으로 항-HBV 안티센스 올리고뉴클레오티드; 단경합 RNA(siRNA), 보다 구체적으로 항-HBV siRNA; 엔도뉴클레아제 조절제; 리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제; B형 간염 바이러스 E 항원 억제제; B형 간염 바이러스의 표면 항원을 표적화하는 HBV 항체; HBV 항체; CCR2 케모카인 길항제; 티모신 효능제; 사이토카인, 예컨대, IL12; 캡시드 조립 조절제, 핵단백질 억제제(HBV 코어 또는 캡시드 단백질 억제제); 핵산 폴리머(NAP); 레티노산-유도성 유전자 1의 자극제; NOD2의 자극제; 재조합 티모신 알파-1; B형 간염 바이러스 복제 억제제; PI3K 억제제; cccDNA 억제제; 면역 체크포인트 억제제, 예컨대, PD-L1 억제제, PD-1 억제제, TIM-3 억제제, TIGIT 억제제, Lag3 억제제, 및 CTLA-4 억제제; 면역 세포(보다 구체적으로 T 세포) 상에 발현되는 공동-자극 수용체의 효능제, 예컨대, CD27, CD28; BTK 억제제; HBV 치료를 위한 기타 약제; IDO 억제제; 아르기나제 억제제; 및 KDM5 억제제 중에서 선택될 수 있다.

전달 방법

본 출원의 조성물 및 치료적 조합물은 본 개시의 관점에서 기술분야에 알려져 있는, 비경구 투여(예를 들어, 근육내, 피하, 정맥내 또는 피내 주사, 경구 투여, 경피 투여, 및 비강 투여를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 방법에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직하게, 조성물 및 치료적 조합물은 비경구(예를 들어, 근육내 주사 또는 피내 주사) 또는 경피로 투여된다.

조성물 및 치료적 조합물이 하나 이상의 DNA 플라스미드를 포함하는 본 출원의 몇몇 구현예에서, 투여는 피부를 통한 주사, 예를 들어, 근육내 또는 피내 주사, 바람직하게 근육내 주사에 의할 수 있다. 근육내 주사는 전기천공법(electroporation), 즉, DNA 플라스미드의 세포로의 전달을 용이하게 하기 위한 전기장의 적용과 조합될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "전기천공법"은 생체막의 미세 경로(포어)를 유도하기 위한 막통과 전기장 펄스의 사용을 지칭한다. 생체내 전기천공법 중, 적절한 세기 및 지속시간의 전기장을 세포에 적용하여, 세포 막 투과성이 증진된 일시적 상태를 유도하고, 이에 따라 그 자체로는 세포 막을 통과하지 못하는 분자의 세포 흡수를 가능하게 한다. 전기천공법에 의한 이러한 포어의 형성은 생체분자, 예컨대, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 약제 등의 세포 막 한쪽에서 다른 쪽으로의 통과를 용이하게 한다. DNA 백신의 전달을 위한 생체내 전기천공법은 주사 부위에 경증 내지 중등도 염증을 초래하면서도 숙주 세포에 의해 플라스미드 흡수를 유의하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 결과적으로, 통상적인 주사와 비교하여 피내 또는 근육내 전기천공법으로 형질감염 효율 및 면역 반응이 유의하게 향상되었다(예를 들어, 각각 1,000 배 및 100 배까지).

전형적인 구현예에서, 전기천공법은 근육내 주사와 조합된다. 그러나, 전기천공법은 또한 다른 형태의 비경구 투여, 예를 들어, 피내 주사, 피하 주사 등과 조합될 수 있다.

전기천공법을 통한 본 출원의 조성물, 치료적 조합물 또는 백신의 투여는 세포 막에 가역적 포어를 유발하기에 효과적인 에너지 펄스를 포유동물의 요망되는 조직에 전달하도록 구성될 수 있는 전기천공 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 전기천공 장치는 전기천공 구성요소 및 전극 조립체 또는 핸들 조립체를 포함할 수 있다. 전기천공 구성요소는 전기천공 장치의 다음 구성요소 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 컨트롤러, 전류파형 발생기, 임피던스 테스터, 파형 로거, 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 구성요소, 전원 및 전원 스위치. 전기천공법은 생체내 전기천공 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로 DNA 플라스미드를 포함하는, 본 출원의 조성물 및 치료적 조합물의 전달을 용이하게 할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예는 CELLECTRA®(Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA), Elgen 전기천공기(Inovio Pharmaceuticals, Inc.), Tri-GridTM 전달 시스템(Ichor Medical Systems, Inc., San Diego, CA 92121) 및 미국 특허 제7,664,545호, 미국 특허 제8,209,006호, 미국 특허 제9,452,285호, 미국 특허 제5,273,525호, 미국 특허 제6,110,161호, 미국 특허 제6,261,281호, 미국 특허 제6,958,060호, 및 미국 특허 제6,939,862호, 미국 특허 제7,328,064호, 미국 특허 제6,041,252호, 미국 특허 제5,873,849호, 미국 특허 제6,278,895호, 미국 특허 제6,319,901호, 미국 특허 제6,912,417호, 미국 특허 제8,187,249호, 미국 특허 제9,364,664호, 미국 특허 제9,802,035호, 미국 특허 제6,117,660호, 및 국제 특허 출원 공개 제WO2017172838호에 기술된 것을 포함하며, 이들 모두는 전체가 참조로서 본 명세서에 통합된다. 생체내 전기천공 장치의 다른 예는 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합되는 대리인 명부 번호 688097-405WO로 본 출원과 동일자로 출원된 "Method and Apparatus for the Delivery of Hepatitis B Virus (HBV) Vaccines"라는 명칭의 국제 특허 출원에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 출원의 조성물 및 치료적 조합물의 전달을 위해 적용이 고려되는 것은 또한, 예를 들어, 전체가 참조로서 본 명세서에 통합되는 미국 특허 제6,697,669호에 기술된 바와 같은, 펄스 전기장(pulsed electric field)의 사용이다.

조성물 또는 치료적 조합물이 하나 이상의 DNA 플라스미드를 포함하는 본 출원의 다른 구현예에서, 투여 방법은 경피이다. 경피 투여는 DNA 플라스미드의 세포로의 전달을 용이하게 하기 위해 표피 피부 마찰과 조합될 수 있다. 예를 들어, 피부 패치(dermatological patch)가 표피 피부 마찰에 사용될 수 있다. 피부 패치의 제거 시, 조성물 또는 치료적 조합물이 마찰된 피부 상에 침착될 수 있다.

전달 방법은 상술한 구현예에 제한되지 않으며, 세포내 전달을 위한 임의의 수단을 사용할 수 있다. 본 출원의 방법에 의해 고려되는 다른 세포내 전달 방법은 리포솜 캡슐화, 지질 나노입자(LNP) 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

본 출원의 특정 구현예에서, 투여 방법은 지질 조성물, 예컨대, 지질 나노입자(LNP)이다. 치료 생산물(예컨대, 본 발명의 하나 이상의 핵산 분자)을 전달하기 위해 사용될 수 있는 지질 조성물, 바람직하게 지질 나노 입자는, 수성 부피가 양친매성 지질 이중층에 의해 캡슐화되거나, 지질이 치료 생산물을 포함하는 내부를 코팅하는, 리포좀 또는 지질 소수포; 또는 지질-캡슐화된 치료 생산물이 비교적 무질서한 지질 혼합물 내에 함유되는 지질 응집체 또는 미셀을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

구체적 구현예에서, LNP는 표적 세포로의 본 발명의 핵산 분자, 예컨대, DNA 또는 RNA 분자를 캡슐화하고/캡슐화하거나 이의 전달을 향상시키기 위해 양이온성 지질을 포함한다. 양이온성 지질은 선택된 pH, 예컨대, 생리적 pH에서 순 양전하를 보유하는 임의의 지질 종일 수 있다. 지질 나노입자는 하나 이상의 양이온성 지질, 비-양이온성 지질 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형 지질을 사용하는 다양한 비율의 다성분 지질 혼합물을 포함함으로써 제조될 수 있다. 여러 양이온성 지질이 문헌에 기재되어 있으며, 이들 중 다수는 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 포함한다.

LNP 제형은 음이온성 지질을 포함할 수 있다. 음이온성 지질은 선택된 pH, 예컨대, 생리적 pH에서 순 음전하를 보유하는 임의의 지질 종일 수 있다. 음이온 성 지질은 양이온성 지질과 조합될 때, LNP의 전체 표면 전하를 감소시키고 LNP 이중층 구조의 pH-의존적 파괴를 도입하여 뉴클레오티드 방출을 촉진하는 데 사용된다. 여러 음이온성 지질이 문헌에 기재되어 있으며, 이들 중 다수는 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 음이온성 지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 포함한다.

LNP는 본 개시의 측면에서 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, LNP는 에탄올 주입 또는 희석, 박막 수화, 동결-해동, 프렌치 프레스(French press) 또는 막 압출, 정용여과, 초음파 처리, 세제 투석, 에테르 주입 및 역상 증발을 이용하여 제조될 수 있다.

지질, 지질 조성물 및 활성 핵산 분자, 예컨대, 본 발명의 것들을 전달하기 위한 지질 담체를 생성하는 방법의 몇몇 예들은 각각 전체 관련 내용이 본 명세서에 참조로 통합되는 US2017/0190661, US2006/0008910, US2015/0064242, US2005/0064595, WO/2019/036030, US2019/0022247, WO/2019/036028, WO/2019/036008, WO/2019/036000, US2016/0376224, US2017/0119904, WO/2018/200943, WO/2018/191657, US2014/0255472, 및 US2013/0195968에 기재되어 있다.

본 출원의 RNAi 제제를 포함하는 약학적 조성물은 약리학적 유효량의 적어도 하나의 종류의 RNAi 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 그러나, 이러한 "약학적 조성물"은 또한 이러한 RNAi 제제의 개개의 가닥 또는 본 출원의 RNAi에 포함된 센스 또는 안티센스 가닥의 적어도 하나의 가닥을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열을 포함하는 벡터(들)을 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 정의된 RNAi를 발현하거나 포함하는 세포, 조직 또는 단리된 기관이 "약학적 조성물"로서 사용될 수 있다고 예상된다.

본 출원의 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제는 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 정맥내(i.v.) 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구로, 근육내 또는 피하 또는 복강내로 대상체에게 투여될 수 있다. 정맥내 주입은, 예를 들어, 15 분, 30 분, 60 분, 90 분, 120 분, 180 분, 또는 240 분, 또는 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간 또는 12 시간에 걸쳐 제공될 수 있다.

근육내, 피하 및 정맥내 사용을 위해, 본 출원의 RNAi 제제를 포함하는 약학적 조성물은 일반적으로 적절한 pH 및 등장성으로 완충된 멸균 수용액 또는 현탁액으로 제공될 것이다. 바람직한 구현예에서, 담체는 배타적으로 수성 완충액으로만 이루어진다. 이러한 맥락에서, "배타적으로"는 B형 간염 바이러스 유전자를 발현하는 세포에서 dsRNA의 흡수에 영향을 미치거나 매개할 수 있는 보조제 또는 캡슐화 물질이 존재하지 않음을 의미한다. 본 출원에 따른 수성 현탁액은 현탁제, 예컨대, 셀룰로스 유도체, 소듐 알지네이트, 폴리비닐피롤리돈 및 검 트라가칸트, 및 습윤제, 예컨대, 레시틴을 포함할 수 있다. 수성 현탁액에 적합한 보존제는 에틸 및 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트를 포함한다. 본 출원에 따라 유용한 RNAi 제제를 포함하는 약학적 조성물은 또한 이식물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하여 제어형 방출 제형과 같이 신체로부터의 RNAi 제제가 빨리 없어지는 것을 막기 위한 캡슐화된 제형을 포함한다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 아교질, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성의 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 리포좀 현탁액 및 이중-특이적 항체는 또한 약학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 본 명세서에 그 전체가 참조로 통합되는 PCT 공개 W091/06309 및 WO 2011/003780에 기재된 바와 같은 당업자에게 알려져 있는 방법에 따라 제조될 수 있다.

애주번트

본 출원의 몇몇 구현예에서, HBV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 추가로 애주번트를 투여하는 것을 포함한다. 용어 "애주번트" 및 "면역 자극제"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 면역계의 자극을 유발하는 하나 이상의 물질로 정의된다. 이러한 맥락에서, 애주번트는 본 출원의 HBV 항원 및 항원성 HBV 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증진하기 위해 사용된다.

본 출원의 구현예에 따르면, 애주번트는 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물에 존재하거나, 별개 조성물로 투여될 수 있다. 애주번트는, 예를 들어, 소분자 또는 항체일 수 있다. 본 출원에서 사용하기에 적합한 애주번트의 예는 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-PD1, 항-TIM-3 등), 톨-유사 수용체 효능제(예를 들어, TLR7 효능제 및/또는 TLR8 효능제), RIG-1 효능제, IL-15 수퍼효능제(AltorBioscience), 돌연변이 IRF3 및 IRF7 유전적 애주번트, STING 효능제(Aduro), FLT3L 유전적 애주번트, IL-12 유전적 애주번트, 및 IL-7-hyFc를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 애주번트의 예는, 예를 들어, 다음 항-HBV 제제 중에서 선택될 수 있다: HBV DNA 폴리머라제 억제제; 면역조절제; 톨-유사 수용체 7 조절제; 톨-유사 수용체 8 조절제; 톨-유사 수용체 3 조절제; 인터페론 알파 수용체 리간드; 히알루로니다제 억제제; IL-10의 조절제; HBsAg 억제제; 톨-유사 수용체 9 조절제; 사이클로필린 억제제; HBV 예방 백신; HBV 치료 백신; HBV 바이러스 진입 억제제; 바이러스 mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 보다 구체적으로 항-HBV 안티센스 올리고뉴클레오티드; 단경합 RNA(siRNA), 보다 구체적으로 항-HBV siRNA; 엔도뉴클레아제 조절제; 리보뉴클레오티드 리덕타제의 억제제; B형 간염 E 항원 억제제; B형 간염 바이러스의 표면 항원을 표적화하는 HBV 항체; HBV 항체; CCR2 케모카인 길항제; 티모신 효능제; 사이토카인, 예컨대, IL12; 캡시드 조립 조절제, 핵단백질 억제제(HBV 코어 또는 캡시드 단백질 억제제); 핵산 폴리머(NAP); 레티노산-유도성 유전자 1의 자극제; NOD2의 자극제; 재조합 티모신 알파-1; B형 간염 바이러스 복제 억제제; PI3K 억제제; cccDNA 억제제; 면역 체크포인트 억제제, 예컨대, PD-L1 억제제, PD-1 억제제, TIM-3 억제제, TIGIT 억제제, Lag3 억제제, 및 CTLA-4 억제제; 면역 세포(보다 구체적으로 T 세포) 상에 발현되는 공동-자극 수용체의 효능제, 예컨대, CD27, CD28; BTK 억제제; HBV 치료를 위한 기타 약제; IDO 억제제; 아르기나제 억제제; 및 KDM5 억제제.

본 출원의 조성물 및 치료적 조합물은 또한 적어도 하나의 다른 항-HBV 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 본 출원과 사용되기에 적합한 항-HBV 제제의 예는 소분자, 항체, 및/또는, HBV env(S-CAR 세포)를 결합하는 CAR-T 요법제, 캡시드 조립 조절제, TLR 효능제(예를 들어, TLR7 및/또는 TLR8 효능제), cccDNA 억제제, HBV 폴리머라제 억제제(예를 들어, 엔테카비르 및 테노포비르, 및/또는 면역 체크포인트 억제제 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

적어도 하나의 항-HBV 제제는, 예를 들어, HBV DNA 폴리머라제 억제제; 면역조절제; 톨-유사 수용체 7 조절제; 톨-유사 수용체 8 조절제; 톨-유사 수용체 3 조절제; 인터페론 알파 수용체 리간드; 히알루로니다제 억제제; IL-10의 조절제; HBsAg 억제제; 톨-유사 수용체 9 조절제; 사이클로필린 억제제; HBV 예방 백신; HBV 치료 백신; HBV 바이러스 진입 억제제; 바이러스 mRNA를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 보다 구체적으로 항-HBV 안티센스 올리고뉴클레오티드; 단경합 RNA(siRNA), 보다 구체적으로 항-HBV siRNA; 엔도뉴클레아제 조절제; 리보뉴클레오티드 리덕타제의 억제제; B형 간염 E 항원 억제제; B형 간염 바이러스의 표면 항원을 표적화하는 HBV 항체; HBV 항체; CCR2 케모카인 길항제; 티모신 효능제; 사이토카인, 예컨대, IL12; 캡시드 조립 조절제, 핵단백질 억제제(HBV 코어 또는 캡시드 단백질 억제제); 핵산 폴리머(NAP); 레티노산-유도성 유전자 1의 자극제; NOD2의 자극제; 재조합 티모신 알파-1; B형 간염 바이러스 복제 억제제; PI3K 억제제; cccDNA 억제제; 면역 체크포인트 억제제, 예컨대, PD-L1 억제제, PD-1 억제제, TIM-3 억제제, TIGIT 억제제, Lag3 억제제, 및 CTLA-4 억제제; 면역 세포(보다 구체적으로 T 세포) 상에 발현되는 공동-자극 수용체의 효능제, 예컨대, CD27, CD28; BTK 억제제; HBV 치료를 위한 기타 약제; IDO 억제제; 아르기나제 억제제; 및 KDM5 억제제 중에서 선택될 수 있다. 이러한 항-HBV 제제는 본 출원의 조성물 및 치료적 조합물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

프라임/부스트 면역화 방법

본 출원의 구현예는 또한 소위 프라임-부스트 요법으로, 대상체에게 면역원적 유효량의 조성물 또는 면역원적 조합물을 투여하고, 후속적으로 동일한 대상체에게 또 다른(another) 용량의 면역원적 유효량의 조성물 또는 면역원적 조합물을 투여하는 것을 고려한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물은 면역 반응을 프라이밍하기 위해 사용되는 프라이머 백신이다. 다른 구현예에서, 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물은 면역 반응을 부스팅하기 위해 사용되는 부스터 백신이다. 본 출원의 프라이밍 및 부스팅 백신은 본 명세서에 기술되는 본 출원의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 프라임-부스트 요법의 일반적인 개념은 백신 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 명세서에 기술된 본 출원의 임의의 조성물 및 치료적 조합물은 HBV에 대한 면역 반응을 프라임 및/또는 부스팅하기 위한 프라이밍 및/또는 부스팅 백신으로서 사용될 수 있다.

본 출원의 몇몇 구현예에서, 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물은 면역화를 프라이밍하기 위해 투여될 수 있다. 조성물 또는 치료적 조합물은 면역화를 부스팅하기 위해 재-투여될 수 있다. 조성물 또는 백신 조합물의 추가적 부스터 투여는 필요에 따라 요법에 선택적으로 추가될 수 있다. 애주번트는 면역화를 부스팅하기 위해 사용되는 본 출원의 조성물에 존재하거나, 면역화를 부스팅하기 위한 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물과 함께 투여될 별개 조성물에 존재하거나, 부스팅 면역화로서 그 자체로 투여될 수 있다. 애주번트가 요법에 포함되는 이들 구현예에서, 애주번트는 바람직하게 부스팅 면역화를 위해 사용된다.

프라임-부스트 요법의 예시적 및 비제한적 예는 면역 반응을 프라이밍하기 위해 대상체에게 단일 용량의 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물의 면역원적 유효량을 투여하고; 후속적으로 하나 더(another)의 용량의 본 출원의 조성물 또는 치료적 조합물의 면역원적 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 상기 부스팅 면역화는 프라이밍 면역화가 최초 투여되고 약 2 주 내지 6 주, 바람직하게 4 주 후에 1차 투여된다. 선택적으로, 프라이밍 면역화가 최초 투여된 후 약 10 주 내지 14 주, 바람직하게 12 주에, 조성물 또는 치료적 조합물, 또는 기타 애주번트의 추가적 부스팅 면역화가 투여된다.

키트

본 명세서에서 본 출원의 치료적 조합물을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 키트는 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드 및 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 하나 이상의 별개의 조성물에 포함할 수 있거나, 키트는 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드, 및 HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제를 단일 조성물에 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 애주번트 또는 면역 자극제, 및/또는 다른 항-HBV 제제를 추가로 포함할 수 있다.

동물 또는 인간 유기체에게 투여 시 항-HBV 면역 반응을 유도하거나 자극하는 능력은 시험관내 또는 생체내에서 기술 분야에 표준인 다양한 검정법을 사용하여 평가될 수 있다. 면역 반응의 개시 및 활성화를 평가할 수 있는 기술의 일반적인 설명에 대하여, 예를 들어, 문헌[Coligan et al. (1992 and 1994, Current Protocols in Immunology; ed. J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health]을 참조한다. 세포 면역의 측정은 CD4+ 및 CD8+ T-세포로부터 유래한 것들을 포함하는 활성화된 이펙터 세포에 의해 분비되는 사이토카인 프로파일의 측정에 의해(예를 들어, ELISPOT에 의한 IL-10 또는 IFN 감마-생산 세포의 정량화), 면역 이펙터 세포의 활성화 상태의 결정에 의해(예를 들어, 고전적 [3H] 티미딘 흡수 또는 유세포 분석-기반 검정에 의한 T 세포 증식 검정), 감작화된 대상체의 항원-특이적 T 림프구에 대한 검정에 의해(예를 들어, 세포독성 검정에서 펩티드-특이적 용해, 등) 수행될 수 있다.

세포 및/또는 체액 반응을 자극하는 방법은 항체 결합 및/또는 결합에서의 경합에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press] 참조). 예를 들어, 면역원을 제공하는 조성물의 투여에 대한 반응으로 생산된 항체의 역가는 효소-결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 면역 반응은 또한 중화 항체 검정에 의해 측정할 수 있으며, 바이러스의 중화는 특정 항체로의 바이러스의 반응/억제/중화를 통한 감염성 손실로 정의된다. 면역 반응은 추가적으로 항체-의존성 세포식작용(Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis, ADCP) 검정에 의해 측정될 수 있다.

구현예

본 발명은 또한 하기 비-제한적인 구현예를 제공한다.

구현예 1은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 치료적 조합물로서,

중 적어도 하나; 및

ii) HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제, 예컨대, 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합되는 US20130005793, WO2013003520 또는 WO2018027106에 기재된 것들을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 2는 구현예 1에 있어서, HBV 폴리머라제 항원 및 절두된 HBV 코어 항원 중 적어도 하나를 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 3은 구현예 2에 있어서, HBV 폴리머라제 항원 및 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 4는 구현예 1에 있어서, 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자, 및 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자 중 적어도 하나를 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 5는 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 치료적 조합물로서,

i) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자; 및

ii) 서열번호 7과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자로서, HBV 폴리머라제 항원이 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 갖지 않는, 제2 비-천연 핵산 분자; 및

iii) HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제, 예컨대, 전체 내용이 본 명세서에 참조로 통합되는 US20130005793, WO2013003520 또는 WO2018027106에 기재된 것들을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 6은 구현예 4 또는 구현예 5에 있어서, 제1 비-천연 핵산 분자가 절두된 HBV 코어 항원의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 6a는 구현예 4 내지 구현예 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 비-천연 핵산 분자가 HBV 폴리머라제 항원의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 6b는 구현예 6 또는 구현예 6a에 있어서, 신호 서열이 독립적으로 서열번호 9 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 6c는 구현예 6 또는 구현예 6a에 있어서, 신호 서열이 독립적으로 서열번호 8 또는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 치료적 조합물이다.

구현예 7은 구현예 1 내지 구현예 6c 중 어느 한 구현예에 있어서, HBV 폴리머라제 항원이 서열번호 7과 적어도 98%, 예컨대, 적어도 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 7a는 구현예 7에 있어서, HBV 폴리머라제 항원이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 7b는 구현예 1 내지 구현예 7a 중 어느 한 구현예에 있어서, 절두된 HBV 코어 항원이 서열번호 2와 적어도 98%, 예컨대, 적어도 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어지는, 치료적 조합물이다.

구현예 7c는 구현예 7b에 있어서, 절두된 HBV 항원이 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는, 치료적 조합물이다.

구현예 8은 구현예 1 내지 구현예 7c 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 제1 및 제2 비-천연 핵산 분자가 DNA 분자인, 치료적 조합물이다.

구현예 8a는 구현예 8에 있어서, DNA 분자가 DNA 벡터에 존재하는, 치료적 조합물이다.

구현예 8b는 구현예 8a에 있어서, DNA 벡터가 DNA 플라스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 및 폐쇄된 선형 데옥시리보핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료적 조합물이다.

구현예 8c는 구현예 8에 있어서, DNA 분자가 바이러스 벡터에 존재하는, 치료적 조합물이다.

구현예 8d는 구현예 8c에 있어서, 바이러스 벡터가 박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는, 치료적 조합물이다.

구현예 8e는 구현예 1 내지 구현예 7c 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 제1 및 제2 비-천연 핵산 분자가 RNA 분자인, 치료적 조합물이다.

구현예 8f는 구현예 8e에 있어서, RNA 분자가 RNA 레플리콘, 바람직하게 자기-복제 RNA 레플리콘, mRNA 레플리콘, 변형된 mRNA 레플리콘, 또는 자기-증폭 mRNA인, 치료적 조합물이다.

구현예 8g는 구현예 1 내지 구현예 8f 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 제1 및 제2 비-천연 핵산 분자가 독립적으로 지질 조성물, 바람직하게 지질 나노입자(LNP)와 제형화되는, 치료적 조합물이다.

구현예 9는 구현예 4 내지 구현예 8g 중 어느 한 구현예에 있어서, 동일한 비-천연 핵산 분자에 제1 비-천연 핵산 분자 및 제2 비-천연 핵산 분자를 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 10은 구현예 4 내지 구현예 8g 중 어느 한 구현예에 있어서, 두 개의 상이한 비-천연 핵산 분자에 제1 비-천연 핵산 분자 및 제2 비-천연 핵산 분자를 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 11은 구현예 4 내지 구현예 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 1 또는 서열번호 3에 적어도 90%, 예컨대, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 11a는 구현예 11에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 1 또는 서열번호 3에 적어도 98%, 예컨대, 적어도 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 12는 구현예 11a에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 1 또는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 13은 구현예 4 내지 구현예 12 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 5 또는 서열번호 6에 적어도 90%, 예컨대, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 13a는 구현예 13에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 5 또는 서열번호 6에 적어도 98%, 예컨대, 적어도 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 14는 구현예 13a에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 5 또는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 15는 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi 제제가 표 2에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는, 치료적 조합물이다.

구현예 15a는 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi 제제가 표 3에 나타나 있는 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는, 치료적 조합물이다.

구현예 15b는 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi 제제가 표 4에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는, 치료적 조합물이다.

구현예 15c는 구현예 15b에 있어서, RNAi 제제가 표 4에 나타나 있는 변형된 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는, 치료적 조합물이다.

구현예 15d는 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi 제제가 표 5에 나타나 있는 표적 서열을 표적화하는, 치료적 조합물이다.

구현예 15e는 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi 제제가 표 6에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는, 치료적 조합물이다.

구현예 15f는 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi 제제가 표 7에 나타나 있는 코어 안티센스 서열 및 표 8에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열을 갖는, 치료적 조합물이다.

구현예 15g는 구현예 15f에 있어서, RNAi 제제가 표 7에 나타나 있는 변형된 센스 가닥 서열 및 표 8에 나타나 있는 변형된 안티센스 가닥 서열을 갖는, 치료적 조합물이다.

구현예 15h는 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi 제제가 표 9에 나타나 있는 안티센스 가닥과 센스 가닥의 이중체를 갖는, 치료적 조합물이다.

구현예 15i는 구현예 15h에 있어서, RNAi 제제가 표 9에 나타나 있는 AD04580; AD04585; AD04776; AD04872; AD04962; AD04963; AD04982; 또는 AD05070의 이중체 구조를 갖는, 치료적 조합물이다.

구현예 15j는 구현예 1 내지 구현예 14 중 어느 한 구현예에 있어서, 치료적 조합물이 HBV 유전자의 S 개방형 해독틀(ORF)을 표적화하는 제1 RNAi 제제, 및 HBV 유전자의 X 개방형 해독틀(ORF)을 표적화하는 제2 RNAi 제제를 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 15k는 구현예 15j에 있어서, 제1 RNAi 제제가 AD04001; AD04002; AD04003; AD04004; AD04005; AD04006; AD04007; AD04008; AD04009; AD04010; AD04422; AD04423; AD04425; AD04426; AD04427; AD04428; AD04429; AD04430; AD04431 ; AD04432; AD04433; AD04434; AD04435; AD04436; AD04437; AD04438; AD04439; AD04440; AD04441; AD04442; AD04511 ; AD04581; AD04583; AD04584; AD04585; AD04586; AD04587; AD04588; AD04590; AD04591; AD04592; AD04593; AD04594; AD04595; AD04596; AD04597; AD04598; AD04599; AD04734; AD04771; AD04772; AD04773; AD04774; AD04775; AD04822; AD04871; AD04872; AD04873; AD04874; AD04875; AD04876; AD04962; 및 AD05164로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제2 RNAi 제제가 AD03498; AD03499; AD03500; AD03501 ; AD03738; AD03739; AD03967; AD03968; AD03969; AD03970; AD03971; AD03972; AD03973; AD03974; AD03975; AD03976; AD03977; AD03978; AD04176; AD04177; AD04178; AD04412; AD04413; AD04414; AD04415; AD04416; AD04417; AD04418; AD04419; AD04420; AD04421; AD04570; AD04571; AD04572; AD04573; AD04574; AD04575; AD04576; AD04577; AD04578; AD04579; AD04580; AD04776; AD04777; AD04778; AD04823; AD04881; AD04882; AD04883; AD04884; AD04885; AD04963; AD04981; AD04982; AD04983; AD05069; AD05070; AD05071; AD05072; AD05073; AD05074; AD05075; AD05076; AD05077; AD05078; AD05147; AD05148; AD05149; 및 AD05165로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이들 각각은 WO2018027106에 기재되어 있고, 이의 개시는 그 전체가 본 명세서에 참조로 통합되는, 치료적 조합물이다.

구현예 15l은 구현예 15k에 있어서, 제1 RNAi 제제가 서열번호 25 내지 서열번호 26의 서열을 갖는 이중체를 포함하는 AD04872이고, 제2 RNAi 제제가 서열번호 27 내지 서열번호 28의 서열을 갖는 이중체를 포함하는 AD05070인, 치료적 조합물이다.

구현예 15m은 구현예 15k에 있어서, 제1 RNAi 제제가 AD04872이고, 제2 RNAi 제제가 AD04982인, 치료적 조합물이다.

구현예 15n은 구현예 15k에 있어서, 제1 RNAi 제제가 AD04872이고, 제2 RNAi 제제가 AD04776인, 치료적 조합물이다.

구현예 15o은 구현예 15k에 있어서, 제1 RNAi 제제가 AD04585이고, 제2 RNAi 제제가 AD04580인, 치료적 조합물이다.

구현예 15p는 구현예 1 내지 구현예 15o 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi 제제가 지질 조성물, 바람직하게 지질 나노입자에서 제형화되는, 치료적 조합물이다.

구현예 15p는 구현예 1 내지 구현예 15o 중 어느 한 구현예에 있어서, RNAi 제제가 표적화 리간드에 접합되는, 치료적 조합물이다.

구현예 15q는 구현예 15p에 있어서, 표적화 리간드가 N-아세틸-갈락토사민을 포함하는, 치료적 조합물이다.

구현예 15r은 구현예 15p에 있어서, 표적화 리간드가 표 10에 도시된 (NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), 또는 (NAG39)이고, 이들 각각이 WO2018027106에 보다 상세히 기재되어 있고, 이의 개시는 그 전체가 본 명세서에 참조로 통합되는, 치료적 조합물이다.

구현예 15s는 구현예 15p에 있어서, 표적화 리간드가 (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), 또는 (NAG39)s, 보다 바람직하게 (NAG37) 또는 (NAG37)s인, 치료적 조합물이다.

구현예 15t는 구현예 15p 내지 구현예 15s 중 어느 한 구현예에 있어서, 표적화 리간드가 RNAi 제제의 센스 가닥에 접합되는, 치료적 조합물이다.

구현예 16은 구현예 1 내지 구현예 15t 중 어느 한 구현예의 치료적 조합물, 및 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 치료하는 데 치료적 조합물을 사용하기 위한 지침서를 포함하는, 키트이다.

구현예 17은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 구현예 15t 중 어느 한 구현예의 치료적 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법이다.

구현예 17a는 구현예 17에 있어서, 치료가 B형 간염 바이러스에 대한 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에서 B형 간염 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하고, 바람직하게 대상체가 만성 HBV 감염을 갖는, 방법이다.

구현예 17b는 구현예 17 또는 구현예 17a에 있어서, 대상체가 만성 HBV 감염을 갖는, 방법이다.

구현예 17c는 구현예 17 내지 구현예 17b 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체가 진행성 섬유증, 간경변, 및 간세포 암종(HCC)으로 이루어진 군으로부터 선택된 HBV-유도 질환의 치료를 필요로 하는, 방법이다.

구현예 18은 구현예 17 내지 구현예 17c 중 어느 한 구현예에 있어서, 치료적 조합물이 경피 주사, 예를 들어, 근육내 또는 피내 주사, 바람직하게 근육내 주사에 의해 투여되는, 방법이다.

구현예 19는 구현예 18에 있어서, 치료적 조합물이 제1 및 제2 비-천연 핵산 분자 중 적어도 하나를 포함하는, 방법이다.

구현예 19a는 구현예 19에 있어서, 치료적 조합물이 제1 및 제2 비-천연 핵산 분자를 포함하는, 방법이다.

구현예 20은 구현예 19 또는 구현예 19a에 있어서, 비-천연 핵산 분자가 전기천공법과 조합하여 근육내 주사에 의해 대상체에게 투여되는, 방법이다.

구현예 21은 구현예 19 또는 구현예 19a에 있어서, 비-천연 핵산 분자가 지질 조성물에 의해, 바람직하게 지질 나노입자에 의해 대상체에게 투여되는, 방법이다.

실시예

상기 기술된 구현예는 이의 광범위한 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고 수정될 수 있다는 것이 당업자에게 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 구체적 구현예로 제한되지 않고, 본 설명에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위 내에서 변형을 포괄하도록 의도된 것으로 이해된다.

실시예 1. HBV 코어 플라스미드 & HBV pol 플라스미드

pDK-pol 및 pDK-코어 벡터의 개략적 표현은 도 1a 및 도 1b에 각각 나타나 있다. CMV 프로모터(서열번호 18), 스플라이싱 인핸서(삼중 복합 서열)(서열번호 10), 시스타틴 S 전구체 신호 펩티드 SPCS(NP_0018901.1)(서열번호 9), 및 pol(서열번호 5) 또는 코어(서열번호 2) 유전자를 함유하는 HBV 코어 또는 pol 항원 최적화 발현 카세트를 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 pDK 플라스미드 골격에 도입하였다.

코어 및 pol 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 코어 및 pol 항원 발현에 대하여 플라스미드를 시험관내에서 시험하였고, 이는 세포 및 분비 코어 및 pol 항원에 대한 지속적인 발현 프로파일을 제공한 것으로 나타났다(데이터 미도시).

실시예 2. 절두된 HBV 코어 항원의 HBV Pol 항원과의 융합을 발현하는 아데노바이러스 벡터의 생성

아데노바이러스 벡터의 형성은 단일 개방형 해독틀로부터 발현된 융합 단백질로서 설계되었다. 예를 들어, 두 개의 별개의 발현 카세트를 사용하는, 또는 2 개 서열을 분리하기 위한 2A-유사 서열을 사용하는, 2 개 단백질의 발현을 위한 추가적인 구성 역시 상정될 수 있다.

아데노바이러스 벡터를 위한 발현 카세트의 설계

발현 카세트(도 2a 및 도 2b에 도시됨)는 CMV 프로모터(서열번호 19), 인트론(서열번호 12)(ApoAI 제2 인트론을 함유하는 인간 ApoAI 유전자(GenBank 수탁 X01038 염기쌍 295 - 523) 유래의 단편), 뒤이어 인간 면역글로불린 분비 신호 코딩 서열(서열번호 14)을 앞세운 최적화된 코딩 서열 - 코어 단독 또는 코어 및 폴리머라제 융합 단백질, 및 뒤이어 SV40 폴리아데닐화 신호(서열번호 13)를 포함하였다.

유발된 T-세포 반응에 영향 없이 분비된 전이유전자를 함유하는 몇몇 아데노바이러스 벡터의 제조능력 향상을 보이는 과거 경험 때문에 분비 신호가 포함되었다(마우스 실험).

코어 단백질의 마지막 2 개의 잔기(VV) 및 폴리머라제 단백질의 처음 2 개 잔기(MP)가 융합된 경우 측접한 상동성과 함께 인간 도파민 수용체 단백질(D3 이소폼) 상에 존재하는 접합부 서열(VVMP)을 생성시켰다.

코어 및 폴리머라제 서열 사이의 AGAG 링커의 개입은 이러한 상동성을 제거하며 인간 프로테옴의 Blast에서 더 이상의 히트(hit)를 내지 않았다.

실시예 3: 마우스에서의 DNA 백신의 생체내 면역원성 연구

HBV 코어 항원 또는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 DNA 플라스미드를 포함하는 면역치료적 DNA 백신을 마우스 내에서 시험하였다. 본 연구의 목적은 BALB/c 마우스 내로 전기천공법을 통한 근육내 전달 후 백신에 의해 유도된 T-세포 반응을 검출하기 위해 설계되었다. 초기 면역원성 연구는 주입된 HBV 항원에 의하여 유발될 세포 면역 반응을 판별하는 것에 중점을 두었다.

구체적으로, 시험된 플라스미드는 각각 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같은, 그리고 상기 실시예 1에 기술된 바와 같은 pDK-Pol 플라스미드 및 pDK-코어 플라스미드를 포함하였다. pDK-Pol 플라스미드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리머라제 항원을 인코딩하였고, pDK-코어 플라스미드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 코어 항원을 인코딩하였다. 먼저, 각각의 플라스미드에 의해 유도된 T-세포 반응을 개별적으로 시험하였다. DNA 플라스미드(pDNA) 백신을 상업적으로 입수 가능한 마우스 모델에 적용을 위해 개조된 TriGrid^TM 전달 시스템-근육내(TDS-IM)를 사용하여 앞정강근(cranialis tibialis)에 전기천공법을 통해 Balb/c 마우스에 근육내 전달하였다. 전기천공법에 의해 마우스에 DNA를 근육내 전달하기 위한 방법 및 장치에 관한 추가 설명에 대하여, 개시의 전체가 본 명세서에 참조로 통합되는, 국제 특허 출원 공개 WO2017172838 및 명칭이 "Method and Apparatus for the Delivery of Hepatitis B Virus (HBV) Vaccines"인 2017년 12월 19일에 출원된 미국 특허 출원 제62/607,430호를 참조한다. 구체적으로, 전극간 간격 2.5 mm 및 전극 직경 0.030 인치의 전극 어레이를 갖는 TDS-IM v1.0 장치의 TDS-IM 어레이가 전도성 길이 3.2 mm 및 유효 침투 깊이 3.2 mm로, 전극의 다이아몬드 형상의 주축이 근섬유와 평행한 배향으로 선택된 근육 내로 경피 삽입하였다. 전극 삽입 후, 주사를 개시하여 근육 내로 DNA를 분배(예를 들어, 0.020 ml)하였다. IM 주사 완료 후, 250 V/cm 전기장(인가 전압 59.4 V 내지 65.6 V, 인가 전류 제한 4 A 미만, 0.16 A/sec)을 10% 듀티 사이클에서 총 지속 시간 약 400 ms(즉, 전압은 총 약 400 ms 지속시간의 약 40 ms로 능동적으로 인가됨) 동안 총 6 회 펄스로 국소적으로 인가하였다. 전기천공법 절차가 완료되면, TriGridTM 어레이를 제거하고 동물을 회수하였다. BALB/c 마우스에 대한 고용량(20 μg) 투여를 표 1에 요약된 바와 같이 수행하였다. 6 마리의 마우스에 HBV 코어 항원을 인코딩하는 플라스미드 DNA를 투여하고(pDK-코어; 그룹 1), 6 마리의 마우스에 HBV pol 항원을 인코딩하는 플라스미드 DNA를 투여하고(pDK-pol; 그룹 2), 2 마리의 마우스에 음성 대존군으로서 빈(empty) 벡터를 수용하였다. 동물들은 2 주 간격으로 2 회 DNA 면역화를 수용하였고, 마지막 면역화 후 1 주에 비장세포를 수집하였다.

표 1: 파일럿 연구의 마우스 면역화 실험 설계

항원-특이적 반응을 IFN-γ 효소-결합 면역점(ELISPOT)에 의해 분석 및 정량화하였다. 이 검정에서, 면역화된 동물의 단리된 비장세포를 코어 단백질, Pol 단백질, 또는 리더 및 접합부 서열 작은 펩티드(각 펩티드 2 μg/ml)를 포함하는 펩티드 풀과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 이들 풀은 코어 및 Pol 백신 벡터의 유전자형 BCD 컨센서스 서열과 매칭하는 11 개 잔기가 중첩하는 15 량체 펩티드로 이루어졌다. 큰 94 kDa HBV Pol 단백질은 중간이 나뉘어 2 개 펩티드 풀이 된다. 항원-특이적 T 세포를 동종성 펩티드 풀로 자극하고 IFN-γ양성 T 세포를 ELISPOT 검정을 사용하여 평가하였다. 단일 항원-특이적 T 세포에 의한 IFN-γ 방출을 적절한 항체 및 후속적 발색 검출에 의하여 반점-형성 세포(spot-forming cell, SFC)라 지칭되는 마이크로플레이트 상의 착색된 점으로서 시각화하였다.

DNA 백신 플라스미드 pDK-코어로 면역화된 마우스(그룹　1)에서 10⁶ 개 세포 당 1,000 개 SFC에 도달하는 HBV 코어에 대한 실질적인 T-세포 반응이 달성되었다(도 3). Pol 1 펩티드 풀에 대한 Pol T-세포 반응은 강력했다(10⁶ 개 세포 당 약 1,000 개 SFC). 약한 Pol-2-지시 항-Pol 세포 반응은 마우스에서의 제한된 MHC 다양성, 하나의 항원으로부터 상이한 에피토프의 불균등 인지로 정의되는 T-세포 면역우세라 불리는 현상에 기인한 것으로 예상되었다. 이 연구에서 얻어진 결과를 확인하는 보강 연구를 수행하였다(데이터 미도시).

상기 결과는 HBV 항원을 인코딩하는 DNA 플라스미드 백신으로의 백신접종이 마우스에서 투여된 HBV 항원에 대한 세포 면역 반응을 유도한다는 것을 입증해 준다. 비-인간 영장류로 또한 유사한 결과가 얻어졌다(데이터 미도시).

실시예 4. 마우스에서 HBV siRNA와 조합한 DNA 백신의 생체내 면역원성 연구

C57BL/6 수컷 마우스(6 주령 내지 8 주령; Janvier, 프랑스)를 1xPBS에 희석된 1x10¹¹vg AAV-HBV(FivePlus MMI, 중국)으로 꼬리 정맥 주사를 통해 감염시켰다. 치료 시작 전 28 일 동안 감염이 수립되게 하였다. 마우스(n=8/그룹)를 이후 6 개의 개별 그룹으로 배치하여 단독의 siRNA 또는 단독의 치료용 백신(Tx Vx), 또는 조합(표 2)으로 조사하였다. TxVx는 상기 실시예 1의 pDK-Pol 플라스미드와 pDK-코어 플라스미드의 1:1 혼합물이다(또한 각각 도 1a 및 도 1b 참조). siRNA는 WO 2018 027106(예를 들어, WO 2018 027106의 청구항 제54항)에 기재된 바와 같고, 더욱 구체적으로 WO 2018 027106에 기재된 바와 같은 두 개의 RNAi 제제의 혼합 AD04872+AD5070, AD04872+AD04982, AD04872+AD04776, 또는 AD04585+AD04580이다. siRNA와 Tx Vx 둘 다에 대한 용량 및 투여 시기는 표 2에 주어져 있다. 치료 첫날을 D0으로 지정하고, 28 일의 감염 확립 기간 후였다.

표 2: 각각의 연구 그룹에 대한 치료 요법의 개요

Tx Vx를 표 2에 지정된 농도로 1xPBS에 희석하고, 경골근(Ichor, USA)에 전기천공법을 통해 투여하였다. siRNA를 1xPBS에 10 mpk의 농도로 목 뒤에 피하 주사를 통해 전달하였다. 그룹 4 및 그룹 6의 siRNA와 Tx Vx 조합을 함께 투여하거나(그룹 4), siRNA를 제1 Tx Vx 용량 3 주 전(그룹 6) 또는 마지막 siRNA 처리 3 주 후(그룹 7)에 시차를 두어 투여하였다. 모든 종점은 그룹 1 내지 그룹 4의 경우 42 일째, 그룹 5 및 그룹 6의 경우 63 일째, 그리고 그룹 7 및 그룹 8의 경우 84 일째에 해당하는 마지막 약물 투여 후 3 주였다.

혈청 중 바이러스 매개변수(HBeAg, HBsAg 및 HBV DNA) 및 간 ALT를 측정하기 위해 매주 혈액 샘플을 채취하였다. 비장을 종점에서 취하고, 면역원성을 Tx Vx 코어와 pol 서열 둘 다를 포함하는 HBV 펩티드 풀로 생체외 자극 후 IFNγ ELISPOT에 의해 모든 그룹에서 평가하였다. 모든 종점은 마지막 치료 용량 후 3 주였다.

본 명세서에 기술된 실시예 및 구현예는 오로지 예시적 목적을 위한 것이며 이의 전반적인 발명적 개념에서 벗어남 없이 상술된 구현예들에 변화가 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명은 개시된 구체적 구현예로 제한되지 않으며, 첨부된 청구항에 규정된 바에 따른 발명의 사상 및 범위 내에서의 변형을 포함하고자 의도된 것으로 이해된다.

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Sciences Ireland Unlimited Company <120> Combination of Hepatitis B Virus (HBV) Vaccines and HBV-targeting RNAi <130> 065814.11196/12WO1 <150> US62/862,754 <151> 2019-06-18 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 444 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV truncated core antigen gene <400> 1 gacatcgacc cttacaagga gttcggcgcc agcgtggaac tgctgtcttt tctgcccagt 60 gatttctttc cttccattcg agacctgctg gataccgcct ctgctctgta tcgggaagcc 120 ctggagagcc cagaacactg ctccccacac cataccgctc tgcgacaggc aatcctgtgc 180 tggggggagc tgatgaacct ggccacatgg gtgggatcga atctggagga ccccgcttca 240 cgggaactgg tggtcagcta cgtgaacgtc aatatgggcc tgaaaatccg ccagctgctg 300 tggttccata ttagctgcct gacttttgga cgagagaccg tgctggaata cctggtgtcc 360 ttcggcgtct ggattcgcac tccccctgct tatcgaccac ccaacgcacc aattctgtcc 420 accctgcccg agaccacagt ggtc 444 <210> 2 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV truncated core antigen <400> 2 Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe 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cctggccaca tgggtgggat ccaatctgga ggaccccgct 240 tcacgggaac tggtggtcag ctacgtgaac gtcaatatgg gcctgaaaat ccgccagctg 300 ctgtggttcc atattagctg cctgactttt ggacgagaga ccgtgctgga atacctggtg 360 tccttcggcg tctggatccg cactccccct gcttatcgac cacccaacgc accaattctg 420 tccaccctgc ccgagaccac agtggtc 447 <210> 4 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV truncated core antigen <400> 4 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala 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gacggcagca gggaaggtct 720 ggcagtatcc gggctagagt gcatcccaca actagaaggc ctttcggcgt cgagccatca 780 ggaagcggcc acaccacaaa caccgcatca agctcctcta gttgcctgca tcagtcagcc 840 gtgagaaagg ccgcttacag ccacctgtcc acatctaaaa ggcactcaag ctccgggcat 900 gctgtggagc tgcacaacat ccctccaaat tctgcacgca gtcagtcaga aggacccgtg 960 ttcagctgct ggtggctgca gtttcggaac tcaaagcctt gcagcgacta ttgtctgagc 1020 catattgtga atctgctgga ggattggggc ccttgtaccg agcacgggga acaccatatc 1080 aggattccac gaacaccagc acgagtgact ggaggggtgt tcctggtgga caagaacccc 1140 cacaatacta ccgagagccg gctggtggtc gatttcagtc agttttcaag aggcaacaca 1200 agggtgtcat ggcccaaatt cgccgtccct aatctgcaga gtctgactaa cctgctgtct 1260 agtaatctga gctggctgtc cctggacgtg tccgcagcct tttaccacct gcctctgcat 1320 ccagctgcaa tgccccatct gctggtgggg tcaagcggac tgagtcgcta cgtcgcccga 1380 ctgtcctcta actcacgcat cattaatcac cagcatggca ccatgcagaa cctgcacgat 1440 agctgttccc ggaatctgta cgtgtctctg ctgctgctgt ataagacatt cggcagaaaa 1500 ctgcacctgt acagccatcc tatcattctg gggtttagga agatcccaat 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gtaccgacct 2400 ctgctgagac tgcccttcag gcctacaact ggccggacat ctctgtatgc cgattcacca 2460 agcgtgccct cacacctgcc tgacagagtc cactttgctt cacccctgca cgtcgcttgg 2520 cggcctcca 2529 <210> 6 <211> 2529 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV pol antigen gene <400> 6 atgcccctgt cttaccagca ctttagaaag ctgctgctgc tggacgatga agccgggcct 60 ctggaggaag agctgccaag gctggcagac gaggggctga accggagagt ggccgaagat 120 ctgaatctgg gaaacctgaa cgtgagcatc ccttggactc ataaagtcgg caacttcacc 180 gggctgtaca gctccacagt gcctgtcttc aatccagagt ggcagacacc atcctttccc 240 aacattcacc tgcaggagga catcattaat agatgcgaac agttcgtggg acctctgaca 300 gtcaacgaaa agaggcgcct gaaactgatc atgcctgcca ggttttaccc aaatgtgact 360 aagtatctgc cactggataa gggcatcaag ccttactatc cagagcacct ggtgaaccat 420 tacttccaga ctagacacta tctgcatacc ctgtggaagg ccggaatcct gtacaaacga 480 gaaactaccc ggagtgcttc attttgtggc tccccatatt cttgggaaca ggagctgcag 540 catggcaggc tggtgttcca gaccagcaca cgccacgggg atgagtcctt ttgccagcag 600 tctagtggca tcctgagcag atcccccgtg 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ataagacatt cggcagaaaa 1500 ctgcacctgt acagccatcc tatcattctg gggtttagga agatcccaat gggagtggga 1560 ctgagcccct tcctgctggc acagtttacc tccgccattt gctctgtggt ccgccgagcc 1620 ttcccacact gtctggcttt ttcctatatg aacaatgtgg tcctgggcgc caaatccgtg 1680 cagcatctgg agtctctgtt cacagctgtc actaactttc tgctgagcct ggggatccac 1740 ctgaacccaa ataagactaa acgctggggg tacagcctga atttcatggg atatgtgatt 1800 ggatcctggg ggaccctgcc acaggagcac atcgtgcaga agatcaagga atgctttcgg 1860 aagctgcccg tcaacagacc tatcgactgg aaagtgtgcc agcggattgt cggactgctg 1920 ggcttcgccg ctccctttac ccagtgcggg tacccagcac tgatgcccct gtatgcctgt 1980 atccagtcta agcaggcttt cacctttagt cctacataca aggcattcct gtgcaaacag 2040 tacctgaacc tgtatccagt ggcaaggcag cgacctggac tgtgccaggt ctttgcaaat 2100 gccactccta ccggctgggg gctggctatc ggacatcagc gaatgcgggg cacattcgtg 2160 gcccccctgc ctattcacac tgctcagctg ctggcagcct gctttgctag atctaggagt 2220 ggagcaaagc tgatcggcac cgacaatagt gtggtcctgt caagaaaata cacatccttc 2280 ccatggctgc tgggatgtgc tgcaaactgg attctgaggg gcaccagctt cgtgtacgtc 2340 ccctcagccc tgaatcctgc tgacgatcca tcccgcgggc gactgggact gtaccgacct 2400 ctgctgagac tgcccttcag gcctacaact ggccggacat ctctgtatgc cgattcacca 2460 agcgtgccct cacacctgcc tgacagagtc cactttgctt cacccctgca cgtcgcttgg 2520 cggcctcca 2529 <210> 7 <211> 843 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV pol antigen <400> 7 Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp 1 5 10 15 Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly 20 25 30 Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val 35 40 45 Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro Glu Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro 65 70 75 80 Asn Ile His Leu Gln Glu Asp Ile Ile Asn Arg Cys Glu Gln Phe Val 85 90 95 Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro 100 105 110 Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly 115 120 125 Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His Tyr Phe Gln 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ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag 420 cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt 480 tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa 540 atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagc 584 <210> 19 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV promoter sequence <400> 19 accgccatgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 60 agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 120 ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 180 gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 240 ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 300 atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 360 catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 420 gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 480 gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 540 attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt 600 agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca 660 ccgggaccga tccagcctcc gcgg 684 <210> 20 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bGH polyA signal <400> 20 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180 gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225 <210> 21 <211> 671 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC ORI <400> 21 cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 60 ttgcaaacaa aaaaaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 180 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660 tttgctcaca t 671 <210> 22 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kanr <400> 22 atgattgagc aagatggtct tcacgctggc tcgccagctg cgtgggtgga acgcctgttt 60 ggttatgatt gggcgcagca gactattgga tgttccgacg cggctgtatt tcggctgtct 120 gctcagggtc gccccgtgct gtttgtgaag acggatttgt ctggcgcatt aaatgagtta 180 caggacgagg cggctcgtct gagttggttg gccaccaccg gcgtgccctg cgccgcagtg 240 ctggatgtcg tgacagaagc aggccgcgat tggctccttc tcggcgaagt gccgggccag 300 gacctgctca gcagccactt ggcaccggca gaaaaagttt ctatcatggc cgacgccatg 360 cgtcgtcttc acactctcga tccggccacg tgcccctttg accaccaggc caagcatcgt 420 attgaacgtg cgcgtactcg gatggaagca ggtttagtag accaggacga tttggatgag 480 gaacatcaag gcctggcccc ggctgaactg tttgcgcgct taaaagcgtc gatgccagat 540 ggcgaagatt tggtagtcac ccatggagat gcgtgtttgc caaacatcat ggttgaaaat 600 ggccgcttct caggctttat tgactgtggg cgcctgggtg ttgccgaccg ctatcaagat 660 attgcgctcg caactcgtga catcgctgaa gagctgggcg gagaatgggc tgaccgtttc 720 ctggtactgt atggcattgc agcgcccgat tcccaacgca tcgcatttta tcgtctgctg 780 gatgagtttt tctaa 795 <210> 23 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized Kanr <400> 23 Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val 1 5 10 15 Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser 20 25 30 Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe 35 40 45 Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala 50 55 60 Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val 65 70 75 80 Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu 85 90 95 Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys 100 105 110 Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro 115 120 125 Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu 145 150 155 160 Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala 165 170 175 Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys 180 185 190 Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp 195 200 205 Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala 210 215 220 Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe 225 230 235 240 Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe 245 250 255 Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe 260 <210> 24 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bla promoter <400> 24 acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 60 ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagt 99 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> HBV RNAi Agent antisense strand modified sequence <400> 25 agaaaauuga gagaagucca c 21 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> HBV RNAi Agent sense strand modified sequence <400> 26 guggacuucu cucaauuuuc u 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> HBV RNAi Agent antisense strand modified sequence <400> 27 uaccaauuua ugccuacagc g 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> HBV RNAi Agent sense strand modified sequence <400> 28 cgcuguaggc auaaauuggu a 21

Claims

B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV) 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 치료적 조합물로서,
i) a) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원, 및
b) 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자,
c) 서열번호 7과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 HBV 폴리머라제 항원으로서, 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 갖지 않는, HBV 폴리머라제 항원, 및
d) HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자
중 적어도 하나; 및
ii) HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제, 바람직하게
1) 표 2에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제;
2) 표 3에 나타나 있는 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제;
3) 표 4에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제, 바람직하게 표 4에 나타나 있는 변형된 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi;
4) 표 5에 나타나 있는 표적 서열을 표적화하는 RNAi 제제;
5) 표 6에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제;
6) 표 7에 나타나 있는 코어 안티센스 서열 및 표 8에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제, 바람직하게 표 7에 나타나 있는 변형된 센스 가닥 서열 및 표 8에 나타나 있는 변형된 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi; 및
7) 표 9에 나타나 있는 안티센스 가닥과 센스 가닥의 이중체를 갖는 RNAi 제제, 바람직하게 표 9에 나타나 있는 이중체를 포함하는 RNAi 제제
로 이루어진 군으로부터 선택된 RNAi 제제를 포함하는, 치료적 조합물.
제1항에 있어서, HBV 폴리머라제 항원 및 절두된 HBV 코어 항원 중 적어도 하나를 포함하는, 치료적 조합물.
제2항에 있어서, HBV 폴리머라제 항원 및 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는, 치료적 조합물.
제1항에 있어서, 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자, 및 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자 중 적어도 하나를 포함하는, 치료적 조합물.
B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 치료하는 데 사용하기 위한 치료적 조합물로서,
i) 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자; 및
ii) 서열번호 7과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자로서, HBV 폴리머라제 항원이 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 갖지 않는, 제2 비-천연 핵산 분자; 및
iii) HBV 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제로서, RNAi 제제가
1) 표 2에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제;
2) 표 3에 나타나 있는 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제;
3) 표 4에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제, 바람직하게 표 4에 나타나 있는 변형된 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi;
4) 표 5에 나타나 있는 표적 서열을 표적화하는 RNAi 제제;
5) 표 6에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제;
6) 표 7에 나타나 있는 코어 안티센스 서열 및 표 8에 나타나 있는 코어 센스 가닥 서열을 갖는 RNAi 제제, 바람직하게 표 7에 나타나 있는 변형된 센스 가닥 서열 및 표 8에 나타나 있는 변형된 안티센스 가닥 서열을 갖는 RNAi; 및
7) 표 9에 나타나 있는 안티센스 가닥과 센스 가닥의 이중체를 갖는 RNAi 제제, 바람직하게 표 9에 나타나 있는 이중체를 포함하는 RNAi 제제, 보다 바람직하게 표적화 리간드에 접합되는 RNAi 제제
로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNAi 제제를 포함하는, 치료적 조합물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 제1 비-천연 핵산 분자가 절두된 HBV 코어 항원의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 제2 비-천연 핵산 분자가 HBV 폴리머라제 항원의 N-말단에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게 신호 서열이 독립적으로 서열번호 9 또는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 신호 서열이 독립적으로 서열번호 8 또는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 치료적 조합물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 절두된 HBV 코어 항원이 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지고;
b) HBV 폴리머라제 항원이 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 치료적 조합물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 제1 및 제2 비-천연 핵산 분자가 DNA 분자이고, 바람직하게 DNA 분자가 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 존재하는, 치료적 조합물.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 비-천연 핵산 분자에 제1 비-천연 핵산 분자 및 제2 비-천연 핵산 분자를 포함하는, 치료적 조합물.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개의 상이한 비-천연 핵산 분자에 제1 비-천연 핵산 분자 및 제2 비-천연 핵산 분자를 포함하는, 치료적 조합물.
제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 1 또는 서열번호 3에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 치료적 조합물.
제11항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 1 또는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 치료적 조합물.
제4항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 5 또는 서열번호 6에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 치료적 조합물.
제13항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호 5 또는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 치료적 조합물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, RNAi 제제가 표 9에 나타나 있는 AD04580; AD04585; AD04776; AD04872; AD04962; AD04963; AD04982; 또는 AD05070의 이중체 구조를 갖고, 바람직하게 RNAi 제제가 표 10에 도시된 표적화 리간드(NAG13), (NAG13)s, (NAG18), (NAG18)s, (NAG24), (NAG24)s, (NAG25), (NAG25)s, (NAG26), (NAG26)s, (NAG27), (NAG27)s, (NAG28), (NAG28)s, (NAG29), (NAG29)s, (NAG30), (NAG30)s, (NAG31), (NAG31)s, (NAG32), (NAG32)s, (NAG33), (NAG33)s, (NAG34), (NAG34)s, (NAG35), (NAG35)s, (NAG36), (NAG36)s, (NAG37), (NAG37)s, (NAG38), (NAG38)s, (NAG39), 또는 (NAG39)에 접합되는, 치료적 조합물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 치료적 조합물, 및 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 치료하는 데 치료적 조합물을 사용하기 위한 지침서를 포함하는, 키트.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 치료하는 데 사용하기 위한, 치료적 조합물.