KR102213402B1 - 중동호흡기증후군 코로나바이러스 예방 및 치료용 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MERS-CoV 감염을 예방하기 위한 항원의 제조 방법 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 n-Coronavirus spike 단백질 또는 S1 부위와 사람 Fc(fragment of crystalline) 부위를 결합시킨 단백질로서, 이를 포함하는 백신 조성물과 백신 조성물을 이용한 면역 반응 유도 및 바이러스 감염 예방에 관한 것이다.

Description

중동호흡기증후군 코로나바이러스 예방 및 치료용 백신 조성물{VACCINE COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF MIDDLE EAST RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS}

본 발명은 MERS-CoV 감염을 예방하기 위한 항원의 제조 방법 및 이를 이용한 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 n-Coronavirus spike 단백질 또는 S1 부위와 사람 Fc(fragment of crystalline) 부위를 결합시킨 단백질로서, 이를 포함하는 백신 조성물과 백신 조성물을 이용한 면역 반응 유도 및 바이러스 감염 예방에 관한 것이다.

중동호흡기증후군은 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV) 감염에 의해 발병되는 감염병으로 2012년 사우디아라비아에서 처음 발견된 뒤 중동 지역에서 집중적으로 발생하고 있는 중증 급성 호흡기 질환이다. 중동호흡기증후군(Middle East Respiratory Syndrome)은 박쥐에서 유래한 베타코로나바이러스 중 유전적 변이를 통해 낙타로 감염이 가능해졌고 감염된 낙타를 통해 사람에게 감염되었으며 사람과 사람간 감염이 가능해진 바이러스 질병이다. MERS-CoV 감염으로 인한 치사율은 35 %(WHO 통계 27 %)를 넘을 정도로 매우 치명적이며 주요한 증상으로는 발열, 기침, 가래, 숨가뿜, 근육통, 설사 복통 등 다양한 증상을 동반하며 감염자의 72 %가 인공호흡을 필요로 했다. 평균 잠복기는 5.5일이며 1.9일에서 14.7일간의 잠복기가 전체 감염자의 95 % 이상이었다. 대부분의 사망원인은 급성호흡혼란증후군으로 이어지는 폐렴이 주원인이며 신장부전, 파종성혈관응고, 식막염 증상이 보고된 경우도 있다. 2015년 5월 대한민국에서 20일 첫 감염자가 발생한 이후 같은 해 7월 16일까지 186명이 MERS-CoV에 감염되었으며 이 중 38명이 사망하였다. 최근에도 중동의 사우디아라비아를 중심으로 매년 5만명 정도의 감염자가 발생하고 있으며 200명이 사망하는 것으로 보고되었다. 2012년 처음 분리된 MERS-CoV의 게놈(Genome)을 분석한 결과 SARS-CoV(Severe acute respiratory syndrome coronavirus)와 같은 속(Family)에 속하는 베타코로나바이러스로 30 kb 에 크기의 RNA 게놈(Genome)을 가지고 있어 RNA 바이러스 중 가장 큰 RNA 게놈(genome)을 가진 것으로 밝혀졌다. MERS-CoV의 게놈(Genome)은 10개의 ORF(Often Reading Frame)으로 구성되어 있으며 전체 게놈의 2/3가 ORF1ab로 16개의 비구조단백질(NSP, Non Structural Protein)의 유전자이다. 나머지 3'말단의 유전자는 4개의 구조 단백질 유전자를 가지고 있는데 Spike(S), envelope(E), Matrix(M) 그리고 nucleocapsid(N) 단백질 유전자이다. 이외에도 5개의 보조 단백질 유전자(accessory protein)를 가지고 있다(ORF3, ORF4b, ORF5, ORF8b). 보조 단백질은 MERS-CoV의 게놈 복제나 바이러스 packaging 에 역할을 하기보다는 바이러스 감염과 면역반응에 관련이 있는 것으로 추축 된다. 보조 단백질은 주로 host cell의 면역 기전에 관여하는 NF-κB의 발현을 증가시켜 B세포 활성화에 관련된 것으로 알려져 있다.

MERS-CoV의 spike protein 은 SARS-CoV, Infectious bronchitis coronavirus(IBV), Porcine Epidemic Diarrhea virus(PEDV) 등과 같이 envelope 표면에 각 바이러스의 세포 침입에 필요한 spike protein을 가지고 있다. spike protein은 host cell receptor 와 결합하는 S1 도메인, cell membrane 과 결합하는 S2 도메인으로 구성되며 바이러스가 세포내 감염이 일어나는 동안 S1 과 S2 domain 사이에 furin cleavage site 가 잘리면서 두개의 도메인으로 분리된다. SARS-CoV의 경우 spike protein은 숙주세포 표면에 발현되어 있는 ACE2(Angiotensin converting enzyme 2)와 결합하여 세포내 감염이 일어나고 MERS-CoV의 경우 spike protein은 DPP4(Dipeptidyl Peptidase 4)에 결합하여 세포내 감염이 일어난다. 코로나바이러스의 S1 단백질의 두개의 주요한 도메인 S1, N-terminal domain (S1-NTD) 와 C-terminal domain (S1-CTD), 은 세포의 receptor) 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 S1-NTD 도메인은 주로 세포 표면의 당분자 결합에 필요하며 S1-CTD 도메인은 ACE2, APN, DPP4 결합에 관련되어 있다. 따라서 Spike protein의 S1 domain을 이용한 백신은 바이러스의 세포내 감염을 막을 수 있는 virus neutralization(VN) 항체 형성에 매우 유용한 단백질로 이용될 수 있을 것이다.

MERS-CoV에 대한 치료제와 백신은 아직 개발되지 않고 있으나 Spike 단백질의 RBD(Receptor Binding Domain)을 항원으로 하는 백신 개발이 이 이루어지고 있다. 항원 발현 재조합 바이러스나 항원 유전자 또는 항원 전달체로 바이러스 vector를 이용한 백신 개발, DNA 백신 등 다양한 백신 제형이 연구되고 있다. 이 중에 재조합 동물세포를 이용한 Spike 단백질 또는 일부 항원 부위와 면역력을 향상시킬 수 있는 바이로분자를 이용한 단위체(subunit) 백신이 개발되고 있다. 재조합 동물세포를 이용한 단위체 백신 개발은 1980년대부터 항체 의약품 개발 및 단위체 백신 개발을 위한 주요한 단백질 발현 시스템으로 이용되어 왔으며 이미 여러 제품의 상용화를 통해 안전성이 충분히 입증된 단백질 발현 시스템이다. 재조합 단백질을 이용한 단위체 백신의 가장 큰 단점은 면역원성이 약해 adjuvant와 같은 면역 증강 물질을 필요로 한다는 점이다. 따라서 바이러스 감염 억제를 위한 중화항체 형성에 필수적인 항원을 찾아내고 구조적 변화 없이 재조합 단백질로 발현하고 면역증강 물질을 이용하여 안전하고 효능이 우수한 백신항원 제조 기술의 개발이 매우 중요하다.

메르스 질병은 최근 중동지역에 한정되어 발생하고 있으나 다시 전세계에 전파될 가능성이 있는 질병으로 최근 백신 제조 기술의 발전에 따라 다양한 형태의 백신 개발 연구가 이루어지고 있으나 안전성이 가장 중용한 백신의 개발에 있어 안전하고 효능이 우수한 백신 개발 기술이 필요한 시점이다.

한국공개특허 제10-2047072호

본 발명은 중동호흡기증후군 코로나바이러스 spike 단백질 또는 S1 부위와 사람 Fc(fragment of crystalline) 부위를 결합시킨 단백질의 중동호흡기증후군 코로나바이러스에 대한 면역 및 치료 반응을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 신규한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 spike 단백질을 이용한 단위체 백신(subunit vaccine) 개발 기술을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기 서열로 표시되는 MERS-CoV 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 3 또는 4의 염기서열로 표시되는 인간 IgG4의 Fc을 코딩하는 유전자가 융합된 핵산을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 세포주를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포주는 Chinese hamster ovary cell LV-MS1-Fc 세포(KCTC18832P)인 것인 세포주일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포주로부터 생산된 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백신은 바이러스가 약독화된 생독 백신 또는 불활화 백신일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 백신은 면역증강물질 또는 아쥬반트를 추가 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 백신 조성물 개체에 투여하여 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염을 예방하거나 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터를 세포에 형질전환시키는 단계; 상기 세포 또는 이의 배양물로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계; 및 상기 재조합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터 또는 본 발명에 따른 재조합 단백질을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서의 면역반응을 평가하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 동물의 혈청으로부터 IgG 항체가를 측정하여 면역 반응을 평가할 수 있다.

본 발명의 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 스파이크 단백질을 포함하는 MERS LV-MS1-Fc 항원의 이용은 MERS-CoV 감염에 대항할 수 있는 면역반응을 유도하는 예방, 개선을 위한 백신으로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 재조합 발현 벡터를 구조를 예시한다.
도 2는 재조합 발현 단백질의 유전자 모식도를 예시한다.
도 3은 MERS-CoV S 재조합 단백질(LV-MS1-Fc)의 발현을 웨스턴 블랏법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 MERS-CoV S 단백질 특이적 항체 생산 및 ELISA 역가를 도시한다.
도 5는 MERS-CoV에 대한 중화항체가를 도시한다.
도 6은 백신 효능 평가를 위한 마우스 모델을 도시한다.
도 7은 공격 접종 시험 후, 마우스 오른쪽 폐의 바이러스 역가를 나타낸다.
도 8은 공격 접종 시험 후, 마우스 왼쪽 폐의 조직 병리학적 H&E 염색 결과를 나타낸다.
도 9는 체중, 사료 섭취량, 음수량 및 백신 접종 그룹 마우스의 해부 관찰 사진을 도시한다.

이하 본 발명의 해결 수단을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어, spike protein 유전자는 DPP4 결합 능력이 있는 코로나바이러스의 유전자로서 바람직하게는 상기 서열 번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 중동호흡기증후군 코로나 바이러스의 spike protein 유전자로서 2015년 한국형 MERS-CoV 유전자 정보 (GeneBank accession No. KT029139, Middle East respiratory syndrome coronavirus isolate MERS-CoV/KOR/KNIH/002 05 2015)를 바탕으로 확립된 spike protein 유전자이다. 더 바람직하게는 spike protein 유전자 중 RBD(receptor binding domain)을 포함하는 S1-CTD 유전자를 포함하는 유전자이다. 더 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 스파이크 아미노산 잔기 19 ~ 647을 포함하는 유전자이다. 더 바람직하게는 포유류 세포에 코돈 최적화를 진행한 염기서열이다. 또한 Fc(fragment of crystalline) 단백질의 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 인간 Immunoglobulin G의 Fc 부위의 유전자이며 더 바람직하게는 Immunoglobulin G 의 subtype IgG4의 Fc 유전자로서 더 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열 238 ~ 457을 코딩하는 유전자이다. Spike protein 19 ~ 647 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는, 유전자 합성 기기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 중동호흡기증후군 코로나 바이러스 게놈을 주형으로 스파이크 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오티드 프라이머(oligo nucleotide primer)로 사용하여 PCR 방법을 사용 제작할 수 있다. 한편, 발현 시스템에 따른 코돈(codon)-최적화로 인하여 중동호흡기증후군 코로나 바이러스의 스파이크 유전자와 상이함이 있을 수 있어 재조합 스파이크 LV-MS1-Fc 유전자는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 스파이크 아미노산 잔기 19 ~ 647을 포함하는 다양한 염기 서열 형태로 존재할 수 있다.

코돈 최적화과정을 거쳐 합성된 LV-MS1-Fc 유전자는 인간 IgG의 Fc 도메인을 포함하며, 상기 유전자를 최적의 단백질 발현 시스템을 이용하여 단백질 생산을 하기 위해 재조합 단백질 발현 시스템을 이용하였다. 재조합 단백질 발현 시스템은 백신 항원의 면역원성이 유지되면서 생산이 용이하고 인체에 위험 요소가 적은 것이어야 하며 또한 생산 방법의 용이성과 생산단가 등 다양한 요소를 고려하여 선정되어야 한다. 본 발명의 숙주 세포는 DNA 도입율이 높고, 도입된 DNA의 발현율이 높은 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 예를 들어, 대장균, 포유류 세포주, 곤충 세포주, 진균, 효모와 같은 진핵 및 원핵 숙주들을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 재조합 단백질 발현 시스템은 크게 4가지 방법이 주로 많이 사용되고 있다. 포유 동물 세포, 곤충 세포, 효모. 그리고 박테리아 시스템이 사용되고 있다. 각각의 재조합 단백질 발현 시스템은 장점과 단점을 가지고 있으며 단백질의 종류에 따라 최적의 시스템으로 또 크게 고려되어야 할 것은 posttranslational modification에 따라 단백질의 특성에 영향이 있는 경우 발현 시스템을 선정해야 한다. LV-MS1-Fc 항원 단백질 발현 시스템은 구체적으로 E.coli 를 이용할 수 있다. E.coli 발현 시스템은 쉽게 단백질 유전자를 도입 적은 비용으로 대량의 생산이 가능한 시스템이다 다만 바이러스 단백질이 발현 고정 중 misfolding에 의해 구조 변성, 심하게는 불용성 침전물(inclusion body) 가 생성되기도 하는 위험성이 있다. 또한 E.coli 균체에서 유래하는 LPS(Lipopolysaccharide)를 제거하는 공정이 까다로운 문제점이 있다. 두번째 재조합 베귤로바이러스(baculovirus)를 이용하여 곤충 세포인 Sf(Spodoptera frugiperda) 세포주를 이용하여 단백질 항원을 생산할 수도 있다. 바이러스 단백질에 많이 사용되는 방법으로 발현량이 좋은 이점이 있으나 재조합 바이러스 seed 와 세포주를 동시에 GMP 규정에 따라 준비해야 하는 단점이 있다. 발현 시스템 중 가장 많이 사용되고 검증된(or 상업화된 제품) 재조합 단백질 발현 시스템은 재조합 동물세포를 이용한 단백질 발현 시스템이다. 단백질 유전자를 특정한 발현 벡터에 삽입 제작하여 세포에 transfection하여 재조합 세포주를 작성하는 방법이다. 주로 사용되는 세포주는 293, 293T, BHK21, CHO, NS0 그리고 Sp2 세포주 등이 주로 사용된다. 바람직하게는 세포주 중 BHK21, CHO 세포주를 이용하여 재조합 세포주를 제작하는 것이며 더 바람직하게는 CHO 세포주를 이용하여 재조합 세포주를 만드는 것이다.

CHO 세포주에서 발현하기 위해 CMV 프로모터를 가지는 pcDNA3.4 TOPO-TA 발현 벡터에 클로닝하여 MERS 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있다. 최종적으로, 상기 재조합 단백질 LV-S1SheFc 유전자 5'말단에 단백질 합성 후 세포 밖으로 분비되게 하기 위해 다양한 signal peptide 유전자를 도입할 수 있다. 바람직하게는 signal peptide 로 알려져 있는 NP-000468, AAA52897, AAA59018, NP-001691, NP-001890, AAC32752, BR14604, AAS93426, Alfa-galactosidase (mutant m3), CAA03658, Q766C3, ABF74624, 2205370A, AAM54023, BAA06291을 도입할 수 있다. 더 바람직하게는 signal peptide gp64를 도입할 수 있다. Fc 유전자 도입에 있어 Spike protein 유전자와 Fc 유전자 사이에 linker peptide를 삽입할 수 있다. Linker peptide의 종류는 다양한 아미노산 조합에 의해 고안될 수 있으며 본 발명에서는 protein domain 상호간의 구조적 변화를 막기 위해 고안된 linker peptide 를 도입하였다. 바람직하게는 단백질 구조에 영향을 미치지 않을 가능성이 큰 아미노산 서열로 고안된 것이며 cysteine, glycine, proline, alanine 으로 구성된다. 더 바람직하게는 GlyGlyGlyProGLyGlyGly 아미노산 서열로 만들어진 linker를 도입할 수 있다.

전체 발현 vector의 유전자 구조는 도 1과 같다.

재조합 단백질 발현 세포로 형질전환하는 방법은 통상의 형질전환 방법들을 사용할 수 있다. 형질 전환 방법은 전기천공법, 열충격법이 있으며 바람직하게는 열충격법을 사용하여 형질 전환을 한다.

본 발명에 있어서, 재조합 발현 벡터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 재조합 스파이크 유전자를 발현하기 위해 외래 유전자를 도입하고 단백질 합성을 작동 할 수 있는 것을 의미하며, 여기에는 플라스미드 또는 잠재적 게놈 삽입일 수 있다. 특정한 숙주 세포에서 외래 유전자의 발현을 효과적으로 유도하는 다양한 발현 벡터가 상업적으로 이용 가능하며, 본 발명에서는 pOptiVEC™-TOPO® 벡터를 이용하였다. 이러한 발현 벡터의 프로모터 부위에 본 발명의 재조합 스파이크 유전자 LV-MS1-Fc가 작동 가능하도록 연결시켜 재조합 발현 벡터를 확보하였다. 본 벡터로 형질 전환될 수 있는 숙주세포로는 포유류세포인 것이 바람직하며, 포유류 세포인 Chinese Hamster Ovary로부터 유래된 ExpiCHO-S 세포에 pOptiVEC™-TOPO® 벡터를 트랜스펙션시켜 높은 단백질 발현율을 가진 단백을 제공한다. 상기 세포주는 LV-MS1-Fc(수탁번호: KCTC18832P) 이다.

다음은 재조합 세포주 Chinese hamster ovary cell LV-MS1-Fc(이하 재조합 세포주) 배양 방법과 배양 중 생산되는 스파이크 단백질 LV-MS1-Fc(이하 재조합 항원) 발현에 대해 기술하겠다.

또한 본 발명은 상기 세포주에 의해 생산된 중동호흡기증후군 코로나 바이러스의 재조합 스파이크 단백질 LV-MS1-Fc을 제공한다.

상기 재조합 스파이크 단백질 LV-MS1-Fc은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 중동호흡기증후군 코로나 바이러스의 재조합 스파이크 단백질 또는 이와 기능적으로 동등한 물질을 포함한다. 상기 "기능적 동등한 물질"이란 아미노산의 치환, 결손과 부가의 결과로 상기 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70 %이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 또한 인간 IgG4 Fc 단백질은 S1Sh2 항원과 아미노산 linker 를 통해 펩타이드 결합을 통해 연결되어 있으며 통상의 인간 IgG4 Fc 단백질의 아미노산 서열과 80 % 이상 더 바람직하게는 90 % 이상 더욱 바람직하게는 95 % 이상 동일한 서열을 말한다. 최종적으로 IgG4 Fc (GeneBank accession No. AAB59394.1, immunoglobulin gamma-4 heavy chain, partial [Homo sapiens]) 도메인의 99 ~ 326까지의 아미노산 서열을 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 스파이크 단백질 LV-MS1-Fc는 통상의 단백질 분리 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 재조합 스파이크 단백질 LV-MS1-Fc는 이에 제한된 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 침전을 포함하는 다양한 방법에 따라 다른 배양물로부터 분리될 수 있다. 재조합 스파이크 단백질 LV-MS1-Fc는 다양한 염의 분별 용해도에 따라 다른 배양물과 분리 침전될 수 있다. 특정 단백질의 침전은 배양액 분리해 내고자 하는 단백질이 최대로 침전되는 농도 또는 다른 단백질이 침전되고 분리해 내고자 하는 단백질이 최대로 용해되어 있는 조건을 만들기 위해 가장 최적의 화학물질과 사용되는 화학물질의 최적 농도에 따라 결정된다. 사용되는 화학물의 종류는 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 등전하 침전(Isoelectric precipitation)을 위한 산, 염기 첨가, 에탄올, polyethylene glycol, 다가 전하 이온 등이 사용될 수 있으며, 예를 들어 암모늄 설페이트를 사용할 수 있다.

재조합 세포주 배양액을 harvest 한 후 원심분리하여 clarification을 진행한다. Clarification은 원심분리나 Micro filtration 방법을 사용할 수 있다. 원심분리 조건은 10,000g, 10 분, 4 ℃ 조건에서 실행하여 supernatant를 다음 정제 과정에 사용할 수 있다. Micro filtration의 경우 filter의 pore size는 1.0 ㎛ 에서 0.2 ㎛ 사이의 filter를 사용할 수 있으며 바람직하게는 0.2 ㎛ pore size filter를 사용할 수 있다. filtration 방법은 dead end filtration 이나 cross flow filtration 방법을 사용할 수 있으며 두 방법 모두 적용 가능하다. 원심분리 supernatant 또는 여과액(permeate)는 침전법을 통하여 다른 단백질 등과 분리할 수 있다. 사용되는 암모늄 설페이트 농도는 30 ~ 90 % 일 수 있으며 바람직하게는 40 ~ 80 %, 더 바람직하게는 50 ~ 70 % 일 수 있다 가장 바람직하게는 70 % 일 수 있다. 암모늄 설페이트 침전은 상등액과 침전물이 충분히 분리될 때까지 1시간에서 8시간, 바람직하게는 2시간에서 7시간, 더 바람직하게는 3시간에서 6시간, 더 바람직하게는 4시간에서 5시간 동안 4℃에서 방치할 수 있으며 가장 바람직하게는 5시간 방치할 수 있다. 침전된 재조합 항원이 포함된 침전물을 분리하기 위해 원심분리(4500g, 30분, 4℃)하여 상등액을 버리고 침전물을 5 ml 20 mM sodium phosphate buffer(pH 7.4) 로 재부유하여 4 ℃에서 NMWCO 20 kD pore size 투석백에 넣어 0.15 M Nacl 을 포함하는 20 mM sodium phosphate buffer에 투석할 수 있다. 투석은 3 ~4 시간동안 마그네틱 바를 이용하여 stirring 하며 총 1.0 L buffer를 사용하여 투석할 수 있으며, 투석한 이후 다음 chromatography 정제 공정을 위해 크로마토그래피 (친화성, 이온 교환, 크기별 배제, 소수성)나 ultrafiltration 방법을 통해 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해 정제 가능하다.

본 백신은 사람에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 약학적 조성물을 의미한다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 공지된 LV-MS1-Fc 재조합 단백질이다. 또한 백신의 효능 증대를 위해 하나 이상의 추가적인 항원이 포함될 수 있으며 는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화) 제조될 수 있다. 백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 동시에 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 백신은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피 (transdermal) 팻치에 함유시킬 수도 있다. 액체 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양 (예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.

본 발명의 백신은 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용 가능한" 이란 생리학적으로 허용되고 돼지에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액, 또는 비-수용액, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 면역원성을 증가시키기 위한 면역보조제로서 정형 또는 비정형 유기 또는 무기 고분자등이 사용될 수 있다. 면역보조제는 일반적으로 항원에 대한 화학적 물리적 결합을 통해 면역반응을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 면역보조제로서는 비정형 알루미늄 겔, 오일 에멀젼, 또는 이중 오일 에멀젼 그리고 이뮤노졸 등이 사용될 수 있다. 또한 면역반응의 촉진을 위해 다양한 식물 유래 사포닌, 레바미솔, CpG 다이뉴클레오티드, RNA, DNA, LPS, 다양한 종류의 싸이토카인 등이 사용될 수 있다. 위와 같은 면역 조성물은 다양한 보조제와 면역반응 촉진 첨가물의 조합에 의해 최적의 면역반응 유도를 위한 조성으로 사용될 수 있다. 또한 백신에 추가될 있는 조성물로는 안정제, 불활화제, 항생제, 보존제, 등이 사용될 수 있다. 백신의 투여 경로에 따라 백신 항원은 증류수, 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다.

상기 백신은 경구, 근육, 피하, 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 바람직하게는 근육 투여경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명은 사람에서 중동호흡기증후군 바이러스에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 생백신 조성물을 포함함을 특징으로 하는 백신의 면역 유효량을 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 보호성 면역 반응의 유도법을 제공한다.

상기 면역 반응은 백신 조성물 또는 이를 포함하는 백신 중에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 서프레서 T 세포, 세포독성 T 세포 및 감마-델타 T 세포의 생산 또는 활성화, 숙주에서 치료학적 또는 보호 면역학적 반응을 나타내어 새로운 감염에 대한 내성이 증진되거나 질환의 임상적 중증도가 감소되는 효과 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 보호 면역 반응일 수 있다.

상기 보호는 감염된 숙주가 통상적으로 나타내는 임상적 징후의 감소 또는 부재, 보다 신속한 회복 시간 또는 보다 낮아진 지속시간 또는 감염된 숙주의 조직 또는 체액 또는 배설물에서 보다 낮은 바이러스 역가에 의해 입증된다.

상기에서 유효량은 면역 반응을 유도하여 사람에서 중동호흡기증후군 바이러스 감염의 빈도수 또는 이의 중증도를 감소시킬 수 있는 백신의 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 유효량은 상기 생백신 조성물을 포함하는 백신일 경우 정제된 항원 단백질의 양은 100 μg 내지 10 μg 일수 있다. 더 바람직하게는 50 μg에서 20 μg 일수 있으며 더 바람직하게는 20 μg 이상일 수 있다.

상기 면역 반응 유도법은 이것에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 경로로 백신을 접종하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 1차 및 2차 접종 시 백신을 근육내 접종하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 불활화 백신 조성물 및 면역강화제를 추가로 포함하는 백신을 제공한다.

불활화백신 조성물은 정제된 중동호흡기증후군 바이러스의 spike 단백질 중 단백질과 인간 IgG Fc 단백질로 구성된 퓨전 단백질과 적절한 면역 활성물일 수 있다. 상기 조성물을 포함하는 백신은 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 정제된 항원을 수득한 후 이들을 포르말린, 베타프로프리오락톤 (BPL), 이성분 에틸렌이민 (BEI) 또는 감마선으로 처리하거나, 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 비활성화 시킨다. 이어서 비활성화된 바이러스를 제약상 허용 가능한 캐리어 (예컨대 염수 용액) 및 임의의 보조제와 함께 혼합한다. 바람직하게는 최종농도 0.1% 포르말린에서 불활화한 것일 수 있다.

면역강화제 또는 어쥬번트(Adjuvant)는 면역반응의 향상 및 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다. 이에 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도 후 신체에 의해 발생되는 보조 분자, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 인터페론, 인터류킨 또는 성장인자이다.

또한 본 발명은 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 재조합 스파이크 단백질 LV-MS1-Fc 의 소동물에서의 면역반응 평가에 대한 방법을 제공한다.

상기 동물은 바람직하게는 포유류이며, 본 발명에서는 마우스에서의 면역원성 평가를 포함한다. 상기 피면역원 동물의 근육 또는 피하 또는 경구, 비강 피부를 통해 일정 시간 간격으로 2회 이내 접종을 수행할 수 있으며 바람직하게는 근육 접종을 통해 2주 간격으로 2회 접종을 할 수 있다. , 피면역 동물을 면역 시킨 2주 후 꼬리 채혈 또는 심장 채혈을 통해 마우스 혈청을 확보하며, ELISA 시스템을 통해 IgG 항체가를 측정하여 면역 유도에 대한 효과를 확인할 수 있으며 바람직하게는 바이러스 감염을 억제할 수 있는 Virus neutralization antibody titer를 측정하는 것으로 방어항체가를 측정할 수 있다.

또한, 본 발명은 중동호흡기증후군 바이러스 중화항체가 측정을 위해 방법을 포함한다. Vesicular stomatitis virus luciferase(VSVluc)-MERSS pseudovirus를 제작하여 바이러스 중화항체에 의한 luciferase 활성을 측정하여 중화항체가를 간접적으로 측정하는 방법을 제공한다. 위 방법을 통해 본 발명에서 시험한 백신의 바이러스 중화항체가는 12배에서 512배 일 수 있으며 바람직하게는 128배에서 256배 일 수 있으며 더 바람직하게는 256배 이상의 중화항체가가 측정되어야 한다.

본 발명은 포유류 중 백신의 효능 평가를 위한 방법을 제공할 수 있다. 시험 방법은 중동호흡기증후군 바이러스에 감수성이 있는 인간의 DPP4 바이러스 리셉터를 발현하는 유전자변형 동물(DPP4 knock in)일 수 있으며 바람직하게는 인간 DPP4 발현 마우스일 수 있다. 정확히 설명하면 마우스는 일반적으로 MERS-CoV에 감수성을 가지고 있지 않아 감염이 불가능한 것으로 알려져 있다. 또한 Human DPP4를 발현하는 마우스 (hDPP4 knock-in mouse)는 MERS-CoV에 감수성을 가지며 감염이 가능하지만 사람의 MERS-CoV는 human DPP4 knock-in mouse에서 질병을 일으키지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나 hDPP4 knock-in mouse에서 30회 이상 계대시킨 결과 만들어진 mouse-adapted MERS-CoV는 hDPP4 knock-in mouse에서 감염을 일으키고 사람에서와 유사한 질병을 일으키는 것이 확인되어 본 연구에서는 백신의 효능을 평가하기 위한 마우스모델로 hDPP4 knock-in mouse와 mouse-adapted MERS-CoV를 사용하였다.

이하, 첨부된 도면들을 함께 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

실시예 1 : MERS-CoV 백신을 위한 spike protein의 활용

MERS-CoV는 약 30 kb 정도의 positive-sense 단일 가닥 RNA를 유전 정보로 가진다. 이는 11개의 ORFs (open reading frames)으로 구성되어 있는데, 바이러스의 구조를 이루는 단백질인 S 유전자, E 유전자, M 유전자, N 유전자 등이 코딩 되어 있다. 여기서 S 유전자는 MERS-CoV의 구조를 이루는 단백질 중 스파이크 단백질을 코딩하는데, 이 단백질은 Host cell의 DPP4 (Dipeptidyl-peptidase 4)와 결합하여 바이러스와 host cell 간의 막 융합에 관여한다. 특히 S 유전자 내부의 RBD (receptor binding domain)는 바이러스의 스파이크 단백질과 host cell의 결합에 중요한 역할을 하며, 독자적으로 병원성을 나타내지 않기 때문에 나아가 MERS-CoV의 치료 및 백신 개발의 중요한 타깃으로 평가된다. 본 발명에서 MERS-CoV의 추가 확산을 통제할 수 있는 예방 전략을 개발하기 위해 MERS-CoV 스파이크 단백질을 백신으로 활용하였다.

실시예 2 : 포유류 세포에서 단백질 발현 가능한 재조합 발현 벡터 제작 및 확보

2015년 한국형 MERS 유전자 정보 (GeneBank accession No. KT029139, Middle East respiratory syndrome coronavirus isolate MERS-CoV/KOR/KNIH/002 05 2015)를 바탕으로 스파이크 단백질의 서열을 결정하였고, 상기 유전자를 인간 IgG4의 Fc 도메인이 태그된 융합 단백질인 MERS LV-MS1-Fc 를 MERS 재조합 백신 항원으로 디자인 하였으며, 최종적으로 발현되는 재조합 백신 항원은 유전자의 3' 말단에 인간 Fc 도메인을 가지도록 설계하였다. 이를 포유류 세포에서 발현하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하여 코돈-최적화된 MERS LV-MS1-Fc 유전자를 pcDNA3.4-TOPO TA 벡터에 클로닝하여 MERS 재조합 발현 벡터를 제작하였으며, 이를 MERS LV-MS1-Fc 라고 명명하였다.

보다 구체적으로, pcDNA3.4-TOPO 벡터는 TA 클로닝을 통해 유전자를 삽입하는 방식으로 taq polymerase를 이용한 PCR amplification 과정을 통해 3' 말단에 'A' 가 첨가된 삽입 유전자를 확보하였다. 삽입 유전자 : 벡터의 ratio를 3 : 1 기준으로 TOPO cloning reaction 진행하였으며, E. coli 주 TOP10 strain을 일반 클로닝의 호스토로 사용하여 형질전환(transformation)을 진행하였다. Ampicillin marker를 이용하여 재조합 유전자가 삽입된 균주를 selection 하였으며, 선별한 균주는 plasmid purification으로 DNA를 확보하여 sequencing 분석을 통해 최종 유전자를 확인하였다. 이에 해당하는 벡터맵 도1과 클로닝을 통해 확보한 최종 유전자 모식도는 도2에 나타내었으며, 염기서열은 서열번호 6에 나타내었다.

최종 확인한 MERS LV-MS1-Fc-TOPO 발현 유전자는 CHO-S cell에 ml 당 1 μg의 유전자를 형질주입(transfection) 하기 위해 plasmid midi scale purification을 통해 CHO-S cell에 형질주입하기 충분한 유전자원을 확보하였다.

실시예 3 : CHO cell에서 MERS LV-MS1-Fc 를 발현하기 위한 transient transfection

(1) 세포 배양

CHO-S (Chinese Hamster Ovary) cell로부터 유래된 ExpiCHO-S cell은 높은 단백질 발현효율을 가지는 CHO 세포주이다. ExpiCHO-S cell은 transient transfection을 위해 사용하였다. ExpiCHO-S cell은 ExpiCHO expression medium을 배양 및 형질주입 진행에 사용하였다. 125-mL 또는 250-mL Erlenmeyer flask는 주기적인 CHO-S cell 배양 flask로 사용하였다. Erlenmeyer flask에 CHO-S cell 0.5 x 10⁶ cells/mL density로 seeding하여 suspension 형태로 8% CO₂, 37℃의 orbital shaker platform 조건의 세포배양기에서 성장시켰다. 세포는 3~4 x 10⁶ cells/mL density에 도달하였을 때 계대 배양하여 세포 성장을 유지하였다.

(2) MERS LV-MS1-Fc 형질주입 (Transient Transfection)

CHO cell에서 MERS LV-MS1-Fc 항원을 발현하기 위해 다음과 같은 방법으로 250-ml Erlenmeyer flask scale로 형질주입을 진행하였다. 형질주입 하루 전날, pre-seeding을 위해 CHO-S cell을 trypan blue staining 후, hemocytometer에 분주하여 cell density를 측정하였다. CHO-S cell은 대략 17 시간의 doubling time을 가지며, 형질주입 진행에 3.0 x 10⁸ cells/50 mL의 cell density를 확보하기 위해 3 x 10⁶~4 x 10⁶ cells/mL로 seeding하여 다음날 7 x 10⁶~10 x 10⁶ cells/mL의 cell density에 도달할 수 있도록 하였다. 형질주입을 진행하는 당일, trypan blue staining을 이용하여 동일한 방식으로 cell density 측정하였다. 그 후 6 x 10⁶ cells/mL로 seeding하여 전체 3.0 x 10⁸ cells/50mL의 cell density를 확보하고 형질주입을 진행하였다. 형질주입에 사용한 reagent는 ExpiFectamine CHO reagent를 사용하였다. ExpiFectamine CHO reagent 160 μL와 OptiPRO SFM 1.84 mL을 혼합하여 2 mL의 mixture A를 준비하였다. MERS LV-MS1-Fc-TOPO 발현 유전자 50 μg을 OptiPRO SFM과 혼합하여 2 mL의 mixture B를 준비하였다. 상기 방법을 통해 준비한 mixture A와 mixture B를 혼합하여 MERS LV-MS1-Fc 발현 유전자 형질주입 mixture를 만들어 실온에서 5 분간 배양하였다. 배양한 MERS LV-MS1-Fc 발현 유전자 형질주입 mixture를 미리 250-ml Erlenmeyer flask에 seeding해둔 CHO-S cell에 천천히 분주하며 잘 섞어 주었다. 형질주입을 마친 CHO-S 세포는 8% CO₂, 37℃의 orbital shaker platform에 배양하였다. 형질주입 20 시간 후, ExpiCHO Feed 12 ml과 ExpiCHO Enhancer 300 μL를 첨가하여 8일차까지 배양하여 MERS LV-MS1-Fc 항원을 발현하였다.

LV-MS1-Fc 유전자를 형질 주입한 세포주를 Chinese hamster ovary cell LV-MS1-Fc 세포라 명칭하고, 2020년 07월 20일, 한국생명공학생물자원센터에 기탁하여 수탁번호 KCTC18832P를 2020년 7월 30일에 부여받았다.

실시예 4 : LV-MS1-Fc 항원 발현 확인

(1) 발현된 LV-MS1-Fc 항원 확보

형질주입 8 일 차에 배양세포를 1500 rpm, 5 분으로 원심분리 하여 세포와 발현액을 분리하였다. 분리한 세포는 1X DPBS 20 ml 세척 과정을 두 번 진행 후, 1X DPBS 5 ml 과 protease inhibitor를 첨가하여 sonication으로 10 min ~ 30 sec on/off 파쇄하여 세포 용해액을 확보하였다.

(2) 발현된 MERS LV-MS1-Fc 항원 확인

상기에서 확보한 발현액과 세포 용해액에서 MERS LV-MS1-Fc 항원의 발현을 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

BCA 단백질 분석을 이용하여 단백질 농도 측정 후, 발현액과 세포 용해액의 20 μg의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 분리하였으며 니트로셀룰로즈 막으로 전기이동 (transfer) 하였다. 상기 멤브레인은 MERS spike 단백질의 381-505 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 α-MERS 스파이크 단백질 다클론성 항체 특이적 반응과 염소 항-인간 IgG-HRP(goat anti-human IgG-HRP) 항체를 이용해 단백질 발현 확인을 수행하였다. 단백질을 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 나타낸 바와 같이, CHO-S 세포 배양액과 용해액 모두에서 약 130-kDa 크기의 재조합 MERS LV-MS1-Fc 단백질 발현을 확인할 수 있었다. 제작한 MERS LV-MS1-Fc 발현 유전자는 signal peptide를 포함하도록 제작되어, CHO-S 세포에서 단백질이 발현된 후 분비되도록 유도되어 MERS LV-MS1-Fc 항원이 발현액에도 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5 : MERS LV-MS1-Fc 항원 정제

상기 실시예 3을 통해 확보한 MERS LV-MS1-Fc 항원 발현액을 하기와 같이 affinity chromatography를 이용하여 단백질 정제를 수행하였다.

보다 구체적으로, affinity chromatography를 진행하기에 앞서 90% ammonium sulfate를 첨가하는 전처리 과정을 거쳐 MERS LV-MS1-Fc 항원 단백질 침전을 진행하였다. 662 g/L의 ammonium sulfate를 발현액에 첨가하여 MERS LV-MS1-Fc 항원 단백질을 침전하였다. 침전시킨 단백질은 13,000 rpm, 30 min, 4℃로 pellet을 확보하여 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4)로 용해시켰다. 용해한 단백질은 cellulose membrane에 담아 20mM sodium phosphate buffer (pH 7.4)에서 2시간 Dialysis 2회를 진행하였다. 최종적으로 13,000 rpm, 30 min, 4℃ 원심분리 후 0.45 μm filtration을 통해 정제 단백질을 확보하였다. 정제에 사용한 컬럼은 HiTrapTM protein A HP를 이용하였다. Elution 시 0.1 M citric acid (pH 3.0)와 1 M Tris-H Cl (pH 9.0)로 중화를 진행하였다. 수득한 단백질은 BCA 단백질 분석을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 10% SDS-PAGE를 통해 단백질을 분리시킨 후, 쿠마시블루 염색을 통한 단백질 확인하였다. 또한, 니트로셀룰로즈 막으로 전기이동한 멤브레인을 통해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. affinity chromatography를 통해 대략 130 kDa의 MERS LV-MS1-Fc 항원이 확보된 것을 확인하였다.

실시예 6 : MERS 항원의 mouse 면역원성 확인

상기의 방법으로 확보한 MERS LV-MS1-Fc 항원 단백질을 5주령, 암컷인 BALB/c 마우스에 다음과 같이 면역하였다. 보다 구체적으로, 그룹으로는 PBS 그룹(음성대조군), LV-MS1-Fc 0.5 μg, 2 μg, 5 μg 의 총 4 그룹으로 나누어 각 5 마리씩 면역화 진행하였으며, 100 μl/마리의 양으로 2주 간격, 2회 피하 접종을 진행하였다. 최초의 접종일로부터 면역화 2 주차와 4 주차의 채혈을 통해 항혈청을 수득하였으며, 수득한 마우스 항혈청과 MERS spike protein의 항체 반응을 확인하기 위하여, 다음과 같은 결합 반응을 진행하였다. MERS LV-MS1-Fc 에 의한 MERS spike protein 항체가를 측정하기 위해 상업적을 구입한 MERS Spike protein (Sino 사)을 200 ng/100 μl씩 ELISA 측정용 96 well plate에 coating 하여 일반적인 ELISA 측정 방법에 따라 항체가를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, LV-MS1-Fc 항원 단백질을 접종한 그룹의 MERS Spike protein IgG 항체가가 대조군과 유의한 차이를 나타내는 것을 확인하였으며, 1 μg의 항원 농도에서보다 5 μg의 항원농도에서 항체가가 더욱 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해서 MERS LV-MS1-Fc 항원 단백질을 통해 MERS Spike protein에 대한 마우스 IgG 항체 형성이 효과적인 것을 확인하였다.

실시예 7 : 중동호흡기증후군 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 중화항체가 평가

상기의 실시예 5를 통해 확보한 MERS LV-MS1-Fc 항원에 대한 중화항체가 및 챌린지 시험을 위해 대부분의 마우스는 마우스는 일반적으로 MERS-CoV에 감수성을 가지고 있지 않아 감염이 불가능하다. Human DPP4를 발현하는 마우스 (hDPP4 knock-in mouse)는 MERS-CoV에 감수성을 가지며 감염이 가능하지만 사람의 MERS-CoV는 human DPP4 knock-in mouse에서 질병을 일으키지 않는다. 도 6에서와 같이 hDPP4 knock-in mouse에서 30회 이상 계대시킨 결과 만들어진 mouse-adapted MERS-CoV는 hDPP4 knock-in mouse에서 감염을 일으키고 사람에서와 유사한 질병을 일으키므로 본 연구에서는 백신의 효능을 평가하기 위한 마우스모델로 hDPP4 knock-in mouse와 mouse-adapted MERS-CoV를 사용하였다. 위의 마우스 모델 및 바이러스는 University of Iowa에서 개발되었으며, 서울대학교로부터 마우스와 바이러스를 분양 받았다. 백신 접종 4주 후, 심장 채혈을 이용해 혈액을 채취하고 2000xg에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리함. 분리된 혈청은 56도에서 30분동안 incubation하였다. 중화항체가를 측정하기 위하여 96 well microplate에 Huh7 세포를 준비시킨 후, 혈청을 1:10으로 희석한 뒤, 2배 단계 희석하였다. 동량의 VSVluc-MERS를 넣어준 뒤, 37도에서 1시간 동안 배양 후 바이러스와 혈청 mixture를 Huh7에 접종하고 1시간 동안 배양하였다. 바이러스와 혈청 mixture를 제거하고 새로운 배지를 넣어준 뒤, 37도에서 18시간 배양하였다. 배지를 제거한 뒤, 1X luciferase lysis buffer를 각 well 당 50 μl씩 넣어준 뒤, -80도에 보관하였다. luciferase substrate를 이용하여 luciferase activity를 측정하여 도 5에서와 같이 높은 중화 항체가 결과를 확인하였다.

실시예 8 : 중동호흡기증후군 코로나바이러스 스파이크 단백질에 대한 공격 접종 시험 수행

시험 제조된 백신의 효능을 평가하기 위해 도 6에서와 같이 MERS virus의 감염 리셉터로 알려진 DPP4 가 발현된 유전자변형 마우스에 백신 접종 후 중화 항체가 측정 및 병원성 바이러스를 이용하여 공격 시험(Challenge test)을 통해 백신의 방어력을 평가하였다.

Mouse-adapted MERS-CoV 배양은 충북대 BL3 실험실에서 수행하였다. VeroE6 세포를 T-75에 준비시킨 후, 세포가 Flask에 부착하면, 10^6 PFU Mouse-adapted MERS-CoV를 2ml media에 희석하여 접종하였다. 접종 1시간 후, 바이러스를 제거하고 새로운 media (10ml)를 넣어준 후, 세포변성효과가 관찰될 때까지 37도 인큐베이터에서 배양하였다. 세포변성효과가 80~90% 정도 관찰되면 Freeze-Thawing에 의해 세포로부터 바이러스를 release하고 상층액을 10,000xg에서 10분 동안 원심분리하여 세포부유물을 제거한 뒤, 1ml씩 분주하여 -80도 초저온냉동고에 보관하였다. 바이러스 역가(전북대 BL3 실험실에서 수행)측정을 위해 VeroE6 세포를 6-well plate에 준비시킨 후, 바이러스를 10배 단계 희석 후, 단계 희석한 바이러스를 200 μl씩 VeroE6 세포에 접종하였다. 접종 1시간 후, 바이러스를 제거하고 0.8% agarose를 함유한 배지를 넣어준 후 3일 동안 배양하였다. 3일 후 생성된 plaque의 개수를 세어 바이러스 농도를 계산하였다.

백신접종을 위해 2.5 μg의 항원 (PBS, LV-MS1-Fc)을 alum과 함께 2주 간격으로 2회 근육 접종하였다. 공격접종 1일 전 백신 접종된 마우스를 전북대학교 BL3 실험실로 이송하였다. 공격접종(전북대 BL3 실험실에서 수행)을 수행하기 위해 - Isofluorane를 사용하여 마우스 마취 후, 백신 접종된 마우스에 10^4 pfu/50 μl 의 바이러스 부유액을 비강 접종하였다. 바이러스 접종 후 7일 동안, 마우스의 체중 및 임상증상 관찰하였다. 공격접종 7일 째, 마취 후 경추탈골로 안락사 유도 후, 부검을 수행하여 폐를 적출하였다. 오른쪽 폐는 바이러스 분리를 위해 파쇄 후 1000xg에서 10분간 원심분리하여 상층액만을 분리해낸 뒤 plaque assay를 통해 바이러스 역가 측정을 수행하였다. 왼쪽 폐는 병리조직학적 검사를 위해 10% 중성포르말린에 24시간 이상 고정 후, 충남대학교 수의과대학으로 이송하여 H&E 염색을 수행하였다.

공격접종 결과, PBS를 접종한 마우스는 바이러스 공격접종 1일 후부터 점차 체중이 감소되기 시작하여 접종 전 체중의 25% 이상 감소를 보였으나, LV-MS1-Fc 백신을 접종한 마우스는 체중의 변화가 없었다. PBS를 접종한 4 마리의 마우스 중 공격접종 4일 후에 1마리가, 공격접종 6일 후에 2마리가 폐사하였다 (폐사율 75%). LV-MS1-Fc 백신을 접종한 마우스에서는 폐사가 관찰되지 않았다(폐사율 0%). PBS를 접종한 마우스는 공격접종 1일 후부터 활동량이 급격히 줄고 음수량 및 사료섭취량이 현저히 줄었다. LV-MS1-Fc 백신을 접종한 마우스에서는 특이 임상증상이 관찰되지 않았다. 도 7에서와 같이 공격접종 후 왼쪽 폐에서 바이러스 역가를 측정한 결과, PBS 접종군 역가 1X10^4.2 PFU/mL에 비하여 LV-MS1-Fc 접종군에서 1X10^2 PFU/mL로 확인되어 LV-MS1-Fc 접종군의 바이러스 검출량이 더 낮음을 확인하였다. 도 8에서과 같이 PBS를 접종한 마우스의 폐조직에서 조직병리학적 증상은 염증세포 침윤, 부종, 삼출물 등이 관찰되었으나, LV-MS1-Fc 백신을 접종한 마우스의 폐에서는 특이 소견이 관찰되지 않음을 확인하였다.

실시예 9 : 항원의 독성 및 안전성 평가

항원의 독성 및 안전성 평가를 위해 50 μl 의 PBS에 20 μg의 LV-MS1-Fc 항원을 동량의 Alum 과 혼합한 후 C57BL/6 마우스의 대퇴 근육에 2주 간격으로 2회 접종 한 후 4주간 체중 변화와 사료섭취량, 음수량을 측정하였다. 음성 대조군은 동량의 PBS 를 같은 방법으로 접종하였다. 각각의 시험 그룹당 마우스는 10마리로 수행하였다. 확인 결과 도 9에서와 같이 PBS 접종군과 LV-MS1-Fc 항원 접종군 사이에 체중 변화, 사료섭취량 및 음수량에서 큰 차이가 없음을 확인하였다.

한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC18832P 20200720

<110> LIBENTECH Co., LTD. <120> VACCINE COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF MIDDLE EAST RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS <130> PN2008-341 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4062 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV spike protein <400> 1 atgatacact cagtgtttct actgatgttc ttgttaacac ctacagaaag ttacgttgat 60 gtagggccag attctgttaa gtctgcttgt attgaggttg atatacaaca gactttcttt 120 gataaaactt ggcctaggcc aattgatgtt tctaaggctg acggtattat ataccctcaa 180 ggccgtacat attctaacat aactatcact tatcaaggtc tttttcccta tcagggagac 240 catggtgata tgtatgtcta ctctgcagga catgctacag gcacaactcc acaaaagttg 300 tttgtagcta actattctca ggacgtcaaa cagtttgcta atgggtttgt cgtccgtata 360 ggagcagctg ccaattccac tggcactgtt attattagcc catctacccg cgctactata 420 cgaaaaattt accctgcttt tatgctgggt tcttcagttg gtaatttctc agatggtaaa 480 atgggccgct tcttcaatca tactctagtt cttttgcccg atggatgtgg cactttactt 540 agagcttttt attgtattct agagcctcgc tctggaaatc attgtcctgc tggcaattcc 600 tatacttctt ttgccactta tcacactcct gcaacagatt gttctgatgg caattacaat 660 cgtaatgcca gtctgaactc ttttaaggag tattttaatt tacgtaactg cacctttatg 720 tacacttata acattaccga agatgagatt ttagagtggt ttggcattac acaaactgct 780 caaggtgttc acctcttctc atctcggtat gttgatttgt acggcggcaa tatgtttcaa 840 tttgccacct tgcctgttta tgatactatt aagtattatt ctatcattcc tcacagtatt 900 cgttctatcc aaagtgatag aaaagcttgg gctgccttct acgtatataa acttcaaccg 960 ttaactttcc tgttggattt ttctgttgat ggttatatac gcagagctat agactgtggt 1020 tttaatgatt tgtcacaact ccactgctca tatgaatcct tcgatgttga atctggagtt 1080 tattcagttt cgtctttcga agcaaaacct tctggctcag ttgtggaaca ggctgaaggt 1140 gttgaatgtg atttttcacc tcttctgtct ggcacacctc ctcaggttta taatttcaag 1200 cgtttggttt ttaccaattg caattataat cttaccaaat tgctttcact tttttctgtg 1260 aatgatttta cttgtagtca aatatctcca gcagcaattg ctagcaactg ttattcttca 1320 ctgattttgg attatttttc atacccactt agtatgaaat ccgatctcag tgttagttct 1380 gctggtccaa tatcccagtt taattataaa cagtcctttt ctaatcccac atgtttgatt 1440 ttagcgactg ttcctcataa ccttactact attactaagc ctcttaagta cagctatatt 1500 aacaagtgct ctcgtcttct ttctgatgat cgtactgaag tacctcagtt agtgaacgct 1560 aatcaatact caccctgtgt atccattctc ccatccactg tgtgggaaga cggtgattat 1620 tataggaaac aactatctcc acttgaaggt ggtggctggc ttgttgctag tggctcaact 1680 gttgccatga ctgagcaatt acagatgggc tttggtatta cagttcaata tggtacagac 1740 accaatagtg tttgccccaa gcttgaattt gctaatgaca caaaaattgc ctctcaatta 1800 ggcaattgcg tggaatattc cctctatggt gtttcgggcc gtggtgtttt tcagaattgc 1860 acagctgtag gtgttcgaca gcagcgcttt gtttatgatg cgtaccagaa tttagttggc 1920 tattattctg atgatggcaa ctactactgt ttgcgtgctt gtgttagtgt tcctgtttct 1980 gtcatctatg ataaagaaac taaaacccac gctactctat ttggtagtgt tgcatgtgaa 2040 cacatttcct ctaccatgtc tcaatactcc cgttctacgc gatcaatgct taaacggcga 2100 gattctacat atggtcccct tcagacacct gttggttgtg tcctaggact tgttaattcc 2160 tctttgttcg tagaggactg caagttgcct cttggtcaat ctctctgtgc tcttcctgac 2220 acacctagta ctctcacacc tcgcagtgtg cgctctgttc caggtgaaat gcgcttggca 2280 tccattgctt ttaatcatcc tattcaggtt gatcaactta atagtagtta ttttaaatta 2340 agtataccta ctaatttttc ctttggtgtg actcaggagt acattcagac aaccattcag 2400 aaagttactg ttgattgtaa acagtacgtt tgcaatggtt tccagaagtg tgagcaatta 2460 ctgcgcgagt atggccagtt ttgttccaaa ataaaccagg ctctccatgg tgccaattta 2520 cgccaggatg attctgtacg taatttgttt gcgagcgtga aaagctctca atcatctcct 2580 atcataccag gttttggagg tgactttaat ttgacacttc tagaacctgt ttctatatct 2640 actggcagtc gtagtgcacg tagtgctatt gaggatttgc tatttgacaa agtcactata 2700 gctgatcctg gttatatgca aggttacgat gattgtatgc agcaaggtcc agcatcagct 2760 cgtgatctta tttgtgctca atatgtggct ggttataaag tattacctcc tcttatggat 2820 gttaatatgg aagccgcgta cacttcatct ttgcttggca gcatagcagg tgttggctgg 2880 actgctggct tatcctcctt tgctgctatt ccatttgcac agagtatctt ttataggtta 2940 aacggtgttg gcattactca acaggttctt tcagagaacc aaaagcttat tgccaataag 3000 tttaatcagg ctctgggagc tatgcaaaca ggcttcacta caactaatga agcttttcgg 3060 aaggttcagg atgctgtgaa caacaatgca caggctctat ccaaattagc tagcgagcta 3120 tctaatactt ttggtgctat ttccgcctct attggagaca tcatacaacg tcttgacgtt 3180 ctcgaacagg acgcccaaat agacagactt attaatggcc gtttgacaac actaaatgct 3240 tttgttgcac agcagcttgt tcgttctgaa tcagctgctc tttccgctca attggctaaa 3300 gataaagtca atgagtgtgt caaggcacaa tccaagcgtt ctggattttg cggtcaaggc 3360 acacatatag tgtcctttgt tgtaaatgcc cctaatggcc tttactttat gcatgttggt 3420 tattacccta gcaaccacat tgaggttgtt tctgcttatg gtctttgcga tgcagctaac 3480 cctactaatt gtatagcccc tgttaatggc tactttatta aaactaataa cactaggatt 3540 gttgatgagt ggtcatatac tggctcgtcc ttctatgcac ctgagcccat cacctctctt 3600 aatactaagt atgttgcacc acaggtgaca taccaaaaca tttctactaa cctccctcct 3660 cctcttctcg gcaattccac cgggattgac ttccaagatg agttggatga gtttttcaaa 3720 aatgttagca ccagtatacc taattttggt tctctaacac agattaatac tacattactc 3780 gatcttacct acgagatgtt gtctcttcaa caagttgtta aagcccttaa tgagtcttac 3840 atagacctta aagagcttgg caattatact tattacaaca aatggccgtg gtacatttgg 3900 cttggtttca ttgctgggct tgttgcctta gctctatgcg tcttcttcat actgtgctgc 3960 actggttgtg gcacaaactg tatgggaaaa cttaagtgta atcgttgttg tgatagatac 4020 gaggaatacg acctcgagcc gcataaggtt catgttcact aa 4062 <210> 2 <211> 1887 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV spike protein <400> 2 gtcgatgtag gaccagatag cgttaagagc gcctgcatcg aggtggacat ccaacagaca 60 ttcttcgaca aaacttggcc caggccaatt gacgtttcca aggctgacgg tattatatac 120 cctcagggcc gtacgtactc taacatcact atcacgtacc aaggtctttt cccgtaccag 180 ggagaccatg gtgacatgta cgtctactcc gctggacatg ccacgggtac aactccacag 240 aagttatttg tagctaacta ctctcaggac gtcaaacagt ttgcaaacgg gttcgtcgtg 300 cgcataggag cagcagccaa ctccaccggc acagttatca tcagcccaag tacccgcgct 360 accatccgaa agatctaccc agctttcatg ctgggttctt cagttggtaa tttctcagat 420 ggtaagatgg gaagattctt caaccacact ttggttctat tgcccgatgg atgtggcacg 480 ctacttagag cgttctactg catactggag cctcgctcag gtaaccactg cccggcgggc 540 aattcctaca cttcctttgc tacgtaccac acccctgcta cagattgctc tgacggcaat 600 tacaaccgta acgcaagtct gaactctttc aaggagtact ttaatctccg taactgtacc 660 ttcatgtaca cttataacat caccgaagac gagattctgg agtggtttgg cattacacaa 720 actgctcaag gcgttcacct cttcagctcg cggtacgtgg acttgtacgg aggcaacatg 780 ttccagtttg cgaccctccc ggtctatgat accattaagt attactcgat cattccccac 840 agtatcaggt ctatccaaag tgataggaag gcttgggctg ccttctacgt ctacaaactc 900 cagccattaa ctttcctctt ggatttcagc gtggacgggt atattcgcag agccatagac 960 tgcggtttca acgacttgtc gcaactccac tgctcatacg aatccttcga cgttgaaagc 1020 ggagtttatt cagttagttc cttcgaagca aaaccctctg gctcggtcgt ggagcaggct 1080 gaaggtgtgg agtgtgactt ctcacctctt ctgagcggca ccccccctca agtgtataat 1140 ttcaagcgtt tggtgttcac caactgcaac tacaacctta ccaaattgct cagccttttc 1200 tctgtcaacg atttcacttg ttcacaaata tctccagcag ccatcgctag caactgctac 1260 tctagcctga tcttggatta cttcagctac ccacttagta tgaaatccga tctcagtgtg 1320 tcctctgccg gtccaatatc ccagttcaac tacaagcagt cgttctccaa tcccacatgc 1380 ctgattctag cgaccgtacc ccacaacctg actacgatca ctaagcctct taagtacagc 1440 tatattaaca agtgctccag gcttctcagc gacgatcgta cggaagtccc acagctagtg 1500 aatgctaacc aatactcacc ctgtgtgtcc atcctcccat ccacggtgtg ggaggacggt 1560 gattattacc gcaaacaact atcgccgctg gagggaggag gctggcttgt tgcctcggga 1620 tcaactgtcg ccatgactga gcagcttcag atgggctttg gtattactgt tcaatacggc 1680 acagacacca atagtgtgtg ccccaagtta gaatttgcta acgacacaaa gattgcctct 1740 caactcggca actgcgtgga atactccctg tatggtgtgt cgggacgtgg agttttccag 1800 aattgcacag ccgtaggggt ccgacagcag agattcgtct atgacgccta ccagaacctc 1860 gtaggctact actccgacga tggcaac 1887 <210> 3 <211> 2028 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG4 Fc <400> 3 agctttctgg ggcaggccgg gcctgacttt ggctgggggc agggaggggg ctaaggtgac 60 gcaggtggcg ccagccaggt gcacacccaa tgcccatgag cccagacact ggaccctgca 120 tggaccatcg cggatagaca agaaccgagg ggcctctgcg ccctgggccc agctctgtcc 180 cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcttcc accaagggcc catccgtctt 240 ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gccgccctgg gctgcctggt 300 caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg 360 cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 420 gaccgtgccc tccagcagct tgggcacgaa gacctacacc tgcaacgtag atcacaagcc 480 cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca gcacagggag ggagggtgtc 540 tgctggaagc caggctcagc cctcctgcct ggacgcaccc cggctgtgca gccccagccc 600 agggcagcaa ggcatgcccc atctgtctcc tcacccggag gcctctgacc accccactca 660 tgctcaggga gagggtcttc tggatttttc caccaggctc ccggcaccac aggctggatg 720 cccctacccc aggccctgcg catacagggc aggtgctgcg ctcagacctg ccaagagcca 780 tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag cccaccccaa aggccaaact ctccactccc 840 tcagctcaga caccttctct cctcccagat ctgagtaact cccaatcttc tctctgcaga 900 gtccaaatat ggtcccccat gcccatcatg cccaggtaag ccaacccagg cctcgccctc 960 cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg 1020 gtgctgacgc atccacctcc atctcttcct cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag 1080 tcttcctgtt ccccccaaaa cccaaggaca ctctcatgat ctcccggacc cctgaggtca 1140 cgtgcgtggt ggtggacgtg agccaggaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg 1200 atggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc aacagcacgt 1260 accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca 1320 agtgcaaggt ctccaacaaa ggcctcccgt cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca 1380 aaggtgggac ccacggggtg cgagggccac acggacagag gccagctcgg cccaccctct 1440 gccctgggag tgaccgctgt gccaacctct gtccctacag ggcagccccg agagccacag 1500 gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1560 ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1620 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1680 agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1740 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1800 tgagtgccag ggccggcaag cccccgctcc ccgggctctc ggggtcgcgc gaggatgctt 1860 ggcacgtacc ccgtctacat acttcccagg cacccagcat ggaaataaag cacccaccac 1920 tgccctgggc ccctgtgaga ctgtgatggt tctttccacg ggtcaggccg agtctgaggc 1980 ctgagtgaca tgagggaggc agagcgggtc ccactgtccc cacactgg 2028 <210> 4 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG4 Fc <400> 4 tccaagtacg gtcctccatg cccctcctgc cccgctcccg agttcctggg tggtccctcc 60 gtgttcctgt tccctccaaa gcccaaggac accctgatga tctcccgtac cccagaggtg 120 acctgcgtgg tggtggacgt gtcccaggag gaccccgagg tgcagttcaa ctggtacgtg 180 gacggtgtgg aggtgcacaa cgctaagacc aagccccgtg aggagcagtt caactccacc 240 taccgtgtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg aaaggagtac 300 aagtgcaagg tgtccaacaa gggtctgccc tcctccatcg agaagaccat ctccaaggct 360 aagggtcagc cccgtgagcc ccaggtgtac accctgcctc catcccagga ggagatgacc 420 aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtg aagggtttct acccctccga catcgctgtg 480 gagtgggagt ccaacggtca gcccgagaac aactacaaga ccacccctcc agtgctggac 540 tccgacggtt ccttcttcct gtactcccgt ctgaccgtgg acaagtcccg ttggcaggag 600 ggtaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacccagaag 660 tccctgtccc tgtcccccgg aaagtaa 687 <210> 5 <211> 907 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LV-MS1-Fc <400> 5 Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His 1 5 10 15 Ser Ala Phe Ala Val Asp Val Gly Pro Asp Ser Val Lys Ser Ala Cys 20 25 30 Ile Glu Val Asp Ile Gln Gln Thr Phe Phe Asp Lys Thr Trp Pro Arg 35 40 45 Pro Ile Asp Val Ser Lys Ala Asp Gly Ile Ile Tyr Pro Gln Gly Arg 50 55 60 Thr Tyr Ser Asn Ile Thr Ile Thr Tyr Gln Gly Leu Phe Pro Tyr Gln 65 70 75 80 Gly Asp His Gly Asp Met Tyr Val Tyr Ser Ala Gly His Ala Thr Gly 85 90 95 Thr Thr Pro Gln Lys Leu Phe Val Ala Asn Tyr Ser Gln Asp Val Lys 100 105 110 Gln Phe Ala Asn Gly Phe Val Val Arg Ile Gly Ala Ala Ala Asn Ser 115 120 125 Thr Gly Thr Val Ile Ile Ser Pro Ser Thr Arg Ala Thr Ile Arg Lys 130 135 140 Ile Tyr Pro Ala Phe Met Leu Gly Ser Ser Val Gly Asn Phe Ser Asp 145 150 155 160 Gly Lys Met Gly Arg Phe Phe Asn His Thr Leu Val Leu Leu Pro Asp 165 170 175 Gly Cys Gly Thr Leu Leu Arg Ala Phe Tyr Cys Ile Leu Glu Pro Arg 180 185 190 Ser Gly Asn His Cys Pro Ala Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Phe Ala Thr 195 200 205 Tyr His Thr Pro Ala Thr Asp Cys Ser Asp Gly Asn Tyr Asn Arg Asn 210 215 220 Ala Ser Leu Asn Ser Phe Lys Glu Tyr Phe Asn Leu Arg Asn Cys Thr 225 230 235 240 Phe Met Tyr Thr Tyr Asn Ile Thr Glu Asp Glu Ile Leu Glu Trp Phe 245 250 255 Gly Ile Thr Gln Thr Ala Gln Gly Val His Leu Phe Ser Ser Arg Tyr 260 265 270 Val Asp Leu Tyr Gly Gly Asn Met Phe Gln Phe Ala Thr Leu Pro Val 275 280 285 Tyr Asp Thr Ile Lys Tyr Tyr Ser Ile Ile Pro His Ser Ile Arg Ser 290 295 300 Ile Gln Ser Asp Arg Lys Ala Trp Ala Ala Phe Tyr Val Tyr Lys Leu 305 310 315 320 Gln Pro Leu Thr Phe Leu Leu Asp Phe Ser Val Asp Gly Tyr Ile Arg 325 330 335 Arg Ala Ile Asp Cys Gly Phe Asn Asp Leu Ser Gln Leu His Cys Ser 340 345 350 Tyr Glu Ser Phe Asp Val Glu Ser Gly Val Tyr Ser Val Ser Ser Phe 355 360 365 Glu Ala Lys Pro Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu 370 375 380 Cys Asp Phe Ser Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn 385 390 395 400 Phe Lys Arg Leu Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu 405 410 415 Leu Ser Leu Phe Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro 420 425 430 Ala Ala Ile Ala Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe 435 440 445 Ser Tyr Pro Leu Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly 450 455 460 Pro Ile Ser Gln Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys 465 470 475 480 Leu Ile Leu Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro 485 490 495 Leu Lys Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Leu Leu Ser Asp Asp 500 505 510 Arg Thr Glu Val Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys 515 520 525 Val Ser Ile Leu Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg 530 535 540 Lys Gln Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly 545 550 555 560 Ser Thr Val Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr 565 570 575 Val Gln Tyr Gly Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe 580 585 590 Ala Asn Asp Thr Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr 595 600 605 Ser Leu Tyr Gly Val Ser Gly Arg Gly Val Phe Gln Asn Cys Thr Ala 610 615 620 Val Gly Val Arg Gln Gln Arg Phe Val Tyr Asp Ala Tyr Gln Asn Leu 625 630 635 640 Val Gly Tyr Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Arg Ser Val Arg Ser Val Pro 645 650 655 Gly Glu Met Arg Leu Ala Ser Ile Ala Phe Asn His Pro Ile Gln Val 660 665 670 Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser 675 680 685 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 690 695 700 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 705 710 715 720 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 725 730 735 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 740 745 750 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 755 760 765 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 770 775 780 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 785 790 795 800 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 805 810 815 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 820 825 830 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 835 840 845 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 850 855 860 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 865 870 875 880 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 885 890 895 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 900 905 <210> 6 <211> 2724 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS WG-S1-Fc <400> 6 atggtctccg cgatcgtact ctatgtcctc ctggctgccg ccgcgcatag cgccttcgca 60 gtcgatgtag gaccagatag cgttaagagc gcctgcatcg aggtggacat ccaacagaca 120 ttcttcgaca aaacttggcc caggccaatt gacgtttcca aggctgacgg tattatatac 180 cctcagggcc gtacgtactc taacatcact atcacgtacc aaggtctttt cccgtaccag 240 ggagaccatg gtgacatgta cgtctactcc gctggacatg ccacgggtac aactccacag 300 aagttatttg tagctaacta ctctcaggac gtcaaacagt ttgcaaacgg gttcgtcgtg 360 cgcataggag cagcagccaa ctccaccggc acagttatca tcagcccaag tacccgcgct 420 accatccgaa agatctaccc agctttcatg ctgggttctt cagttggtaa tttctcagat 480 ggtaagatgg gaagattctt caaccacact ttggttctat tgcccgatgg atgtggcacg 540 ctacttagag cgttctactg catactggag cctcgctcag gtaaccactg cccggcgggc 600 aattcctaca cttcctttgc tacgtaccac acccctgcta cagattgctc tgacggcaat 660 tacaaccgta acgcaagtct gaactctttc aaggagtact ttaatctccg taactgtacc 720 ttcatgtaca cttataacat caccgaagac gagattctgg agtggtttgg cattacacaa 780 actgctcaag gcgttcacct cttcagctcg cggtacgtgg acttgtacgg aggcaacatg 840 ttccagtttg cgaccctccc ggtctatgat accattaagt attactcgat cattccccac 900 agtatcaggt ctatccaaag tgataggaag gcttgggctg ccttctacgt ctacaaactc 960 cagccattaa ctttcctctt ggatttcagc gtggacgggt atattcgcag agccatagac 1020 tgcggtttca acgacttgtc gcaactccac tgctcatacg aatccttcga cgttgaaagc 1080 ggagtttatt cagttagttc cttcgaagca aaaccctctg gctcggtcgt ggagcaggct 1140 gaaggtgtgg agtgtgactt ctcacctctt ctgagcggca ccccccctca agtgtataat 1200 ttcaagcgtt tggtgttcac caactgcaac tacaacctta ccaaattgct cagccttttc 1260 tctgtcaacg atttcacttg ttcacaaata tctccagcag ccatcgctag caactgctac 1320 tctagcctga tcttggatta cttcagctac ccacttagta tgaaatccga tctcagtgtg 1380 tcctctgccg gtccaatatc ccagttcaac tacaagcagt cgttctccaa tcccacatgc 1440 ctgattctag cgaccgtacc ccacaacctg actacgatca ctaagcctct taagtacagc 1500 tatattaaca agtgctccag gcttctcagc gacgatcgta cggaagtccc acagctagtg 1560 aatgctaacc aatactcacc ctgtgtgtcc atcctcccat ccacggtgtg ggaggacggt 1620 gattattacc gcaaacaact atcgccgctg gagggaggag gctggcttgt tgcctcggga 1680 tcaactgtcg ccatgactga gcagcttcag atgggctttg gtattactgt tcaatacggc 1740 acagacacca atagtgtgtg ccccaagtta gaatttgcta acgacacaaa gattgcctct 1800 caactcggca actgcgtgga atactccctg tatggtgtgt cgggacgtgg agttttccag 1860 aattgcacag ccgtaggggt ccgacagcag agattcgtct atgacgccta ccagaacctc 1920 gtaggctact actccgacga tggcaaccgc agtgtgcgct ctgttccagg ggaaatgcgc 1980 ttggcatcga tcgctttcaa ccaccctatc caggttggcg gtggaccggg cggtggatcc 2040 aagtacggtc ctccatgccc ctcctgcccc gctcccgagt tcctgggtgg tccctccgtg 2100 ttcctgttcc ctccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccgtacccc agaggtgacc 2160 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaggac cccgaggtgc agttcaactg gtacgtggac 2220 ggtgtggagg tgcacaacgc taagaccaag ccccgtgagg agcagttcaa ctccacctac 2280 cgtgtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggaaa ggagtacaag 2340 tgcaaggtgt ccaacaaggg tctgccctcc tccatcgaga agaccatctc caaggctaag 2400 ggtcagcccc gtgagcccca ggtgtacacc ctgcctccat cccaggagga gatgaccaag 2460 aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggtttctacc cctccgacat cgctgtggag 2520 tgggagtcca acggtcagcc cgagaacaac tacaagacca cccctccagt gctggactcc 2580 gacggttcct tcttcctgta ctcccgtctg accgtggaca agtcccgttg gcaggagggt 2640 aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac ccagaagtcc 2700 ctgtccctgt cccccggaaa gtaa 2724

Claims (12)

1. 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 MERS-CoV 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 인간 IgG4의 Fc을 코딩하는 유전자가 융합된 핵산을 포함하고,
   상기 MERS-CoV 스파이크 단백질을 코딩하는 유전자는 RBD (receptor binding domain)를 가지는 S1-CTD 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
2. 삭제
3. 제1항의 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포주.
4. 제3항에 있어서, 상기 세포주는 Chinese hamster ovary cell LV-MS1-Fc 세포 (KCTC18832P)인 것인 세포주.
5. 제3항에 따른 세포주로부터 생산된 재조합 단백질.
6. 제5항에 따른 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 백신은 불활화 백신인 것인 백신 조성물.
8. 제6항에 있어서, 상기 백신은 면역증강물질 또는 아쥬반트를 추가 포함하는 것인 백신 조성물.
9. 제6항의 백신 조성물 인간을 제외한 개체에 투여하여 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염을 예방하거나 또는 치료하는 방법.
10. 제1항의 재조합 발현 벡터를 세포에 형질전환시키는 단계; 상기 세포 또는 이의 배양물로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계; 및 상기 재조합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 중동호흡기증후군 코로나바이러스 백신용 재조합 단백질의 제조 방법.
11. 제1항의 재조합 발현 벡터 또는 제5항의 재조합 단백질을 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물에서의 면역반응을 평가하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 방법은 인간을 제외한 동물의 혈청으로부터 IgG 항체가 (antibody titer)를 측정하여 면역 반응을 평가하는 것인, 방법.

Images