JP2002502241A

JP2002502241A - クローン化されたヌクレオチド配列からの弱毒化パラインフルエンザウィルスワクチンの製造

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Publication number: JP2002502241A
Application number: JP55070498A
Authority: JP
Inventors: アール．マーフィー，ブライアン; エル．コリンズ，ピーター; ピー．ダービン，アンナ; エイチ．スキアドプロス，マリオ; タオ，タオ
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1997-05-23
Filing date: 1998-05-22
Publication date: 2002-01-22
Anticipated expiration: 2018-05-22
Also published as: CN1306575A; ATE501259T1; EP0994949A1; CA2291216A1; JP4237268B2; JP2008307055A; AU7797798A; DE69842165D1; BR9809456B1; JP4384244B2; CN1250725C; WO1998053078A1; EP0994949B1; BR9809456A; KR20010012893A; KR100702523B1

Abstract

(57)【要約】単離されたポリヌクレオチド分子は、組換えPIVワクチンの生成のための組換えPIVゲノム又はアンチゲノムを提供する。その組換えゲノム又はアンチゲノムは、単離された感染性PIV粒子を生成するために、ヌクレオチドタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）及び大きな（Ｌ）ポリメラーゼタンパク質と共に発現され得る。組換えPIVゲノム又はアンチゲノムは、所望する変化を生成するために、たとえば、生物学的に誘導されたPIV変異体からの弱毒化突然変異を組込むために、又はキメラPIVクローンを創造するために、すなわちワクチン使用のための弱毒化された免疫原ウィルスを生成するために修飾され得る。

Description

【発明の詳細な説明】クローン化されたヌクレオチド配列からの弱毒化パラインフルエンザウィルスワクチンの製造発明の背景ヒトパラインフルエンザウィルス（HPIV）、すなわちHPIV１，HPIV２、及びHP IV３は、乳児及び幼児における細気管支炎、偽膜性喉顎炎及び肺炎の主要原因である（Karronなど.，J ．Infect．Dis．172：1445-50(1995);Collinsなど．“Par ainfluenza Viruses”，p．1205-1243；B．N．Fieldsなど.，eds.，Fields Viro logy ，3rd ed，vol．1．Lippincott-RaVen Publ.，Philadelphia（1996）;Murph yなど.，Virus Res ．11：1-15(1988)）。それらのウィルスによる感染は、３才以下の年齢の幼児に実質的な病的状態をもたらし、そして呼吸気管感染のために乳児及び幼児間での約20％の入院の原因でもある。 HPIVに対する効果的なワクチン療法を開発するための相当な努力にもかかわらず、いづれかのHPIV株に対しても、又はHPIV関連疾病の回復のためにも、改良されたワクチン剤は、まだ達成されていない。今日まで、わずか２種の弱毒化された生PIVワクチン候補が特に注目されている。それらの候補の１つは、HPIV３に対して抗原的に関連し、そしてHPIV３に対して動物を保護することが示されているウシPIV(BPIV)株である。BPIV３は、弱毒化され、遺伝的に安定しており、且つヒト乳児及び幼児において免疫原性である(Karronなど，J ．Inf．Dis．171：1 107-14（1995a）；Karronなど.，J ．Inf．Dis．172：1445-1450(1995b))。第２のPIV３ワクチン候補、すなわちJS cp45は、HPIV３のJS野生型（wt）の低温適合変異体である（Karronなど，(1995b),前記；Belsheなど，J ．Med．Virol．10：235-42 （1982））。この弱毒化された低温−継代された（cp）生PIV３ワクチン候補は、感温性（ts）低温−適合性（ca）、及びインビボでのウィルス複製の後、安定性である表現型を示す。cp45ウィルスは、実験動物においてヒトPIV３攻撃に対して保護性であり、そして弱毒化され、遺伝的に安定しており、そしてセロネガティブヒト乳児及び幼児において免疫原性である（Hallなど，Virus Res ．22：1 73-184（1992）；Karronなど，(1995b),前記）。 HPIV３は、パラミクソウィルス(Paramyxovirus)科、モノネガビラレス(Monone gavirales)目のパラミクソウイルス属のメンバーである。そのゲノムは、長さ15 462個のヌクレオチド（nt）の一本鎖ネガティブ−センスRNAであり（Galinskiなど，Virology 165：499-510,（1988）；Stokesなど，Virus Res ．25：91-103（1 992））、そして少なくとも８種のタンパク質をコードする(Collinsなど，前記, （1996）；Galinski,前記，(1991)；Spriggs及びCollins，J ．Gen．Virol．67： 2705-2719，(1986)）。それらの３種のタンパク質は、ヌクレオキャプシド、すなわちヌクレオキャプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ及び大きなポリメラーゼサブユニットＬを形成するために、RNAゲノムに関係している。３種の追加のタンパク質、すなわちウィルス結合及び開放を仲介することが示されているユトリックスタンパク質Ｍ、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質HN、及び融合タンパク質Ｆは、エンベロープに関係している。２種の他のタンパク質、すなわちMN及びＦは、PIVの中和及び保護抗原を表わす(Collinsなど，Filds Virol ogy ， 3rd ed.，1：1205-43(1996))。異なったPIV間でのそれらの２種の保護抗原における有意な配列の相違が、それらの病原体に対する保護免疫性の型特異性のための基礎である。 PIVのもう１つのタンパク質、すなわちＣタンパク質は、Ｐタンパク質mRNAのオーバーラップ読取り枠(ORF)によりコードされ(Spriggs and Collins，1986)、そしてＤタンパク質はＰシストロンのRNA修正により生成される（Galinskiなど，Virology 186：543-50(1992)）。Ｐ mRNAはまた、Ｖと呼ばれるシステインに富んでいるドメインをコードする能力を有する内部ORFを含む。Ｖ ORFはまた、他のパラミクソウィルスにも見出されており、そして典型的には、RNA修正により入手されるが、しかしこれはPIVに関する場合ではない。現在、PIV V ORFが発現されるかどうかは知られていない。 PIVのウィルスゲノムはまた、ウィルスの複製及び転写のために必要とされるプロモーターを有する、遺伝子外リーダー及びトレイラー領域も含む。従って、 PIV遺伝子地図は、３’リーダーＮ−Ｐ／Ｃ／Ｄ−Ｍ−Ｆ−HN−Ｌ−トレイラーとして表わされる。転写は３’末端で開始し、そして遺伝子境界で見出される短い保存されたモチーフにより案内される連続的停止−開始機構により進行する。個々の遺伝子の上流端は、そのそれぞれのmRNAの開始を方向づける遺伝子−開始（GS）シグナルを含む。個々の遺伝子の下流端は、ポリアデニル化及び終結を方向づける遺伝子−末端（GE）モチーフを含む。 cp45及び他のPIV３ワクチン候補における弱毒化突然変異の同定が種々の理由のために興味あるものである。特に、それらの及び他のパラミクソウィルス、特に、追加の７％の小児科入院の原因であるHPIV１及びHPIV２に対して使用するための臨床的に許容できるワクチンを提供するために、弱毒化の遺伝子基礎を理解し、そして弱毒化されたHPIV３株の分子ウィルス学及び病因論を特徴づけることが有用であろう。それらの及び関連する目的を達成するためには、 cDNAからのwt表現型を有するウィルスを生成するための方法が、cp45ウィルスにおける突然変異がts，ca及びatt表現型を規定し、そしてBPIV３の遺伝子が弱毒化表現型を規定することを決定するために必要とされる。原型PIV３株、並びにJS wt HPIV３及びcp45株の完全なヌクレオチド配列は決定されている(Stokesなど，前記，(1992)；Stokesなど.，Virus Res ．30：43-52 (1993))。それらの研究から、cp45株は、親JS wt HPIV３株に比較して、少なくとも17個のヌクレオチド置換（その８個の置換は、ウィルスタンパク質に対する変化と相互関係する）を有することが示されている。しかしながら、それらの同定された突然変異のどれが、所望の、たとえばts，ca、及びatt表現型を規定するかどうかは、これまで示されたことはない。最近、非許容温度でのcp45の増殖が、47885wt PIV３株のＬ遺伝子のcDNAクローンの同時発現により補足されることが報告されており(Rayなど.，J ．Virol．70：580-584(1996))、これは、Ｌ遺伝子が、cp45の表現型に寄与する１又は複数の突然変異を含むことができることを示唆している。しかしながら、この研究の結果は、47885株がcp45のJS親と同遺伝子型ではない（たとえば、前記２種のウィルスはヌクレオチドレベルで４％の差異があり、そしてＬタンパク質が41のアミノ酸位置で異なる）事実によりわかりにくい（Stokesなど，前記，(1992)；公開された誤りがVirus Res．27：96 （1993）にあり；Virus Res ．25：91-103）。また、この補完法は、cp45の全体のts表現型へのＬ遺伝子突然変異の相対的寄与の明白な測定を提供していない。 PIV３及び他のRNAウィルスにおける弱毒化突然変異の獲得及び分析は、注目の特定のウィルスについてのcDNAを操作する効果的方法を必要とする。PIVのためのcDNAを同定するこれまでの進歩にもかかわらず、この及び他のネガティブ−センスRNAウィルスのゲノムRNAの操作は、困難であることがわかっている。これに関しての１つの主要障害は、それらのウィルスの裸のゲノムRNAが非感染性であることである。セグメント化されていないネガティブ鎖RNAウィルスの直接的な遺伝子操作のための好都合な方法がつい最近、開発され始めている（総説のためには、Conzel mann，J ．Gen．Virol．77：381-89（1996）；Raleseなど，Proc ．Natl．Acad．S ci．USA 93：11354-58，(1996)を参照のこと）。機能的ヌクレオカプシドは、Ｔ７ RNAポリメラーゼプロモーターを担持し、そしてゲノム又はアンチゲノムRNA 、並びにＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする、別々にトランスフェクトされたプラスミドの細胞内同時発現から都合良く、生成されて来た。その細胞内cDNA発現は、ワクシニア組換えウィルスにより同時感染せしめることによって生成されるＴ７ RNAポリメラーゼにより駆動される。このアプローチは最初に、cDNAによりコードされたミニレプリコンの転写及び複製必要条件を決定するために使用された。いくつかの成功が、ヌクレオカプシドＮ、リンタンパク質Ｐ及び大きなポリメラーゼサブユニットＬの存在下で、cDNAコードされたアンチゲノムRNAから感染性狂犬病ウィルス、水疱性口内炎ウィルス(VSv)、麻疹ウィルス及びSendai ウィルスを獲得するためにそれらの一般的な方法の適用により達成されて来た（ Garcinなど，EMBO J ．14：6087-6094(1995)；Lawsonなど，Proc ．Natl．Acad．S ci．USA 92：4477-81(1995)；Radeckeなど，EMBO J ．14：5773-5784（1995）；S chnellなど，EMBO J ．13：4195-203（1994）；Whelanなど，Proc ．Natl．Acad． Sci．USA 92：8388-92(1995)）。呼吸シンシチウムウィルス(RSV)がまた、cDNA コードのアンチゲノムから回収されているが、しかしこれはM2 ORF 1転写延長因子をコードする追加のプラスミドの転写を必要とした(Collinsなど.，1995)。感染性PIVウィルス及び他のモノネガビラレス(Mononegavirales)メンバーの獲得は、それらのセグメント化されていないネガティブ−鎖RNAゲノムのために複雑である。セグメント化されたゲノムウィルス、たとえばインフルエンザのゲノムリボヌクレオプロテイン複合体(RNP)は一般的に、サイズが小さく、そしてゆるく(loosely)構成されており、そしてRNA及び必要とされるウィルスタンパクシ質からインビトロで、アセンブルされ得る。しかしながら、PIV及び他のモノネガビラレスメンバーは、より大きく、且つよりきつく(tightly)構成されたRNPであり、これらはインビトロで、機能的会合しにくい。さらに、HPIV３ P mRNAのコード能力は、同時転写“RNA編集”により複雑化される（Galinskiなど，Virol ogy 186：543-50(1992)）。読取り枠におけるその得られるシフトは、ＰのＮ−末端部分に融合されるキメラとして発現される内部ORFに近づく。さらに、HPIV３は、上記に示されたように、キメラＶタンパク質を発現するほとんどの他のパラミクソウィルスとは異なっているように見える。HPIV３編集からのその対応するタンパク質組はまだ同定されておらず、そしてHPIV３の内部Ｖ ORFは多くの翻訳停止コドンにより編集部位から分離される。（Galinskiなど．(1992)，前記）。さらにもう１つの複雑化する要因は、BPIV３及びHPIV３による編集が、Ｐの上流半分が第２内部ORFによりコードされるドメインに融合されている新規のキメラタンパク質Ｄを生成することである(Peletなど，EMBO J ．10：443-448(1991)；G alinskiなど，前記，(1992))。そのＤタンパク質は、他のパラミクソウィルスにおいて、カウンターパートを有さない。前述の観点から、PIVに帰因する重大な健康問題、特にHPIV３に帰因する、乳児及び幼児間で疾病を緩和するための安全且つ効果的なワクチンを生成するための手段及び方法の早急な必要性が、当業界において存在する。非常に驚くべきことには、本発明は、それらの及び他の関連する必要性を満たすものである。発明の要約本発明は、感染性PIV中に、定義された予定の構造及び表現型変化を導入するための新規手段及び方法を提供する。本発明の１つの態様においては、作用可能に連結された転写プロモーター、PIVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列、及び転写ターミネーターを含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子が提供される。 PIVゲノム又はアンチゲノムは、ヒトもしくは非ヒトPIV配列、又は組換え的に修飾されたそのバージョンであり得る。１つの態様において、ポリヌクレオチド配列は、非ヒトPIV配列、たとえばウシPIV(BPIV)からの遺伝子又は遺伝子セグメントにより組換え的に連結されたヒトPIV配列を含んで成るキメラゲノム又はアンチゲノムをコードする。さらなる例においては、ポリヌクレオチドは、非ヒト PIVからの配列及びヒト又は非ヒト起源の少なくとも１つの他のPIVのキメラをコードする。他の態様においては、本発明は、組換えPIV(rPIV)ゲノム又はアンチゲノムを含んで成る、単離された感染性PIV粒子を提供する。その単離された感染性PIV粒子は、ウィルス又はサブウィルス粒子であり得る。本明細書において使用される場合、サブウィルス粒子とは、完全なウィルス（たとえば、完全なゲノム又はアンチゲノム、ヌクレオカプシド及びエンベロープを包含するアセンブルされたビリオン）に存在する、構造要素、たとえば遺伝子セグメント、遺伝子タンパク質、又はタンパク質機能ドメインを欠いているいづれかの感染性PI V粒子を意味する。従って、本発明のサブウィルス粒子の１つの例は、ゲノム又はアンチゲノム、並びにＮ，Ｐ及びＬ遺伝子の生成物を含む感染性ヌクレオカプシドである。他のサブウィルス粒子は、他の非必須構造要素の中で、非必須遺伝子及び／又はそれらの生成物（たとえば、F．HN,Ｍ又はＣ）の部分的又は完全な欠失又は置換により生成される。単離された感染性PIV粒子は好ましくは、ヒトPIV、より好ましくはヒトPIV３（HPIV３）である。本発明はまた、ウシ又はネズミPIV(BPIV又はMPIV)からの単離された感染性粒子、及び複数の異なったPIVゲノムからのキメラ配列を含んで成る粒子、たとえばHPIV３及びHPIV１からの、HPIV３及びHPIV２配列からの、又はHPIV３及びBPIV配列から成るポリヌクレオチド配列を組込んでいる粒子を提供する。本発明の関連する観点においては、異種PIV、たとえばHPIV１，HPIV２，BPIV 又はMPIVからの少なくとも１つの配列に連結されたHPIV３からのヌクレオチド配列を組込んでいる、単離された感染性PIV粒子が提供される。たとえば、HPIV３の全遺伝子は、PIVの他の形からのカウンターパート遺伝子、たとえばPIV１又は PIV２のHN及び／又はＦ糖タンパク質遺伝子により置換され得る。あるいは、選択された遺伝子セグメント、たとえばHPIV１又はHPIV２のHN又はＦの細胞質末端、トランスメンブランドメイン又はエクトドメイン（ectodomain）は、キメラタンパク質、たとえはPIV１又はPIV２のエクトドメインに融合された、PIV３の細胞質末端及び／又はトランスメンブランドメインを有する融合タンパク質をコードする構造体を生成するために、カウンターパートのHPIV３遺伝子における対応する遺伝子セグメントにより置換され得る。他の方法として、１つのPIVからの遺伝子又は遺伝子セグメントは、得られるクローン内に新規の免疫原性質を創造するために、異種PIVバックグラウンド内に付加され得る（すなわち、置換を伴わないで）。他の修飾は、所望の表現型変更、たとえばPIPの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、改良されたインビトロ増殖、又は免疫原性エピトープの変化をもたらす変更をコードするよう選択された、ヌクレオチド挿入、転位、欠失、又は置換をPIVゲノム又はアンチゲノム中に導入することによって生成され得る。本発明の１つの観点においては、生物学的に誘導された、弱毒化されたPIVに存在する突然変異は、同定され、そして十分な長さのPIVクローン中に個々に、又は組合して導入される。典型的には、それらの突然変異は、野生型PIV対する、生物学的に誘導された変異体ウィルスにより示される単一のアミノ酸変化、たとえばts，ca、又はatt表現型を有するPIV変異体により示される変化である。生物学的に誘導された変異体PIVからのそれらの変化は、得られるウィルスにおける所望の特徴を規定するために組換えPIVクローン中に組込まれる。典型的な突然変異は、HPIV３株JS cp45における弱毒化された表現型を規定するアミノ酸変化を包含する。それらの中で、典型的な突然変異は、ts，ca 又はatt表現型を規定するPIVポリメラーゼ遺伝子Ｌ内に存在する突然変異、たとえばJS野生型PIV株のTyr₉₄₂，Leu₉₉₂，及び／又はThr₁₅₅₈で存在するアミノ酸置換である。より詳細な観点においては、Tyr₉₄₂がHisにより置換され、Leu₉₉₂がP heにより置換され、そして／又はThr₁₅₅₈がIleにより置換されている弱毒化されたPIV組換え体が記載される。所望の特性、たとえば弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲の制限、等を生成するために感染性クローンのゲノム又はアンチゲノム中に選択された組換えで導入された複数の表現型−特異的突然変異を有する組換えPIVがまた、本発明内に提供される。たとえば、生物学的に誘導されたPIV変異体から採用された少なくとも２種の異なった突然変異、たとえばHPIV３ JS cp45からの２種のts突然変異を組込むPIVクローンが提供される。従って、多様に弱毒化されたウィルスが、同定された損傷の“メニュー”から突然変異を選択し、そしてそれらの突然変異を、ワクチンウィルスを、弱毒化、免疫原性及び安定性の選択されたレベルに対応せしめるために種々の組合せで導入することによって得られる。さらなる態様においては、本発明は、生物学的に誘導されたPIVから採用された１又は複数の突然変異の、同じか又は異なった遺伝子を包含する追加のタイプの突然変異による補足を提供する。これに関しての突然変異のための標的遺伝子は、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、大きなポリメラーゼサブユニットＬ、マトリックスタンパク質Ｍ，赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質HN、融合タンパク質Ｆ並びにＣ，Ｄ及びＶ ORF生成物を包含する。好ましい観点においては、生物学的に誘導されたPIVから採用された弱毒化突然変異が、キメラPIV組換え体、たとえばHPIV３及びHPIV１の両者、又はHPIV及びBPIV 両ウィルスからのヌクレオチド配列を有するPIV組換え体内に導入される。他の態様においては、本発明は、PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子から、感染性PIV粒子、たとえばウィルス又はサブウィルス粒子を生成するための方法を提供する（また、1997年５月23日に出願された係属中のアメリカ合衆国特許出願第60／047575号を参照のこと；それは引用により本明細書中に組込まれる）。それらの方法に従って、感染性PIV粒子を生成するためには、PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターが、PIVのＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターと共に、細胞又は細胞−フリーシステムにおいて同時発現され、それにより、感染性PIV粒子が生成される。 PIVゲノム又はアンチゲノム、並びにＮ，Ｐ及びＬタンパク質は、単一の発現ベクター、又は別々の発現ベクターにより同時発現され得る。他の態様においては、Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質は、別々の発現ベクターに基づいて、個々にコードされる。前記方法内においては、PIVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子は、ヒト、ウシ又はネズミPIVのゲノム又はアンチゲノム配列に対応することができる。あるいは、PIVコードのポリヌクレオチドは、ヒトPIVゲノム又はアンチゲノム配列及び少なくとも１つの非ヒトPIVゲノム又はアンチゲノム配列のキメラであり得る。感染性PIVを生成するための追加の方法においては、P IVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチドは、複数のヒトPIVゲノムのキメラ、たとえは１又は複数の関連する形のヒトPIV、たとえばヒトPIV１又はヒトPIV２からの配列に連結される、HPIV３からの配列を含むポリヌクレオチドである。ヒトPIV３の個々の遺伝子は、キメラPIVをコードする修飾されたゲノム又はアンチゲノムを生成するために、異種PIVからのカウンターパート遺伝子、たとえばPIV１又はPIV２のHN及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換され得る。あるいは、選択された異種遺伝子セグメント、たとえばHPIV１又はHPIV２のHN 又はＦの細胞質末端、トランスメンブランドメイン又はエクトドメインは、キメラタンパク質、たとえばPIV１又はPIV２のエクトドメインに融合されたPIV３の細胞質末端及び／又はトランスメンブランドメインを有する融合タンパク質をコードする構造体を生成するために、異なったPIV型又は異なった遺伝子、たとえばHPIV３のHN又はＦにおけるカウンターパートの遺伝子セグメントにより置換され得る。感染性PIVを生成するためのさらにもう１つの方法においては、PIVゲノム又はアンチゲノムは、ヒトPIVゲノム又はアンチゲノム配列、及び少なくとも１つの非ヒトPIV配列のキメラ、たとえはヒト及びウシの両PIVからの配列を含むポリヌクレオチドを生成するために修飾される。感染性PIVを生成するための他の方法においては、PIVゲノム又はアンチゲノムが、所望の表現型の変更、たとえばPIVの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープにおける変化をもたらす変更をコードするよう選択された、ヌクレオチドの挿入、転位、欠失又は置換により修飾される。あるいは、PIVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子は、意図された宿主において保護免疫応答を誘発することができる非−PIV分子、たとえばサイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、又は異なった微生物病原体（たとえば、ウィルス、細菌又は菌類）のタンパク質をコードするよう修飾され得る。１つの態様においては、PIVゲノム又はアンチゲノムは、ヒトRSV、又は麻疹ウィルスからのタンパク質をコードするよう修飾される。本発明の他の態様においては、PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクター、並びにPIVのＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターを組込む、細胞又は細胞−フリー発現システム（たとえば、細胞−フリー溶解物）が提供される。発現に基づいて、ゲノム又はアンチゲノム、並びにＮ，Ｐ及びＬタンパク質が、感染性PIV粒子、たとえばウィルス又はサブウィルス粒子を生成するために結合する。PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子、並びにPIVのＮ，Ｐ、及びＬタンパク質をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子は、単一のベクターにより発現され得、又は１もしくは複数のＮ，Ｐ及びＬタンパク質は、複数の別々のベクター中に組込まれ得る。図面の簡単な説明図１は、HPIV３ゲノムRNAの完全なコピーをコードするプラスミドｐ218（131 ）の構成を示す。ｐ218(A^★A'CC'D^★E)のダイアグラム（上部左）は、HPIVゲノムのヌクレオチド１に隣接するδリボザイム及びＴ７ターミネーターの位置を示す。ｐ（E^★FF'GHIJKL^★）の上部右のダイアグラムは、７個の配列決定マーカー (星印)(下記図２を参照のこと)、及びHPIV３のヌクレオチド15462に隣接するＴ７プロモーターの位置を示す。十分な長さのゲノムcDNAを構成するために使用される15のオーバーラップするクローンが、２種のプラスミドの外部上に文字により示される。ユニーク制限部位NgoMI及びXhoＩが、底部に示されるHPIV３の完全なネガティブ−センスのゲノムRNAをコードするｐ218（131）をクローン化するために使用された。JSと組換えJSとを区別するｐ218（131）における個々の配列決定マーカーの位置は星印により示される。図２は、HPIV３のHN（１）及びＬ（２）遺伝子のcDNAによりコードされたゲノムRNAにおける配列マーカーを示す。配列はネガティブセンスであり、突然変異はボックスで囲まれている。１）7903での非コードnt置換は、JS wtからHgaＩ部位を除く。7913及び7915でのJS cDNAにおけるヌクレオチド置換は、ScaＩ部位を創造し、そしてアミノ酸370をプロリンからトレオニンに変え、mAb170／７及び423／６により認識される抗体エピトープを除去する。また、HN遺伝子は、これまで認識されたことがないnt7593での追加の点突然変異を含むことが見出された。これは、HNタンパク質におけるアミノ酸位置263でのトレオニンのイソロイシンへの変化をもたらす。２）プラスミド構成又はアセンブリーの間に生じた、JS cDNAのＬ遺伝子における３種の偶発的な非コード突然変異。図３は、PIV３−CAT cDNA（上部；環状プラスミドとして描かれている）、及びコードされたミニゲノムRNA（低部；一本鎖のネガティブ−センスRNA（３’→ ５’）として描かれている）の図を包含する。プラスミド：Ｔ７プロモーターは、転写の方向を示す黒の矢印として示される。位置は、δリボザイム、Ｔ７転写ターミネーター、挿入されたワクシニアウィルス転写ターミネーター（T₇CT及びT₅AT）、制限酵素部位、及びコードされたミニゲノムの種々のドメインのためのコード配列に関して示される。ミニゲノムRNA：ミニゲノムの５’（右側）端は、２種の非ウィルスＧ残基の延長に寄与する、Ｔ７ RNAポリメラーゼのためのプロモーターにより定義される。それらは、長さの計算には包含されない。３’端は、リボザイムにより定義され、そしていづれの異種ヌクレオチドも有さない。PIV３−特異的領域は、空白のボックスとして示される。CAT ORFは、影がつけられており、そして翻訳開示（UAC）及び終結(AUU)コドンのネガティブ−センス相補体が示される。ヌクレオチド位置は、最とも短い898−ヌクレオチドのミニゲノムに従って示される。特定領域のヌクレオチドの長さは、括弧内に示される。位置90〜124（３’→５’ 、ネガティブ−センス）の配列が底部に示され；PIV３−特異的配列には下線が引かれており、ワクシニアウィルス転写ターミネーターの相補体には上線が引かれており、XbaＩ部位の相補体はイタリック体で示されており、そしてCAT ORFのための翻訳開始コドンの相補体は太字で示されている。PIV３−CAT ０〜＋６をもたらす、０〜６個のＧ残基が挿入された部位が、示される。略語：GS，転写遺伝子−開始モチーフ；GE ，転写遺伝子−末端終結／ポリアデニル化モチーフ；NT，非翻訳遺伝子配列。図４は、ミニゲノムPIV３−CAT ０〜＋６によるCAT酵素の発現を示す。細胞は、示されるPIV３−CATミニゲノム、並びにＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドによりトランスフェクトされ、そしてＴ７RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルス組換えvTF7−３により同時に感染された。溶解物が感染の 48時間後に調製され、そして3000個の細胞を示すサンプルがCAT活性について分析された。活性は、６の倍数である＋２ミニゲノムに対して、100として示される。Ｌプラスミドが除去されているサンプルは、それらの条件下で検出できるCA T活性を有さなかった。図５Ａ及び５Ｂは、PIV３−CATミニゲノム０〜＋６によるミニ−アンチゲノム RNAの合成を示す。細胞が図４に記載されるようにしてトランスフェクトされ、そして感染された。但し、Ｎプラスミド（レーン１）又はＬプラスミド（レーン２）が削除された対照を除く。個々の場合において、トランスフェクトされたPI V３−CATミニゲノムプラスミドが示される。細胞溶解物がトランスフェクションの48時間後に調製され：１つのアリコートはミクロコッカスヌクレアーゼにより処理され（処理された）、そして第２のアリコートは擬似（mock）処理され（処理されていない）、続いてRNA精製のために処理された。RNAは、ネガティブ−センスCATリボプローブとのノザンブロットハイブリダイゼーションにより分析された。ヌクレアーゼ処理のマーカー及び対照として、RSV−CAT Ｃ２ミニゲノム（Grosfeldなど.，J ．Virol． 69：5677-5686(1995)、引用により本明細書中に組込まれる）がRSV Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質により補完され、そして同時に処理された（レーン10）。ハイブリダイズされたブロットのオートラジオグラムが、図５Ａに示される。図５Ｂは、＋２ミニゲノムに対するハイブリダイゼーションの量が、処理された及び処理されていないサンプルに関して別々に計算されているホスホルイメージャー（phosphorimager）分析を示す。図６Ａ及び６Ｂは、PIV３−CATミニゲノム０〜＋６による、ポリアデニル化されたmRNAの分析を示す。図５Ａ及び５Ｂに示されるのと同じ実験からの細胞のアリコートを用いて、全細胞内RNAを、感染の48時間後に収穫し、そしてネガティブ−センスCATリボプローブとのノザンブロットハイブリダイゼーションにより分析される、結合された及び結合されていない画分に、オリゴ（dT）クロマトグラフィーにより分別した。図６Ａは、ハイブリダイズされたブロットのオートラジオグラムを示す。図６Ｂは、ハイブリダイゼーションの量が＋２ミニゲノムの結合されたRNA画分に対して標準化されているホスホルイメージャー分析を示し、２ｄは、結合された画分及び結合されていない画分に関して、別々に計算された。図７Ａ及び７Ｂは、PIV３−CATミニゲノム０〜＋６をコードするプラスミドに応答しての細胞内ミニゲノムの蓄積を示す。これは、図５Ａ及び５Ｂに示される実験の継続である。従って、ミニゲノム並びにＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドによりトランスフェクトされ、そしてvTF７−３により感染された細胞を、トランスフェクションの48時間後に収穫し、そして細胞溶解物を調製した。溶解物の１つのアリコートを、ミクロコッカスヌクレアーゼにより処理し（処理された）、そして他を、擬似（mock）処理し（処理されていない）、続いて、RNA精製のために処理した。RNAを、ポジティブ−センスCAT リボプローブとのノザンブロットハイブリダイゼーションにより分析し、他方図５Ａにおいては、リボプローブは、ネガティブ−センスであった。図７Ａは、ハイブリダイズされたブロットのオートラジオグラムを示す。図７Ｂは、＋２ミニゲノムに対してのハイブリダイゼーションの量が、処理された及び処理されていないサンプルに関して、別々に計算されているホスホルイメージャー分析を示す。図８〜10は、ｐ３／７(131)２Ｇの構成を示す。ｐ３／７(131)２Ｇは、完全なポジティブ−センスHPIV３アンチゲノムをコードし、そしてアンチゲノムのＴ７プロモーターとヌクレオチド１との間に２つのＧ残基を含む。その構成は、ネガティブ−センスゲノムをコードするcDNA218（131）の左及び右半分の別々の修飾に関与した。同じ手段を用いて、２つのＧ残基が除去されていることを除いて、ｐ３／７(131)２Ｇに対して同一である第２のcDNA、すなわちｐ３／７(131)を構成した。図８は、ｐ218(A^★A'CC'D^★E)のリボザイム及びＴ７転写ターミネーターを、２つのＧ残基を含むＴ７プロモーターにより置換することによって実施される、ｐ（Left+２Ｇ）の構成を示す。ｐ218(A^★A'CC'D^★E)は、Ｔ７プロモーターを導入された左側PCRプライマーを用いて、HPIV３ゲノムの左側の1224個のヌクレオチド（右側の長方形のラベルされた“PIV３seq.”）を増幅するPCRにおいて鋳型として使用された。このPCRフラグメントを、ｐ218(A^★A'CC'D^★E)のMluＩ−Pml Ｉウインドウ中にクローン化し、ｐ（Left−２Ｇ）をもたらした。図９は、ポジティブ−センス（アンチゲノム）鎖においてPIV３ヌクレオチド15642に隣接して配置されるリボザイム及びＴ７ターミネーターによりｐ(E^★FF'GHIHKL^★)のＴ７プロモーターを置換することによって実施されるｐ(Right＋)の構成を示す。ｐ(E^★FF'GHIHKL^★）が、δリボザイムの一部（天然に存在するRsrII部位を含む）を付加した突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、右側の649個のヌクレオチドのHPIV３ゲノム（左側の長方形のラベルされた“PIV３seq.”）を増幅するPCRにおいて鋳型として使用された。このPCR生成物を、ｐ３／７のRsrII−BssHIIウインドウ中にクローン化し、pPIV３−３／７を生成し、従って、Ｔ７ターミネーターを端に有する完全なリボザイムを再構成した。pPIV３−３／７のSwaＩ−NgoMIフラグメントを、ｐ(E^★FF'GHIHKL^★)のSw aＩ−NgoMIウインドウ中にクローン化し、ｐ(Right＋)をもたらした。７個の配列マーカーの位置は、星印により示される。図10は、ｐ３／７(131)２Ｇの構成を示す。ｐ(Right＋)のNgoMI−XhoＩフラグメントを、ｐ（Left＋２Ｇ）のNgoMI−XhoＩ窓中にクローン化し、ｐ３／７(131 )２Ｇをもたらした。HPIV３遺伝子の位置は示されている。配列マーカーの位置は星印により示される。図11は、ネガティブ−センスの組換えPIV３の配列確認を示す。7903，7913及び7915での突然変異を包含する1379bpのフラグメント（ヌクレオチド7334−8713 ）を、感染された細胞からのRNAのRT-PCRにより生成し、そしてサイクル−配列決定により分析した。JSから組換えPIVを分化する突然変異は、矢印により示される。nt7897〜7922の完全な配列が、太字で示される３種のヌクレオチド差異と共に、個々のゲルの次の端に示される。図12は、Ｌタンパク質配列における位置942，992及び1558でのアミノ酸置換を有するPIV３ L cDNAを含む、プラスミドpTM(Ｌ)942 ／992／1558の地図を提供する。個々のコード変化の相対的位置が、マーカーとして故意に除去された天然に存在する制限部位及びaa差異と共に示される。クローニングのために使用される制限部位(SphＩ，PinAI，BamHI及びNheＩ)が示される。矢印は、Ｌタンパク質コード配列の方向を示し、そしてアミノ酸位置に従って番号づけされている。図13は、本発明内の代表的な突然変異を担持する組換えPIV３ウィルスの図示である。図14は、PIV３ HN及びＦ ORFがPIV１のそれらにより置換されているキメラPIV ３−PIV１アンチゲノムをコードするcDNAの構成を示す。最初に（底部左から開始して）、PIV３Ｆ及びHN遺伝子を、十分な長さのPIV３ cDNAクローンｐ３／７(131)２Ｇ（パネルＡ）からサブクローン化し（BspEII−XhoＩ及びEcoRI−Spe Ｉフラグメントとして）、それぞれpLit．PIV３．F3a及びpLit．PIV３．NH4（パネルＢ）を生成した。PCR突然変異誘発（パネルＣ）を実施し、PIV３Ｆ及びHN 遺伝子の完全なコード領域を欠失し、そして新しい制限部位（ボックスにより囲まれる）を導入した。PIV１Ｆ及びHN cDNAを、RT−PCRにより感染された−細胞RNAから調製し、そしてpLITMUS28中にクローン化した（パネルＤ）。それらのクローン、すなわちpLit．１Fwt及びpLit．１HNwtを、PIV３欠失において導入された制限部位と適合する新規制限部位を導入するためにそれらの開始及び停止コドンでのPIV１Ｆ及びHN遺伝子の修飾のための鋳型として使用した（パネルＥ）。キメラＦ及びNH遺伝子が、pLit．PIV３−１．Fhc及びpLit．PIV３−１．HNh cを生成するために、PIV３欠失中にPIV１コード領域を導入することによって構成された（パネルＦ）。キメラＦ及びHNを一緒にアセンブルし、pSE．PIV３−１．hcを生成した（パネルＧ）。Ｆ及びHNキメラセグメントを、十分な長さのPIV３クローンｐ３／７(131)２Ｇ中に、そのBspEI −SphＩフラグメントを置換することによって導入し、pFLC．２Ｇ−.hを生成した（パネルＨ）。遺伝子間の小さなボックスは、遺伝子末端、遺伝子間、及び遺伝子開始領域を示し、そして線は非コード領域を示す。濃い色の部分はPIV１からであり、空白のボックスはPIV３からである。黒色の矢印はＴ７プロモーターを示し、そして黒色のボックスは肝炎δウィルス(HDV)のリボザイムを示す。図15Aは、キメラrPIV３−１のキメラHN及びＦ遺伝子（中間）と共に、rPIV３／JS（上部；他方では、本明細書において、rJS及びJS wt rPIV３として言及される）及びPIV１／Wash64（底部）のHN及びＦ遺伝子の図である。PIV３からPIV １への配列移行を含む４種の連結領域がボックスで囲まれており、そしてＩから IVまで番号づけされている。遺伝子間の個々の小さなボックスは、遺伝子末端、遺伝子間及び遺伝子開始領域を示し、そしてラインは非コード領域を示す。図14 Bにおいて使用される、PIV３Ｍ及びＬ遺伝子に対して特異的な（上部でのプライマー対Ａ）、又はPIV１Ｍ及びHN遺伝子に対して特異的な（底部でのプライマー対Ｂ）RT−PCRプライマーが、矢印により示される。図15Ｂは、鋳型としてビリオンRNA(vRNA)、及び図14Ａに記載されるPIV３−又はPIV１−特異的プライマー対を用いて生成されたRT−PCR生成物の評価を示す。逆転写段階は、PCR生成物がRNAに由来することを確かめるために、示されるように、個々の鋳型の重複体においては削除された。rP1V３−１に関しては、PIV３ −特異的プライマー対Ａが予測される4.6kbの生成物を生ぜしめ、そしてrPIV３ −１に存在しないPIV−１配列に対して特異的なプライマー対Ｂは生成物を生成しなかった。rPIV３／JS（rPIV３としてラベルされる）又はPIV１／Wosh64(PIV１としてラベルされる)vRNAを用いての陽性対照が同時に示されている。図16は、決定された、図14Ｂに示されるrPIV３−１のRT−PCR生成物におけるP IV３−PIV１連結の配列を示す。４種の連結領域（領域Ｉ−IV）の個々のための配列が示されており、そしてrPIV３／JS（上部ライン）及びPIV１／Wash64（下部ライン）のその対応する領域（RT−PCR生成物から同時に配列決定された）と共に一列配列されている。垂直の棒は配列同一性を示し、そしてボックスで囲まれた領域は導入された突然変異及び制限部位を示す。キメラＦ遺伝子におけるGl nのGluコドンへの変化が濃いボックスにより示される。開始及び停止コドンは下線が引かれている。図17は、rPIV３（左）又はPIV１（右）に比較しての、rPIV３−１のRT−PCR生成物の領域III（左）及びIV（右）についての配列決定ゲルを示す。開始及び停止コドンはボックスにより示され、制限部位は矢印により示される。図18は、組織培養物における親及びキメラPIVの多サイクル増殖を示す。LLC− MK２細胞単層培養物を、0.01のMOIでウィルスにより接種し、そしてウィルス感染された細胞を、トリプシンの存在下で32℃でインキュベートした。組織培養物上清液を24時間の間隔で収穫し、そしてウィルス−感染された培養物を同定するために、赤血球吸着を用いての同じTCID₅₀アッセイにおいて分析した。個々の点は、示されるS．E．と共に、３種の別々の培養物の平均力価を表わす。水平の点線は、ウィルス検出の下限を示す。図19は、pFLC．２Ｇ＋．hc、すなわちキメラウィルスrPIV３−１のアンチゲノムcDNAクローン中への３種のＬ遺伝子突然変異の導入を示す。pTM(Ｌ)942／992 ／1558（Ａ）は、cp45に見出される３種の突然変異を担持するＬ遺伝子のプラスミドクローンである。PIV ３Ｌタンパク質におけるアミノ酸位置942での突然変異は、tyr(wt)→his(cp45) の置換であり、そして近くのEaeＩ部位はこの部位を示すために削除された。同様に、992突然変異はleu→phe変化であり、そしてBsrＩ部は削除され、そして15 58突然変異はthr→ile変化であり、そしてAvaII部位は削除された。pTM(Ｌ)942 ／992／1558に存在する2.9kbのSphＩ−NheＩフラグメントを、pFLC．２Ｇ＋hc（Ｂ）、すなわちrPIV３−１の十分な長さのcDNAクローンを担持するプラスミド中に導入し、pFLC＋hc．cp45Ｌ（Ｃ）を得た。（Ｂ）及び（Ｃ）における構造体に関しては、黒色のボックスはＤ型肝炎ウィルスのリボザイム及びＴ７ターミネーターの位置を示し、そして濃い領域はPIV１ HN及びＦ ORFであり、そして空白のボックスはPIV３に由来する配列を示す。pFLC．２Ｇ＋hc．cp45Ｌをトランスフェクションに使用し、rPIV３−１．cp45Ｌと命名された、弱毒化されたキメラ組換えウィルスを生成した。特定の態様の記載本発明は、単離されたポリヌクレオチド分子、好ましいcDNAから感染性PIVを生成し、そして修飾するための組成物及び方法を提供する。感染性PIV粒子は、感染性PIV中への定義された変化の導入を可能にする組換え同時発現系により生成される。それらの修飾は、広範囲の種類の用途、たとえば予定された、定義された弱毒化突然変異を担持する弱毒化された生存ワクチン株の開発において有用である。本発明の感染性PIVは、転写、複製ヌクレオカプシドを生成するために必要なウィルスタンパク質をコードする１又は複数のポリヌクレオチドと一緒に、PIV ゲノム又はアンチゲノムRNAをコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子の細胞内又は細胞 −フリーの同時発現により生成される。感染性PIVを生成するための同時発現のために有用なウィルスタンパク質の中には、次のものが存在する：主要ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｐ）、大きな（Ｌ）ポリメラーゼタンパク質、融合タンパク質（Ｆ）、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ糖タンパク質(NH)、及びマトリックス（Ｍ）タンパク質。PIVのＣ，Ｄ及びＶ ORFの生成物もまた、本発明において有用である。 PIVゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAが、感染性PIVを形成するために、必要なウィルスタンパク質による細胞内又はインビトロ同時発現のために構成される。“PIVアンチゲノム”とは、子孫PIVゲノムの合成のための鋳型として作用する単離されたポジティブ−センスのポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくは、転写し、複製するヌクレオカプシドを生成するのに必要なタンパク質をコードする相補的配列のポジティブ−センスの転写体によるハイブリダイズの可能性を最少にするために、複製性中間体RNAに対応するPIVゲノム、又はアンチゲノムのポジティブ−センスバージョンであるcDNAが構成される。本発明のいくつかの態様においては、組換えPIV(rPIV)のゲノム又はアンチゲノムは、それによりコードされるウィルス又はサブウィルス粒子を感染性にするのに必要なそれらの遺伝子又はそれらの一部を単に含む必要がある。さらに、前記遺伝子又はそれらの一部は、１よりも多くのポリヌクレオチド分子により供給され得、すなわち１つの遺伝子は別々のヌクレオチド分子からの相補性又は同様のものにより供給され得る。他の態様においては、PIVゲノム又はアンチゲノムは、プラスミド又はヘルパー細胞系により提供されるヘルパーウィルス又はウィルス機能の関係を伴わないで、ウィルス増殖、複製及び感染のために必要なすべての機能をコードする。 “組換えPIV”とは、組換え発現系に直接的に又は間接的に由来するか又はそれらから生成されるウィルス又はサブウィルス粒子から増殖された、PIV又はPIV 株ウィルス又はサブウィルス粒子を意味する。組換え発現系は、PIV遺伝子発現において調節的な役割を有する少なくとも１つの遺伝子要素又は複数の遺伝子要素、たとえはプロモーター、PIV RNA中に転写される構造又はコード配列、及び適切な転写開始及び終結配列のアセンブリーを含んで成る組換え発現ベクターを用いるであろう。 cDNA−発現されたPIVゲノム又はアンチゲノムから感染性PIVを生成するためには、ゲノム又はアンチゲノムが、（ｉ）RNA複製できるヌクレオカプシドを生成し、そして（ii）子孫ヌクレオカプシドを、RNA複製及び転写の両者のために有能にするのに必要なそれらのPIV Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質と共に同時発される。ゲノムヌクレオカプシドによる転写は、他のPIVタンパク質を提供し、そして生産性感染を開始せしめる。他方では、生産性感染のために必要とされる追加のPI Vタンパク質は、同時発現により供給され得る。上記ウィルスタンパク質と共にPIVアンチゲノム又はゲノムの合成はまた、たとえば組合された転写−翻訳反応、続く細胞のトランスフェクションを用いて、インビトロ（細胞−フリー）で達成され得る。他方では、アンチゲノム又はゲノムRNAは、インビトロで合成され、そしてPIVタンパク質を発現する細胞中にトランスフェクトされ得る。本発明の一定の態様においては、転写し、複製するPIVヌクレオカプシドを生成するのに必要なタンパク質をコードする相補的配列が、１又は複数のヘルパーウィルスにより供給される。そのようなヘルパーウィルスは、野生型でも又は変異体でもあり得る。好ましくは、ヘルパーウィルスは、PIV cDNAによりコードされるウィルスとは、表現型的に区別され得る。たとえば、ヘルパーウィルスとは免疫学的に反応するが、しかしPIV cDNAによりコードされるウィルスとは反応しないモノクローナル抗体を供給することが所望される。そのような抗体は、中和抗体であり得る。いくつかの態様において、前記抗体は、組換えウィルスからヘルパーウィルスを分離するためにアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用され得る。そのような抗体の獲得を助けるためには、突然変異が、たとえばHN又はＦ糖タンパク質遺伝子に、ヘルパーウィルスからの抗原多様性を付与するためにPIV cDNA 中に導入され得る。本発明の他の態様においては、Ｎ，Ｐ，Ｌ及び他の所望のPIVタンパク質は、ゲノム又はアンチゲノムをコードするベクターと同じか又は異なる１又は複数の非ウィルス性発現ベクターによりコードされる。追加のタンパク質が、所望により含まれ得、その個々のタンパク質はそれ自体のベクターにより、又は１もしくは複数のＮ，Ｐ，Ｌ及び他の所望するPIVタンパク質、又は完全なゲノムもしくはアンチゲノムをコードするベクターによりコードされる。トランスフェクトされたプラスミドからのゲノム又はアンチゲノム、及びタンパク質の発現は、たとえばＴ７RNAポリメラーゼのための発現系、たとえばＴ７RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルスMVA株組換え体による感染、トランスフェクション又はトランスダクションにより供給される、Ｔ７RNAポリメラーゼのためのプロモーターの制御下にある個々のcDNAにより達成され得る(Wyattなど.，Virology，210 ：202-205（1995）；引用により本明細書に組込まれる）。ウィルスタンパク質、及び／又はＴ７RNAポリメラーゼはまた、形質転換された哺乳類細胞により、又は予備形成されたmRNAもしくはタンパク質のトランスフェクションにより供給され得る。 PIVアンチゲノムは、PIV mRNA又はゲノムRNAの逆転写されたコピーのポリメラーゼ鎖反応又は同様のもの(PCR；たとえば、アメリカ特許第4,68 3,195号及び第4,683,202号、及びPCR Protocols：A Gudide to Methods and App lications，Innisなど.，eds.，Academic Press，San Diego（1990）；個々は引用により本明細書中に組込まれる）により、完全なアンチゲノムを凝集体において表わすクローン化されたcDNAセグメントをアセンブルすることによって、本発明への使用のために構成され得る。たとえば、適切なプロモーター（たとえば、Ｔ７RNAポリメラーゼプロモーター）から、アンチゲノムの左側端までを含むcDN Aを含んで成る第１構造体が生成され、そして適切な発現ベクター、たとえばプラスミド、コスミド、ファージ、又はDNAウィルスベクターにおいてアセンブルされる。ベクターは、突然変異誘発、及び／又はアセンブリーを促進するよう企画されたユニーク制限部位を含む合成ポリリンカーの挿入により修飾され得る。容易な調製のためには、Ｎ，Ｐ，Ｌ及び他の所望するPIVタンパク質は、１又は複数の別々のベクターにおいてアセンブルされ得る。アンチゲノムプラスミドの右側端は、所望により、追加の配列、たとえばフランキングリボザイム及びタンデムＴ７転写ターミネーターを含むことができる。リボザイムは、単一の非ウィルス性ヌクレオチドを含む３’末端を生成するハンマーヘッド型（たとえば、Gr osfeldなど，(1995)，前記）であり得、又は他の適切なリボザイム、たとえば非 −PIVヌクレオチドを有さない３’末端を生成する肝炎デルタウィルス（Perrott aなど，Nature 350：434-436（1991）；引用により本明細書に組込まれる）のリボサイムのいづれかであり得る。次に、左側及び右側端が、共通する制限部位を通して連結される。種々のヌクレオチド挿入、欠失及び転位が、cDNAの構成の間、又はその後で、 PIVゲノム又はアンチゲノムにおいて行なわれ得る。たとえば、特定の所望のヌクレオチド配列が、合成され、そして常用の制限酵素部位を用いて、cDNAにおける適切な領域で挿入され得る。他方では、そのような技法、たとえば部位特異的突然変異誘発、アラニンスキャンニング、PCR突然変異誘発、又は当業界において良く知られている他のそのような技法が、cDNA中に突然変異を導入するために使用され得る。ゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAを構成するためのもう１つの手段は、サブユニットcDNA成分の数を、１又は２つなどの少ない断片に減じるために、改良されたPCR条件（たとえば、Chengなど，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 91：5 695-5699(1994)に記載のような；これは引用により本明細書中に組込まれる）を用いての逆転写−PCRを包含する。他の態様においては、異なったプロモーター（たとえば、Ｔ３，SP６）、又は異なったリボザイム（たとえば、肝炎デルタウィルスのリボザイム）が使用され得る。異なったDNAベクター（たとえば、コスミド）が、大きなサイズのゲノム又はアンチゲノムを良好に提供するための増殖のために使用され得る。ゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド（たとえは、cDNA）は、生産性PIV感染を支持することができる細胞、たとえばHEp−２，FR hL−DBS２,LLC−MK２,MRC−５及びVero細胞中にトランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入、トランスダクション又は同様の手段により挿入され得る。単離されたポリヌクレオチド配列のトランスフェクションは、たとえばリン酸カルシウム−介在性トランスフェクション(Wiglerなど.，Cell 14：725 （1978）；Corsumo and Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603（1981）；Gra ham and Van der Eb，Virology 52：456(1973))、エレクトロポレーション(Neun lannなど，EMBO J ．１：841-845(1982))，DEAE−デキストラン介在性トランスフェクション（Ausube lなど，(ed.)Current Protocols in Molecular Biology ，John Wiley and Sons ，Inc.，NY(1987)）、カチオン性脂質介在性トランスフェクション(Hawley−Nel sonなど，Focus 15：73-79(1993))、又は市販のトランスフェクション試薬、たとえばLi 手段により、培養された細胞中に導入され得る（前記個々の引例は、引用により本明細書中に組込まれる）。上記で示されたように、本発明のいくつかの態様においては、Ｎ，Ｐ，Ｌ及び他の所望するPIVタンパク質は、ゲノム又はアンチゲノムをコードするウィルスとは、表現型的に区別できる１又は複数のヘルパーウィルスによりコードされる。Ｎ，Ｐ，Ｌ及び他の所望のPIVタンパク質はまた、ゲノム又はアンチゲノム、及びその種々の組合せをコードするベクターと同じか又は異なる１もしくは複数の発現ベクターによってもコードされ得る。それ自体のベクターにより、又は１又は複数のＮ，Ｐ，Ｌ及び他の所望するPIVタンパク質、又は完全なゲノム又はアンチゲノムをコードするベクターによりコードされる追加のタンパク質が、所望により含まれ得る。本発明の組成物及び方法は、選択されたPIVタンパク質の機能又は発現を変更するために、たとえば、定義された突然変異を用いて、PIV分子生物学及び病原性機構の分析及び操作を可能にする。それらの方法及び組成物を用いれば、偶発的なサイレント突然変異と所望の表現型変化を担当する突然変異とを容易に区別し、そしてワクチン生成のために組換えPIVゲノム又はアンチゲノム中への組込みのための表現型−特異的突然変異を容易に選択することができる。本発明内に提供されるPIVの修飾は、たとえばウィルス弱毒化及びワクチン免疫原性を増強するために、不所望の免疫病理学に関係するエピトープを削除するために、抗原ドリフトを提供するために、改良されたワクチンウィルスの生成に向けられる。それらの及び他の目的を達成するためには、本発明の組成物及び方法は、感染性組換えPIV中への組込みのためのPIVゲノム又はアンチゲノム中への広範囲の種類の修飾の導入を可能にする。たとえば、保護抗原又はエピトープをコードする外来性遺伝子又は遺伝子セグメントが、保護抗原が由来するPIV及びもう１つのウィルス又は剤の両者に対する免疫性を誘発することができるPIVウィルス株を生成するためにPIVクローン内に付加され得る。あるいは、ワクチンウィルスの免疫原性を増強するために、免疫系のモジュレーター、たとえばサイトカインをコードする外来性遺伝子が、全部又は一部、挿入され得る。本発明のPIVクローン内に包含され得る他の突然変異は、たとえば、異種遺伝子又は遺伝子セグメント（たとえば、糖タンパク質遺伝子の細胞質末端をコードする遺伝子セグメント）の、カウンターパートの遺伝子又は遺伝子セグメントによるPIVクローンにおける置換を包含する。他方では、PIVクローン内の遺伝子の相対的順序を変えることができ、PIVゲノムプロモーターはそのアンチゲノムカウンターパートにより置換され得、又は選択された遺伝子は非機能的にされ得る（たとえば、遺伝子の発現を阻止するために停止コドンの導入を包含する機能的削除による）。PIVクローンにおける他の修飾は、操作、たとえば種々の非コード又はコード領域又は他の場所におけるユニーク制限部位の挿入を促進するために行なわれ得る。さらに、翻訳されていない遺伝子配列が、外来性配列を挿入するための能力を高めるために除去され得る。従って、PIVの感染性クローンを提供することによって、本発明は、PIVゲノム（又はアンチゲノム）内で組換え的に生成される広範囲の変更を可能にし、所望の表現型変化を規定する、定義された突然変異を生成する。“感染性クローン”とは、感染性ウィルス又はサブウィルス粒子のゲノムを生成するために鋳型として作用することができるゲノム又はアンチゲノムRNA中に転写され得る感染性ビリオン中に直接的に組込まれ得る、cDNA又はその生成物、合成物又は他方では、RNAを意味する。上記で示されたように、定義された突然変異は、種々の従来の技法（たとえば、特定部位の突然変異誘発）により、ゲノム又はアンチゲノムのcDNAコピー中に導入され得る。本明細書において記載されたような完全なゲノム又はアンチゲノムcDNAをアセンブルするためへのゲノム又はアンチゲノムcDNAサブフラグメントの使用は、個々の領域が別々に操作され得、ここで小さなcDNA対象が大きなcDNA対象よりも、より容易な操作を提供し、そして次に、完全なcDNAに容易にアセンブルされ得る利点を有する。従って、完全なアンチゲノム又はゲノムcDNA、又は選択されたそのサブフラグメントが、特定オレゴヌクレオチドの突然変異誘発のための鋳型として使用され得る。これは、たとえば、Bio−Ra として二本鎖プラスミドを直接的に用いる方法、たとえばStratage 又は興味ある突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマー又は鋳型のいづれかを用いるポリメラーゼ鎖反応により、一本鎖ファージミド（phagemid）形の中間体を仕上げることができる。次に、突然変異誘発されたサブフラグメントが、完全なアンチゲノム又はゲノムcDNAにアセンブルされ得る。種々の他の突然変異誘発技法が知られており、そして本発明のPIVアンチゲノム又はゲノムcDNAにおける興味ある突然変異を生成することへの使用のために通常、適合され得る。従って、１つの例示的な機能においては、突然変異は、Bio−Ra 突然変異誘発キットを用いることによって導入される。手短に言及すれば、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAが、プラスミドpTZ18U中にクローン化され、そしてCJ236細胞（Life Technologies）を形質転換するために使用される。ファージミド調製物は、製造業者により推薦されるようにして調製される。オリゴヌクレオチドが、ゲノム又はアンチゲノムの所望の位置での変更されたヌクレオチドの導入による突然変異誘発のために企画される。次に、遺伝子的に変更されたゲノム又はアンチゲノムを含むプラスミドが、増幅される。突然変異は、単一のヌクレオチドの変更から、１又は複数の遺伝子又は遺伝子セグメントを含む大きなcDNAセグメントの導入、欠失又は置換まで変化することができる。ゲノムセグメントは、構造及び／又は機能ドメイン、たとえばタンパク質の細胞質、トランスメンブラン又はエクトドメイン、活性部位、たとえば異なったタンパク質との結合又は他の生化学的相互作用を仲介する部位、エピトープ部位、たとえば抗体結合、及び／又は体液又は細胞介在性免疫応答を刺激する部位、等に対応することができる。これに関する有用なゲノムセグメントは、タンパク質の小さな機能的ドメイン、たとえばエピトープ部位をコードするゲノムセグメントの場合の約13〜35個のヌクレオチドから約50，75，100，200〜500及び500〜1,500又はそれ以上のヌクレオチドまでの範囲である。定義された突然変異を感染性PIV中に導入する能力は、PIV病原及び免疫原機構の操作を包含する多くの用途を有する。たとえば、Ｎ，Ｐ，Ｍ，Ｆ，HN及びＬタンパク質、並びにＣ，Ｄ及びＶ ORF生成物を包含する、PIVタンパク質の機能は、タンパク質発現のレベルを削減するかもしくは低め、又は変異体タンパク質を生成する突然変異を導入することによって操作され得る。１つのそのような典型的な修飾においては、Ｆタンパク質の分解部位での配列が修飾され得、そして得られるPIVの組織培養における増殖、及びそのPIVの感染及び病因に対するこの修飾の効果は、通常、実験動物において決定され得る。種々のゲノムRNA構造特徴、たとえばプロモーター、遺伝子間領域及び転写シグナルはまた、本発明の方法及び組成物内で通常、操作され得る。トランス−作用性タンパク質及びシス−作用性RNA配列の効果は、たとえば、PIVミニゲノムを用いる平行したアッセイにおいて、完全なアンチゲノムcDNAを用いて、容易に決定され得（Dimock，など，J ．Virol．67：2772-8（1993）；これは引用により本明細書に組込まれる）、この救援−依存性状態は複製−無関係感染ウィルスにおいて回収されるほど阻害性であり得るそれらの変異体の特徴化において有用である。本発明はさらに、疑わしい突然変異を、感染性野生型（すなわち、１又は複数の表現型特性、たとえば感温性、選択された宿主における複製、等のために）PI Vのゲノム又はアンチゲノム中に、別々に、及び種々の組合せで導入することによって、偶発的なサイレント突然変異と表現型差異を担当する突然変異との間を容易に区別する手段及び方法を提供する。この方法は、所望のワクチン表現型、たとえば弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲の制限、等を担当する突然変異の同定を可能にする。次に、それらの方法により同定された突然変異は、ワクチンウィルスを適切な弱毒化レベルに修飾するために、所望により、種々の組合せで導入され得る。さらに、本発明は、異なったウィルス株から単一のワクチン株に突然変異を組合す能力を提供する。上記で示されたように、組換え的に変更されたPIVクローン内に組込まれる突然変異は、所望の表現型変化を生成するか、又は種々の他の目的のための、選択されたPIVタンパク質の発現及び／又は機能を変更するそれらの能力に基づいて選択され得る。所望の表現型変化は、たとえば培養物におけるウィルス増殖、感温性、プラークサイズ、弱毒化及び免疫原性の変化を包含する。たとえば、ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列は、弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲の制限、遺伝子発現の変更、又は免疫原エピトープの変化を特定するためにヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾され得る。本発明の１つの観点においては、生物学的に誘導され、弱毒化されたPIVに存在する突然変異が、同定され、そして十分な長さのPIVクローン中に、個々に又は組合して導入され、そしてその導入された突然変異を含む獲得された組換えウィルスの表現型が決定される。典型的な態様においては、野生型PIVに対する生物学的に誘導された変異体ウィルスにより示されるアミノ酸変化、たとえばts， ca又はatt表現型を有するPIV変異体により示される変化が、組換えPIVクローン内に導入される。生物学的に誘導された変異体PIVからのそれらの変化は、得られるクローンにおける所望の特徴、たとえばHPIV３変異体JS cp45から採用された突然変異により特定される弱毒化表現型を特定する。それらの変化は好ましくは、遺伝的復帰に対して突然変異を安定化する効率を有する、対応する野生型又は生物学的に誘導された変異体配列に比較して、２又は３個のヌクレオチド変化を用いて組換えウィルス中に導入される。本発明はまた、感染性クローンのゲノム又はアンチゲノム中に選択された組合せで導入される、複数の表現型−特異的突然変異を有する組換えPIVを提供する。表現型の評価と対をなすこの方法は、弱毒化、感温性、低温適合化、小さなプラークサイズ、宿主範囲の制限、等のような所望する特性を有する変異体組換えPIVを供給する。従って、１又は複数の、そして好ましくは少なくとも２種の弱毒化突然変異、たとえば生物学的に誘導されたPIV変異体、たとえばJS cp45から採用されたts，ca又はatt突然変異を組込む典型的な PIVクローンが開示される。本明細書に関して、組換えPIVにおいて生物学的に誘導された突然変異を採用するための標的遺伝子は、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、大きなポリメラーゼサブユニットＬ、マトリックスタンパク質Ｍ、赤血球凝集素−イノラミニダーゼタンパク質HN、融合タンパク質Ｆ、及びＣ，Ｄ及びＶ ORF生成物を包含する。遺伝子外配列、たとえばPIVゲノムの３’側リーダー又はトレイラー領域における、及びシス−作用性要素、たとえば遺伝子開始及び遺伝子終結配列、たとえばＮ遺伝子開始シグナルにおける配列がまた、標的化される。本明細書において組換えPIVに組込まれる典型的な突然変異は、たとえばTyr₉₄₂，Leu₉₉₂及び／又はThr₁₅₅₈で、ポリメラーゼＬ遺伝子におけるアミノ酸変化を特定する１又は複数のヌクレオチド置換を包含する。たとえば、Tyr₉₉₂がHisにより置換され、Leu₉₉₂がPheにより置換され、そして／又は Thr₁₅₅₈がIleにより置換されているPIV組換え体が開示される。それらの突然変異は、下記例に記載されるｒ94２,ｒ992,ｒ1558，ｒ942／992,ｒ992／1558，ｒ9 42／1558、又はｒ942／992／1558組換え体を包含する、本明細書における種々の典型的なPIV組換え体に連続的に組込まれて来た。生物学的に誘導されたPIV変異体から採用される他の典型的な突然変異は、JS cp45の残基Val₉₆又はSer₃₈₉に対応する位置での特定の突然変異を包含する、Ｎタンパク質における１又は複数の突然変異を包含する。より詳細な観点においては、それらの突然変異は、Val₉₆→Ala又はSer₃₈₉→Ala として表わされる。Ｃタンパク質におけるアミノ酸置換、たとえば、好ましくは Ile₉₆→Thrの置により表わされる、JS cp45のIle₉₆に対応する位置での突然変異をコードする組換えPIVが、下記例に記載される。生物学的に誘導されたPIV変異体から採用された、さらなる典型的な突然変異は、好ましくはアミノ酸置換Ile₄ ₂₀ →Val又はAla₄₅₀→Thrにより表わされる、JS cp45の残基Ile₄₂₀又はAla₄₅₀に対応する位置でJS cp45から採用される突然変異を包含する、Ｆタンパク質における１又は複数の突然変異を包含する。本発明内の他のPIV組換え体は、好ましくは置換Val₃₈₄→Alaにより表わされる、JS cp45の残基Val₃₈₄に対応する位置での突然変異を採用する組換え体PIVにより例示されるように、HNタンパク質における１又は複数のアミノ酸置換を採用する。本発明のこの観点内のように追加例は、遺伝子外配列、たとえば組換えPIVゲノム又はアンチゲノムの３’側リーダー配列における１又は複数の突然変異を組込む組換えPIVを包含する。これに関しての典型的な突然変異は、JS cp45のヌクレオチド23でのＴ→Ｃ変化、ヌクレオチド24でのＣ→Ｔ変化、又はヌクレオチド28でのＧ→Ｔ変化を包含する、それらのヌクレオチド23，24及び／又は28に対応する１又は複数の位置での３’側リーダー配列における突然変異を包含する。さらなる追加の遺伝子外突然変異は、好ましくは、Ａ→Ｔ変化により表わされる、JS cp45のヌクレオチド62に対応する位置でのＮ遺伝子開始配列における突然変異により例示されるように、Ｎ遺伝子開始配列における１又は複数の突然変異を包含する。生物学的に誘導された変異体PIVから採用される上記の典型的な突然変異は、rcp45，rcp45 3'NCMFHN，rc p45 3'NL，rcp45 3'N及びrcp45 Fとして本明細書において命名された組換え体により例示されるように、新規の弱毒化された候補体ワクチン株を、個々に及び／又は組合してもたらすよう、下記例において評価され、そして組換えPIV中に組合される。本発明内の他のPIV組換え体は、１又はそれよりも多くのそれらの典型的な組換え体に存在する突然変異の多くの及び十分なまでの相補体、及び本明細書における教授に従って組換えPIVにおいて同定され、そして採用された、他の生物学的に誘導された変異体PIV株に同定される突然変異を組込むであろう。本明細書に開示される方法に従って同定される突然変異は、“メニュー”中に編集され、そしてワクチンウィルスを弱毒化、免疫原性及び安定性の選択されたレベルに対応されるために種々の組合せで導入される。好ましい態様においては、本発明は、生物学的に誘導されたPIVから採用される１又は複数の突然変異、たとえばts，ca又はatt突然変異、及び同じか又は異なった遺伝子を包含する追加のタイプの突然変異の補充を提供する。これに関しての突然変異のための標的遺伝子はまた、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、大きなポリメラーゼサブユニットＬ、マトリックスタンパク質Ｍ、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質HN、融合タンパク質Ｆ、及びＣ，Ｄ及びＶ ORF生成物を包含する。１つの観点においては、少なくとも１つの弱毒化突然変異がPIVポリメラーゼ遺伝子Ｌにおいて存在し、そして生物学的に誘導された変異体PIV株、たとえばJS cp45から採用されるts又はatt表現型を特定するヌクレオチド置換を包含する組換えPIVが供給される。本明細書に開示される典型的なHPIV３組換え体は、下記例に記載される、r942,ｒ992,ｒ1558，ｒ942／992,ｒ992／1558，ｒ942／ 1558、又はｒ942／992／1558組換え体を包含する。それらの典型的なPIVクローンは、Tyr₉₄₂，Leu₉₉₂、及び／又はThr₁₅₅₈で、ポリメラーゼ遺伝子においてアミノ酸変化をもたらす１又は複数のヌクレオチド置換を組込む。たとえば、Tyr₉₄₂がHisにより置換され、Leu₉₉₂がPheにより置換され、そして／又はThr₁₅₅₈がIleにより置換されているPIV組換え体が開示される。好ましくは、２又は３個の突然変異が、表現型復帰に対する高められた安定性を付与する弱毒化突然変異を特定するコドンに組込まれる。さらなる観点においては、種々の他の遺伝子変更が、感染性組換えPIV中への組込みのために組換えPIVゲノム又はアンチゲノムにおいて、単独で、又は生物学的に誘導された変異体PIVから採用される１又は複数の弱毒化突然変異と一緒に、生成され得る。異種遺伝子（たとえば、異なったPIV株又は非−PIV源、たとえば他のウィルス、たとえばRSV又は麻疹ウィルスからの）が、全体的に又は一部、挿入され、又は置換され、遺伝子の順序が変えられ、遺伝子オーバーラップが除去され、PIVゲノムプロモーターがそのアンチゲノムカウンターパートにより置換され、そしてさらに、非必須遺伝子が欠失され得る。１つの観点においては、選択されたPIV遺伝子、たとえばＣ，Ｄ又はＶ ORFが、新規の表現型特徴、たとえば増強されたインビトロ増殖及び／又はインビボ弱毒化を有する組換えPI Vを生成するために、機能的に欠失される。本発明の感染性PIVクローンはまた、その免疫原性を増強し、そして天然の感染により生成される保護よりも強いレベルの保護を誘発するか、又は所望しない免疫病理学的反応に関連するエピトープを削除するよう構築され得る。本発明により生成されるワクチンの増強された免疫原性は、PIVを制御することに対する１つの最大の障害、すなわち天然の感染により誘発される免疫性の不完全な性質を取り組む。この場合、追加の遺伝子又は遺伝子セグメントが、共通する又は独立した転写シグナル組の制御下で配置され得るPIVゲノム又はアンチゲノム中に又はその近くに挿入され得る。興味ある遺伝子は、サイトカイン（たとえばIL−２〜IL−15、特にIL−２，IL−６及びIL−12、等）、及びＴヘルパー細胞エピトープに富んでいるタンパク質をコードするそれらの遺伝子を包含する。追加のタンパク質は、別々のタンパク質として、又はPIVタンパク質の１つの第２のコピー、たとえばHNから構築されたキメラとして発現され得る。これは、PIVに対する免疫応答を、定量的及び定性的に修飾し、そして改良する能力を提供する。本発明内の有用な他の突然変異は、ゲノムの３’末端の、RNA複製及び転写の変化に関連する、アンチゲノムからのそのカウンターパートによる置換を包含する。さらに、遺伝子間領域は、配列含有において、短くされたり又は長くされたりされ得、又は変更され得る。さらに追加の観点においては、ワクチン配合において有用なPIVは便利には、循環ウィルスにおける抗原流動性を順応せしめるために修飾され得る。典型的には、その修飾は、HN及び１又はＦタンパク質に存在するであろう。たとえば、完全なHN又はＦ遺伝子、又は特定の免疫原性領域をコードするセグメントの選択された抗原形が、PIVゲノム又はアンチゲノムcDNA中に、感染性クローンにおけるカウンターパート領域の置換により、又はいくつかの抗原形がその得られるクローンにおいて表わされるよう遺伝子の１又は複数のコピーを付加することによって、組込まれ得る。次に、修飾されたPIVcDNAから生成された子孫ウィルスが、出現する株に対して予防接種プロトコールに使用される。本発明の感染性PIVへの使用のための他の突然変異は、PIVミニゲノムの突然変異分析の間に同定されるシス−作用性シグナルにおける突然変異を包含する。たとえば、リーダー、トレイラー及びフランキング配列の挿入及び欠失分析は、ウィルスプロモーター及び転写シグナルを同定し、そしてRNA複製又は転写の種々の程度の低下に関連する一連の突然変異を提供する。それらのシス−作用性シグナルの飽和突然変異誘発（それにより、個々の位置が個々の選択されるヌクレオチドに、順に修飾される）はまた、RNA複製又は転写を低め又は高める突然変異を同定する。それらの突然変異のいづれかが、本明細書に記載のようにして、完全なアンチゲノム又はゲノム中に挿入され得る。 PIVクローンにおける追加の修飾が、操作、たとえば種々の遺伝子間領域又は他の場所におけるユニーク制限部位の挿入を促進せしめるために行なわれ得る。翻訳されていない遺伝子配列がまた、外来性配列を挿入するための能力を高めるために除去され得る。本発明の組換えPIV内の遺伝子又は遺伝子セグメントの一定の置換、挿入、欠失又は転位（たとえば、選択されたタンパク質又はタンパク質領域、たとえば細胞質末端、トランスメンブランドメイン又はエクトドメイン、エピトープ部位又は領域、結合部位又は領域、活性部位又は活性部位を含む領域、等をコードする遺伝子セグメントの置換）が、同じか又は異なったPIV又は他の源からの存在する“カウンターパート”遺伝子又は遺伝子セグメントに対して構造的又は機能的関係で行なわれる。そのような修飾は、野生型又は親PIV又は他のウィルス株に比較して、所望する表現型変化を有する新規の組換え体を生成する。たとえば、このタイプの組換え体は、もう１つのPIVのエクトドメインに融合される１つのP IVの細胞質末端及び／又はトランスメンブランドメインを有するキメラタンパク質を発現することができる。このタイプの他の典型的な組換え体は、重複タンパク質領域、たとえば重複免疫原性領域を発現する。本明細書において使用される場合、“カウンターパート”遺伝子、遺伝子セグメント、タンパク質、又はタンパク質領域は典型的には、異種源（たとえば、異なったPIV遺伝子からの、又は異なった PIV型又は株において同じ（すなわち、相同又は対立遺伝子）遺伝子又は遺伝子セグメントを表わす）からである。これに関して、選択される典型的なカウンターパートは、全体的な構造特徴を共有し、たとえば個々のカウンターパートは、比較できるタンパク質又はタンパク質構造ドメイン、たとえば細胞質ドメイン、トランスメンブランドメイン、エクトドメイン、結合部位又は領域、エピトープ部位又は領域、等をコードすることができる。カウンターパートドメイン及びそれらのコード遺伝子セグメントは、ドメイン又は遺伝子セグメント変異体間で共通する生物学的活性により定義される広範囲のサイズ及び配列の流動性を有する種の集団を包含する。たとえば、本発明内のカウンターパート遺伝子セグメントによりコードされる２種の選択されたタンパク質ドメインは、たとえば膜延長機能、特定の結合活性、免疫学的認識部位、等を提供する、実質的に同じ性質的な活性を共有する。より典型的には、カウンターパート間で、たとえば選択されたタンパク質セグメント又はタンパク質間で共有される特定の生物学的活性は、定量的に実質的に類似し、すなわち、それらはそれぞれの定量活性レベルにおいて、30％以上、好ましくは20％以上、より好ましくは５〜10％以上、変化しないであろう。本発明の組換えPIVを生成するために本明細書に開示される、カウンターパート遺伝子及び遺伝子セグメント、及び他のポリヌクレオチドは、好ましくは、選択されたポリヌクレオチド“対照配列”と、たとえばもう１つの選択されたカウンターパート配列と実質的な配列同一性を共有する。本明細書において使用される場合、“対照配列”（reference sequence）とは、配列比較のための基礎として使用される定義された配列、たとえば十分な長さのcDNA又は遺伝子のセグメント、又は完全なcDNA又は遺伝子配列である。一般的に、対照配列は、少なくとも20個の長さのヌクレオチド、時おり、少なくとも25個の長さのヌクレオチド、及びしばしば少なくとも50個の長さのヌクレオチドのものである。２種のポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）それらの２種のポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含んで成り、そして（２）さらに、それらの２種のポリヌクレオチド間で互いに異なる配列を含んで成るので、２種（又はそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局部領域を同定し、そして比較するために “比較窓”に対してそれらの２種のポリヌクレオチドの配列を比較することによって実施される。“比較窓”（reference window）とは、本明細書において使用される場合、少なくとも20個の連続したヌクレオチド位置の概念的セグメントを意味し、ここでポリヌクレオチド配列は少なくとも20個の連続したヌクレオチドの対照配列に比較され得、そして比較窓におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２種の配列の最適な一列配列のための対照配列（付加又は欠失を包含しない）に比較される場合、20％又はそれ以下の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。比較窓を一列配列するための配列の最適な一列配列は、Smit h & Waterman，Adv ．Appl．Math．2：482（1981）の局部相同アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch，J ．Mol．Biol．48：443（1970）の相同一列配列アルゴリズムにより、Pearson & Lipmon，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 05：2444（1 988）の類似性調査方法により、それらのアルゴリズムのコンピューター処理された実施により（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetic s Conputer Grop，575 Science Dr.，Madison，WIにおけるGAP，BESTFIT，FASTA 及びTFASTA）、又は検査により行なわれ得、そして種々の方法により生成される最良の一列配列（すなわち、比較窓に対して配列類似性の最高％をもたらす）が選択される。用語“配列同一性”とは、２種のポリヌクレオチド配列が、比較窓に対して同一である（すなわち、ヌクレオチド×ヌクレオチドに基づいて）ことを意味する。用語“配列同一性の百分率”は、比較窓に対して２種の最適に一列配列された配列を比較し、同一の核酸塩基（たとえば、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｕ、又はＩ）が、適合された位置の数を得るために、両配列において存在する位置の数を決定し、前記適合された位置の数を、比較窓における位置の合計数（すなわち、窓サイズ）により割り算し、そして配列同一性の％を得るために、前記結果に100を掛け算することによって計算される。用語“実質的な同一性”とは、本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも20個のヌクレオチド位置の比較窓に対して、時おり、少なくとも25〜50個のヌクレオチドの窓に対し、対照配列に比較される場合、少なくとも85％の配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95％の配列同一性、より通常には、少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含んで成り、ここで配列同一性の％は、比較窓に対して対照配列の合計20％又はそれ以下の配列において欠失又は付加を包含することができるポリヌクレオチド配列に対して対照配列を比較することによって計算される。対照配列は、より長い配列のサブセットであり得る。それらのポリヌクレオチド配列の関係の他に、本発明の組換えPIVによりコードされるタンパク質及びタンパク質領域はまた、典型的には、保存的関係を有するように、すなわち選択された対照ポリペプチドに対して、実質的な配列同一性又は配列類似性を有するように選択される。ポリペプチドに適用される場合、用語“配列同一性”とは、ペプチドが対応する位置で同一のアミノ酸を共有することを意味する。用語“配列類似性”とは、ペプチドが対応する位置で、同一の又は類似するアミノ酸（すなわち保存性置換）を有することを意味する。用語“実質的な配列同一性”とは、２種のペプチド配列が、たとえば欠如ギャップ重量(d efault gap weights)を用いてのプログラムGAP又はBESTFITにより、最適に一列配列される場合、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性又はそれ以上（たとえば 99％）の配列同一性を共有することを意味する。用語“実質的な類似性”とは、２種のペプチド配列が対応する％の配列類似性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存性アミノ酸置換により異なる。保存性アミノ酸置換とは、類似する側鎖を有する残基の互換性を言及する。たとえは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸グループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸グループはセリン及びトレオニンであり；アミド−含有側鎖を有するアミノ酸グループはアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸グループはフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸グループはリシン、アルギニン及びヒスチジンであり；そして硫黄−含有側鎖を有するアミノ酸グループはシステイン及びメチオニンである。好ましい保存性アミノ酸置グループは次のものである：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミン。本明細書において使用される20種の天然に存在するアミノ酸についての略語は、従来の使用法に従がう（Immunology-A Synthesis（2nd ed .，E．S．Golub & D．R．Gren，eds.，S-inauer Associates，Sunderland，MA， 1991；それらは引用により本明細書に組込まれる）。20種の従来のアミノ酸、非天然のアミノ酸、たとえばα，α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の異例なアミノ酸の立体異性体（たとえば、Ｄ−アミノ酸）もまた、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。異例なアミノ酸の例としては、次のものを挙げることができる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ −トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、Ｓ−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、及び他の類似するアミノ酸及びイミノ酸（たとえは、４−ヒドロキシプロリン）。さらに、アミノ酸は、グリコシル化、リン酸化及び同様のものにより修飾され得る。 cDNA−発現されたゲノム又はアンチゲノムから生成された感染性PIVは、たとえばヒト、ウシ、ネズミ、等からのPIV又はPIV−様株のいづれかであり得る。保護免疫応答を生ぜしめるためには、PIV株は、免疫化される対象に対して内因性であるものであり、たとえばヒトPIVがヒトを免疫化するために使用される。しかしながら、ゲノム又はアンチゲノムは、異種PIV遺伝子又は遺伝子セグメント、又は他の異種源、たとえばRSV、又は麻疹ウィルスからの遺伝子又は遺伝子セグメントを発現するために修飾され得る。従って、ヒトへの投与のために意図された感染性PIVは、たとえば弱毒化のために、ウシ又はネズミPIV型からの遺伝子又は遺伝子セグメントを含むよう修飾されたヒトPIVであり得る。BPIV３は、アカゲザル及びヒトにおいてその複製を制限する宿主域変異を有する（Karronなど .,前記，1995a；ran Wyke Coelinghなど，1988；それらは引用により本明細書中に組込まれる）。所望する表現型、たとえば宿主域制限を特定するBPIV３の遺伝子、突然変異及びシス−作用性調節配列は、本発明のrPIVにおける対応する配列によるそれらの置換により同定され、そしてさらに有用なワクチン剤を開発するために、さらに修飾されたrPIV内に組込まれるであろう。同様に、アカゲザルのための非−ts宿主域弱毒化突然変異を付与することが知られているJS cp45の突然変異（Hallなど，前記，(1992) ）は、同様に同定され、そして本発明の修飾されたrPIVワクチン剤中に組込まれる。他方では、ウシPIVは、たとえばヒトPIV感染に対する保護を誘発するタンパク質、又は免疫原エピトープをコードする遺伝子を含むよう修飾され得る。たとえば、ヒトPIV糖タンパク質遺伝子は、ウシPIVがヒトPIV株に対して、ヒトにおいて保護免疫応答を誘発するよう、カウンターパートのウシ糖タンパク質遺伝子により置換され得る。典型的な態様においては、１つのPIVの個々の遺伝子、遺伝子セグメント、又は単一の又は複数のヌクレオチドが、異種PIV又は他の源からのカウンターパート配列により置換される。たとえば、１つのPIVからの選択されたタンパク質の異種遺伝子セグメント、たとえば細胞質末端、トランスメンブランドメイン又はエクトドメイン、エピトープ部位又は領域、結合部位又は領域、活性部位又は活性部位を含む領域、等をコードする遺伝子は、新規組換え体、たとえばもう１つのPIVのエクトドメインに融合される１つのPIVの細胞質末端及び／又はトランスメンブランドメインを有するキメラタンパク質を発現する組換え体を生成するために、もう１つのPIVにおけるカウンターパート遺伝子セグメントにより置換される。これに関しての好ましいゲノムセグメントは、タンパク質の小さな機能的ドメイン、たとえばエピトープ部位をコードする遺伝子セグメントの場合、約15 〜35のヌクレオチドから、大きなドメイン又はタンパク質領域をコードする遺伝子セグメントの場合、約50，75，100， 200〜500又は500〜1,500又はそれ以上のヌクレオチドまでの範囲である。本発明の１つの観点においては、１つのPIV株のHN及び／又はＦタンパク質の選択されたドメインが、免疫化された宿主において両PIV株に対する交差−保護免疫応答を刺激することができる組換えウィルスを生成するために、異種PIVクローン中に置換される。他の態様においては、ヒトPIVゲノム又はアンチゲノム配列、及び少なくとも１つの非ヒトPIV配列のキメラ、たとえばヒト及びウシの両PIVからの配列を含むポリヌクレオチドを含んで成る修飾されたPIVクローンが提供される。ヒトPIVコード配列又は非コード配列（たとえば、プロモーター、遺伝子−終結、遺伝子−開始、遺伝子間又は他のシス−作用性要素）のカウンターパートウシ又はネズミPIV配列による置換は、種々の可能な弱毒化効果を有する組換え体を生成する。たとえば、宿主域効果は、他の有用な弱毒化効果の中で、ヒト細胞において効果的に機能しない異種PIV遺伝子から、すなわち生物学的に相互作用するヒトPIV配列又はタンパク質と異種配列又はタンパク質（たとえば、ウィルス転写、翻訳、アセンブリー、等のために置換された配列又はタンパク質と通常、協力する配列又はタンパク質）との不適合性からしばしば発生するであろう。本発明のさらにもう１つの観点においては、外来性遺伝子又は遺伝子セグメント、及びいくつかの場合、非コードヌクレオチド配列のPIVゲノム中への挿入は、さらに追加の所望の表現型効果を引き起こす、ゲノムの長さの所望の上昇をもたらす。高められたゲノムの長さは、挿入体の長さに一部、依存して、得られるPIVクローンの弱毒化をもたらすことが予測される。さらに、組換えPIV 中に挿入された遺伝子からの一定のタンパク質の発現は、そのタンパク質の作用のために、ウィルスの弱毒化をもたらすであろう。これは、ワクシニアウィルスにおいて発現されるIL−２について記載されており（たとえば、Flexnerなど，Nature 33：259-62（1987）を参照のこと）、そしてまた、γインターフェロンのために予測されるであろう。本発明の組換えPIVにおける完全なウィルス遺伝子又は遺伝子セグメントの変化を包含する欠失、挿入、置換及び他の突然変異は、免疫抑制された個人の場合に特に有用である、非常に安定したワクチン候補体を生成する。それらの突然変異の多くは、得られるワクチン株の弱毒化をもたらし、そして他は、異なったタイプの所望する表現型変化を特定するであろう。たとえば、宿主免疫性を特異的に妨害するタンパク質をコードする一定のウィルス遺伝子は知られている（たとえば、Katoなど.，EMBO ．J．16：578-87(1997)を参照のこと；これは引用により本明細書中に組込まれる）。ワクチンウィルスにおけるそのような遺伝子の削除は、毒性及び病因を低め、そして／又は免疫原性を改良することが予測される。本発明の好ましい観点においては、修飾されたPIVクローンは、複数のヒトPIV ゲノムのキメラ、たとえば１又は複数の異種ヒトPIV、たとえばHPIV１及びHPIV ２からの配列に連結されるHPIV３からのポリヌクレオチド配列を含むクローンを表わす。従って、ヒトPIV３の個々の遺伝子又は遺伝子セグメントは、HPIV１又はHPIV２からのカウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントにより置換され又は複製され得、又は逆も真である。下記に記載される１つの例においては、本発明は、PIVクローン、すなわちHPIV１のHN及びＦ糖タンパク質の両者がHPIV３バックグラウンドにおけるそれらのカウンターパート遺伝子を置換し、両親の株を表わす免疫学的特徴を有するキメラウィルスを生成するrPIV３−１を提供する。本発明の追加の観点においては、上記のような、遺伝子又は遺伝子セグメントの他の変更を有するキメラPIV又はPIVクローンが、弱毒化された、又はさらに弱毒化されたキメラ変異誘導体を達成するために、生物学的に誘導された変異体PIV、たとえばHPIV３ JS cp45から採用される１又は複数の弱毒化突然変異を導入することによってさらに修飾される。たとえば、１又は複数のヒト PIVコード又は非コードポリヌクレオチドが上記のようにして、異種ヒトPIV、ウシPIV又はネズミPIVからのカウンターパート配列により置換され得、そしてこの変更が、弱毒化された又はさらに弱毒化された（すなわち、キメラクローン又は生物学的に誘導された親ウィルスのいづれかと比較して）ワクチンウィルスを得るために、生物学的に誘導された、弱毒化されたPIV変異体から採用されるts，c a又はatt表現型を特定する１又は複数の突然変異により組合され得る。他方では、非必須遺伝子又は遺伝子セグメント、たとえばＣ，Ｄ又はＶ ORFの機能的欠失が、弱毒化されたワクチン株を生成するために、生物学的に誘導されたPIV変異体からのts，ca又はatt表現型を特定する１又は複数の突然変異と共に組換えPIV において組合され得る。それらの組合せ修飾は、所望の表現型特徴、たとえば高められたウィルス収率、高められた弱毒化、弱毒化された表現型からの復帰に対する遺伝子耐性を、異なった選択された突然変異の組合された効果のために有する組換えPIVを生成する。１つの組合せ突然変異企画においては、ヒトPIVゲノム又はアンチゲノム配列及び少なくとも１つの非ヒトPIV配列のキメラ、たとえばヒト及びウシの両PIVからの配列を含むポリヌクレオチドを含んで成り、そしてまた、生物学的に誘導されたPIVから採用された１又は複数の突然変異、たとえば１又は複数の天然に存在するts，ca又はatt突然変異を組込んでいる修飾されたPIVが提供される。他方では、修飾されたPIVは、複数のヒトPIVゲノムのキメラ、たとえば１又は複数の異種ヒトPIV、たとえばHPIV１及びHPIV２からの配列に連結されるHPIV３からの配列を含むポリヌクレオチドであり得、そして後者はさらに、１又は複数のtS，ca，att、又は生物学的に誘導されたPIVからの他の選択された突然変異（たとえば生物学的に誘導された変異体PIV株、たとえばJS cp45から採用されたts，ca又はatt表現型を特定するヌクレオチド置換）を組込む。より詳細な観点においては、ヒトPIV３の個々の遺伝子又は遺伝子セグメントは、たとえば弱毒化されているか又は大きなポリメラーゼＬ遺伝子におけるts突然変異を付与するアミノ酸置換をコードするヌクレオチド変更により、さらに弱毒化されているクローンにおいて、HPIV１又はHPIV２からのカウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントにより置換され又は補完され、又は逆も真である。たとえば、本発明は、HPIV３バックグラウンドにおいてそれらのカウンターパート遺伝子により置換されたHPIV１のHN及び／又はＦ糖タンパク質遺伝子を有するPIVクローンを提供し、ここで得られるキメラクローンの表現型は、１又は複数のＮ，Ｐ，Ｌ，Ｍ，HN，Ｆ，Ｃ，Ｄ及びＶ遺伝子内にコードされるts，ca又はatt突然変異によりさらに修飾される。本明細書に開示される可能な突然変異のメニューからの種々の組合せが、ワクチンウィルスを、選択された弱毒化、免疫原性及び安定性レベルに対応せしめるために、たとえば複数のPIV株を表わす免疫学的特徴を有する、十分に弱毒化された免疫原性キメラウィルスを得るために実施され得る。１つの観点においては、少なくとも１つの弱毒化突然変異が、キメラPIVバックグラウンドにおいて組込まれるPIVポリメラーゼ遺伝子Ｌにおいて存在する（下記例に記載される組換え体ｒ942,ｒ992,ｒ1558，ｒ942／992,ｒ942／1558，ｒ992／1558又はｒ942／992／1558により例示されるような）組換えPIVが提供される。たとえば、本発明のこの観点内の有用なキメラPIV組換え体は、異種バックグラウンドにおいて、たとえばHPIV３クローンにおいてそれらのカウンターパート遺伝子により置換された HPIV１からのHN及び／又はＦ糖タンパク質遺伝子の１又は複製の遺伝子又は遺伝子セグメントを有し、そして１又は複数の弱毒化突然変異、たとえば生物学的に誘導されたPIV変異体からのポリメラーゼ遺伝子におけるアミノ酸変化（たとえば、位置942でのTyrからHisへの変化、位置992でのLeuからPheへの変化、及び／又は位置1558でのThrからIleへの変化）をもたらすヌクレオチド置換をさらに組込むであろう。下記に例示される、１つのそのような弱毒化されたキメラ組換え体は、rPIV３−１．cp45Ｌ、すなわちJS cp45からの、上記に特定されたすべての３種のＬ遺伝子突然変異を組込むrPIV３−１の誘導体である。ワクチン株を開発するためにキメラPIVバックグラウンドに組込まれ得るさらに追加の突然変異は、他の遺伝子における生物学的に誘導された突然変異から選択され、又は標準的部位特定突然変異誘発又は他の純粋な組換え突然変異誘発方法により組換えゲノムに新たに創造されるであろう。これに関して、組換えPIV における、生物学的に誘導された突然変異を採用し、又は新規の突然変異を創造するための標的遺伝子は、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、大きなポリメラーゼサブユニットＬ、マトリックスタンパク質Ｍ、赤血球凝集素 −ノイラミニダーゼタンパク質HN、融合タンパク質Ｆ、並びにＣ，Ｄ及びＶ ORF 生成物を包含する。遺伝子外配列、たとえばPIVゲノムの３’リーダー又はトレイラー領域における配列がまた、標的化される。従って、上記の非キメラ性組換えPIVにおいて同定され、そしてそれに組込まれる典型的な突然変異は、たとえばrPIV３−１により例示されるように、キメラPIVバックグラウンド内に容易に組込まれるであろう。それらの典型的な突然変異は、Ｎタンパク質における１又は複数の突然変異、たとえばJS cp45の残基Val₉₆又はSer₃₈₉に対応する位置での特異的突然変異を包含する。より詳細な観点においては、それらの突然変異は、Val₉₆→Ala又はSer₃₈₉→Alaとして表わされる。Ｃタンパク質における突然変異、たとえば、好ましくは、上記のようにして、Ile₉₆のThrへの置換により表わされる、JS cp45のIle₉₆に対応する位置での突然変異が、キメラPIV組換え体における組込みのために所望される。キメラPIVバックグラウンドにおける組込みのためのさらなる典型的な突然変異は、残基Ile₄₂₀又はAla₄₅₀に対応する位置でのJS cp45から採用された、Ｆタンパク質における１又は複数の置換、たとえば置換Ile₄₂₀→Val又はAla₄₅₀→Thrを包含する。本発明内のさらなる追加のキメラPIV組換え体は、HNタンパク質における１又は複数のアミノ酸置換、たとえばJS cp45の残基Val₃₈₄に対応する位置での突然変異、たとえばVal₃₈₄→Alaを採用するであろう。さらに追加のキメラ組換え体は、遺伝子外配列、たとえば組換えゲノム又はアンチゲノムの３’側リーダー配列に１又は複数の突然変異を組込むであろう。これに関しての典型的な突然変異は、JS cp45のヌクレオチド23，24，28及び／又は45に対応する１又は複数の位置で生じる３’側リーダーにおける突然変異、たとえばヌクレオチド23でのＴ→Ｃ変化、ヌクレオチド24でのＣ→Ｔ変化、ヌクレオチド28でのＧ→Ｔ変化、又はヌクレオチド45でのＴ→Ａ変化を包含する。キメラPIVバックグラウンド内への組込みのためのさらに追加の遺伝子外突然変異は、JS cp45のヌクレオチド6 2に対応する位置でのＮ遺伝子開始配列における突然変異、たとえばＡ→Ｔ変化により本明細書において例示されるように、Ｎ遺伝子開始配列における１又は複数の突然変異を包含する。下記例において組換えPIVを評価し、そしてそこに組合されるそれらの典型的な突然変異は、本明細書に提供される方法及び手段を用いてキメラPIV組換え体内に容易に組込まれ、そして本発明のさらに追加の弱毒化されたキメラワクチン株を生成するために所望する表現型変化を、個々に及び／又は組合して特定するであろう。さらなる組合せ突然変異企画においては、生物学的に誘導されたPIVから採用され、又は本発明のPIVクローンにおいて組換え的に生成された、１又は複数の前述のts，ca又はatt突然変異を、本明細書に開示されるもう１つの明確な突然変異（たとえば、PIVのＮ，Ｐ，Ｌ，Ｍ，HN，Ｆ，Ｃ，Ｄ又はＶ遺伝子又は遺伝子セグメント、又は他の源、たとえばRSV又は麻疹ウィルスからの遺伝子又は遺伝子セグメントの欠失、付加、又は転位）と組合して組込んでいる修飾されたPI Vが提供される。また、この場合、本明細書に開示される突然変異のメニューからの種々の組合せが、ワクチンウィルスを、選択された弱毒化、免疫原性及び安定性レベルに対応せしめるために行なわれ得る。従って、生物学的に誘導された PIV変異体からの少なくとも１つの弱毒化突然変異、たとえばJS cp45に見出されるようなPIVポリメラーゼ遺伝子Ｌにおける突然変異、又は組換え的に生成された突然変異を示し、そしてさらに、たとえば非−PIV源（たとえば免疫原性RSV又は麻疹ウィルス遺伝子又はエピトープ、又はサイトカインをコードする遺伝子）からの異種遺伝子又は遺伝子セグメントの置換又は導入、発現レベルを変更するためにウィルス遺伝子の順序の変化、遺伝子オーバーラップの除去、PIVゲノムプロモーターのそのアンチゲノムカウンターパートによる置換、外来性領域を挿入するための能力を高めるための遺伝子間領域の短縮、延長又は除去、RNA複製又は転写を低めたり又は高めたりするためにシス−作用性シグナルにおける突然変異、ユニーク制限部位の挿入、又は完全な非−必須遺伝子の欠失から選択された１又は複数の追加の変更を組込んでいる組換えPIVが提供される。ワクチン使用のためには、本発明に従って生成されたウィルスは、ワクチン配合物に直接的に使用され、又は当業者に良く知られている凍結乾燥プロトコールを用いて、所望により、凍結乾燥され得る。凍結乾燥されたウィルスは典型的には、約４℃で維持される。使用される場合、その凍結乾燥されたウィルスは、下記にさらに記載されるように、安定化溶液、たとえば塩溶液、又はSPG，Mg²⁺及びHEPESを含んで成る溶液（アジュバントを含んでも又は含まなくても良い）において再構成される。本発明のPIVワクチンは、活性成分として、本明細書に記載のようにして生成された、免疫学的有効量のPIVを含む。修飾されたウィルスは、生理学的に許容できるキャリヤー及び／又はアジュバントと共に宿主中に導入され得る。有用なキャリヤーは当業界において良く知られており、そしてたとえば、水、緩衝水、 0.4％塩溶液、0.3％グリシン、ヒアルロン酸及び同様のものを包含する。得られる溶液は使用のためにパッケージされ、又は凍結乾燥され、その凍結乾燥された調製物が、上記で言及されたように、投与の前、無菌溶液と組合される。生成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされるような、医薬的に許容できる補助物質、たとえばpH調節及び緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤及び同様のもの、たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、及び同様のものを含むことができる。許容できるアジュバントは、当業界において良く知られている多くの他の適切なアジュバントの中で、不完全フロイントアジュバント、MPL^TM(３−０−デアシル化されたモノホスホリル脂質Ａ；RIBI Immuno Chem Research，Inc.，Hamilton，MT)及びIL−12(Genetics Institute，Ca mbridge，MA)を包含する。エアゾール、液滴、経口、局所又は他の経路を通して、本明細書に記載されるようなPIV組成物により免疫化した後、宿主の免疫系は、PIVウィルスタンバク質、たとえばＦ及びHN糖タンパク質に対して特異的な抗体を生成することによってそのワクチンに応答する。本明細書に記載されるようにして生成された、免疫原的有効量のPIVによる予防接種の結果として、宿主は、PIV感染に対して少なくとも部分的に又は完全に免疫性になり、又は特に、低部呼吸器官の中位の又は重度のPIV感染に対して耐性になる。ワクチンが投与される宿主は、PIV又は密接に関連するウィルスによる感染に対して敏感であり、そして予防接種株の抗原に対して保護免疫応答を生成することができるいづれの哺乳類でもあり得る。従って、本発明は、種々のヒト及び獣医使用のためのワクチンを創造するための方法を提供する。本発明のPIVを含むワクチン組成物は、宿主自体の免疫応答能力を増強するために、PIV感染に対して敏感な又はPIV感染の危険性のある宿主に投与される。そのような量は、“免疫原的有効用量”であると定義される。この使用においては、有効用量内で投与されるPIVの正確な量は、宿主の健康状態及び体重、投与の態様、配合物の性質、等に依存するが、しかし一般的には、約10³〜約10⁶のプラーク形成単位(PFU)又はそれ以上のウィルス／宿主、より通常には、約10⁴〜10⁵P FUのウィルス／宿主の範囲である。いづれにせよ、ワクチン配合物は、重度の又は生命−脅威のPIV感染に対して宿主患者を効果的に保護するのに十分な量の修飾されたPIVを提供すべきである。本発明に従って生成されるPIVは、複数のPIV血清型又は株に対する保護を達成するために他のPIV血清型又は株のウィルスと共に組合され得る。他方では、複数のPIV血清型又は株に対する保護は、本明細書に記載のように、１つのウィルス中に構築された複数の血清型又は株の保護エピトープを組合すことによって達成され得る。典型的には、異なったウィルスが投与される場合、それらは混合して存在し、そして同時に投与されるが、しかしそれらはまた、別々でも投与され得る。１つの株による免疫化は、同じか又は異なった血清型の異なった株に対して保護することができる。多くの場合、本発明のPIVワクチンを、他の剤、特に他の小児期ウィルスに対する保護応答を誘発するワクチンと共に組合すことが所望される。本発明のもう１つの観点においては、PIVは、他の病原体、たとえば呼吸シンシチウムウィルス(RSV)又は麻疹ウィルスの保護抗原のためのベクターとして、それらの保護抗原をコードする配列を、本明細書に記載のようにして、感染性PIVを生成するために使用されるPIVゲノム又はアンチゲノム中に組込むことによって、使用され得る。RSV cRNAのクローニング及び本発明に関する他の開示は、アメリカ合衆国同時係属特許出願番号第08／534,768号、第60／021,773号、第08／720,132号、第60／046,141号、第60／047,634号及び第08／892,403号、及びPCT特許出願PCT ／US97／12269号（それらは、引用により本明細書中に組込まれる）に記載されている。本発明のワクチン組成物の１回の又は複数回の投与が実施され得る。新生児及び幼児においては、複数回の投与が十分なレベルの免疫性を誘発するのに必要とされる。投与は生後、１カ月以内に開始し、そして小児期を通して、生来（野生型）のPIV及び／又は他の対象のウィルス感染に対する十分なレベルの保護性を維持するために必要により、２カ月、６カ月、１年及び２年間隔で行なわれるべきである。同様に、反復しての又は重度のPIV感染に対して特に敏感である成人、たとえばヘルスケアーワーカー、デイケアーワーカー、子供、年配の人、及び無防備状態の心肺機能を有する個人は、保護免疫応答を確立し、そして／又は維持するために複数回の免疫化を必要とする。本発明のワクチンにより提供される、誘発された免疫性のレベルは、中和性分泌及び血清抗体の量を測定することによってモニターされ得る。それらの測定値に基づいて、ワクチン投与量が調整され、又はワクチン投与が、所望する保護レベルを維持するために、所望により反復され得る。さらに、異なったワクチンウィルスが、異なった受容体グループのためには好都合であり得る。たとえば、Ｔ細胞エピトープに富む追加のタンパク質を発現する、構築されたPIV株が特に、幼児よりもむしろ成人のために好都合である。本発明のさらにもう１つの観点においては、PIVは呼吸器官の一時的な遺伝子療法のためのベクターとして使用される。この態様によれば、組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、興味ある遺伝子生成物をコードすることができる配列を組込む。その興味ある遺伝子生成物は、PIV発現を制御する同じか又は異なったプロモーターの制御下にある。組換えPIVゲノム又はアンチゲノムを、Ｎ，Ｐ，Ｌ及び他の所望するPIVタンパク質と共に同時発現し、そして興味ある遺伝子生成物をコードする配列を含むことによって生成された感染性PIVが患者に投与される。投与は典型的には、エアロゾル、ネブライザー又は他の局部適用により、処理される患者の呼吸器官に行なわれる。組換えPIVは、治療又は予防レベルの所望する遺伝子生成物の発現をもたらすのに十分な量で投与される。本発明内で投与され得る代表的な遺伝子生成物、たとえばインターロイキン−２、インターロイキン−４、γ−インターフェロン、GM−CSF,Ｇ−CSF、エクトロポイエチン及び他のサイトカイン、グルコセレブロシダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ノウ胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（CFTR）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、細胞毒素、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスRNA及びワクチン抗原が、好ましくは、一時的な発現のために適切である。次の例は例示的であって、本発明を制限するものではない。例Ｉ陰性センスPIVゲノムRNAをコードするプラスミドｐ218（131）の構成ｐ218(131)(図１：配列番号１)(American Type Culture Collection(ATCC)，1 2301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USAにブタベスト条約に基づいて寄託され、そして寄託番号第97991号が得られた)と命名された十分なcDNA クローンを、HPIV３ JS株の完全な15461ntのゲノム配列をコードするよう構成した。肝炎ウィルスδリボザイムを、自己−切断がHPIV３の３’末端を生成するよう、ゲノム配列の３’末端に隣接して配置した（Perrotta and Been，Nature 35 0 ：434-436,（1991）；引用により本明細書中に組込まれる）。Ｔ７転写ターミネーターを、δリボザイムに続いて配置した。Ｔ７プロモーターを、HPIV３ゲノムの５’末端ヌクレオチドが合成される最初のヌクレオチドであるよう、そのゲノム配列の５’末端に隣接して配置した。この配置においては、cDNAは、いづれの追加の異種ヌクレオチドも伴わないで、正しいゲノム末端を含むPIV３ゲノムR NAの完全なネガティブ−センスコピーをコードする。 HPIV３ cDNAを、スクロースグラジエント遠心分離（Stokesなど.,前記，1992; Stokesなど，前記，1993;それらは引用により本明細書に組込まれる）により精製されたビリオンから単離されたRNA の逆転写（RT）及びポリメラーゼ鎖反応(PCR)により構成された、14のオーバラップするサブクローン（A^★−Ｌと称する；括弧内の文字は個々のプラスミドを示し、そして特定のウィルス遺伝子を言及しない）からアセンブルした。サブクローンは、ゲノムRNAの次のヌクレオチドに及んだ（位置１として命名された３ ’末端から番号づけされた）：１−2058(A^★)，1874-3111(A')，3086-5140(C),4 348-5276(C’)，5072-6695(D^★)，5904-8532(E)，7806-9898(F)，9632-10740(F ’)，9760-10955(G)，10862-11925(H，11835-12868(I)，12426-13677(J)，13630 -14496(K),及び14467-15462（L）。個々のフラグメントを、従来のクローニング技法を用いて、pBluescript KS II（Strategene，La Julla，CA）中にクローン化し、そして完全に配列決定した。次に、プラスミドｐ（Ｌ）を、MUTA−GENE方法（BioRad，Hercules，CA）に従って一本鎖DNA中間体を通してＴ７プロモーターを導入するために特定部位の突然変異誘発にゆだねた。Ｔ７プロモーターを位置決定し、その結果、転写がネガティブーセンスの突然変異誘発プライマ-5'-AATACGACTCACTATA ^★ACCAAACAAGAGAA G -3'（配列番号２；Ｔ７配列はイタリック型で書かれており、HPIV３−特異的配列は下線が引かれており、そして５’−末端HPIV３ヌクレオチド(ゲノム位置154 62)は星印により示される）を用いて、HPIV３ゲノムの正確な５’末端で開始する。この修飾されたｐ（Ｌ）を、ｐ(Ｌ^★)と命名した。プラスミドｐ（Ｅ）を、３種のヌクレオチド置換（下線）をHPIV３位置7903，7913，7915（図１）でHN遺伝子中に挿入するためにネガティブーセンスの突然変異誘発オリゴヌクレオチド 5'-CCAAGTACTATGAGATGCTTGATT-3'（配列番号３）を用いて、同じ方法により修飾し、ｐ(Ｅ^★)を生成した。それらの置換は、HgaI部位を除去し、ScaＩ部位を挿入し、そしてモノクローナル抗体(m Ab)423／６及び170／７により認識されるエピトープが削除されるよう、コードされたHNタンパク質のアミノ酸370を修飾した(van Wyke Coelinghなど，J ．Viro l． 61：1473-1477(1987);引用により本明細書中に組込まれる）ｐ(Ｅ)^★〜ｐ（Ｋ）サブクローンを、ｐ(Ｌ^★)プラスミド中に、段階的態様でアセンブルし、ｐ (E^★FF'GHIJKL^★)(図１Ａ)を得た。このプラスミドは、ゲノムの５’末端でヌクレオチド15462に隣接するＴ７プロモーターと共にHPIV３ヌクレオチド5904−154 62を含む。サブクローンｐ(Ａ^★)〜ｐ（Ｅ）を、HPIV３ヌクレオチド１−8532を含む第２のオーバーラッピングサブクローンｐ（A^★A'CC'D^★E）中にアセンブルした。両サブクローンｐ(E^★FF'GHIJKEL^★)及びｐ（A^★A'CC'D^★E）を、完全に配列決定した。上記の導入された点突然変異の他に、cDNAは、Ｎ遺伝子内に存在し、そしてコードされたタンパク質におけるアミノ酸506での置換を引き起こした位置1615での単一のヌクレオチド置換により、真正のJS HPIV３配列（Stokesなど，前記，1992）とは異なった。３種の他のヌクレオチド置換が、コードされたタンパク質を変更しなかったＬ遺伝子において位置10355，11333及び15248で見出された（図２）。それらの３種の非コード変更を、cDNAに由来する組換えウィルス（rPIVと命名される）を同定するための追加の配列マーカーとして保持し、そしてＮ遺伝子における突然変異を、後で記載のようにして補正した。次に、サブクローンｐ（A^★A'CC'D^★E）を修飾し、HPIV３位置１に隣接して、肝炎δウィルスリボザイム及びＴ７ターミネーターを挿入した。HPIV３ゲノム(G GT ↓GGG)の３’末端（下線が引かれている）がフランキング肝炎δウィルスアンチゲノムリボザイム（太文字で部分的に示される）の自己−切断を通して生成されたHPIV３ミニゲノムを、前記のようにして構成した（Dimock及びCollins，J ． Vi rol ．67：2772-2778,（1993）；Perrotta and Been,前記，（1991）；それぞれ引用により、本明細書中に組込まれる）。リボザイムの後に、Ｔ７転写ターミネーターが続いた。このミニゲノムcDNAを、リボザイム切断部位に隣接する配列を、SmaＩ部位(CCC↓GGG)に修飾し、そしてＴ７ターミネーターの下流部位上にApa Ｉ部位(GGGCC↓C)を配置するPCR反応において鋳型として使用した。PCR生成物を、BssH IIにより消化され、そしてフィルインによりブラント末端化されたpKS I I中にクローン化し、p218を生成した。ｐ218を、いづれかの配列が開環されたSmaＩ部位中にブラント−末端連結により導入され、そしてそのRNA転写体がδリボザイム切断部位(NNN↓GGG)で切断されるよう企画した。ｐ（A^★A'CC'D^★E）サブクローンをHgaＩ及びSalＩ（8533）により消化し、HPIV３ｃDNAを開放し、そしてdNTP及びＴ４ DNAポリメラーゼによりフィルインし、ブラント末端を得た。HgaＩ部位は、HPIV３位置１の10ヌクレオチド上流に存在し、そして消化され、そしてフィルインされる場合、HPIV３位置１で開始するブラント末端を付与する。修飾されたHgaＩ−SalＩフラグメントを、ゲル精製し、そしてｐ218のSmaＩ部位中にクローン化した。Ｎ遺伝子における突然変異（nt1615でのＴ）を、Kunkel突然変異誘発（Kunkelなど.，Methods Enzymol ． 154：367-382,（1987）；引用により本明細書中に組込まれる）を用いて、JS wt配列（nt1615でのＡ）(GenBank受託番号Z11575を参照のこと；これは引用により本明細書中に組込まれる)に対して補正した。このプラスミドをｐ2 18（A^★A'CC'D^★E）(図１)と命名した。ヌクレオチド7438−15462からのＴ７プロモーター及びHPIV３ｃDNAをを含む、ｐ（E^★FF'GHIJKL^★）のXhoＩ−NgoMIフラグメントを、ｐ218(A^★A'CC'D^★E) のXhoＩ−NgoMI窓中にクローン化した（図１）。これは、HPIV３ヌクレオチド7438でHPIV３ cDNAの２つのフラグメントを連結せしめ、HN遺伝子における上記３種の所望する突然変異及びＬ遺伝子における３種の偶発的突然変異と共に、ネガティブ−センスのゲノムRNAをコードする十分な長さのHPIV３ cDNAを含むプラスミドを生成した。次に、ｐ218(131)(図１；配列番号１)として命名された最終構造体を、Taq DYE Deoxy Terminatorサイクル配列決定キット（ABI，Foster City，CA）を用いて、NCI Frederick Canc er Research and Development Center(Frederick，MD)で、自動配列決定によりその全体を配列決定した。これは、HN遺伝子における追加の変化、すなわち、図２にまた示される、トレオニンからイソロイシンにHNアミノ酸263を変えた位置7 593でのHN遺伝子におけるＣからＴへの変化を同定した。例II HPIV ３のための転写及びRNA複製系この例は、ヒトパラインフルエンザウィルスタイプ３（HPIV３）のための再構成された転写及びRNA複製系を生成するための組成物及び方法を記載する。この典型的なシステムを、ワクシニアウィルス組換え体により供給されるＴ７ RNAポリメラーゼにより駆動される、トランスフェクトされたプラスミドから細胞内発現される成分を用いて開発した。この系は、ウィルス遺伝子が欠失され、そして細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)をコードするポリヌクレオチドにより置換されているHPIV３ゲノムRNAのネガティブ−センス類似体に基づかれている。Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質を、効果的な転写及びRNA複製を方向づけるために、同時トランスフェクトされたプラスミドから発現せしめる。この例に従っての転写は、たとえばoligo(dT)クロマトグラフィーにより容易に単離され得る、ポリアデニル化されたサブゲノムmRNAを生成する。この例に従ってのRNA複製は、ミクロコッカスヌクレアーゼによる消化に対する耐性に基づいてカプシド封入されることが示されている、ミニ−アンチゲノム及び子孫のミニゲノムを生成する。Ａ）ウィルス及び細胞バクテリオファージＴ７ RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルス組換え体、すなわちvTF７−３を、Fuerstなど.（Proc ．Natl．Acad．Sci．USA．83： 8122-8126，1986；これは引用により本明細書に組込まれる）により記載のようにして調製した。HEp-２単層培養物を、２％ウシ胎児血清(FBS)、50μｇ／mlのゲンタマイシンスルフェート及び２mMのグルタミンにより補充されたOptiMEM１（Life Technologies，Gaithersburg，MD）により、５％CO₂下で37℃で維持した。Ｂ）cDNA HPIV３のJS株(GenBank ♯Z11575；Stokesなど.，1992)のＮ，Ｐ及びＬ遺伝子のORFに対応するcDNAは、Ｔ７ RNAポリメラーゼ、及び外来性ORFの前の内部リボソーム侵入部位による翻訳により仲介される(Elroy-Steinなど.，Proc ．Natl．A cad．Sci．USA， 86：6126-6130(1989);引用により本明細書に組込まれる)。個々の遺伝子をまず、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)により修飾し、下流の末端上の翻訳開始部位及びSa’lＩ部位でNcoＩ又はNcoＩ−適合性部位を配置した。肝炎δウィルスリボザイムを欠いていることを除いて、ｐ218（131）に類似するプラスミドｐ(131)を、個々のPCRのための鋳型として使用した。Ｎ ORFを増幅するために使用されるプライマーは、CCCTATAATTTCA ACATGT TGAGCCTATTTG（配列番号４；ポジティブ−センスに対して前方向プライマー）、及びGATTAAAATGTT G GTCGAC TTAGTTGCTTCC（配列番号５；イタリック型が制限酵素部位を表わし、そして翻訳開始部位が太字で示される）であった。PCR生成物、すなわちAfl III及びSalＩ部位を端に有する1578bpのフラグメントを、pTM−１のNcoＩ−SalＩ窓中にクローン化し、pTM(Ｎ)を生成した。 PIV３リンタンパク質（Ｐ）を増幅するために使用されるプライマーは、5-'CC ATAGAGAGT CCATGG AAAGCGATGCTAAAAACTATC-3'(配列番号６；前方向プライマー、及び5'-CGGTGTCGTTTCTTT GTCGAC TCATTGGCAATTGTTG-3'（配列番号７；逆方向プライマー）であった。ゲノムRNA(p131)のJS株の十分な長さのcDNAを、PCRのための鋳型として使用した。得られるPCR生成物は、NcoＩ及びSalＩ制限部位（イタリック型）を端に有する1851bpのフラグメントであった。次に、PCR生成物を、p TM−１のNcoＩ−SalＩ窓中にクローン化し、pTM(ｐ)を生成した。第２のPCRを実施し、Ｃ ORFを有さないPIV３リンタンパク質Ｐ ORFを増幅した。ｐ131を再び、鋳型cDNAとして使用した。次の異なった前方向プライマー及び同じ逆方向プライマーを用いて、Ｃを有さないPIV３Ｐ ORFを増幅した：5'-CCA TAGAGAGT CCATG GAAAGCGACGCTAAAAACTATC-3'(配列番号74；前方向プライマー)及び5'-CGGTGTCGTTTCTTT GTCGAC TCATTGGCAATTGTTG-3(配列番号７；逆方向プライマー)、その得られるPCR生成物は、NcoＩ及びSalＩ制限部位（イタリック型で示される）を端に有する1851bpのフラグメントであった。前方向プライマーにおける下線のヌクレオチドは、Ｐ ORFにおいてはサイレントであるが、しかしＣ ORF の開始コドンをトレオニンに変えるヌクレオチド置換を表わす。Ｃ ORFのための次の開始コドンは、400以上下流のヌクレオチドである。従って、Ｐタンパク質のみが生成される。次に、PCR生成物を、pTM−１のNcoＩ−SalＩ窓中にクローン化し、第２のプラスミド、すなわちpTM(Ｐ，Ｃナシ）を生成した。 HPIV３のＬ ORFを、３個の部分でpTM−１中にクローン化した：末端はPCR生成物に由来し、そして主要本体はｐ218（131）からの制限フラグメントであった。Ｌ ORFの上流末端を、次のプライマーを用いて増幅した：GCAAAGCGTG CCCGGGCCA TGG ACACTGAATCTAACAATGGC(配列番号８)及びGAAATTCCTTA ATCGAT TCTCTAGATTC( 配列番号９)。これは、十分な長さのゲノムの位置8625−9645が、上流末端上にS maＩ及びNcoＩ部を、及び下流末端上にClaＩ部位を有する（すべての３種の部位はイタリック型で示される）、1,020−bpのPCR生成物Ｌ１を生成した。Ｌ ORFの下流末端を次のプライマーを用いて増幅した；CCCATCAACTGTAACA TACGTA AGAAAG AC(配列番号10)及びGGTTAGGATAT GTCGAC ATTGTATTTATG（配列番号11）。これは、十分な長さのゲノムの位置13,645−15,378が、SnaBI及びSalＩ部位（イタリック型で示される）を有する1,733−bpのPCR生成物Ｌ２を生成した。プラスミドｐ (131)をClaＩ及びPstＩにより消化し、十分な長さのゲノムの位置9,630−14,120 を含む4,487−bpのフラグメントＬ中間を生成した。Ｌ１及びＬ中間を共通するC laＩ部位で連結し、そしてpBluescriptのSmaＩ−PstＩ窓中にクローン化し、ｐ（Ｌ１−Ｌ中間）を生成した。次に、Ｌ２フラグメントを、ｐ（Ｌ１＋Ｌ中間）のPstＩ−SalＩ窓中にクローン化し、NcoＩ及びSalＩを端に有する完全なＬ ORF を生成した。次に、これを、pTM−１のNcoＩ−SalＩ窓中にクローン化し、pTM( Ｌ)を生成した。pTM(Ｎ)(配列番号20)、pTM(Ｐ)(配列番号21)及びpTM(Ｌ)(配列番号22)のPCR−生成された領域の配列を、ジデオキシヌクレオチド配列決定方法により確かめた。Ｔ７転写の効率を高めるために、一定の修飾を、PIV３−CAT(−)と呼ばれるネガティブ−センスのPIVミニゲノムをコードするcD NA構造体に対して行なった（Dimock及びCollins，Ｊ．Virol．672772-2778（199 3）;これは引用により本明細書に組込まれる）。ＰIV３−CAT(−)は、CAT ORFのネガティブ−センスコピーに融合されるHPIV３ゲノムの３’−末端の111個のヌクレオチド及び５’−末端の115個のヌクレオチドを含む。このcDNAを、HgaＩによる線状化及びＴ７ RNAポリメラーゼによる転写に基づいて、HPIV３ゲノムの正確な末端を含むミニゲノムを生成するよう企画した。cDNA末端への連続的な延長を付加する突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いての２回の連続したPCRを用いて、自己−切断が正しい3'HPIV３ゲノム末端を生成するよう、肝炎ウィルスδ リボザイムによりHgaＩ部位を置換した(Perotta及びBeen，Nature 350：434-436 （1991）；これは引用により本明細書中に組込まれる)。Ｔ７転写終結シグナルを、リボザイムの直後に挿入し（図３）、PIV３−CAT−δを生成した。 PIV３−CAT−δ cDNAを、PCR突然変異誘発により修飾し、トレイラー及びＴ７プロモーターを端に有する制限部位を用いて、Ｔ７プロモーターとミニゲノムの５’末端との間に１，２又は３個のＧ残基を挿入した。この修飾はＴ７転写の高められた効率を生成した。予備実験においては、PIV３−CAT−GGと呼ばれる、Ｇ残基を含むミニゲノムが、下記に記載される再構成された転写及び複製システムにおいてのCATの発現において最とも活性的であり、そしてすべての続く誘導体化のために使用された。 PIV３−CAT−GG cDNAをさらに、オーバーラッピングPCR突然変異誘発により修飾し、次の通りに、２つの部位で同時に修飾を導入した。第１に、ワクシニアウィルス初期段階RNAポリメラーゼ(T₅NT)（Yuen及びMoss，Proc ．Natl．Acad ．Sci．USA 84：6417-6421(1987);引用により本明細書中に組込まれる）のためのタンデム転写終結モチーフを含む配列T₇CTを、δリボザイムとＴ７転写ターミネーターとの間のボジティブ−センス鎖のcDNA鎖中に挿入した（図１）。このモチーフ、及び下記に記載される第２モチーフを付加し、ワクシニアウィルス初期RNAポリメラーゼによりCAT遺伝子の無差別な転写を防止した。第２に、ミニゲノムcDNA挿入体を、（ｉ）第２ワクシニアウィルス終結モチーフ（T₅AT）の、コードされたミニゲノムに対して位置103〜109でのポジティブ−センスのcDNA鎖中への挿入、及び（ii）ミニゲノム位置112での０〜６個のＧ残基（ネガティブ−センス）の挿入を含むよう、Ｎ−非翻訳領域とCAT遺伝子との間の連結部で修飾した（図３）。オーバーラッピングPCR突然変異誘発は、次の通りに実施される３組の反応( PCR１，２及び３)を包含した。PCR１は、鋳型としてPIV３−CAT−GG cDNAを及びプライマーとして次の２種の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いる７回の平行した反応組〔PCR１（０）〜（＋６）〕であった：前方向プライマー：⁺¹¹¹G GGGTTATGCTACTGCAGGCTTTTTTTCTCCCTTAGCCATCCG^-52（配列番号12）、及び逆方向プライマー：¹²⁴CTC CATTCTAGA(N)TTATAAAAATTATAGAGTTCCC⁹⁰(配列番号13)。第１のオリゴヌクレオチドにおける太字の配列は上流のタンデムワクシニアターミネーターであり、そして第２のオリゴヌクレオチドにおける太字の配列は第２ターミネーターである。この反応は、リボザイム及び隣接するリーダー領域を増幅し、そして上記の突然変異を挿入した。PCR２は、鋳型としてPIV３−CAT−GG cD NA、及びユニークNgoMI部位の上流のプラスミド配列においてハイブリダイズした前方向プライマー（図３）、及び反応１の前方向プライマーに対して相補的な逆方向プライマーを用いる単一反応であった。従って、PCR１及び２の生成物は、この後者の配列でオーバーラップした。PCR１（０）〜（＋６）、及びPCR２の生成物をゲル精製した。PCR１（０）〜（＋６）の生成物を、PCR２の生成物のアリコートとそれぞれ別々に混合し、そしてまた、PCR２の前方向プライマー一及びPCR１の逆方向プライマーを含む第３反応(PCR3（０）〜(＋６))において増幅した。PCR3（０）〜（＋６）の生成物を、プラスミド特異的配列において切断するNgoMI、及びCAT遺伝子の上流端で切断するXbaＩにより消化し（図３）、そしてPIV３−CAT−GGのNgo MI−XbaＩ窓中にクローン化した。これは、挿入されたＧ残基の数に従って命名されたミニゲノムコードのcDNAのパネルをもたらした：PIV３−CAT ０〜PIV３− CAT＋６．PCRに由来するすべてのDNA領域の構造を、ジデオキシヌクレオチド配列決定により確かめた。Ｃ）トランスフェクション HEp−２細胞を、６ウェルプレートにおいて、90％集密性に増殖した。６ウェルプレートの個々のウェル(1.5×10⁶個の細胞)を、0.4μｇのpTM(Ｐ)，0.4μgの pTM(Ｎ)，0.05μｇのpTM(Ｌ)、及び0.4μｇのミニゲノムプラスミドによりトランスフェクトした。前記プラスミドを、0.1mlのOpti MEM(Life Technologies)に添加し、そして12μｌのLipofect ACE(Life Technologies)を含むOpti MEM 0.1m lと共に混合した。室温で約15分間のインキュベーションの後、２％ウシ血清及び1.5×10⁷pfuのvTF７−３を含むOpti MEM1(0.8ml)を、個々のウェルに添加した。プレートを37℃で12時間インキュベートし、その後、培地を、２％ウシ胎児血清を含む新鮮なOpti MEMにより変換した。次に、細胞を37℃で合計48時間インキュベートし、そしてRNA分析及びCATアッセイのために収穫した。個々のミニゲノムを、三重反復して表わし（３個のウェル）、これを培地に削り取り、そしてプールした。Ｄ）CAT アッセイ上記収穫された細胞の個々のプールされたサンプルの3.33％(1.5×10⁵個の細胞)を表わすアリコートを、CATアッセイのために取り出した。そのアリコートを 1,000rpmで５分間、遠心分離し、そして上清液を捨てた。細胞懸濁液を、40mMのトリス(pH7.5)、１mMのEDTA、150mMのNaClの溶液１mlにより洗浄し、そして0.25 Mのトリス(pH7.5)溶液50mlに再懸濁した。溶解物を、３回の凍結及び融解により調製し、そして8,000rpmでの５分間の遠心分離により透明にした。溶解物１μｌを、従来のアッセイを用いて、Ｄ−トレオー〔ジクロロアセチル１−¹⁴Ｃ〕クロラムフェニコール（Amersham）をアセチル化する能力についてアッセイした（Go rmonなど.，Mol ．Cell．Biol．２：1044-1051(1982);これは引用により本明細書に組込まれる。アセチル化を、薄層クロマトグラフィーにより可視化し、そしてホスホイメージャー分析(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)により定量化した。Ｅ）RNA 分析個々のプールされたサンプルの残る細胞収穫物を、カプシド化されたRNA、合計RNA及びmRNAの単離のために３つの等しい部分に分けた。それらの３つのアリコートを、1,000rpmで５分間、遠心分離し、そして上清液を捨てた。細胞懸濁液の２つのアリコートを、１％Triton Ｘ−100，0.5％DOCを含むRSB(10mMのNaCl ，10mMのトリス、pH7.5，1.5mMのMgCl₂)50μｌに再懸濁した。次に10mMのトリス (pH7.5)，１mMのCaCl₂及び20μｇ（１mg／mlのストック）のミクロコッカスヌクレアーゼの溶液50μｌを１つのアリコートに添加し、そして他はミクロコッカスヌクレアーゼを有さない同じ混合物を受けた（Baker & Moyer，J ．Virol．62：8 34-838（1988）；311pにより本明細書に組込まれる）。ミクロコッカスヌクレアーゼの目的は、カプシド化されなかったRNAを破壊することであり、そして使用される条件は、予備実験において最適化された。混合物を30℃で30分間インキュベートし、そしてRNAを供給者の方法に従ってTrizol(Life Tcehnologies)により単離した。細胞懸濁液の第３のアリコートをTrizolによるRNA精製のために処理し、そして精製されたRNAを、oligo(dT)セルロースクロマトグラフィーによりポリアデニル化された画分及びポリアデニル化されていない画分に分離した（ Grosfeldなど.，J ．Virol．69：5677-5686(1995);引用により本明細書中に組込まれる）。RNAサンプルを、0.44Ｍのホルムアルデヒドを含む1.5％アガロースゲル上で試験し、ニトロセルロースに移し（Chomczynski，Anal ．Biochem．201：1 34-139(1992);引用により本明細書中に組込まれる）、鎖特異的リボプローブによりハイブリダイズせしめ、そしてホスホイメージャー分析により定量化した。例III 修飾されたPIV３ミニゲノムの構成及び発現この例においては、cDNAのバネルが、単一のヌクレオチドインクレメントにより長さが異なるPIV３ミニゲノムをコードするよう構成された。この再構成されたシステムにおける転写及びRNA複製は、その長さがちょうど６の倍数であるミニゲノムに関して最とも効果的であった。これに関して、パラミキソウィルス及びモルビリビラス(Morbillivirus)属のメンバーは、典型的には、“６の規則” により守られ、すなわちゲノム（又はミニゲノム）は、それらのヌクレオチドの長さが６の倍数である場合のみ、効果的に複製する（NPタンパク質のカプシド化に対してのヌクレオチド残基の正確な間隔開けのための必要条件であると思われる）。しかしながら、この発見は、長さが６のちょうど倍数よりも１つのヌクレオチド大きいか又は少さいミニゲノムが驚くべきことには、特にRNA複製においてのみ活性的であることを示す。７種のcDNAのパネルが、単一のヌクレオチドインクレメント、長さが異なる、 PIV３−CAT ０〜＋６と呼はれる７種のPIV３−CATミニゲノムをコードするよう構成された（図３）。個々のミニゲノムは、ウィルス遺伝子が欠失され、そして CAT ORFのネガティブ−センスコピーにより置換されているHPIV３ゲノムRNAの短いネガティブーセンス類似体である。CAT ORFは、Ｎ及びＬ遺伝子非翻訳セグメント、Ｎ GS及びＬ GE転写モチーフ、及びゲノムRNAの３’リーダー及び５’トレイラー遺伝子外末端を端に有する。個々のPIV３−CATミニゲノムの５’末端は、Ｔ７ RNAポリメラーゼのための隣接するプロモーターにより定義される。このプロモーターは、上記のように、２つの非ウィルスＧ残基の延長が、コードされたミニゲノムの５’末端に寄与されるよう構成された。Ｔ７プロモーターの非転写コアーに隣接する追加のＧ残基の存在は、その転写の効率を改良し、そして予備研究は、２つのＧ残基の存在が下記再構成されたシステムにおいて最高レベルの活性を提供したことを示した。それらの２つのＧ残基は、ミニゲノムの長さの計算には包含されていない。３’ミニゲノム末端を、正しい３’−末端ヌクレオチドを生成する、隣接する肝炎δウィルスリボサイムによる自己−切断により創造する。７種のPIV３−CATミニゲノムは、Ｎ非翻訳領域とCAT遺伝子との間の連結部での０〜６のＧ残基の挿入のために長さの延長、及び898〜904のヌクレオチドの長さの範囲で、単一のヌクレオチドで異なる。PIV３−CAT＋２ミニゲノムは、６のちょうど倍数である唯一のミニゲノムである（個々のミニゲノムは、２つの追加の非ウィルス性Ｇ残基を、Ｔ７プロモーターにより寄与される５’末端で含むが、しかしそれらは細胞内HPIV３−介在性RNA複製の間、失なわれると思われることが注目されるべきである）。個々のPIV３−CAT cDNAを、vTF7−３、すなわちＴ７ RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルス組換え体により感染されたHEp−２細胞中にトランスフェクトした。Ｔ７プロモーターの制御下でＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドを同時にトランスフェクトした。Ｐ cDNAは、Ｃ ORFの翻訳開始部位を排除するために特定部位の突然変異誘発により修飾されていた。細胞を感染後 48時間で収穫した。細胞懸濁液のアリコートを、CAT酵素アッセイのために処理した（図４）。残る細胞を、３つの等しいアリコートに分け、そして下記のようにして、RNA分析のために処理した。ミニゲノムcDNAをさらに、PIV３−CAT挿入体の上流のポジティブ−センスプラスミド鎖に２つのタンデムワクシニアウィルス初期−遺伝子転写終結モチーフ（ T₇NT）を、及びCAT ORFのすぐ上流の同じ鎖に第３の前記モチーフ（T₅AT）を含むよう、修飾した（図３）。それらを、ワクシニアウィルスポリメラーゼによる CAT ORFの無差別な転写を最少にするよう企画した（Grosfeldなど．(1995)，前記）。CAT発現は、PIV３−CATミニゲノムの個々がＮ，Ｐ及びＬプラスミドにより補充される場合、再生的に検出され、（図４）、そしてCATの検出は、すべてのそれらのPIV３タンパク質に依存した。しかしながら、発現率は、６のちょうど倍数であるヌクレオチドの長さを有するPIV３−CAT＋２に関してより高かった。ミニゲノム及び支持プラスミドの好ましい割合及び量を、CAT酵素発現に基づいて決定した。例IV PIV ミニゲノムによるポジティブ−センスRNAの合成 PIVミニゲノムの転写及び複製を、両方法のRNA生成物の検出により確かめた。前記例に記載されるように、細胞懸濁液の３つの等しいアリコートを、RNA分析のために採取した。１つのアリコートを、上記のように、oligo(dT)分析のために使用した。他の２つのアリコートを、界面活性剤により溶解し、そしてミクロコッカスヌクレアーゼと共にインキュベートするか又は擬似−処理した。次に、RNAを、単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上での電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移し、そしてネガティブ−センスCATリボプローブによるハイブリダイゼーションにより分析した。ミクロコッカス−処理された及び擬似−処理された溶解物からのRNAが、それぞれ、図５Ａの上部及び下部パネルに示される。擬似（mock）−処理された溶解物からのRNAの分析は、Ｎ，Ｐ及びＬプラスミドによる個々のミニゲノムの補充が、931−ヌクレオチドRSV−CAT Ｃ２ミニゲノムにより発現されるRNAから成るマーカーにサイズ上、ひじょうに類似するRNAバンドの合成をもたらしたことを示した（Grosfeldなど，(1995)，前記）。ホスホルイメージャー分析が、図８Ｂに示される。Ｎ又はＬプラスミドが削除される場合、RNAはほとんど、又はまったく検出されず、このことは、それらのRNAが再構成されたPIV３ポリメラーゼの生成物であることを確かめた。個々のPIV３−CATミニゲノムは、２種のポンティブ−センスRNA、すなわちミニ−アンチゲノム及びサブゲノムCAT mRNAをコードすることが予測される。個々のミニ−アンチゲノムは、898〜904の長さのヌクレオチドである、そのミニゲノムの正確な補体であることが予測される。予測されるサブゲノムmRNAは、GS及び GEシグナルにより定義され、そして804個のヌクレオチドの長さであり、そして1 00〜200個のヌクレオチドのポリＡ末端を含むことが予測される。図５Ａにおけるポジティブ−センスRNAの単一ゲルバンドの検出（下部パネル）は、アンチゲノム及びmRNAがゲル電気泳動により分解されなかったことを示した。従って、ミクロコッカスヌクレアーゼによる処理は、アンチゲノム(及びゲノム)(但し、mRNAではない)がカプシド化され、そして消化に対して耐性であるので、アンチゲノムRNAを同定するために使用された。この目的のためへのミクロコッカスヌクレアーゼの使用は十分に確立されており（Baker & Moyer(1988)，前記）、そして選択される条件はRSVミニレプリコンにより確証されており、そしてHEp−２細胞溶解物に含まれるmRNAを完全に分解することが示されている。残留RNAを精製し、そしてネガティブ−センスリボプローブによるノザンブロット分析により分析し（図５Ａ、上方パネル）、そしてホスホルイメージャーにより定量化した（図５Ｂ；この分析においては、ミクロコッカス−処理された及び処理されていないRNA量が別々に標準化されたことを注目すること）。それらの調査は、ポジティブ−センスのカプシド化されたミニ− アンチゲノムに対応する保護されたRNA集団の存在を示した。いくつかの実験の中で、この保護されたRNAは、約３〜15％のポジティブ−センスRNAであった。全RNA及びミクロコッカス−耐性RNAの両者に関して、蓄積は、900個の長さのヌクレオチドであり、そして従って６の倍数である＋２ミニゲノムの場合に最大であった。しかしながら、RNAの実質的な量がまた、６の倍数のヌクレオチドに対応する長さを示さないミニゲノム１、特に＋２ミニゲノムよりも１つ長いか又は短いヌクレオチドであるミニゲノム＋１及び＋３の場合に蓄積した。実際、＋１及び＋３ミニゲノムにより生成されるカプシド化されたアンチゲノムの量は、＋２ミニゲノムの85％及び72％であった（図５Ｂ）。さらに最少の効率のミニゲノム、すなわち＋５ミニゲノムは、蓄積されたカプシド化されたRNAの測定により決定される場合、＋２ミニゲノムの20％ほどの活性であった。合計のポジティブ−センス RNAを検出するための測定の場合、＋１及び＋３ミニゲノムは、＋２ミニゲノムの合計RNAの52％及び45％を生成した。サブゲノムmRNAの存在を確かめるために、収穫された細胞懸濁液の最終アリコートを、RNA精製のために処理した。次に、RNAをoligo(dT)クロマトグラフィーにゆだねた。結合しなかったRNA、及び結合し、そして低い塩緩衝液で溶出されたRNAを、ノザンブロットハイブリダイゼーションにより（図６Ａ）及びホスホリイメージャー（図６Ｂ；この場合、結合された及び結合されなかったRNAは、＋２ミニゲノムの結合されたRNAに対して一緒に標準化されたことを注目すること）により分析した。それらのアッセイは、約64％のポジティブ−センスRNAが、サブゲノムmRNAに関して予測されるように、ポリアデニル化されたことを示した。mRNAの蓄積は、＋２ミニゲノムに関しては最大であった。しかしながら、mR NAの実質的な量がまた、他のミニゲノムに関して観察された。＋１及び＋３ミニゲノムにより合成されたmRNAの量は、＋２ミニゲノムにより合成されるその量に比較して、それぞれ30％及び20％であり、そして最少の活性ミニゲノムに関して、約13％であった。例Ｖ PIV ミニゲノムによるネガティブセンスのRNAの合成前記例に記載される種々のPIV３−CATミニゲノムを、mRNA及びポジティブ−センスのカプシド化されたミニ−アンチゲノムの合成に向け、後者は、RNA複製における第１段階を表わす。RNA複製における第２段階は、ミニ−アンチゲノム生成物からのカプシド化された子孫ミニゲノムの合成を包含する。この後者の工程を評価するために、前記例に記載される擬似（mock）−処理された及びヌクレアーゼ−処理された溶解物を、ポジティブ−センスCATリボプローブによるノザンブロットハイブリダイゼーションにより分析し（図７Ａ）、そしてホスホルイメージャーにより定量化した（図７Ｂ）。擬似−処理された溶解物からのRNAの分析（図７Ａ、下方パネル）は、相当量のミニゲノムが、Ｎ又はＬ支持プラスミドが削除されている負の対照を包含するすべてのサンプルにおいて、細胞内蓄積していることを示した。図５Ａ−Ｂ及び６Ａ−Ｂに記載される分析は、ボジティブ−センスRNAの合成がそれらの条件下でほんのわずかであったことを示した。従って、Ｎ又はＬの不在下で観察されるミニゲノムは、再構成されたHPIV３ポリメラーゼにより介在されるRNA複製の生成物ではなく、そして代わりに、トランスフェクトされたプラスミドのＴ７転写の生成物であるはずである。再構成されたHPIV３ポリメラーゼにより生成されたミニゲノムは、カプシド化されていることが予測されるが、Ｔ７ RNAポリメラーゼにより生成される多くのミニゲノムは、カプシド化されていないことが予測される。従って、図５Ａ〜Ｂに記載される、同じミクロコッカスヌクレアーゼで処理されたサンプルからのRN Aを、ポジティブ−センスのCATリボプローブによりハイブリダイズされる第２ブロットを調製するために使用した（図７Ａ、上方パネル）。これは、Ｎタンパク質の不在下で蓄積したすべてのミニゲノムRNAが、予測通りに分解されたことを示した（図７Ａ、上方パネル、レーン１）。Ｌの不在下で蓄積した実質的にすべてのミニゲノムはまた、分解に対して敏感であって（図７Ａ、上方パネル、レーン２）。Ｌの不在下で、そしてＮ及びＰのみの不在下で合成されたプラスミド− 由来のミニゲノムは、効果的に生じるようには思えなかった。３種の支持プラスミドの完全な組が存在する場合、有意な量のミクロコッカスヌクレアーゼ−耐性ミニゲノムRNAが、個々のミニゲノムに関して蓄積した（図７Ａ、上方パネル）。ポジティブ−センスのRNAの場合、よくあることだが、最大量の子孫ミニゲノムが＋２ミニゲノムと共に観察された。次に、＋１及び＋３ミニゲノムが豊富になり、そしてゲノム RNAのレベルは、＋２ミニゲノムのレベルの67％及び42％であった。前記例は、HPIV３Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質が効果的な転写及びRNA複製のために必要且つ十分であることを示す。再構成されたPIV３ポリメラーゼにより介在される転写及びRNA複製の非常に強い性質が、コードされたタンパク質の機能性を確認した。発現系内への追加のウィルスタンパク質の包含がそれらの過程を増強し、又は修飾するであろうことがさらに予測される。本発明の組成物及び方法内でのPIV Ｃ，Ｄ、及び滞在的にはＶの同時発現が、たとえばRNA複製を増大し、そして／又は修飾するために有用であろう。このためには、プラスミドが、 PIV転写及びRNA複製、並びに適切な感染モデルにおけるPIV表現型に対するそれらの効果を決定するために、１又は複数のそれらの要素の同時発現を達成するための前記方法に従って、構成され、そしてアッセイされるであろう。例VI cDNA からの感染性組換えRNAの構成次の例は、４種のプラスミド担持のcDNAの細胞内同時発現による感染性組換え PIV(rPIV)の生成を記載する。それらのcDNAは、完全なHPIV３ゲノム及びHPIV3ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、及びポリメラーゼタンパク質Ｌを別々にコードする。Ａ）ウィルス及び細胞修飾されたワクシニア株Ankara(MVA)、すなわちバクテリオファージＴ７ RNA ポリメラーゼを発現するワクシニアウィルス組換え体を、wyattなど.，Virol ．2 10：202-205，1995(引用により本明細書に組込まれる)に従って調製した。HEp− ２単層培養物を、２％ FBS,50μｇ／mlのゲンタマイシンスルフェート及び２mMのグルタミンにより補充されたOpti MEM1（Life Technologies）により、５％CO₂下で37℃で維持した。H PIV３のJS wt株及びその弱毒化されたts誘導体、すなわちJS cp45を、Hallなど. ，Virus Res ．22：173-184,（1992）(引用により本明細書に組込まれる)により記載のようにして、LLC−MK２細胞において増殖した。Ｂ）cDNA HPIV３の完全なゲノム配列をコードする、ｐ218(131)(図１、配列番号１)と称する十分なcDNAクローンを、上記のようにして構成した。ｐ３／７（131）(配列番号14)(ATCCにブタペスト条約の下で寄託され、そして寄託番号第97990号を付与されている)と称する第２のcDNAクローンを、HPIV３の完全なアンチゲノム配列をコードするよう構成した。ｐ３／７(131)は、ｐ218（131）と、HPIV３ｃDN A挿入体に対してのＴ７プロモーター及びリボザイム／Ｔ７ターミネーターの位置が相互変更されていることにおいて異なる。従って、ｐ３／７(131)において合成される第１のヌクレオチドは、アンチゲノムの５’末端、すなわちゲノム位置１のポジティブ−センス相補体であり、そしてリボザイム分解により定義される３’アンチゲノム末端はゲノム位置15462の相補体である。ｐ３／７（131）２Ｇ(配列番号15)(ATCCにブタペスト条約下で寄託され、そして寄託番号第97989号を付与されている)と称する第３のクローンもまた構成し、これはｐ３／７(131) と同一であるが、但し２つのＧ残基がアンチゲノムの５’末端とＴ７プロモーターとの間に挿入されている点で異る。ｐ３／７(131)２Ｇ及びｐ３／７(131)の構成のために、２種のプラスミドｐ（ A^★A'CC'D^★E）及びｐ（E^★FF'GHIJKL^★）を修飾し、そしてHPIV３の完全なポジティブ−センスのアンチゲノムをコードするよう連結した。第１に、ｐ（A^★A'CC'D^★E）におけるHPIV３の３’末端に隣接するＴ７ターミネーター及びδリボザイムを、PCRを用いて、Ｔ７プロモーターにより置換した（図８を参照のこと）。ポジティブ−センスプライマー：5'-GGC CCGTC GACGCG TAATACGACTCACTATAGGACCAAACAAGAG-3'（配列番号18）により、HPI V３（HPIV３配列は下線を引かれている）の３’リーダーに隣接してＴ７プロモーター（太字）が配置され、転写を改良するためにそれらの２種の要素間に２個のＧ残基が挿入される。ユニークMluＩ部位（イタリック型）を、クローニング目的のためにＴ７プロモーターの上流に配置した（図８）。ネガティブ−センスプライマー：5'-¹²²⁴CGGCAT CACGTG CTAC¹²⁰⁹-3'（配列番号19）は、HPIV３Ｎ遺伝子のnt1209−1224にわたり、そして天然のHPIV３配列に存在するユニークPm lＩ部位（イタリック型）を包含した。PCR生成物及び親の鋳型ｐ218（A^★A'CC'D^★ E）の両者を、MluＩ及びPmlＩにより消化し、そして次に、PCR生成物をMluＩ −PmlＩウインドウ中にクローン化した。第２のPCR反応を、同じネガティブ−センスプライマー及びポジティブ−センスプライマー（但し、HPIV3のＴ７プロモーターと３’末端との間に２Ｇ残基が挿入されていない）を用いて行なった。それらのプラスミドを、ｐ（Left＋２Ｇ）及びｐ（Left＋）と命名した。ｐ（Left ＋２Ｇ）の構成は図８に示され、ｐ（Left＋）の構成は同じ手段に従った。プラスミドｐ（E^★FF'GHIJKL^★）をPCRにより修飾し、HPIV３の５’末端に隣接してδリボザイム及びＴ７ターミネーターを配置した（図９）。ポジティブ− センスプライマー：5'-GGATTT GCGCCC¹⁴⁸¹³ AATTTAAATCATCTGG ²⁴⁸²⁰-3'（配列番号16)は、HPIV３（HPIV３特異的配列は下線が引かれている）のＬ遺伝子におけるユニークSwaＩ部位（イタリック型、下線が引かれている）のすぐ上流にBssH II 部位（イタリック型）を導入した。ネガティブ−センスプライマー：5'-CCCAGGT CGGACC GCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCAGCCC¹⁵⁴⁶² ACCAAAACAAGAGAAGAACTCTGTTTGG ¹⁵ ^435- 3'（配列番号17）は、HPIV３ゲノム（ネガティブ−センスは下線が引かれている）の５’末端に隣接する天然に存在するユニークRsr II部位（イタリック型）を含む、δリボザイムの一部（太字）を配置した。このPCR生成物をHssH II及びBsr IIにより消化し、そしてプラスミドｐ３／７のBssH II−RsrIIウインドウ中にクローン化した（図９）。プラスミドｐ３／７はｐ218と同一であるが、但し、δリボザイム及びＴ７ターミネーターは逆方向配向で存在する。上記挿入を含むｐ３／７プラスミドを、pPIV３−３／７として命名し、そしてHPIV３の５’ 末端の651個のヌクレオチドに隣接する完全なδリボザイム及びＴ７ターミネーターを含んだ。プラスミドのPIV３−３／７のSwaＩ及びMgoMIフラグメントを単離し、そしてｐ（E^★FF'GHIKL^★）のSwaＩ−NgoMIウインドウ中にクローン化した。ｐ（Right＋）と命名されたその得られるプラスミドは、HPIV３の５’末端に隣接する完全なδリボザイム及びＴ７ターミネーターを配置した（図９を参照のこと）。ｐ（Right＋）のXhoＩ−NgoMIフラグメントを、ｐ（Left＋）及びｐ（Left＋２Ｇ）のXhoＩ−NgoMIウインドウ中にクローン化し、それぞれ、プラスミドｐ３／７（131）(配列番号14)及びｐ３／７（131 ２Ｇ)(配列番号15)をもたらした（図10）。それらの個々は、HPIV３アンチゲノムRNAの完全なポジティブ −センス類似体をコードし、そして後者のcDNAは改良された転写効率のためにＴ７プロモーターに隣接して２つのＧ残基を含む。Ｃ）トランスフェクション HEp−２細胞を、６ウェルプレートにおいて90％集密性（confluence）まで増殖せしめた。６−ウェルプレートの個々のウェル(1.5 ×10⁶個の細胞）を、３種の前記支持プラスミド、すなわち0.4μｇのpTM(Ｐ)，0 .4μｇのpTM(Ｎ)，0.05μｇのpTM(Ｌ)、及び５μｇの十分な長さのゲノム又はアンチゲノムHPIV３ cDNAによりトランスフェクトした。プラスミドを、12μｌのL ipofect ACE(Life Technologies)を含むOpti MEM1(Life Technology)0.2mlに添加した。室温で約15分間のインキュベーションの後、２％ウシ胎児血清及び1.5 ×10⁷pfuのMVA−Ｔ７を含む0.8mlのOpti MEMを個々のウェルに添加した。その培養物を32℃で12時間インキュベートし、その後、培地を、２％ウシ胎児血清を含む新鮮なOpti MEM1により交換した。その培養物を32℃でさらに３日間インキュベートし、次に収穫し、そして新鮮なHEp−２単層上に継代した（継代１と言及する）。それらの継代１培養物を32℃で５日間インキュベートし、そして培養物に存在するウィルスを収穫し、LLC−MK２培養物において１度、継代し、そしてv an Wyke Coelinghなど.，Virol ．143：569-582，(1985)(引用により本明細書に組込まれる)に記載のようにして赤血球凝集阻止(HAI)により特徴づけ、それがcD NAから回収されたウィルスを表わすモノクローナル抗体耐性突然変異（MARM）を有するかどうかを決定した。Ｄ）組換えウィルスの配列決定組換えPIVのHN及びＬ遺伝子におけるヌクレオチド配列マーカーの存在を、回収されたビリオンから単離されたRNAのRT−PCRにより決定した。１mlのpPIV（１ ×10⁵pfu／ml、継代レベル２）を、氷上での１時間のインキュベーションにより、25％ポリエチレングリコール200μｌにより沈殿せしめ、そして12,000ｇで15 分間、遠心分離した。RNAを、TRIzol試薬(Life Technologies)により、製造業者の推薦方法に従って精製した。RT−PCRを、Superscriptキット(Life Technologi es)により、製造業者の推薦方法に従って実施した。対照反応は同一であったが、但しPCR生成物がウィルスRNAからのみ由来し、そして可能性ある汚染性cDNAプラスミドからではないことを確認するために逆転写酵素を反応から削除した。４種のプライマー対を用いて、nt7334-8715，936 4-10854，10939-15392及び13623-15392からPCR生成物を生成した。次に、それらの得られるPCR生成物を、サイクルジデオキシヌクレオチド配列分析（New Engla nd Biolabs，Beverly，MA）を用いて配列決定した。例VII ネガティブ−センスのゲノムRNAをコードするcDNAからの組換えウィルスの回収プラスミドｐ218（131）、及び３種の支持プラスミドpTM(Ｎ)，pTM(Ｐ)及びpT M(Ｌ)を、Ｔ７ RNAポリメラーゼを発現するMVAと共に、HEp−２細胞中にトランスフェクトした。pTM(Ｎ)，pTM(Ｐ)，pTM(Ｌ)及びMVAから成る対照グループを、 HEp−２細胞中に、ｐ218（131）を伴わないで同時トランスフェクトした。４日目、トランスフェクタントを収穫し、新鮮なHEp−２細胞単層上に５日間、継代し、そして再びLLC−MK２培養物において５日間、継代した（継代２）。継代２収穫物に存在するウィルスをさらに、HAIにより特徴づけた。十分な長さのゲノムクローンｐ218（131）を伴わないで、３種の支持プラスミドのみを受けたトランスフェクショングループからの培養物は、HPIV３を生成しなかった。ウィルスから回収されたrPIVは、それがHAIアッセイにおいて、HPIV３に対して特異的であるmAb77／5,101／１及び454／11と反応するので、HPIV３であることが確認された。それは、mAb170／７及び423／６と反応しないので、仮定に基づけば、cDN A−由来のものとして同定され、それはcDNA中に導入されたMARM突然変異と一致した。 rPIVが実際にcDNAから回収されたかを確かめるために、それを、野生型JS株HP IV３と平行して、７個の挿入されたマーカー突然変異挟む４種のプライマー対を用いてRT−PCRにより分析した。得られた個々のPCR生成物はRTの包含に依存し、このことは、各々がRNAに由来し、そして汚染性cDNAに由来しないことを示す。４種のPCR生成物のサイクル−配列決定は、rPIVの配列が７種のマーカーの各々を含むことを確かめ、３種のマーカーを示す配列決定データが図11に示される。 nt7903，7913及び7915を包含する、HN遺伝子におけるrPIVとJS wtとの間の配列差異は明白である。類似する配列分析を、nt位置7593，10355，11333及び15248 での他の４種のマーカー、並びに個々の突然変異を有したrPIVについて行なった。それらの結果は、ネガティブ−センスのゲノムRNAをコードするcDNAからの感染性rPIVの好都合な回収を示す。これは、ウィルス回収のために使用されたcDNA がポジティブ−センスのアンチゲノムRNAをコードするように企画されている、セグメント化されていないネガティブ鎖RNAウィルスの回収についてのほとんどの公開された報告とは異なる（Baron and Barrett,前記，1997；Collinsなど，前記，1995；Conzelmann,前記，1996;Garcinなど，前記，1995;Lawsonなど，前記，1995；Radeckeなど.,前記，1995;Whelanなど，前記，1995）。ゲノムRNAをコードするcDNAからの感染性ウィルスの回収は、これまで、Sendaiウィルスの場合においてのみ報告されており、そして回収の効率はアンチゲノムRNAをコードするcDNAに関してよりも低かった(Katoなど.，1996)。ほとんどの他の研究においては、ウィルスの回収は、アンチゲノムcDNAにより達成されているが、しかしゲノムcDNAによっては達成されていない(Lawsonなど.，1995；Whelanなど.，199 5)。不活性ハイブリッドをもたらす、支持プラスミドにより生成されるmRNAとcD NA−コードのゲノム RNAとの可能なアニーリングを包含する、それらの御しがたい結果を説明することができる多くの可能性ある問題が示されて来た（Conztlmann，前記，1996;Law sonなど.,前記，1995）。たぶん、GEシグナルのオリゴＵ形跡がＴ７ RNAポリメラーゼによる転写終結のための天然のシグナルに類似するので、Ｔ７ RNAポリメラーゼは、ゲノムRNAの遺伝子連結部で選択的に終結するように思われることがまた示されている（Whelanなど.,前記，1995）。例VII ポジティブ−センスのアンチゲノムRNAをコードするcDNAからの組換えウィルスの回収上記でより詳細に記載されたように、ｐ３／７(131)及びｐ３／７(131)２Ｇを、組換えPIVを生ぜしめるポジティブ−センスのアンチゲノムをコードするよう構成した。プラスミドｐ３／７（131）２Ｇは、ｐ３／７(131)と同一であるが、但しＴ７プロモーターとアンチゲノムの第１ヌクレオチドとの間の２つのＧ残基が付加されている。Ｔ７プロモーターと第１HPIV３ヌクレオチドｐ３／７(131) ２Ｇとの間への２つのＧ残基の付加は、２つのＧ残基の存在（０，１又は３個の付加される残基に反して）はミニレプリコン複製の実質的に高められたレベルを生成することを示す前記例に基づかれている。２種のアンチゲノムcDNA〔ｐ３／７(131)及びｐ３／７(131)２Ｇ〕を、Ｎ，Ｐ及びＬ支持プラスミドと共に、細胞中に別々にトランスフエクトし、そしてｐ21 8（131）について記載されるのと同じ方法を用いて、MVA−Ｔ７組換えウィルスにより同時に感染せしめた。個々のアンチゲノムcDNAからの感染性ウィルスを回収し、そしてmAb423／６及び170／７と反応できないその能力によりcDNA−誘導されるものとして推定的に同定した。ウィルス回収の効率を、ゲノムcDNA ｐ218（131）に対する個々のアンチゲノムcDNAについて評価した。ネガティブ−センスのゲノムcDNA ｐ218(131)(配列番号１)を用いての12のトランスフェクション反応を、２種のcDNAからのウィルス回収の効率を比較するために、ポジティブ−センスのアンチゲノムcDNA ｐ３／７(131)２Ｇ（配列番号15）を用いての12のトランスフェクションと同時に実施した。個々のウェルからのトランスフェクション収穫物１mlをLLC−MK２細胞に対してタイトレーションし、そして残る２mlを新鮮なLLC−MK２細胞ヒト継代した（継代１）。５日目、継代１を収穫し、そして上記のようにしてタイトレーションした。組換えウィルスを、ｐ218（131）によりトランスフェクトされた12 のウェル当たりわずか４のウェルからではなく、ｐ３／７(131)２Ｇによりトランスフェクトされた12のウェル当たり12のウェルから回収した。ポジティブ−センスのアンチゲノムからの継代されたウィルスの培養物に存在するウィルスの平均力価(10^5.0)は、10^4.1であるネガティブ−センスゲノムからの力価よりも10倍近く高かった。しかしながら、１つの追加増幅により、力価は同等になった。（ｉ）ゲノム又はアンチゲノムcDNAが組換えウィルスの生成でより効果的であるかどうかを決定するために、及び（ii）組換えウィルスの収率に対する２つの特別な５’末端Ｇ残基の効果を決定するために、ゲノム又はアンチゲノムHPIV３ RNAをコードする３種の十分な長さのプラスミドからの組換えウィルスの回収効率を研究した（表２）。不運なことには、残留MVA−Ｔ７がLLC−MK２単層培養物上でのrJSのプラーク形成を妨害するので、プラークタイトレーションによりトランスフェクション収穫物を直接的にタイトレーションすることは不可能であった。従って、本発明者は、まず、複数の独立したトランスフェクションからのrJ Sの回収の効率を比較し、そして他の実験に見られるように、rJSがｐ218（131）によりトランスフェクトされた培養物からよりもｐ３／７(131)２Ｇによりトランスフェクトされた培養物からより頻繁に回収されたことを見出した。ｐ218（1 31）によるトランスフェクション収穫物を包含する、個々のトランスフェクション収穫物は他の実験においてrJSを生成したので、組換えウィルスを生成する相対的な効率を比較するためにこの分析方法を用いることは不可能であった。従って、本発明者は、トランスフェクション収穫物の１回の継代に続いてウィルスの量を定量化することによって、トランスフェクション収穫物に存在するウィルスの相対的量を推定した（表２）。個々のプラスミドは同一のウィルス(rJS)を生成するよう企画されているので、継代されたウィルスの力価における差異は、トランスフェクション収穫物に存在するウィルスの力価の差異の表示として見なされた。上記実験においては、５’末端Ｇ残基を有する構造体はrJSの生成において最とも効果的であった。これは、２つの付加された残基が実際、回収の効率を増強したことを示したが、しかし効率におけるこの小さなインクレメントについての機構は定義されていない。それらの発見は、HPIV３ cDNA中に突然変異を導入するよう企画される将来の実験のための基質としてｐ３／７(131)２Ｇを用いることの小さいが、しかし記載できる利点を示す。ｐ３／７(131)２Ｇからの組換えウィルスの回収における小さな利点は、インビトロで複製を制限する弱毒化突然変異を有するウィルスを回収するために特に必要とされる。VSVは、５’−末端で３個のＧ残基を含むアンチゲノムcDNAから回収されて来たが、この構造体からのウィルスの回収効率は、その特別な残基を欠失する同じ構造体からの回収率と比較されていない（Whelanなど .，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 92：8388-8392（1995）；引用により本明細書に組込まれる）。Sendaiウィルス及び麻疹ウィルスによる実験に比較して、アンチゲノムの５’−末端でのウィルス外Ｇ残基が、組換えウィルスの回収に対して有害でなく、そして好都合であると思われることが明白である（Garcinなど.,前記，1995；Radeckeなど.,前記，1995;Katoなど，1996）。２つの５’−末端グアニン残基を有さないゲノム及びアンチゲノムプラスミドは、組換えウィルスの生成において同様に効果的であるように思われる。これは、組換えウィルスの生成においてアンチゲノムcDNAよりも効果が低いゲノムcDNAを見出しているこれまでの報告とは異なる（Whelan，1995;Katoなど，1996）。ｐ３／７（131）(配列番号14)からのウィルスの回収の効率を、上記に類似する実験で、ｐ３／７(131)２Ｇ（配列番号15）及びｐ218(131)(配列番号１)のその効率と比較した。ｐ３／７(131)からの回収率は、ｐ217（131）の回収率に相当した。回収率は、余分のＧを含む両アンチゲノムcDNAに関して、より一致し且つ効果的であった（表２）。例VII 許容できる温度及び制限的温度でのrPIVのプラーク形成の効率 p218（131）及びｐ３／７(131)２Ｇの両者に由来するrPIV及び対照ウィルスのインビトロ複製の温度感受性レベルを、次の変性を伴って、Hallなど.，Virus R es ．22：173-184(1992)(引用により本明細書中に組込まれる)により前に記載されたようにしてLLC-MK２単層培養物において、32℃、37℃、39℃及び40℃で決定した。ウィルスを、室温で１時間、吸着せしめられた連続した10倍希釈溶液を含む24−ウェルプレート上のLLC−MK２単層上に接種した。次に、培養物を、２mM のグルタミン及び0.8％のメチルセルロースにより補充された１mlのＬ−15により被覆し、そして次に、プレートを上記で示された温度で５日間インキュベートした。メチルセルロース膜を除去し、そして単層を80％メタノールにより４℃で１時間、固定した。単層に存在するウィルスプラークを、Murphyなど.，Vaccine ８：497-502(1990)(引用により本明細書に組込まれる)により記載のようにしてネズミ抗体に対して特異的なイムノペルオキシダーゼ染色方法を用いて、１：50 0の希釈度で使用される腹水として２種のHPIV３−特異的抗−HNネズミmAb101／１及び66／４の混合物を用いて計数した。ポジティブ又はネガティブ−センスのcDNAのいづれかに由来する組換えウィルスを、それらがJS wtウィルスに表現型的に類似するかどうかを決定するために、32℃、37℃、39℃及び40℃でプラークアッセイにより特徴づけた。ポジティブ及びネガティブ−センスのrPIVの両者は、39℃及び40℃の高温で、それらの複製レベルにおいて、JS wtウィルスに匹適した（表３）。これを、37℃で力価の30 倍の低下を示し、そして39℃又は40℃でプラークを生成し得ないts変異体JS cp4 5と対比した。 JS cp45の配列は十分に決定されており（Stokesなど.,前記，1993）、そして突然変異はリーダー、Ｎ，Ｐ，Ｍ，Ｆ，HN及びＬ遺伝子において同定されている。しかしながら、突然変異がca，att又はts表現型を担当するかは未知である。本発明の典型的なrPIVはJS wt親のようなts⁺表現型を示すので、既知の又はPIV のために発見されるべき他の突然変異間のcp45突然変異が、たとえば高温で注目の突然変異を組込む組換えウィルスの複製を評価することによって、個々の突然変異又はその組合せの効果を指摘するために十分な長さのcDNA中に、単独で、又は組合せて導入され得る。このように同定された突然変異は、下記例に記載のようにして、効果的な弱毒化されたワクチン剤中に組込まれ得る。組換えPIV中に組込まれたそれらの及び他の突然変異はさらに、生物学的に誘導された変異体株よりも組換えウィルスを遺伝子的により安定性にするために、コドン当たり複数のヌクレオチド置換を創造する突然変異誘発により最適化され得る。例VIII ハムスターにおけるrPIVの複製 36匹の生後16週のgolden Syrianハムスターを、４つのグループ（それぞれ９匹のハムスター）に分け、そして10^5.5pfuの、ネガティブ−センスcDNAから回収されたrPIV、ポジティブ−センスcDNAから回収されたrPIV，JS cp45、又はJS wt ウィルスを含む0.1ml溶液を鼻腔内接種した。４日目、ハムスターを殺し、そして肺及び鼻甲介を収穫した。肺を、2.5μｇ／mlのアンホテリシンＢ(Guality Bi ologicals，Gaithersburg，MD)、200μｇ／mlのピペリシリン(Lederle Laborato ries，Pearl River，NY)及び50μｇ／mlのゲンタマイシン(Quality Biologicals )を含む20％（ｗ／ｖ）Ｌ−15懸濁液において均質化した。鼻甲介を同様に、10 ％（ｗ／ｖ）Ｌ−15懸濁液において均質化した。均質化の後、サンプルをアリコートし、そしてドライアイス−エタノール槽において急速に凍結せしめた。サンプルに存在するウィルスを、後日、32℃でLLC−MK２細胞の96ウェルプレートにおいて滴定し、接種の後、５及び７日目でCPEを計測した。平均log₁₀TCID₅₀／ｇを、９匹のハムスターの個々のグループについて計算した。表４は、ネガティブ−センスのcDNAから回収されたrPIV及びポジティブ−センスのcDNAから回収されたrP1Vが、ハムスターの上部及び下部呼吸器官におけるJS wtと実質的に同じレベルに複製することを示す。これを、個々の部位で弱毒化される、IS cp45ウィルスと対比した。従って、本発明の典型的なrPIVは、生物学的に誘導されたJS wt親株により示される、ハムスターにおける複製能力を保持することができ、それにより、突然変異、たとえばハムスター及び他の宿主、たとえば非ヒト霊長類及びヒトにおいて複製を制限する、JS cp4５候補ワクチンに存在する突然変異が、下記例に記載のようにして、同定され、そして本発明の修飾されたrPIV株内に組込まれ得る。例IX 弱毒化された表現型を特定するHPIV３中のアミノ酸置換の同定、及び感染性の弱毒化されたPIVクローン中への弱毒化突然変異の組込み cDNAから感染性PIVを生成する能力は、弱毒化された生パラインフルエンザウィルスワクチンの開発を促進する。より詳しくは、本明細書に開示される方法及び手段を用いることによって、PIV候補ワクチンの弱毒化の遺伝的基礎が容易に決定され、そしてcDNAから生成される感染性PIVワクチンが、精細に調節されたレベルの弱毒化及び免疫原性を達成するよう企画され得る。さらに、本発明の手段及び方法は、ヒト疾病において最とも重要であるすべての３種のヒトパラインフルエンザウィルスHPIV１，HPIV２及びHPIV３のためのワクチン開発を提供する。たとえば、本発明内の効果的なHPIV３ワクチン剤を生成し、そして選択するためには、生物学的に誘導するHPIV3候補体ワクチン又は弱毒化されたBPIV３ウィルスの所望する表現型に関連する突然変異、たとえば弱毒化突然変異が、同定され、そしてrPIV中に組込まれ得る。この方法を適用して、候補突然変異の大メニューからの弱毒化突然変異が、弱毒化と免疫原性との間の所望するバランスを有し、そしてヒトにおける複製に続いて、弱毒化表現型を保持するrPIVを生成するために選択され、そして組合される。この例においては、PIV３JS cp45弱毒化された生ウィルスの感温性（ts）及びインビボ弱毒化(att)表現型の遺伝的基礎が記載されている。７種の典型的な組換えPIV３ウィルス（３種の単一、３種の二重、及び１種の三重−障害ウィルス）が、十分な長さのアンチゲノムcDNAから回収され、そしてそれらのts及びatt 表現型について分析された。それらの組換え体は、JS wt親のcDNAクローン内に採用された、JS cp45（他方では、cp45として本明細書において言及される）のＬ遺伝子に存在する１又は複数のアミノ酸置換突然変異を担持する。それらの３種の典型的な、生物学的に誘導された突然変異は、 12301 Parklaw Drive，Rockville，Muryland 20852，USAのAmerican Type Cultu re Collection（ATCC）に、ブダペスト条約の下で、1997年８月21日に寄託され、そして寄託番号VR2588を付与された、JS cp45 Veroと称する、Vero細胞において増殖されたJS cp45の代表的株にすべて存在する。下記に示される典型的なPIV組換え体の分析は、Ｌにおける３種の個々の典型的な突然変異(Tyr₉₄₂→His，Leu₉₉₂→Phe、及びThr₁₅₅₈→Ile)が、cp45のts及び att表現型に寄与し、そして組換えワクチンウィルスの生成のために有用である。ウィルス及び細胞 PIV３ JS wt及びcp45ウィルスを、前記のようにして、LLC−MK２細胞において増殖した（Hallなど，Virus Res ．22：173-184（1992）;引用により本明細書中に組込まれる）。vTF７−３組換えワクシニアウィルスは、Fuerstなど，Virolog y 225：419-422（1996）に記載されており、そしてＴ７ポリメラーゼを発現する修飾されたワクシニアウィルスAnkara(MVA)は、Wyattなど，Virology 210：202- 205(1995)に記載される（個々の引例は、引用により本明細書中に組込まれる）。HEp−２（ATCC CCL23）及びLLC−MK２(ATCC CCL7.1)細胞は、２％FBS、及びゲンタマインンスルフェート（50μｇ／ml）により補充されたOpti MEM(Life Tech nologies)において維持された。 PIV ３のＬ遺伝子における点突然変異の構成部位特定突然変異誘発により点突然変異をＬ遺伝子中に導入するために、pUC1 9をJS wt PIV３Ｌ遺伝子のフラグメントを受容するよう修飾した。第１に、ユニークNheＩ制限部位を、pUC19(Ｎ)を創造するためにpUC19のMind III部位中に、NheＩ制限部位を含む１対の相補的オリゴヌクレオチド(5’GATCGATGCTAGCCC3'(配列番号23)及び5’GA TCGGGCTAGCATC3'(配列番号24))を連結することによって、pUC19中に導入した。c p45における３種のコード変化が生じる位置を包含し、そして十分な長さのPIV３ cDNA中に直接的に導入され得る（下記参照のこと）、pTM(Ｌ)のSphＩ（PIV３ n t11317）〜NheＩ(PIV３ nt14087)フラグメントを、pUC19(Ｎ)のSphＩ及びNheＩ部位中にクローン化し、pUCL（Ｎ−Ｓ）を創造した。点突然変異を、（ｉ）Ｌタンパク質位置942，992、及び1558で、個々に及び組合して、典型的なアミノ酸置換を創造するために、及び（ii）マーカーとして個々のコドン置換に近位の１つの特定の天然に存在する制限酵素部位を削除するために、Transformer突然変異誘発キット(Clontech，Polo Alto，CA)と共に突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いて、pUCL（Ｎ−Ｓ）中に導入した〔表５を参照のこと〕。 pUCL（Ｎ−Ｓ）誘導体に導入された突然変異を、プラスミドDNAのジデオキシヌクレオチド配列決定により確かめた。cp45の個々のＬ遺伝子突然変異を含むpU CL（Ｎ−Ｓ）のSphＩ〜BamHI(nt13733)フラグメントを、pTM(Ｌ)のSphＩ〜BamHI 部位中にサブクローン化し、pTM(Ｌ)−942，−992，−942／992、及び−1558を付与し；他の二重及び三重突然変異はPinAI及びNheＩ部位を用いてアセンブルされた（図12）。変異体pTM(Ｌ)プラスミドを、プラスミド−コードのミニゲノムR NA、及びＮ，Ｐ及びＬタンパク質を含んで成るミニレプリコンシステムにおいてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼマーカー遺伝子の発現を方向づける能力について、許容できる温度（32℃）で個々に試験した（Durbinなど. ，Virology 234：74-78(1997);引用により本明細書に組込まれる）。種々の変異体Ｌプラスミドは、マーカー遺伝子発現を、wt Ｌのレベルの75〜106％までを支持し、このことは、個々の構築されたcDNAが有意な卓越した突然変異を有さないことを示唆する（示されていない）。次に、変異体pTM(Ｌ)プラスミドの個々のSphＩ〜NheＩフラグメントを、十分な長さのPIV３ JSアンチゲノムcDNA ｐ３／７(131)２ＧのSphＩ〜NheＩ窓中にサブクローン化し、３種の置換のあらゆる可能な組合せを表わす７種の十分な長さのPIV３cDNAクローンを創造した。１，２又は３個のcp45 Ｌタンパク質置換を担持する組換え体PIV３（rPIV３）の回収３種の支持プラスミドpTM(Ｎ)，pTM(Ｐ)及びpTM(Ｌ)と共に、１又は複数のcp4 5 Ｌ遺伝子突然変異を担持する個々の十分な長さのアンチゲノムcDNAを、上記のようにして、Lipofect ACE(Life Technologies)及びMVA−Ｔ７を用いて、６− ウェルプレート(Costar，Cambridgo，MA)上のHEp−２細胞中にトランスフェクトした。 32℃で４日間のインキュベーションの後、トランスフェクション収穫物を、６− ウェルプレート上のHEp−２細胞上に継代し、これを32℃で４日間インキュベートした。個々の継代１の上清液を収穫し、そしてLLC−MK２細胞のＴ−25フラスコ上に通し、これを32℃で５〜６日間インキュベートした。継代２の上清液を収穫し、そして組換えウィルスの存在をまず、生物学的に誘導されたJS PIV３及び組換えJS PIV３の両者に結合する抗−HNモノクローナル抗体(Mab)、及びそのエピトープがマーカーとして作用するために削除されているために、cDNA−由来のウィルスに結合しないMab423／６による、ウィルスプラークのイムノペルオキシダーゼ染色（Murphyなど.，Vaccine ８：497-502（1990）；引用により本明細書に組込まれる）により確かめた。継代１に存在するウィルスを、前記のようにして、LLC−MK２細胞に基づいて、２又は３回のプラーク精製にゆだねた。個の生物学的にクローン化された組換えウィルスを、さらなる特徴化のためのウィルスを生成するために、32℃でLLC−MK２細胞において２度、増幅した。ウィルスを、ポリエチレングリコール沈殿法により透明な培地から濃縮し、そしてウィルス RNA(vRNA)を、トリゾール試薬(Life Technologies)により抽出した。逆転写を、ランダムヘキサマーのプライマーと共にSuperscript IIキット(Life Technologi es)を用いて、vRNAに対して実施した。Advantage cDNA PCRキット(Clontech，Po lo Alto，CA)、及びPIV３Ｌ遺伝子に対して特異的な、センス（5’nt 11190-G CATTATCTAGATGTGTCTTCTGGTCAGAG 3’nt-11219）（配列番号31）及びアンチセンス(5’nt 14140-CCTGAATTATAATAATTAACTGCAGGTCCT 3’nt-14111)(配列番号32)プライマーを、SphＩ〜NheＩフラグメントの領域を増幅するために使用した。PCR フラグメントを、認識部位がＬにおける３種のcp45突然変異の挿入の間、削除されている、個々の制限酵素による消化により分析した（表５を参照のこと）。１，２又は３個のcp45 Ｌタンパク質アミノ酸置換を担持するrPIV３の許容でき且つ制限的な温度でのプラーク形成効率(EOP) 対照及び組換えウィルスのインビトロプラーク形成の感温性のレベルを、LLC −MK２単層培養物において、32℃、37℃、38℃、39℃、40℃及び41℃で決定し、そしてプラークを、メチルセルロース被膜の除去に続いて、テンジクネズミの赤血球細胞による血球吸着により数えた。他方では、その単層に存在するウィルスプラークを、１：500に希釈された、２種のPIV3−特異的抗−HNネズミmAb101／１及び454／11の混合物によるイムノペルオキシダーゼ染色により同定した(Murp hyなど，前記(1990))。ハムスター研究６匹のグループにおける生後４〜16週間のgolden Syrianハムスターに、10^5.5 pfuのrPIV３ JS wt,PIV３ cp35ウィルス、又は１もしくは複数のcp45 Ｌタンパク質置換を含むrPIV３を含むOpti MEM1(動物当たり１ml)を、鼻腔内接種した。感染の４日後、ハムスターを殺し、肺及び鼻甲介骨を収穫し、そしてウィルスを上記のようにして定量化した。平均log₁₀TCID₅₀／ｇを、６匹のハムスターの個々のグループについて計算した。結果 wt JS rPIV ３中へのPIV３ cp45 Ｌタンパク質アミノ酸置換の導入上記のようにして、cp45のＬタンパク質に存在する３種のアミノ酸置換（表５）を、そのwt親、すなわちPIV３ JS株をコードするアンチゲノムcDNA中に個々に又は選択された組合せで導入した。個々の導入された突然変異を、回収されたrP IV３における突然変異のモニターを促進するために、近位の天然に存在する制限酵素部位を削除したサイレント突然変異により識別されるよう構築した（表５、図12）。アミノ酸1558でのコード変化が、インビトロ、又はインビボ複製の間、この部位での復帰の機会を低めるために、cp45における１つのnt置換と比較して、r1558における２つのヌクレオチド変化を含むよう企画された。 cp45からの１，２又はすべての３個のアミノ酸置換を担持する７個のrPIV３を、pTM(Ｎ)，pTM(Ｐ)及びpTM(Ｌ)支持プラスミドによる個々のアンチゲノムcDNA のトランスフェクンョン、及びワクシニアウィルスMVA／Ｔ７ pol組換え体による同時感染により組織培養物から回収した(Wyattなど，前記，(1995))。個々のr PIV３は、アンチゲノムcDNAを構築することによってHN遺伝子中に意図して導入されたMab耐性マーカーを有した。rPIV３を、個々のウィルス調製物が遺伝的に均質であることを確かめるように、２又は３サイクルのプラーク対プラーク継代により生物学的にクローン化した。ワクシニアウィルスがアンチゲノムcDNAと支持プラスミドとの間での組換えを仲介する可能性があるので、上記のごとく用心した。７種のrPIV３の各々がＬ遺伝子に構築された突然変異を含むことを確認するために、RNAを沈殿したビリオンから精製し、そしてcDNA中にコピーし、そしてRT −PCRにより増幅した。対照反応は、RT段階がRT−PCR生成物の生成のために必要とされたことを示し、このことは、汚染性cDNAよりもむしろRNA鋳型がRT−PCR生成物の生成のために必要とされたことを示唆する。RT−PCR生成物を、認識配列が挿入されたコード変化のためのマーカーとして削除されている、３種の制限酵素による消化にゆだねた。予測されるように、JS wt rPIV３のRT−PCR生成物を、３種の酵素の個々により適切な回数、切断し、ところがｒ942／992／1558は、個々のcp45コード変化の創造の間に削除された個々の３つの部位を欠いていた。他のrP IV３の個々は、適切な制限部位を欠いており、このことは、導入された突然変異の存在を示す。 cp45 Ｌ突然変異を担持するrPIV３の32℃、37℃、38℃、39℃、40℃及び41℃ でのプラーク形成の効率 cp45 Ｌタンパク質アミノ酸置換の種々の組合せを担持する７種のrPIV３を、 32℃、37℃、38℃、39℃、40℃及び41℃で、LLC−MK２単層上でのプラークを形成するそれらの能力についてアッセイした。表６に示されるように、cp45 aa置換を担持する個々のrPIV３はtsであり、そしてJS wt rPIV３親は試験されたいづれの温度でも、プラーク形成において制限されなかった。ｒ942,ｒ992及びｒ155 8のプラーク形成の遮断温度は40℃であった。ｒ942は40℃でプラーク形成の700 倍の低下を現わし、このことは、その複製がこの制限的温度でわずかに低められたことを示唆する。しかしながら、ｒ942のプラークサイズはまた、40℃で非常に減じられ、このことはまた、その複製が、JS wtに比較して、この温度で制限されたことを示す。ｒ942は、41℃で複製を完全に制限された（データは示されていない）。ｒ992及びｒ1558は40℃でプラーク形成を非常に減じられた(1,000, 000倍以上の低下)。それらの結果は、３種のcp45 Ｌ遺伝子突然変異の各々が、 ts表現型を個々に特定し、但しｒ94２突然変異の表現型は幾分、限的的であったことを示す。二重変異体ウィルスｒ942／1558及び三重変異体ｒ942／992／1558 は、39℃の遮断(cut-off)温度を有したが、ところがｒ942／992の遮断温度は38 ℃であった。二重変異体ｒ992／1558は、ｒ992の単一変異体よりも低いtsであった。ｒ942のようにｒ992／1558は、41℃でのプラーク形成において、完全に制限された。二重又は三重変異体により示される感温性のレベルは、単一変異体により示される感温性のレベルから予測され得ない３種の突然変異の微妙なrPIV相互作用に起因する。また、ｒ942／992／1558はcp45よりもわずかに低いtsであるので、Ｌ遺伝子外の他の突然変異はまた、たぶん、cp45のts表現型に寄与し、従って、本発明内の注目の追加の突然変異を表わす。ハムスターにおける増殖６匹のGolden Syrrianハムスターのグループを、JS wt rPIV３、生物学的に誘導されたcp45、又は１もしくは複数のcp45 Ｌタンパク質アミノ酸置換を含むrP IVにより鼻腔内接種し、そして肺及び鼻甲介骨におけるウィルス複製を決定した。この実験〔表７〕においては、単一のアミノ酸置換を担持するrPIV３の各々を、上部及び下部呼吸器官における複製において制限した〔表７〕。しかしながら、ｒ942、すなわち最小のtsウィルスが、第２の実験において上部及び下部呼吸器官における複製においてわずかに抑制されたに過ぎなかった。それらのデータは、３種のアミノ酸置換のうち２種の置換が、単一の損傷された組換えウィルスとして存在する場合、att表現型に寄与することを示す。しかしながら、942突然変異は、実際、弱毒化に寄与する（たとえば、ｒ942／992は、ｒ992のみよりも、より弱毒化される）。従って、Ｌにおける個々のアミノ酸置換は、単独で作用するか又はもう１つのＬアミノ酸置換と共に作用するatt表現型に寄与する。二重変異体の個々が弱毒化され、このことは、インビボでの複製に続いて、３種のＬ遺伝子置換のいづれかの欠失が弱毒化されたウィルスをまだ残していることを示す。これは、インビボでの複製に続いて、cp45のts表現型のこれまで観察された高レベルの安定性についての部分的な説明である。三重変異体ｒ942／992／15 58は、上部及び下部呼吸器官における複製のためにcp45と同じくらい制限され、このことは、Ｌタンパク質における３種のアミノ酸置換がcp45のatt表現型に対する主要要因であることを示す。上記結果を要約すると、Ｌタンパク質アミノ酸位置992及び1558での置換がそれぞれ、40℃で細胞培養物においてプラーク形成の１,000,000倍の低下を特定し、そして位置942での置換が700倍の低下を特定した。従って、３種の突然変異の各々は、それぞれ、ts表現型に寄与する。すべての３種のＬ突然変異を有する三重組換え体は、cp45よりもわずかに少ないtsであり、このことは、また、そのts表現型に寄与する、cp45におけるＬ遺伝子の外部に突然変異が存在することを示唆する。Ｌにおける３種の個々の突然変異のうち２種の突然変異はそれぞれ、ハムスターの上部又は下部呼吸器官における制限された複製に寄与し、これは、インビボでの複製の間、cp45のts及びatt表現型の観察される安定性を説明する。重要なことには、インビトロでの組換えワクチン株の感温性のレベルは、インビボでの弱毒化の密接な前兆となった、。すべての３種の突然変異を有する組換えウィルスは、ハムスターの上部及び下部呼吸器官において、cp45変異体と同じほど、複製において制限され、このことは、cp45ウィルスのＬ遺伝子がこの候補体ワクチン株の主要な弱毒化成分であることを示す。個々の突然変異は、それ自体で、ts表現型を特定するが、一緒に配置される場合、それらは単純には、付加的ではないが、しかし代わりに、幾分、お互いに影響を及ぼす。三重変異体における３種の突然変異の一緒での効果は、評価される２種の二重変異体に観察される感温性のレベルを増強するよりもむしろ改良するように見えた。興味あることには、992又は1558置換のいづれかの復帰による損失は、感温性のレベルを低めるよりもむしろ高めるので、これは、cp45 Ｌ突然変異の少なくともいくつかを維持するために予期しない選択的圧力を提供する。ひとまとめにして考えると、それらの発見は、cp45ウィルスのts及びatt表現型の安定性の高レベルが、att表現型へのＬにおける複数のts突然変異の寄与に起因することを示す。cp45の主要弱毒化突然変異としてのそれらの３種の突然変異の同定は、すべての製造段階の間、及びヒトにおける複製に続いて、ウィルスをモニターするための基礎を提供する。位置942でのチロシンのヒスチジンへの突然変異、論じることには、３種の突然変異の最とも保存的な置換は、最小感温性であることが、さらなる興味の対象である。PIV３のＬポリメラーゼは、2233個の長さのaaの大きなポリペプチドであり、そしてＰタンパク質、RNA結合、RNAポリアデニル化、RNA転写及びRNA複製による複合体形成のために必要とされるそれらのドメインを包含する、複数のドメインをコードする多機能タンパク質であると思われる(Colllns など.,前記，(1996))。位置942及び992でのＬにおけるアミノ酸置換は、パラミクソウィルス科の他のメンバー間に十分に保存される領域近くに位置する（Blum bergなど．，Virlogy 164：487-497(1982);Galinskiなど.，Virology 165：499- 510(1988)）。位置1558での突然変異は、他のＬポリメラーゼと低い配列同一性を共有するように見えるポリメラーゼの領域に存在する。ts表現型がＬにおける三重アミノ酸置換により付与される機構は知られていないが、たぶん、複数のＬタンパク質ドメイン及び活性が影響され、又はＬの種々の活性を包含する通常の機構が影響される。例Ｘ感温性、低温適合化及び弱毒化表現型を特定する、生物学的に誘導された、生存−弱毒化されたHPIVタイプ３ウィルス（cp45）における突然変異の直接的な同定、及び組換えワクチンウィルス中への再構成上記例は、cp45のＬポリメラーゼタンパク質における３種のアミノ酸置換の各々が感温性（ts）及び弱毒化(att)表現型を付与するが、しかし低温−適合性（c a）表現型を提供しないことを示す（また、Skiadopoulosなど，J ．Virol．72(3) ：1762-8，1998を参照のこと）。cp45は、他のタンパク質（Ｎ，Ｃ，Ｍ，Ｆ及び HN）又は可能性あるシス−作用性配列（Ｎ遺伝子のリーダー領域及び転写遺伝子開始｛GS｝シグナル）において12の追加の突然変異を含み、そしてそれらの表現型に対するそれらの寄与は前記のように下線が引かれている。この例はさらに、ヒト又は非ヒト霊長類におけるcp45の複製に続いてのそれらの表現型の観察される高レベルの安定性のための基礎に関するさらなる追加の情報を提供するために、cp45のts，ca及びatt表現型についての遺伝的基礎を特徴づける。この研究の１つの観点においては、すべての15のcp45−特異的突然変異を含む組換えcp45(rcp45)ウィルスが、復帰遺伝学系を用いて構成され、そしてハムスターの上部及び下部呼吸器官におけるプラークサイズ、感温性のレベル、低温適合性及び複製のレベルに基づいて、生物学的に誘導されたウィルスと実質的に区別できないことが見出された。さらに、（１）Ｃ，Ｍ，Ｆ又はHNタンパク質におけるcp45−特異的変化、（２）組合されたリーダー及びＮ遺伝子突然変異、又は（３）cp45突然変異のいくつかの組合せを含む組換えウィルスを構成した。それらの組換えウィルスの分析は、ゲノムじゅうに分配される複数のcp45突然変異が、ts，ca及びatt表現型に寄与することを示した。Ｃ及びＦにおける突然変異は、40℃でtsではないが、しかしそれにもかかわらず、att表現型を付与し、そして従って、それらは非−ts att突然変異である。HN突然変異は、ca，ts又は att表現型を提供しなかった。３’リーダー及びＮ突然変異を有するウィルスはt sであるが、しかしハムスターの低部呼吸器官においては、わずかな弱毒化のみを示した。いくつかの突然変異の組合せを有する組換え体はcp45よりも高いレベルの感温性を示したが、しかしその高められた感温性レベルは、インビボでの弱毒化の増強において影響されなかった。それらの後者の発見は、cp45に同定される複数の突然変異は、インビトロでの複製を影響するために相互作用する。cp45 における複数ts及び非−ts弱毒化突然変異はたぶん、その高レベルの弱毒化及び表現型安定性に寄与する。本明細書に提供されるcp45の種々の突然変異に関連する表現型の知識は、本発明内の有用なワクチン組換え体の大きな集合体を得るために、生物学的に誘導されたPIVウィルスの正確なモニターリング、及び組換えウィルスの容易な操作を可能にする。ウィルス及び細胞この例に記載されるrPIV３,PIV３ JS wt及びcp45ウィルスを、上記のようにして、サルLLC−MK２細胞(ATCC CCL7.1)において増殖した（また、Durbinなど，Virology 235：323-332，1997a，Hallなど，Virus Res ．22(3)：173-184，1992 ，Skiadopoulosなど.，J ．Virol．72(3)：1762-8，1998を参照のこと）。修飾されたワクシニアウィルスAnkaraを上記のようにして調製した。HEp−２(ATCC CCL 23)及びLLC−MK２細胞を、２％FBS及びゲンタマイシンスルフェート（50μｇ／ ml）により補充されたOpti MEM1（Life Technologies，Gaithersburg，MD）、又は10％FBS、ゲンタマイシンスルフェート（50μｇ／ml）及び２mMのグルタミンにより補充されたEMEMにおいて維持した。Ｌ−132細胞（ATCC CCL5）を、10％FB S,２mMのグルタミン、20mMのHepes,１mMの非必須アミノ酸、及び１00単位のストレプトマイシン−ネオマイシン／mlにより補充されたEarl's MEM(Life Technolo gies)において増殖せしめた。 PIV ３における点突然変異の構成ｐ３／７(131)２Ｇ、すなわち感染性ウィルスを回収するために上記で使用されたPIV３ JS wtのアンチゲノムcDNAクローンのサブゲノムフラグメント（また、Durbinなど．，Virology 235：323-332，1997a;Skiadopoulosなど，J ．Virol ． 72(3)：1762-8，1988を参照のこと）を、標準的分子クローニング技法を用いて、それらのフラグメントを受容するよう修飾されたpUC19ベクター中にクローン化した。cp45に同定される突然変異に対応する点突然変異、及びサイレント制限酵素認識配列を創造し又は削除する突然変異（表８）を、前記のようにして、Transformer突然変異誘発キット(Clontech，Palo Alto，CA)を用いて導入した。突然変異誘発の後、制限エンドヌクレアーゼフラグメントを完全に配列決定し、そして十分な長さのクローン、ｐ３／７(131)２Ｇ中にクローン化した。３’ リーダー及びＮ突然変異を、PIV３cp45ビリオンRNAから直接的に、逆転写（RT） −PCRにより増幅し、そしてpLeft＋２Ｇ（上記参照のこと）又はさらなる操作のために修飾されたpUC19ベクター中にクローン化した。突然変異の組合せを、標準の分子クローニング技法を用いて構成した。pFLCcp45と称する、cp45突然変異を含む十分な長さのプラスミドクローンを、外来性突然変異がクローニング工程の間に導入されたかどうかを決定するために完全に配列決定したが、しかし見出されていない。組換えPIV３（rPIV３）の回収３種の支持プラスミドpTM(Ｎ)，pTM(Ｐ，Ｃなし)及びpTM(Ｌ)と共に、cp45突然変異を担持する個々の十分な長さのアンチゲノム cDNAを、上記のようにして、Lipofect ACE(Life Technologies，Gaithersburg， MD)及びMVA−Ｔ７を用いて、６−ウェルプレート(Costar，Cambridge，MA)上でH Ep−２細胞中にトランスフェクトした。32℃で４日間のインキュベーションの後、トランスフェクション収穫物を、Ｔ−25フラスコにおけるLLC−MK２細胞上に継代し、それを32℃で４〜８日間インキュベートした。この収穫されたウィルスを継代１と呼び、そして上記のようにして、LLC−MK２細胞上での３回のプラーク精製にゆだねた。個々の生物学的にクローン化された組換えウィルスを、さらなる特徴化のためのウィルスを生成するために32℃でLLC−MK２細胞において２度、増幅した。ウィルスを、ポリエチレングリコール沈殿により透明化された培地から濃縮し（Mbiguino and Menezes，J ．Virol．Methods 31：2-3，1991を参照のこと；引用により本明細書に組込まれる）、そしてウィルスRNA(rRNA)を、トリゾール試薬(Life Technologies)により抽出した。逆転写を、ランダムヘキソマープライマーと共に、Superscript II Preamplification System(Life Tech nologies)を用いて、vRNAに対して行なった。Advantage cDNA PCRキット（Clont ech）、及びPIV３ゲノムの種々の部分に対して特異的なセンス及びアンチセンスプライマーを用いて、制限エンドヌクレアーゼ分析のためのフラグメントを増幅した。PCRフラグメントを、認識部位が突然変異の構成の間、創造されているか又は削除されている個々の制限酵素による消化により分析した（表８）。許容できる温度及び制限的な温度での、cp45突然変異を担持するrPIV３のプラーク形成の効率(EOP) 対照及び組換えウィルスのインビトロででのプラーク形成の感温性のレベルを、上記のようにして、LLC−MK２単層培養物において、32℃、35℃、36℃、37℃ 、38℃、39℃、40℃及び41℃で決定した（また、Hallなど，Virus Res ．22(3)：173-184，1992を参照のこと；これは、引用により本明細書中に組込まれる）。プラークを、メチルセルロースオーバレイの除去に続いて、テンジクネズミの赤血球細胞による血球吸着により数え、又は他方では、単層に存在するウィルスプラークを、１：250に希釈された、２種のPIV３−特異的抗−HNネズミmAb101／１及び454／11の混合物によるイムノペルオキシダーゼ染色により同定した(Murphなど.，Vaccine ８（5）：497-502，199 0：van Wyke Coelinghなど.，Virology 143（2）：569-582，1985を参照のこと）。低温−適合表現型についてのrPIV３変異体のウィルスの評価変異体及びwt rPIV３ウィルスの増殖を、24−ウェル組織培養プレートにおいて調製された集密的Ｌ−132細胞単層上で、32℃及び20℃で決定した。２つのプレートの個々のウェルを、0.2mlの個々の変異体又はwt rPIV３ウィルスにより、 0.01の感染の多重度で二重反復して接種した。室温での１時間の吸着の後、接種物を吸引し、そして単層を、ウェル当たり１mlのPBSにより洗浄した。接種された培養物を、10％FBS,２mMのグルタミン、20mMのHepes,１mMの非必須アミノ酸、及び100単位のストレプトマイシン−ネオマイシン／mlにより補充されたイーグルMEM 0.5mlによりオーバーレイした。１つのプレートを、耐水性パウム(Kapak) に密封し、そして20℃の槽において13日間、浸した。二重反復プレートをCO₂インキュベーターに、32℃で３日間、配置した。インキュベーション期間の最後で、ウィルスを凍結／融解により収穫した。個々のウェルから回収されたウィルスの力価を、プラークを可視化するために、テンジクネズミ赤血球細胞による血球吸着を用いて、32℃でLLC−MK２細胞におけるプラークアッセイにより決定した。２つのwt及び２つのcp45対照ストックを、対照として使用した。ハムスター研究５つのグループにおける生後５週目のGolden Syrianハムスターを、10^6.0pfu のJS wt rPIV３,PIV３ cp45ウィルス、又は変異体rPIV３の１つを含むOpti MEM 1 0.1ml／動物により鼻腔内接種した。感染の４日後、ハムスターを殺し、肺及び鼻甲介を収穫し、そしてウィルスを上記のようにして定量化した。32℃での平均log₁₀TCID₅₀／ｇを、個々のグループのハムスターについて計算した。結果 JS wt rPIV ３中へのPIV３ cp45突然変異の導入 cp45の３’リーダー、ＮGSシグナル、並びにＮ，Ｃ，Ｍ，Ｆ，HN及びＬタンパク質における15の突然変異（表８）を、所望の突然変異を担持するcp45 cDNAのセグメントの部位特定突然変異誘発により又は直接的なPCR増幅により、完全なP IV３アンチゲノムcDNA中に導入した。次のアンチゲノムcDNAを製造した（図13を参照のこと）：（ｉ）リーダー領域の４つの点突然変異、Ｎ GSシグナルにおける点突然変異、及びＮタンパク質における２つのアミノ酸変化を含むrcp45 3'N ；（ii）Ｃタンパク質における単一のアミノ酸変化を含むrcp45 Ｃ；（iii）Ｍにおける単一のアミノ酸変化を含むrcp45 Ｍ；（iv）Ｆにおける２つのアミノ酸変化を有するrcp45 Ｆ；（ｖ）HNにおける単一のアミノ酸変化を含むrcp45 HN； (vi)上記のように、Ｌにおける３個のアミノ酸変化を含むrcp45 Ｌ；（vii）上記（ｉ）及び（vi）からの突然変異を含むrcp45 3'XIL；（viii）Ｌにおける３個の突然変異を除くすべての突然変異を含むrcp45 3'NCMFHN;及び（ix）表８に列挙されるすべての15個のcp45突然変異を含むrcp45。ほとんどの場合、個々のc p45変化は、制限酵素認識部位を導入するか又は除去する１又は複数の近くのサイレント変化により付随されるよう構築された（表８）。それらは、cDNA及び回収されたウィルスにおける突然変異の存在を確かめるためのマーカーとして作用した。また、２つのアミノ酸コード変化（表８における突然変異番号10及び15）を、wtへの同じ部位復帰の可能性を低めるために、cp45に見出される単一の変化よりもむしろ２つのヌクレオチド変化を用いて行なった。表８におけるすべての 15個のcp45変化を含むcp45 cDNAを、他のアンチゲノムcDNA中へのcp45変化を導入するために使用されるのと同じ突然変異誘発されたcDNAサブクローンからアセンブルし；それを全体的に配列決定し、そして意図された突然変異のみを含むことを確かめた。これは、突然変異誘発又はPCRにゆだねられ、そしてクローニングにより操作された領域のすべてが、所望する配列を有し、そして他の所望しない突然変異を欠いていることを示した。１又は複数のcp45突然変異を担持する個々の十分な長さのプラスミドを、上記のように、組換えPIV３を生成するために、支持プラスミド及びMVA−Ｔ７と共にHEp−２細胞中にトランスフェクトした。図13に示される種々の組換えウィルスのビリオンRNAから増幅された、表８に示される突然変異を包含するRT−PCRフラグメントの分析は、導入された突然変異の存在を確かめ、そして他の意図されない突然変異は見出されなかった。プラーク形態いくつかの組換えウィルスは、LLC−MK２細胞に対して試験される場合、特徴的なプラーク形態、すなわち平均サイズ１mmのJS wt rPIV３プラークを示し、そして生物学的に誘導されたJS wt PIV３からはサイズ的に区別でなかった。cp45 及びrcp45ウィルスのプラークは、wtよりも大きく、wtよりも直径にして、平均２〜３倍大きく、そしてお互いとは区別できなかった。これは、この表現型に関しての生物学的に誘導された及び組換え体のcp45ウィルスの適合性を示した。許容できる温度及び制限的な温度での、LLC−MK２細胞にcp45突然変異を担持するrPIV３のプラーク形成効率 rPIV３を、32℃〜41℃の範囲の許容できる温度及び制限的温度でプラークを形成するそれらの能力についてアッセイした（表９）。cp45の個々の成分を担持するウィルスのts表現型の分析は、rcp45 3'N及びrcp45 Ｍウィルスが40℃の遮断温度を有し、そしてrcp45 Ｃ変異体が41℃の遮断温度を有したことを示した。rc p45 Ｆ及びrcp45 HN変異体の遮断温度は、41℃以上であった。rcp45 Ｌウィルスが39℃の遮断温度を有したことは、上記結果と一致した。40℃での複製のその低下（すなわち32℃での力価−40℃での力価）が40℃でのwtウィルスの力価の約10 0倍以上である場合、ウィルスはts表現型を有すると思われる。この定義の適用により、この結果は、cp45の少なくとも２つの領域（３'Ｎ、及びＬ）がts表現型に寄与することを示した。表９に示されるように、すべてのcp45突然変異を含むrcp45は、生物学的に誘導されたcp45の遮断温度と同一である38℃の遮断温度を有した。それらの結果は、cp45のts表現型がrcp45において都合良く再生されたことを示す。さらに、それらの結果は、cp45の配列分析、及び組換えウィルス中への突然変異の続く再構成を確認する。３種のＬ突然変異を欠いていることを除いて、rcp45と同一であるrcp45 3'NCM FHNウィルスは、36℃の遮断温度を示した。Ｌ突然変異は感温性を個々に又は組合して付与することが知られているので、rcp45 3'NCMFHNがcp45よりもtsであることは幾分、逆説的である。これは、cp45内に突然変異の相互作用が存在し、それにより、突然変異が個々の成分の合計よりも低い感温性レベルを付与するためにお互い補足しあうことを意味する。Ｌ突然変異がリーダー及び／又はＮ突然変異と相互作用するかどうかを調べるために、ウィルスrcp45 3'NLを構成した。なぜならば、それらのすべての要素は、RNA合成の間、相互作用すると思われるからである。このウィルスは、それぞれ、rcp45 3'N及びrcp45 Ｌに関して40℃及び39℃であるの比較して、36℃の遮断温度を有した。それらの結果は、感温性の増大をもたらす、３’ＮとＬ突然変異との間に相互作用が存在することを示唆する。それらの結果はまた、cp45突然変異のサブセットが全組の突然変異を含むrcp45に関して観察される感温性よりも高レベルの感温性を特定するもう１つの例を提供する。 cp45 突然変異を担持するrPIV３のca表現型 cp45の遺伝子要素がca表現型を特定したことを測定するために、rPIV３を分析した（表10）。rcp45 Ｌはts及びattであるが、しかしcaではないことが上記に示されている。これは、ca表現型の大きな部分を特定する遺伝子要素がＬの外部に位置することを示し、そしてこれは、本発明の研究において確かめられた。３’リーダー及びＮ突然変異を有するrPIV の各々は、中間表現型を示したrcp45 3'NCMFHNを除いて、caであった。これは、 ca表現型が３’Ｎ領域内にほとんど特定されることを示す。３’Ｎセグメントを含むウィルスのcaレベルがcp45又はrcp45のcaレベルよりも低いという発見は、c p45の他の領域が、たとえこの領域がそれぞれ、他の領域の分析から明白でなくても、ca表現型に寄与することを示す。rcp45 3'NLウィルスは、rcp45 3'Ｎウィルスよりも、よりcaであり、このことは、Ｌ突然変異が適度な寄与を行なうことを示している。生物学的に誘導されたcp45及びrcp45ウィルスは、caの比較できるレベルを示しており、このことは、プラークサイズ及びts表現型のような、この表現型が、本明細書に提供される組換えcp45ウィルスにおいて都合よく再生されることを示す。従って、ts表現型のような、このca表現型は、全体の表現型への個々の寄与、及び相互作用する遺伝子要素からの寄与に影響を及ぼす複合表現型である。ハムスターにおけるrcp45変異体ウィルスの増殖５匹のGolden Syrianハムスターのグループを、10⁶TCID₅₀の組換え体又は生物学的に誘導されたウィルスにより鼻腔内接種し、そして肺及び鼻甲介骨におけるウィルス複製のレベルを、４日後に決定した（表11）。接種の14日目、wt及びcp 45ウィルスの両者に関して、ハムスターにおいてウィルス複製のピークが存在することがこれまでに示されている（Crookshanks and Belshe，J ．Med．Virol． 13(3)：243-9，1984を参照のこと；引用により本明細書に組込まれる）。rcp45 ウィルスは、鼻甲介における複製が約40倍、及び肺における複製が1000倍低められ、そして従って、生物学的に誘導されたcp45ウィルスほどに弱毒化された。それらの結果は、cp45の弱毒化表現型が、その組換え体バージョンにおいて都合良く再生されたことを示す。cp45の個々の表現型は十分にrcp45において再生されたので、この例に包含されないcp45における追加の５つの突然変異はたぶん、cp 45の性質にほとんど寄与しなかった。上記に示されるように、cp45のＬ遺伝子における突然変異は、このウィルスの弱毒化表現型の大部分を特定する。、この例においては、グループとしてのＬの外部のcp45突然変異の寄与が試験された。rcp45 3'NCMFHN変異体は、鼻甲介における複製においてわずかに低下したが、しかし肺における複製においては100倍以上低下し、このことは、追加の弱毒化突然変異がＬタンパク質の外部に存在したことを示す。重要なことには、rcp45のＬ遺伝子における３種の突然変異の各々が野生型配列に復帰する場合、その得られるウィルス、すなわちrcp45 3'NCMF HNはまだ、その弱毒化表現型を保持している。rcp45 Ｍ及びrcp45 HN変異体ウィルスはハムスターの呼吸器官における複製を欠いておらず、そしてrcp45 3'Nウィルスは、下部呼吸器官における複製において単にわずかな低下を示した。これは、３’リーダー、Ｎ遺伝子開始部位、並びにＮ，Ｍ及びHNタンパク質に存在する突然変異がそれら自体で及び単独で弱毒化しないことを示す。しかしながら、それらの突然変異は、他のcp45突然変異に関して、cp45の全体的な弱毒化に寄与する。また、３’Ｎ領域内の個々の突然変異は、突然変異の組が一緒に分析される場合、明らかでない効果を有し、これは、本発明の開示に従って、容易に決定され得る。 rcp45 Ｃ及びrcp45 Ｆ変異体ウィルスの複製は、鼻甲介及び肺の両者において約100倍低下し、このことは、cp45のＣ及びＦタンパク質に存在する突然変異が、弱毒化のレベルはcp45 Ｌ突然変異により付与されるレベルほど高くはないが、ハムスターにおいて弱毒化表現型を付与することを示す。上記で記載されたように、rcp45 Ｆ及びrcp45 Ｃ変異体ウィルスはts表現型を有さず、そして従って、Ｃ及びＦタンパク質に存在する突然変異は非−ts弱毒化突然変異であると思われる。例ＸＩ赤血球凝集素及び融合糖タンパク質がPIV１からの対応する糖タンパク質により置換されている組換え、キメラPIV３の回収この例においては、異なったrPIVバックグラウンド中に、１つのPIVからの１もしくは複数の異種遺伝子又は大きなポリヌクレオチド配列を組込んでいるキメラrPIVウィルスが生成され、そして選択される。本発明のこの観点においては、１つのPIVの個々の遺伝子又は遺伝子セグメントが、異種PIV又は他の源からのカウンターパート配列により置換される。この例に記載される１つの態様においては、弱毒化された生ワクチンを開発するために適切なキメラ組換え体を生成するために、組換えHPIPV中にHPIV１又はHPIV２のHN及び／又はＦ保護抗原を置換するための手段及び方法が提供される。ウィルス及び細胞この研究に使用されるPIV１株、PIV１／Washington／20993／1964(PIV１／Was h64)が、1964年、Washington DCにおいて単離され、そして成人ヒトボランティアにおける臨床研究においてビルレント野生型ウィルスであることが確認された（Murphyなど，Infect ．Immun．12：62-8(1975);引用により本明細書に組込まれる）。それを、50μｇ／mlのゲンタマイシンサルフェート、２mMのグルタミン及び0.75μｇ／mlのトリプシンを含むOpti-MEM１(Life Techn ologies)中のLLC−MK２細胞(ATCC CCL7.1)において増殖せしめた(カタログNo．3 941，Warthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)。血球凝集−阻害アッセイ(HAI)に使用されるヒトPIV２のGreer株（カタログNo．Ｖ−322−001−020，NI AID Repository，Rockville，MD）を、同じ手段において増殖させた。ヒトPIV３ウィルスからのJS株、及び野生型表現型を有する、cDNAからのその組換え誘導体（rPIV３／JS）を、上記のようにして増殖せしめた。バクテリオファージＴ７ RNAポリメラーゼを発現する修飾されたワクシニアAnkara(MVA)組換え体は、wyat tなど，Virology 210：202-205（1995）（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。 HEp−２細胞を、ATCC(ATCC CCL 23)から得、そして２％ウシ胎児血清(FBS)，5 0μｇ／mlのゲンタマイシンサルフェート及び２mMのグルタミンを含むOpti-MEM １(Life Technologies)中に維持した。完全なキメラPIV３−PIV１アンチゲノムをコードするcDNAの構成 PIV３ HN及びＦ ORFがそれらのPIV１カウンターパートにより置換されている十分な長さのPIV３アンチゲノムRNAをコードするcDNAを、図14に示されるようにして構成した。PIV１／Wash64のHN及びＦ遺伝子のcDNAクローンを、PIV１／Wash 64野生型ウィルスにより感染されたLLC−MK2細胞から抽出されたRNAから調製した。cDNAを、ランダムヘキサマープライマー(Life Technologies)を用いて、Sup erScript Preamplification Systemにより生成した。PIV１Ｆ及びHN cDNAを、 GenBankに存在するコンセンサス配列に基づいて、遺伝子特異的プライマー対を用いて、Vent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs，Beverly，MA）により増幅した。下記に記載されるすべてのプライマーに注釈をつけ、その結果、PIV特異的配列に下線を引き、制限部位をイタリック型で書き、野生型配列から変更されたntを小文字で書き、そして開始及び停止コドンを太字で書く。開始コドンの上流のnt69−97にハイブリダイズするポジティブーセンスのPIV１Ｆプライマーは、5'-GGGAAAGAAtCCAGAGACAAGAACGG-3'（配列番号33）であった。Ｆ停止コドンの下流のnt36-61にハイブリダイズするネガティブーセンスのPIV１Ｆプライマーは、5'-GGTGAAGTTGTGGATccATTTGATTG-3'（配列番号34）であった。それは、 BamHI部位を担持する。PIV１ HNのためのポジティブーセンスのプライマーは、 5'-CAACCTGTAAGGtAcCAGCATCCG-3'（配列番号35）であった。それはHN開始コドンの上流のnt13-36にハイブリダイズし、そしてKpnＩ部位を担持する。ネガティブーセンスのPIV１ HNプライマーは、5'-GATATGGTGTTαGGcCTTGATCTGTTC-3'(配列番号36)であった。それは停止コドンの最後の２つのnt、及びさらに下流の25nt にハイブリダイズし、そしてStuＩ部位を担持する。PIV１ F cDNAを、BamHI及びブラント−末端フラグメントとして、BamHI−EcoRV消化されたpLITMOS28（New E ngland Biolabs）中にクローン化し、そしてPIV１ HN cDNAを、KpnＩ−StuＩフラグメントとして、前記と同じベクター中にクローン化した。pLit．1HNwt及びp Lit．1Fwt GenBank受託番号：AFO16280，AFO16279）として命名されたそれらの得られるプラスミドのnt配列を、Circumvent Sequencing Kit（New England Bio lals）を用いて決定した。それらの２つのクローンを、突然変異誘発性PCRプライマーを用いて修飾し（図14）、それらの非コード領域を欠失し、そしてPIV３ −１キメラHN及びＦ遺伝子を構成するためにそれらの開始及び停止コドンを端に有する新規制限部を導入した。ポジティブーセンス及びネガティブーセンスのPI V１Ｆ突然変異誘発性プライマーの配列は、それぞれ、5'-CgccATGgAAAAATCAGA GATCCTCTTCT -3'(配列番号 37)及び5'-CtggatcctAATTGGAGTTGTTACCCATGTA-3'(配列番号38)であり、導入された制限部位はNcoＩ及びBamHIである。ポジティブ−センス及びネガティブ−センスのPIV１ HN突然変異誘発性プライマーの配列は、それぞれ、5'-AACcATGGCTGA AAAAGGGAAAA -3'(配列番号39)、及び5'-GGTGAaGCTtAAGATGTGATTTTACATATTTTA-3'( 配列番号40)であり、そして導入された制限部位はNcoＩ及びHindIIIである。第２段階は、上記で生成された領域をコードするPIV１の受容体として作用するようPIV３ HN及びＦ遺伝子の修飾を包含した。pLit．PIV３．HN．４及びpLit ．PIV３．F．3aを生成するために、PIV３／JS，ｐ３／７(131)２Ｇの十分な長さのクローンからのPIV３Ｆ及びHN遺伝子も、いくつかの段階でサブクローン化した（図14）。PIV３Ｆ又はHNコード領域を、PCR突然変異誘発により欠失せしめ、そして上記PIV１ HN及びＦ cDNAを受容するのに適切な制限部位により置換した。PIV３Ｆポジティブーセンス及びネガティブーセンスの突然変異誘発性プライマーの配列は、それぞれ、5'-AAATAggatccCTACAGATCATTAGATATTAAAAT-3'( 配列番号41)、及び5'-CgcCATgGTGTTCAGTGCTTGTTG-3'（配列番号42）であり、導入された制限部位は、BamHI及びNcoＩであった。PIV３ HNポジティブ−センス及びネガティブ−センスの突然変異誘発性プライマーの配列は、それぞれ、5'-CCA CAAgCtTAATTAACCATAATATGCATCA-3'(配列番号43)、及び5'-TTCCATggATTTGGATTTGT CTATTGGGT -3'(配列番号44)であり、導入された制限部位はHindIII及びNcoＩであった。キメラHNのための停止コドンを、突然変異誘発されたPIV１ HNカセットとの連結に基づいて再生した。上記PIV１ HN及びＦ cDNAを、pLit.PIV３−１． HNhc及びpLit.PIV３−１．Fhcを生成する、HNのためのNcoＩ−HindIIIフラグメントとして、又はＦのためのNcoＩ− BamHIフラグメントとして導入した。次に、それらの２つのcDNAを、続いてその全体を配列決定されるpSE．PIV３−１．hc中に連結した。次に、BspE．Ｉ−Sph Ｉフラグメントを、ｐ３／７(131)２Ｇ中に挿入し、pFLC．２Ｇ＋．hcを生成した（図14）。キメラＦ及びHN遺伝子を含むこのBspEＩ−SphＩフラグメントのヌクレオチド配列は、GenBank(受託番号AFO16281)に存在する。、重要なことには、cDNA構築は、最終rPIV３−１アンチゲノムが６の規則に従うよう企画された（ Purbinなど.，Virology 234：74-78(1997);引用により本明細書に組込まれる）。rPIV３−１キメラをコードするプラスミドpFLC．２Ｇ＋．hcを、12301 Parkla wn Drive，Rockville，Maryland 20852，USAにあるAmerican Type Culture Coll ection（ATCC）に、ブダペスト条約下で1997年９月17日に寄託した。トランスフェクション HEp−２細胞単層を、６−ウェルプレート（Costar Corp．Cambridge，MA）において集密性まで増殖し、そしてトランスフェクションを上記のようにして実施した。細胞単層を、50μｇ／mlのゲンタマイシン及び２mMのグルタミンを含む無血清Opti-MEM 1(0.8ml)におけるMVA−Ｔ７により、その感染の多重度で感染せしめ、そして次に、３種の支持プラスミド、すなわち0.4μｇのpTM(Ｎ)，0.4μｇのpTM(Ｐ）及び0.05μｇのpTM(Ｌ)、並びにPIV３−１アンチゲノムcDNA５μｇによりトランスフェクトした。プラスミドを、12μｌのLipofect ACE(Life Techno logies)を含むOpti-MEM 1(0.2ml)において混合し、そして個々のウェルに添加した。野生型PIV３／JSアンチゲノムRNAをコードするPIV３／JS cDNAプラスミド、すなわちｐ３／７(131)２Ｇを、ポジティブ対照として平行してトランスフェクトした。32℃で12時間のインキュベーションの後、トランスフェクション培地を、50μｇ／mlのゲンタマイシンにより補充された新鮮なOpti-MEM 1(1.5ml)により交換し、そして培養物を32℃で、さらに２日間インキュベートした。トリプシンを、トランスフェクションの３日後に添加し、0.75μｇ／mlの最終濃度にした。細胞培養物上清液を４日目に収穫し、そして新鮮なLLC−MK２細胞単層上で継代した（継代１として言及される）。一晩の吸着の後、培地を、0.75μｇ／mlのトリプシンを含む新鮮なOpti-MEM 1により交換した。継代１培養物を32℃で４日間インキュベートし、そして増幅されたウィルスを収穫し、そして0.75μｇ／mlのトリプシンの存在下で32℃でさらに４日間、LLC−MK２細胞上で継代した（継代２として言及される）。回収されたウィルスを、ウサギPIV１抗血清、テンジクネズミPIV２抗血清、及び２種のPIV３ HN モノクローナル抗体との反応により、上記のような血球凝集−阻害(HAI)アッセイ(van Wyke Coelinghなど.,前記，(1985))において特徴づけ、但し、上記アッセイにおいては、鶏赤血球細胞（RBCS）がPIV１ HN糖タンパク質を有するウィルスのために使用され、そしてテンジクネズミがPIV３のために使用された。HAI を、rPIV３がcDNAから回収されたウィルスを特徴づけるモノクローナル抗体耐性突然変異（MARM）を有するかどうかを、又はrPIV３−１がPIV１ HNを有するかどうかを決定するために実施した。ヌクレオチド配列分析キメラcDNA構造体pSE．PIV３−１．hcを、Circumuent Sequencing Kit（New E ngland Biolabs）により配列決定し、その後、最終的に、十分な長さのクローン pFLC．２Ｇ＋．hc中にアセンブルした。RNAの分析のために、適切なPIVを、LLC −MK２細胞のＴ75フラスコにおいて増幅した。ウィルスを感染の５日目に収穫し、そしてポリエチレングリコール沈殿法(Mbiguinoなど.，J ．Virol．Methods 31 ：161-70(1991))により濃縮した。ウィルスRNAを、ウィルスペレットから抽出し、そしてSuperscript Preamplification System（Life Tech nologies）による逆転写（RT）に使用した。RT−PCRを、Advantage cDNA合成キット（Clontech）、及びPIV１又はPIV３特異的プライマー対を用いて行なった。 RT−PCR生成物を、電気泳動、及びNA45 DEAEニトロセルロース膜（Schleicher & Schnuell，Keene，NH）のストリップからの溶出により精製し、そして配列決定した。 LLC −MK２細胞におけるPIVの複製 LLC−MK２単層上のプラークの計数を、前記のようにして行なったが、但し、トリプシンが、PIV１及びrPIV３−１ウィルスの場合に添加された(Hallなど．Vi rus Res ． 22：173-84(1992))。手短に言及すれば、連続的に希釈されたウィルスを、６−ウェルプレートにおけるLLC−MK２単層上に接種し；ウィルスを32℃で１時間吸着せしめ；培養物を、0.8％のアガロースを含むＬ−15培地(Life Techn ologies)（添加されたトリプシンを有する又は有さない）によりオーバーレイし、そして32℃で６日間インキュベートし；そしてプラークを、アガロースオーバーレイの除去に続いて、テンジクネズミ赤血球細胞による血球吸着(HAD)により同定した。組織培養におけるPIVウィルスの増殖を、0.01のMOIでウィルスにより、12−ウェルプレート上の集密的LLC−MK２単層を感染せしめることによって評価した。3 2℃で１時間の吸着の後、接種物を、ゲンタマイシン（50μｇ／ml）及びトリプシン（0.75μｇ／ml）により補充された1.5ml（ウェル当たり）のOpti-MEM 1により交換し、そしてさらに、32℃で６日間インキュベートした。24時間の間隔で、0.3mlの培地を個々のウェルから除去し、そしてトリプシンを含む新鮮な培地0 .3mlを添加した。ウィルスの力価を、前記のようにして、流体オーバーレイを用いてLLC−MK２細胞単層上での血球吸着アッセイにより32℃で決定し（Hallなど，Virus Res ．22：173-84（1992））、そしてその力価をlog₁₀TCID₅₀／mlとして表わした。ハムスターの呼吸器官におけるPIVの複製 12匹のグループにおけるGolden Syrianハムスターにそれぞれ、10⁵pfuのrPIV ３／JS，rPIV３−１又はPIV１／Wash64を含むＬ−15培地0.1mlを鼻腔内接種した。接種の４及び５日後、個々のグループからの６匹のハムスターを殺し、そしてそれらの肺及び鼻甲介を収穫し、そして均質化し、そしてLLC−MK２細胞単層からのサンプルに存在するウィルスを32℃でタイトレーションした。力価は、６匹のハムスターの個々のグループに関して、平均log₁₀TCID₅₀／ｇとして表わされた。結果十分な長さのキメラPIV３−１アンチゲノムRNAをコードするcDNAクローンの構成がキメラウィルスrPIV３−１の回復をもたらした上記に示されるようにして、JS野生型PIV３ HN及びＦ糖タンパク質遺伝子のOR FがPIV１／Wash64コード配列のORFにより置換されている（図14）、PIV３及びPI V１キメラcDNAの最終構造体は、６の規則に従う、15,516ntのPIV３−１キメラアンチゲノムRNAをコードする（Durbinなど.，Virology 234：74-78(1997)）。キメラPIV３−１アンチゲノムをコードするpFLC．２Ｇ＋．hc cDNAを、Ｎ，Ｐ及びＬ支持プラスミドと一緒に、HEp−２細胞上にトランスフェクトした。JS wt PIV ３アンチゲノムをコードするｐ３／７(131)２Ｇ cDNAを、rPIV３対照親ウィルスを生成するために、同時にトランスフェクトした。ウィルスを、LLC−MK２細胞上での第２の増幅に続いて、個々のトランスフェクションから回収し、そして個々の組換えウィルスがcDNAに由来することを確かめるために、研究を開始した。組換えウィルスrPIV３−１及びrPIV３をまず、血清型−特異的抗−HNモノクローナル又はポリクローナル抗体によるHAIアッセイにより、PIV１又はPIV３ HN糖タンパク質の存在について特徴づけた。表12に示されるように、rPIV３は、予測通り、２種のmAbの中の１つのみと反応するが、その生物学的誘導された親PIV３／JSは両者と反応した。これは、rPIV３が、cDNAに由来する場合、このウィルスを特徴づける導入されたMARM突然変異を含んだことを確かめた。rPIV３−１ウィルスは、PIV１ HN糖タンパク質に対して特異的な抗体と反応するが、しかしPIV ３又はPIV２のHNに対して特異的な抗体とは反応せず、このことは、そのウィルスが予測されるようにPIV１ HN遺伝子を含んだことを示す。次に、rPIV３−１ウィルスが構築されたキメラPIV３−１ HN及びＦ遺伝子を含むことが確かめられた。予定されるように、rPIV３−１の遺伝子構造は、その親、すなわちPIV１／Wash64又はrPIV３／JSのいづれかと比較される場合、４つの連結領域においてユニークであった（図15Ａのボックス部分）。それらの領域は、配列がPIV３非コード領域からPIV１コード領域に変化し、そして次に、PIV １コード領域からPIV３非コード領域に戻る遷移点である。PIV３Ｍ及びＬ遺伝子に対して特異的なプライマー対Ａ、又はPIV１Ｍ、及び異３’−末端のHN遺伝子に対して特異的なプライマー対Ｂを用いて、RT−PCR生成物を、rPIV３−１，rPIV３／JS、及びPIV１／Wash64からのビリオン−由来のRNAのために生成した。対照反応は、RT段階がRT−PCR生成物の生成のために必要とされることを示し、このことは、汚染性DNAよりもむしろRNA鋳型が、RT−PCR生成物を生成するために必要とされたことを示す。rPIV３−１が実際、キメラウィルスであった初期表示は、PIV３−特異的プライマー対Ａのみが、Ｆ及びHN遺伝子まで及ぶ予測される4.6kbのcDNA生成物を生成した発見に起因した（図15Ｂ）。従って、rPIV３ −１ウィルスはHPIV１−特異的HN糖タンパク質のみを含むが（表12を参照のこと）、その非コード領域はPIV３に対して特異的である。一般的に、PIV１特異的プライマー対Ｂは、PIV１対照からの適切にサイズ分類された生成物を増幅するが、しかしrPIV−１からの生成物は増幅しなかった。制限消化分析はまた、rPIV−１ RT−PCR生成物が、rPIV３／JS及びPIV１／Wash64の制限パターンとは異なり、そしてその予測される配列のために適切なユニーク制限パターンを有することを示した。 rPIV３−１の4.6kbのRT−PCR生成物のnt配列をその４つの領域において決定し（図15Ａ）、そしてrPIV３／JS及びPIV１／Wash64のnt配列と比較した（図16）。rPIV３−１配列は、それが由来するcDNAと完全に一致した。３つのRT−PCR生成物のための領域Ｉ−IVの配列の一列配列の試験は、rPIV３−１が、変更された開始及び停止コドンと共に、及びPIV３の５’及び３’非コード領域を端に有する、PIV１Ｆ及びHN糖タンパク質ORFを含むことを示す。rPIV３／JB又はPIV１／Wash64と同時に比較しての、rPIV３−１の領域III及びIVに及ぶ配列決定ラダー（ladder）の例を評価し、そしてこの分析は、rPIV３−１が、その構造がそれが生成されるcDNAと完全に一致する組換えキメラウィルスであることを確かめた。インビトロでのrPIV３−１のトリプシン−依存性及び細胞障害性。 Sendaiウィルスのようであるが、しかしPIV３とは異なるPIV１は、組織培養細胞の連続した系上で多サイクル複製を受けるために、そのＦ糖タンパク質の切断のためにトリプシンを必要とする(Frankなど，J ．Clin．Microbiol．10：32-6(1 979)))。さらに、FIV１は非細胞障害性ウィルスであり、そしてFIV３は広範なCP Eを容易に生成する(Collinsなど，Fields Virology ，3rd ed.，ｌ：1205 -43(1996))。rPIV３−１，rPIV３及びPIV１／Wash64を、それらの性質に基づいて比較した。PIV１／Wash64のようにrPIV３−１は、テンジクネズミよりもむしろニワトリRBCを用いて高いHA力価を有し、そのPIV１／Wash64親のように、rPIV ３−１は流体オーバーレイを伴っての培養において効果的な複製のために及び効果的なプラーク形成のためにトリプシンを必要とした。rPIV３−１は、類似する効率を伴って、32℃、37℃又は40℃でプラークを生成した。従って、rPIV３−１がPIV１親ウィルスのＦ糖タンパク質を有し、そしてそれが感温性でないことが明らかである。他方では、rPIV３−１は、ウィルス感染された単層における細胞球状化及び分離により示されるように、そのPIV３親とほとんど同じ程度、CPEを生成し、このことは、この生物学的性質が、HN及びＦコード領域外に存在するそのPIV３遺伝子の機能であることを示す。、従って、rPIV３−１は、それがキメラウィルスであることを示す上記発現と一致する両親からの生物学的性質を有する。本発明内のこの典型的な組換えキメラウイルスは、12301 Parklawn Drive， Rockville，Maryland 20852，USAのAmerican Type Culture Collection（ATCC）にブダペスト条約下で、1998年５月21日に寄託された。 LLC −MK２細胞及びハムスターにおけるrPIV３−１及びその親ウィルスの複製のレベルの比較 rPIV３，rPIV３−１及びPIV１ Wash／64の多サイクル複製を、 0.01のMOIでのLLC−MK２組織培養細胞の接種に続いて評価した（図18）。３種のウィルスの複製の速度動態及び程度は非常に類似することが見出され得る。これは、PIV１のHN及びＦ遺伝子の、PIV３のそれらによる置換が、インビトロでの複製のためにウィルスを弱毒化しなかったことを示す。rPIV３−１がハムスターの上部及び下部呼吸器官における複製のために特にインビボで弱毒化されるかどうかが次に決定された（表14）。rPIV３−１の複製の観察されるレベルは、ハムスターの上部及び下部呼吸器官において、いづれかの親に類似し、そうでなければ、親よりもわずか高かった。要約すると、この例は、PIV１ HN及びＦ糖タンパク質のORFがrRIV３のORFにより置換されているrPIV３−１キメラウィルスの好都合な回収を示す。このキメラウィルスは、インビトロ及びインビボで、その野生型PIV１及びPIV３親ウィルスのように複製し、このことは、糖タンパク質ORF の置換がrPIV３−１の弱毒化をもたらさないことを示す。PIV１のHN及びＦ糖タンパク質を担持する組換えPIV３のこの好都合な回収率は、異なった血清型を表わす２種のウィルスは密接には関連していないので、驚くべきことである。特に、キメラ組換え体が２種の親と同様、増殖することは、注目すべきである。特に、糖タンパク質遺伝子に置換を有するキメラ組換えウィルスがまた、水庖性口内炎ウィルス(VSV)に関して回収されている（Lawsonなど，Proc ．Nat．Acad．Sci ．USA 92：4477-81（1995））。特に、Indiana血清型のVSV Ｇ糖タンパク質遺伝子が、わずか50％のアミノ酸配列同一性を共有するNew Jersey血清型により置換された。rPIV３−１と比較すると、キメラ組換えVSV_1/NJは、組換え体VSV₁又は生物学的に誘導されたVSVのレベルのわずか10％を複製する。この例においては、HN及びＦ糖タンパク質は、PIV１とPIV３との間で、それぞれ43及び47％の配列同一性を有する。もちろん、２種の糖タンパク質の一緒のトランスファーは、糖タンパク質−対−糖タンパク質の不適合性を回避する（Tana bayashi，K．and Compans，R．W．J ．Virol．70：6112-18(1996)）。他方では、糖タンパク質はそれらの細胞質（CT）又はトランスメングラン（TM）ドメインを通してＭタンパク質(PIV１とPIV３との間で63％の同一性がある)と相互作用し、そしてこの相互作用がビリオンの形態発生及び構造において重要であると一般的に思われている。これに関して、TM及びCTドメインにおける２種の血清型のHNタンパク質とＦタンパク質との間の配列同一性の程度は低く、実際、TMドメインに関しては、それぞれ30％及び22％であり、そしてCTドメインに関しては、それぞれ９及び11％であった。この低レベルの配列関連性を考慮して、本発明者は、また、個々の糖タンパク質のPIV１エクトドメインがPIV３ TM及びCTドメインに融合されているキメラ糖タンパク質を構成する同目的の方策を追求している。Ｍタンパク質又は他の内部タンパク質との可能な相互作用に関して、保存された構造、たとえば変更されたアミノ酸の配列群が、保存された配列よりもむしろ重要である。他方では、内部タンパク質と、糖タンパク質のTM及びCTドメインとの相互作用は、これまで考えられて来たほど決定的ではない。それらの要因を、本明細書に提供される方法及び手段を用いて、より密接に試験することは可能であろう。たとえば、それらの要因は、さらに、PIV２のHN及びＦを担持するPIV３を構成するために上記方法を用いての進行中の研究により解明されるであろう。 rPIV３−１は、これがPIV１Ｆ糖タンパク質により付与される性質であり、そしてこれが良く見出されるので、、組織培養物における効果的な複製のためにトリプシンを必要とすることが予測された。しかしながら、rPIV３−１がPIV３親ウィルスのCPEにひじょうに密接に類似するCPEを引き起こすことを観察することは興味あることであり、ここで前記観察は、HN又はＦ以外のPIV３遺伝子がこの表現型を特定していることを示す。それらの役割はまた、非細胞障害性PIV１と細胞障害性PIV３との間の追加の遺伝子を交換するために、本明細書に提供される方法及び手段を用いて、さらに解明されるであろう。例ＸII PIV タイプ３の内部タンパク質及びPIVタイプ１の表面糖タンパク質をコードする生存−弱毒化されたキメラ組換えPIVの回収この例においては、rPIV３−１．cp45Ｌと称する、生存−弱毒化 cp45 PIV３候補体ワクチンウィルスのＬ遺伝子に見出される変化をコードする３種の感温性及び弱毒化アミノ酸を担持するrPIV３−１の誘導体は、同じ３種の突然変異を有する組換えrPIV３ cp45 Ｌの表現型に類似する、38℃の遮断温度を有する感温性表現型を表わすことが示されている。rPIV３−１．cp45Ｌは、rPIV ３ cp45 Ｌと同じ程度に、ハムスターの呼吸器官において弱毒化される。rPIV ３−１．cp45Ｌによるハムスターの感染は、wt PIV１に対して中位のレベルの血球凝集−阻害抗体を生成し、そして野生型PIV１による攻撃に対して完全な耐性を誘発する。これは、本発明の弱毒化されたキメラPIVがPIV１に対してひじょうに効果的な免疫応答を誘発することができることを示す。この開示はまた、パラインフルエンザウィルスの表面糖タンパク質が同種ウィルス攻撃に対して高レベルの耐性を誘発するのに十分であることを示す上記データを確認する。意外なことには、PIV１の表面糖タンパク質遺伝子及びPIV３の内部遺伝子をそれぞれ担持する、組換えキメラウィルスrPIV３−１．cp45Ｌ又はrPIV３−１による感染は、また、PIV３攻撃ウィルスの複製に対して中位のレベルの耐性を誘発する。。これは、PIV３の内部遺伝子がゲッ歯動物においてPIV３に対して保護免疫性を独立して誘発できることを示す。従って、本明細書に開示されるようなPIV３に関する逆向き遺伝学システムは、許容されたモデル対象において弱毒化され、そして保護性である生存−弱毒化されたPIV１ワクチン候補体を都合良く生成する。ウィルス及び細胞この研究に使用されるwt PIV１株は、PIV１／Washington／20993／1964(PIV１／Wash64)(たとえば、Murphyなど，Infect ．Immun．62：1975を参照のこと；引用により本明細書に組込まれる)、及びPIV３Ｆ及びHN ORFが、上記のようにして及びTaoなど，J ．V irol ． 72：2955，1998(引用により本明細書に組込まれる)に記載のようにして、 FIV１／Wash64のORFにより置換されているキメラPIV３ cDNAから回収されたキメラrPIV３−１である。それらのウィルスは、50μｇ／mlのゲンタマイシンスルフェート、及び0.75μｇ／mlのトリプシン（カタログNO．3741，Washington Bio chemical Corp.，Freehold，NJ）により捕充されたOpti-MEM１(Life Technologi es，Gaithersburg，MD)におけるLLC−MK２細胞において増殖された。トリプシンは、PIV３の糖タンパク質ではなく、PIV１のＦ糖タンパク質がそれらの条件下で細胞培養物において増殖される場合、切断のために外因性トリプシンに依存するので、包含される。ヒトPIV３ウィルスのwt JS株、及びcDNAからのその組換え誘導体（rPIV３／JS）は、上記のようにして及びDurbinなど，Virology 235：323 ，1997（引用により本明細書に組込まれる）に記載のようにして、増殖された。 cp45、すなわちwt PIV３／JSの弱毒化された誘導体（上記、及びKarronなど，J ．Infect．Dis． 171：1107，1995（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと）、及びrPIV３ cp45 Ｌ、すなわちcp45のＬ遺伝子に見出される３種のts 突然変異を担持する組換えPIV３は、上記のようにして、及びSkiadopoulosなど，J ．Virol．72：1762，1998(引用により本明細書に組込まれる)に記載のようにして、増殖された。バクテリオファージＴ７ RNAポリメラーゼを発現する修飾されたワクシニアAnkara(MVA)組換え体は、Virology 210：202，1995（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。トランスフェクションに使用されるHEp−２細胞は、ATCC（ATCCCCL23）から得られ、そして２％ウシ胎児血清(FBS)、50μｇ／mlのゲンタマイシンスルフェートにより補充されたOpti-MEM 1に維持された。rPIV ３−１アンチゲノムcDNA中へのＬ突然変異の導入上記（また、Skiadopoulosなど，J ．Virol．72：1762，1998も参照のこと）、 pTM(Ｌ)942／992／1558プラスミドに存在するcp45の３種のＬ突然変異が、PIV１Ｆ及びHN ORF、及び３種のcp45 Ｌ遺伝子突然変異を担持する十分な長さのpF LC．２Ｇ＋．hc．cp45Ｌを生成するために、2.8kbのSphＩ−NheＩフラグメント( PIV３アンチゲノムcDNAにおいてnt11313〜14092)として、キメラcDNA pFLC．２Ｇ＋．hc（上記に記載される；また、Taoなど，J ．Virol．72：2955，1988も参照のこと）中に導入された（図19）。pTM(Ｌ)942／992／1558に存在する特定の突然変異は、図19に示される。トランスフェクション６−ウェルプレートにおけるHEp−２細胞単層を、集密的に増殖し、そしてトランスフェクションを、上記のようにして（また、Taoなど，J ．Virol．72：295 5，1988も参照のこと）実施した。４日目、収穫の前、トリプシンを、トランスフェクションの３日後、添加し、0.75μｇ／mlの最終濃度にした。細胞培養物上清液を澄まし、そして新鮮なLLC−MK2細胞単層上に継代した（継代１として言及される）。一晩の吸着の後、培地を、0.75μｇ／mlのトリプシンを有する新鮮な Opti-MEM 1により交換した。継代１培養物を32℃で４日間インキュベートし、そして上清液に存在するウィルスを収穫し、そして再び、同じ条件下で継代した（継代２として言及される）。継代２収穫物に存在するウィルスを、上記のようにして血球凝集−阻害(HAI)アッセイによりPIV１ HNタンパク質の存在について試験した（また、Taoなど，J ．Virol．72：2955，1998も参照のこと）。種々の温度でのLLC−MK２におけるPIVの複製 LLC−MK２単層上のプラークの数え上を、PIV１，rPIV３−１及びrPIV３−１． cp45Ｌの場合、アガロースオーバーレイに添加される0.75μｇ／mlのトリプシンを伴って、上記のようにして実施した（また、Taoなど，J ．Virol．72：2955，1 998を参照のこと）。種の温度での６日間のインキュベーションの後、．アガロースオーバーレイを除去し、そしてプラークを、テンジクネズミ赤血球(RBC)による血球吸着(HAD)により同定した。ハムスターの呼吸器官におけるPIVの複製５匹のハムスターのグループを、10⁶プラーク形成単位(PFU)のrPIV３／JS，rP IV３ cp45 Ｌ，cp45，PIV１／Wash64，rPIV３−１又はrPIV３−１．cp45Ｌを含むＬ15培地0.1mlにより鼻腔内接種した。ハムスターを、感染の４日後、殺し、そしてそれらの肺及び鼻甲介を収穫し、そして均質化した。組織サンプルに存在するウィルスを、上記のようにして、及びTaoなど，J ．Virol．72：2955，1998 に記載のようにして、32℃でLLC−MK２細胞単層上で滴定した。力価は、個々のグループに関して、逆数平均log₁₀TCID₅₀／ｇ組織として表わされる。ハムスターにおける免疫化及び攻撃の研究 10匹のハムスターのグループを、上記のようにして、動物当たり10⁶のPFUにより鼻腔内免疫化した。血清を、HAIアッセイのために、感染の前、及び33日目に採取した。10匹のハムスターの個々のグループの血清に存在するHAI抗体のレベルを、抗原としてPIV１／Wash64及びPIV３／JSを用いて決定し、そして決定されたHAI力価を、平均log₂として表わす（また、Taoなど，J ．Virol．72：２955，1 998を参照のこと）。免疫化の35日後、個々のグループからの５匹のハムスターを、10⁶PFUのPIV１／Wash64又はrPIV３／JSにより鼻腔内攻撃した。それらの攻撃されたハムスターの鼻甲介及び肺を、攻撃の４日後に収穫した。組織サンプルにおけるウィルス力価を、上記のようにして及びTaoなど，J ．Virol．7 2：2955，1998に記載のようにして、LLC−MK２単層上で決定し、そして力価を平均log₁₀TCID₅₀／ｇ組織として表わす。結果組換えキメラウィルスrPIV３−１．cp45Ｌの回収及び特徴化上記に示されるように、cDNAクローンpFLC．２Ｇ＋．hc、すなわちＦ及びHN糖タンパク質をコードするORFがPIV１のORFにより置換されているPIV３の十分な長さのアンチゲノムcDNAを、cp45のＬ遺伝子に同定され、そして独立したts及び弱毒化突然変異であることが示されている３種のアミノ酸コード変化（Ｌタンパク質におけるアミノ酸位置に従って、942，992及び1558と称する）の導入により修飾した（図19；また、Skiadopoulosなど，、J ．Virol．72：1762，1998も参照のこと）。個々のコード変化を、、天然に存在する制限部位を除去する連続した、翻訳的にサイレントなnt置の同時導入により示した（図19；表８）。最終の十分な長さのプラスミド構造体、すなわちpFLC．２Ｇ＋．hc．cp45Ｌ（図19）は、長さ15516ntのPIV３−１キメラアンチゲノムRNAをコードし、そして６の規則に従う（Durbinなど，Virology 234：74，1997を参照のこと；引用により本明細書に組込まれる）。pFLC．２Ｇ＋．hc．cp45Ｌの真正性は、適切な制限酵素による消化により確かめられた。 pFLC．２Ｇ＋．hc．cp45Ｌ cDNAを、PIV３Ｎ，Ｐ及びＬ支持プラスミドと一緒に、HEp−２細胞中にトランスフェクトし、そして上記のようにして及びTaoなど，J ．Virol．72：2955，1998に記載のようにして、MVA−Ｔ７により感染せしめた。rPIV３−１．cp45Ｌと称する、LLC−MK２細胞上での２回の継代の後に回収されたウィルスを、プラーク〜プラーク〜プラーク継代により生物学的にクローン化し、そして増幅されたウィルスを、それがＬにPIV１糖タンパク質及び３種の導入された突然変異を有することを確かめるために分析した。最初に、rPIV３−１．cp45ＬにおけるPIV１ HNタンパク質の存在を、上記のようにして及びTaoなど，J ．Virol．72：2955，1998に記載のようにして、HAIアッセイにおいてPIV１特異的抗体との反応性により確かめた。rPIV３−１．cp45ＬゲノムRNAにおけるキメラPIV３−１ HN及びＦ遺伝子、並びに導入されたＬ遺伝子突然変異の存在を、上記のようにして及びTaoなど，J ．Virol．72：2955，1998に記載のようにして、ビリオンRNAから生成されたRT−PCR生成物の制限酵素消化又はヌクレオチド配列分析により確かめた。それらのデータは、rPIV３−１．cp45Ｌがcp45のＬ遺伝子の３種のコドン置換を担持する組換えキメラウィルスであることを確認した。 rPIV ３−１．cp45Ｌは感温性である cp45の３種のＬ遺伝子突然変異は、wt PIV３中に導入される場合、ts表現型を付与することが上記に示された(また、Skiadopoulosなど，J ．Virol．72：1762 ，1998)。キメラウィルスにおけるそれらの存在が同じ効果を有するかどうかを評価するために、rPIV３−１．cp45Ｌのプラーク形成効率を種々の温度で決定した。表15に示されるように、３種のＬ突然変異は実際、キメラウィルスに表現型を付与した。組換えウィルスrPIV３ cp45 Ｌ及びrPIV３−１．cp45 Ｌにおける cp45 Ｌ突然変異により特定される感温性のレベルは等しく（表15）、このことは、突然変異の効果が、PIV３又はPIV１ HN及びＦ糖タンパク質と無関係であることを示す。rPIV３ cp45 Ｌ及びrPIV３−１．cp45Ｌの感温性のレベルは、後者のウィルスがＬの外部の突然変異を有する事実にかかわりなく、生物学的に誘導されたcp45ウィルスのレベルに匹敵した（Stokesなど，Virus Res ．30：43，199 3を参照のこと；引用により本明細書に組込まれる）。ハムスターにおけるrPIV３−１．cp45Ｌの複製のレベル cp45の３種のＬ遺伝子突然変異は、wt PIV３中に導入される場合、ハムスターの上部及び下部呼吸器官においてウィルス複製の弱毒化を付与することが上記で示された（また、Skiadopoulosなど，J ．Virol．72：1762，1998を参照のこと）。キメラウィルスに対するそれらの効果を、表16に示されるように、ハムスターの鼻腔内感染により評価した。それらの発見は、rPIV３−１．cp45Ｌが実際、両部位で弱毒化され、そしてさらに、弱毒化のそのレベルがrPIV３ cp45 Ｌのレベルに匹敵したことを示す。従って、感温性のように、弱毒化を付与するcp45 Ｌ突然変異の能力は、表面糖タンパク質の抗原特異性に無関係である。 PIV ３の内部タンパク質及びPIV１の糖タンパク質を含むrPIV３−１又はrPIV３ −１．cp45Ｌによる感染は、ハムスターにおいてPIV１攻撃に対する耐性を付与するキメラrPIV３−１ウィルス及びその弱毒化されたrPIV３−１．cp45Ｌ誘導体を、ハムスターにおいて免疫原性及び保護効率について評価した。表17に示されるように、いづれかのウィルスによる感染は、PIV３に対してではなく、PIV１に対してHAI抗体を誘発し、このことは、それらのキメラウィルスがPIV１ HN糖タンパク質を有し、そして高い免疫原性であることを確認する。rPIV３−１．cp45Ｌにより誘発されるHAI抗体のレベルはrPIV３−１によるレベルよりも２倍近く、このことは、その弱毒化が免疫原性において中位の低下をもたらしたことを示す。同様に、rPIV３及びrPIV３ cp45ＬはPIV１に対してではなく、PIV３に対して HAI抗体を誘発し、そしてその弱毒化されたウィルスにより誘発されるレベルは約２倍、低かった。cp45 Ｌ突然変異を担持する組換えウィルスのハムスターにおける制限された複製にもかかわらず、rPIV３ cp45 Ｌ又はrPIV３−１．cp45 Ｌのいづれかによる感染は、相同糖タンパク質を担持する攻撃ウィルスの複製に対して完全な耐性を誘発した。 rPIV ３−１．cp45Ｌによる感染はまた、PIV３に対する耐性を付与する耐性におけるPIV中の非HN又はＦ糖タンパク質（すなわち、内部タンパク質）の役割に対する情報は制限されている。本明細書におけるrPIV３−１及びrPIV３ −１．cp45Ｌの開示及び使用は、免疫化及び攻撃ウィルスにより共有される遺伝子のみが内部タンパク質遺伝子であるので、内部タンパク質がPIV３による攻撃に対する耐性において演じる役割を試験する機会を提供する。PIV３攻撃ウィルスの複製は、rPIV３−１又はrPIV３−１．cp45Ｌによるハムスターの先の感染により上部及び下部呼吸器官において有意に制限される（表17）。従って、それらのデータは、HN及びＦタンパク質のように、PIV３の内部タンパク質が攻撃PIV３の複製に対して部分的な耐性を誘発できることを示す。上記免疫原性及び効率により示される発見の中で、特に予測できない発見は、 wt又は弱毒化されたrPIV３による感染が肺におけるPIV１攻撃ウィルスの複製の1 00倍の低下を誘発したことであった。従って、PIVの１つの血清型による感染は、異種血清型に対して有意な保護を提供した。これは、これまでの研究が、ヒト PIVの１つのタイプによる動物の感染が、ヒトPIV感染に対する免疫性が大部分、タイプ−特異的である一般的な考えに従って、異なったヒト血清型に属するPIV に対して有意な異種保護性を誘発しなかったことを示しているので、一部、予測できないことであった（たとえば、Cookなど，Amer ．Jour．Hyg．77：150，1963 ；Rayなど，J ．Infect．Dis．162：746，1990；それぞれ引用に。より本明細書に組込まれる）。この例は、PIV１のための弱毒化された生存候補体ワクチンの急速、合理的な開発をさらに提供するために、PIV３ワクチンを生成するために開発された新規方法及び試薬の好都合な開発を示す。感染性PIV３をコードするcDNAを、PIV１ HN及びＦ保護抗原をコードするORFのそれらのPIV３カウンターパートによる置換により修飾した。続いて、cp45 PIV３のＬ遺伝子に存在する３種の弱毒化突然変異により例示される弱毒化突然変異を、この修飾されたPIV３−PIV１ cDNA内に組込んだ。このcDNAから、PIV１のHN及びＦ遺伝子、PIV３の内部タンパク質及びPIV３ cp45 Ｌ遺伝子突然変異を担持する組換えウィルスを回収した。この組換え体rPIV３−１．cp45Ｌは、感温性であり、ハムスターにおいて高く弱毒化され、そしてハムスターにおいてPIV１攻撃に対してひじょうに有効であった。rPIV３−１．cp45Ｌにより示される、感温性、弱毒化及び免疫原性のレベルは、cp45 PIV３のレベルに相当し、このことは、cp45 Ｌ遺伝子突然変異組により特定される表現型がHN及びＦ表面糖タンパク質に無関係であることを示す。逆向き遺伝学により生成される第１の生存、弱毒化されたPI V１ワクチン候補体を表わすそれらの発見は、PIV１に対するワクチンを開発するための一般的に好都合なスキームを提供する。パラインフルエンザウィルスの内部タンパク質が相同ウィルスによる再感染に対する耐性において演じる役割に関しての情報は、ほとんど知られていない。Ｎ，Ｎ以内のエピトープ又はＭを発現するワクシニア組換え体による感染は攻撃ウィルスの複製に対する耐性を誘発すると言われているが、しかし報告される耐性の大きさは、HN又はＦ糖タンパク質を担持するワクシニア組換え体により誘発される大きさよりも小さい（たとえば、Kastなど，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 8 8：2283，1991；Sakaguchiなど，J ．Gen．Virol．74：479，1993;Thomsonなど，J ．Immunol． 157：822，1996を参照のこと；それらは引用により本明細書に組込まれる）。それらの研究は、内部タンパク質が再感染に対する耐性に対して単にわずかな寄与を行なっていることを示唆した。従って、この開示は、rPIV３−１．cp45Ｌ又はrPIV３ −１によるハムスターの事前の感染が鼻甲介及び肺の両者においてPIV３の複製の約250〜4000倍の低下を誘発したことを示すことによって、予測できない結果を表わしている。それらの２種のキメラ組換えウィルスは、それらがPIV３よりもむしろPIV１のHN及びＦ糖タンパク質を有するが、しかしそれらが攻撃ウィルスとすべての他の遺伝子を共有していることにおいて、PIV３攻撃ウィルスとは異なる。PIV１のHN及びＦ糖タンパク質は、それぞれ、PIV３のそれらの糖タンパク質と47％及び43％の配列同一性を共有する。たぶん、共有される内部タンパク質は観察された耐性を仲介すると思われるが、PIV１及びPIV３Ｆ及びHN糖タンパク質間の共有されるタンパク質配列が観察される免疫性に寄与しているとも思われる。たとえば、PIV１とPIV３との間に共有され、そして保護CTLエピトープとして作用する能力を有する少なくとも９個の長さのアミノ酸残基を延長する、 HNにおける５つの延長部及びＦにおける２つの延長部が存在する。共有される内部タンパク質は、交差−免疫性のこのレベルはこれまでの研究には見出されていないので、wt PIV３攻撃ウィルスの複製の制限に寄与していると考えることが道理的である（たとえば、Cookなど，Amer ．Jour．Hyg．77：150，1963;Rayなど，J ．Infect．Dis． 162：746，1990を参照のこと；これは引用により本明細書中に組込まれる）。 rPIV３−１及びrPIV３−１．cp45Ｌの内部PIV３タンパク質がPIV３攻撃に対する耐性を付与する発見は、PIV３の弱毒化された誘導体がPIV１及びPIV２保護抗原のためのベクターとして使用され得ることを示す。本発明の教授に従って、１つのPIV３に基づく生存−弱毒化されたワクチンウィルスによる免疫化が、続いて投与される他のPIV３に基づくワクチンウィルスの複製を制限することができ、それにより、第２ウィルスの免疫原性を低める。RSVのようにPIV３は初期乳児において有意な疾病を誘発するので、ひじょうに若い、生後２〜４週目の乳児への使用のための組合されたRSV-PIV３ワクチンが本発明の重要な観点である（たとえば、C ollinsなど，Fields Virology 3rd ed．Philadelphia：Lippincott-Raven Publi shers，1205(1)，1996;Reedなど，J ．Infect．Dis．175：807，1997を参照のこと；それぞれ引用により本明細書中に組込まれる）。本発明のこの観点によれば、PIV１−PIV２ワクチンによる免疫化は、ほとんどのPIV１及びPIV２疾病が６カ月の年齢の後に生じるので、好ましくは、約６カ月の年齢で開始されるであろう。rPIV３ cp45による免疫化が、それが内部タンパク質遺伝子を共有するキメラ組換えPIV３−１ワクチンウィルスの複製を有意に阻害する可能な状況下では、組換えPIV３−１ワクチンによる好都合な免疫化が制限されるであろう。最終的には、三価のPIVワクチンが、連続的によりもむしろ同時に投与され、それにより、上記に示された阻害性を妨げるであろう。ワクチン又はwt PIV３による感染が異種wt PIV１の肺ウィルス複製の100倍の低下を誘発する本明細書における開示は、一部、ヒトPIVウィルスは中和アッセイにより血清学的に異なっており、そしてハムスターにおけるこれまでの研究は、１つのタイプのPIVによる事前の感染が高い用量の異なったPIV型による攻撃に対する耐性を誘発できなかったことを見出しているので、明らかに予測できるものではない（たとえば、Cookなど，Amer ．Jour．Hyg．77：150，1963;Rayなど，J ．Infect．Dis． 162：746，1990；Cookなど，Amer ．Jour．Hyg．69：250，1959 を参照のこと）。さらに、１つのPIVによる事前の感染が異種型PIVによる続く感染を有意に修飾することを詳細に示す疫学的データはほとんど存在しない。要約すると、本発明の例は、rPIV３が、Ｆ及びHN糖タンパク質をコードするOR Fを置換し、そしてそのPIV３内部遺伝子中に既知の弱毒化突然変異を導入することによって、PIV１のためのワクチンに都合良く転換されることを示す。従って、本明細書に提供される広範な方法及び試薬は、rPIV３−１キメラウィルスのPI V３バックボーンを直接的且つ予測的に弱毒化するために、並びに生存−弱毒化されたPIV２ワクチンウィルスを生成するために適用され得る。前述の開示は、PIV及び関連するワクチンの広い集合体を開発するために本明細書に提供される試薬及び方法の開発を可能にする。これに関して、PIV３とPIV ２との間の生存性免疫原性キメラの再生は、ワクチンへの使用のための広範囲の組換えPIVウィルスを開発するための強力な新規手段を例示する。この研究に関して、天然に存在するPIV変異体、たとえばcp45及びBPIV３ワクチン候補体の本発明の開示の教授に従っての弱毒化のための遺伝的基礎の同定及び特徴化はまた、組換えワクチンウィルス及びサブウィルス粒子の大きな宿主における開発を可能にする。特に、生物学的に誘導された変異体ウィルスに存在する所望する突然変異は、上記例に示されるように、野生型、特に弱毒化される、又はキメラ性の PIVバックグラウンド中に単独での及び組合してのそれらの導入により容易に同定され、そして選択されるであろう。それらの発見は、ワクチン組換え体における弱毒化及び免疫原性のレベルを調節するためにPIVクローン中に導入され得る、本発明内の典型的な弱毒化突然変異のメニューを拡張するであろう。生物学的に誘導された突然変異はまた、種々のタイプの突然変異、たとえば遺伝子又は遺伝子セグメントの変更、欠失又は置換を有するPIVクローン内に導入され得る。本発明のこの観点においては、選択された遺伝子欠失、付加又は置換を有する組換えPIV、たとえばＣ，Ｄ又はＶ ORFの欠失を有するrPIVが提供される。そのような二者択一的に突然変異誘発されたクローンはさらに、PIV組換え体ｒ942，ｒ992，ｒ1558，ｒ942／992，ｒ992／1558又はｒ942／1558及びｒ 942／992／1558により例示されるように、生物学的に誘導された変異体PIVから採用されたts，ca又はatt表現型を特定する１又は複数の突然変異を導入することによって、本発明の開示に従って修飾され得る。本発明のさらなる観点においては、生物学的に誘導された突然変異が、たとえばＣ，Ｄ、及び／又はＶ ORFの弱毒化遺伝子欠失により例示されるように、天然において見出されない新たな弱毒化突然変異と組合されるであろう。所望する表現型特徴を付与する、本明細書に開示される他のタイプの突然変異がまた、1997年７月15日に出願されたアメリカ特許出願第08／892,403号（引用により本明細書に組込まれる）における組換えRSVワクチン株について開示される組合せ突然変異の範囲に類似する、生物学的に誘導された弱毒化突然変異と組合されるであろう。比較できる突然変異が、キメラワクチン株において所望するレベルの弱毒化及び免疫原性を達成するために、たとえばキメラウィルス中に容易に導入され得る。この態様においては、他の所望する表現型特徴と共に、所望するバランスの弱毒化及び免疫原性を有する生存弱毒化されたrPIVワクチンの広範囲の集合体を構築するために有用である大多数の突然変異が本発明において提供される。前述の発明はより明確に理解するために、いくらか詳細に例示的且つ例的に記載されて来たが、一定の変更及び修飾を本発明の範囲内で行なえることは明白であろう。

【手続補正書】【提出日】平成１１年１２月２日（１９９９．１２．２）【補正内容】明細書第19頁第９行目、「図14」を『図14Ａ及び図14Ｂ』に補正します。同第21頁第12行目、「図17」を『図17Ａ及び図17Ｂ』に補正します。同第124頁下から第９行目、「図14」を『図14Ａ及び図14Ｂ』に補正します。同第125頁下から５行目、「修飾し（図14）、」を『修飾し、』に補正します。同第127頁第４行目、「図14」を『図14Ａ及び図14Ｂ』に補正します。同第130頁下から第９行目、「（図14）」を『（図14Ａ及び図14Ｂ）』に補正します。同第133頁下から第11行目、「III及びIV」を『III及びVI（図17Ａ及び図1 7Ｂ）』に補正します。同第133頁下から第８〜７行目、「インビトロでのrPIV３−１のトリプシン−依存性及び細胞障害性。」を『インビトロでのrPIV３−１のトリプシン−依存性及び細胞障害性』に補正します。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 7/00 5/10 7/04 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:92）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ダービン，アンナピー. アメリカ合衆国，メリーランド 20874, ジャーマンタウン，セントジョーンズバリーレーン 19440 (72)発明者スキアドプロス，マリオエイチ. アメリカ合衆国，メリーランド 20854, ポトマック，アクエダクトロード 8303 (72)発明者タオ，タオアメリカ合衆国，メリーランド 20814, ベセスダ，ウェイマウスストリート 10684 ＃104

Claims

【特許請求の範囲】 1. 作用可能に連結された転写プロモーター、PIVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列、及び転写ターミネーターを含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子であって、ここで前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、キメラPIVゲノム又はアンチゲノムを形成するために、HPIV１配列、HPIV２配列、HPIV３配列、BPIV配列又はMPIV配列から選択された異種PIV配列の導入により修飾されていることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド分子。 2. ヒトPIV３の遺伝子又は遺伝子セグメントが、異種PIVからのカウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントにより置換される請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 3. 前記カウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントが、HPIV１又はHPIV２のHN又はＦ糖タンパク質遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第２項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 4. PIV１又はPIV２のHN又はＦ糖タンパク質遺伝子がHPIV３のカウンターパートHN又はＦ糖タンパク質遺伝子により置換される請求の範囲第２項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 5. 前記ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列がBP IV遺伝子又は遺伝子セグメントを含む請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 6. RSVからの異種配列を組込む請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 7. RSVからの前記異種配列が、Ｇ又はＦ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第６項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 8. 麻疹ウィルスからの異種配列を含む請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 9. 麻疹ウィルスからの前記異種配列がHA又はＦ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第８項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 10．作用可能に連結された転写プロモーター、PIVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列、及び転写ターミネーターを含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子であって、ここで前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチト配列が、 i）ｐ218(131)(配列番号１)； ii）ｐ３／７(131)(配列番号14)； iii）ｐ３／７(131)２Ｇ(配列番号15)；又は iv） HPIV１配列、HPIV２配列、BPIV配列もしくはMPIV配列から選択された異種PIV配列の導入により、又はPIVの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されている、i）、ii）又はiii）の単離されたポリヌクレオチド、、から成る群から選択されることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド分子。 11．作用可能に連結された転写プロモーター、PIVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列、、及び転写ターミネーターを含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド分子。 12．前記ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換が、PIVの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 13．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が複数のts突然変異を組込む請求の範囲第12項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 14．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が複数の非ts突然変異を組込む請求の範囲第12項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 15．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列がJS cp45の１又は複数の突然変異を含む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 16．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ポリメラーゼＬタンパク質における少なくとも１つのアミノ酸置換をコードする請求の範囲第15項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 17．前記ポリメラーゼＬタンパク質における前記アミノ酸置換が、JS cp45のT yr₉₄₂，Leu₉₉₂、又はThr₁₅₅₈に対応する位置で生じる請求の範囲第16項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 18．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｎタンパク質における少なくとも１つのアミノ酸置換をコードする請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 19．前記Ｎタンパク質における前記アミノ酸置換が、JS cp45の残基Val₅₆又は Ser₃₈₉に対応する位置で生じる請求の範囲第18項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 20．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｃタンパク質におけるアミノ酸置換をコードする請求の範囲第 11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 21．前記Ｃタンパク質における前記アミノ酸置換が、JS cp45のIle₉₆に対応する位置で生じる請求の範囲第20項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 22．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｆタンパク質における少なくとも１つのアミノ酸置換をコードする請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 23．前記Ｆタンパク質における前記アミノ酸置換が、JS cp45のIle₄₂₀又はAla₄₅₀ に対応する位置で生じる請求の範囲第22項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 24．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、HNタンパク質におけるアミノ酸置換をコードする請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 25．前記HNタンパク質における前記アミノ酸置換が、JS cp45の残基Val₃₈₁に対応する位置で生じる請求の範囲第24項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 26．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が３’リーダー配列における少なくとも１つの突然変異を組込む請求の範囲第11 項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 27．前記３’リーダーにおける突然変異が、JS cp45のヌクレオチド23，24，2 8又は45に対応する位置で生じる請求の範囲第26項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 28．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｎ遺伝子開始配列における突然変異を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 29．前記Ｎ遺伝子開始配列における突然変異がJS cp45のヌクレオチド62に対応する位置で生じる請求の範囲第28項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 30．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、rcp45，rcp45 3'NCMFHN，rcp45 3'NL，rcp45 3'N、又はrcp45 Fに存在する、多くの及び十分な数までの突然変異を含む請求の範囲第12項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 31．rcp45，rcp45 3'NCMFHN，rcp45 3'NL，rcp45 3'N，rcp45 L，rcp45 F，rc p45 M，rcp45 HN又はrcp45 Cから選択されたアンチゲノムcDNAである請求の範囲第12項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 32．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、突然変異を特定するコドンにおける複数のヌクレオチド置換により安定化された突然変異を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 33．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、キメラゲノム又はアンチゲノムを形成するために、HPIV１，HPIV２，HPIV３，BPIV又はMPIVからの異種配列を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 34．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数のts突然変異を組込む請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 35．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数の非−ts弱毒化突然変異を組込む請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 36．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、JS cp45の１又は複数の突然変異を組込む請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 37．前記JS cp45の１又は複数の突然変異が、Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｆ、又はHNから選択された１又は複数のPIVタンパク質において、又は３’リーダー又はＮ− 遺伝子開始配列から選択されたPIV遺伝子外配列において生じる請求の範囲第36 項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 38．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、又は宿主範囲制限から選択された表現型をそれぞれ特定する複数の突然変異を組込む請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 39．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、rcp45，rcp45 3'NCMFHN，rcp45 3 'NL，rcp45 3'N、又はrcp45 Fに存在する、少なくとも１つの及び十分な数までの突然変異を組込む請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 40．PIVの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更を特定する突然変異が、１又は複数のカウンターパートPIV１又はPIV２HN及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換された、１又は複数のPIV３ HN又はＦ糖タンパク質遺伝子を有するゲノム又はアンチゲノムを含んで成るキメラPIVバックグラウンドに組込まれる請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 41．前記異種配列が、PIVの弱毒化、感温性、、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更を特定する請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 42．HPIV１，HPIV２，BPIV又はMPIVのシス−作用性調節配列を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 43．RSVからの異種配列を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 44．前記RSVからの異種配列が、Ｇ又はＰ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第43項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 45．麻疹ウィルスからの異種配列を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 46．前記麻疹ウィルスからの異種配列がHA又はＦ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第45項記載の単離されたポリヌクレオチト分子。 47．哺乳類宿主において保護免疫応答を誘発することができる、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、又は微生物病原体のタンパク質から選択された非−PIV分子をコードするポリヌクレオチド配列を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。 48．PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクター、及びPIVのＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターを包含し、それにより、前記PIVゲノム又はアンチゲノム、及びＮ，Ｐ、及びＬタンパク質の発現が感染性PIV粒子を生成する細胞又は細胞−フリー組成物。 49．前記感染性RIV粒子がウィルスである請求の範囲第48項記載の細胞又は細胞−フリー組成物。 50．前記感染性PIV粒子がサブウィルス粒子である請求の範囲第48項記載の細胞又は細胞−フリー組成物。 51．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド、及びPIV のＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数のポリヌクレオチドが、単一のベクター内に組込まれる請求の範囲第48項記載の細胞又は細胞−フリー組成物。 52．感染性PIV粒子をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子から前記PIV粒子を生成するための方法であって、 PIVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクター、及びＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数のポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターを、細胞又は細胞−フリーシステムにおいて同時発現し、それにより、感染性PIV粒子を生成することを含んで成る方法。 53．前記PIVゲノム又はアンチゲノム、及び前記Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質が同じ発現ベクターにより発現される請求の範囲第52項記載の方法。 54．前記Ｎ，Ｐ、及びＬタンパク質が、２又は３種の異なった発現ベクター上にコードされる請求の範囲第52項記載の方法。 55．前記Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質の少なくとも１つが、PIVによる同時感染により供給される請求の範囲第52項記載の方法。 56．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子がcDNAである請求の範囲第52項記載の方法。 57．前記感染性PIV粒子がウィルスである請求の範囲第52項記載の方法。 58．前記感染性PIV粒子がサブウィルス粒子である請求の範囲第52項記載の方法。 59．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、ヒト、ウシ、又はネズミPIV配列である請求の範囲第52項記載の方法。 60．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、野生型PIV株の配列をコードする請求の範囲第52項記載の方法。 61．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、HPIV３をコードする請求の範囲第52項記載の方法。 62．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、生物学的に誘導されたPIV株からの弱毒化突然変異を組込む請求の範囲第52 項記載の方法。 63．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、１又は複数のts突然変異を組込む請求の範囲第52項記載の方法。 64．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、１又は複数の非−ts弱毒化突然変異を組込む請求の範囲第52項記載の方法。 65．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、JS cp45の少なくとも１つの突然変異を組込む請求の範囲第52項記載の方法。 66．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、JS cp45の複数の突然変異を組込む請求の範囲第65項記載の方法。 67．前記JS cp45の突然変異が、ポリメラーゼＬタンパク質における少なくとも１つのアミノ酸置換を特定する請求の範囲第65項記載の方法。 68．前記ポリメラーゼＬにおける前記アミノ酸置換が、JS cp45のTyr₉₄₂，Leu₉₉₂ 、又はThr₁₅₅₆に対応する位置で生じる請求の範囲第67項記載の方法。 69．前記JS cp45の突然変異が、Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｆ、又はHNから選択されたP IVタンパク質、又は３’リーダー又はＮ遺伝子開始配列から選択されたPIV遺伝子外配列における変化を特定する請求の範囲第65項記載の方法。 70．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、突然変異を特定するコドンにおける複数のヌクレオチド置換により安定化される突然変異を組込む請求の範囲第52項記載の方法。 71．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、rcp45，rcp45 3'NCMFHN，rcp45 3'NL，rcp45 3'N又はrcp45 Fに存在する、多くの及び十分な数までの突然変異を組込む請求の範囲第52項記載の方法。 72．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、rcp45，rcp45 3'NCMFHN，rcp45 3'NF，rcp45 3'N，rcp45 L，rcp45 F，rcp4 5 M，rcp45 HN又はrcp45 Cから選択されたアンチゲノムcDNAである請求の範囲第 69項記載の方法。 73．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、キメラゲノム又はアンチゲノムを形成するために、HPIV１，HPIV２，HPIV３，BPIV又はMPIVからの異種配列を組込む請求の範囲第52項記載の方法。 74．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、HPIV３配列、及びHPIV１，HPIV２，BPIV又はMPIV配列のキメラである請求の範囲第73項記載の方法。 75．HN又はＦ糖タンパク質の遺伝子又は遺伝子セグメントをコードする、HPIV １又はHPIV２からの異種配列が、HPIV３の対応する遺伝子又は遺伝子セグメントにより置換される請求の範囲第74項記載の方法。 76．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが１又は複数のts突然変異を組込む請求の範囲第73項記載の方法。 77．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが１又は複数の非−ts弱毒化突然変異を組込む請求の範囲第73項記載の方法。 78．前記キメラゲノム又はアンチゲノムがJS cp45の１又は複数の突然変異を組込む請求の範囲第73項記載の方法。 79．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ又は宿主範囲制限が選択された表現型をそれぞれ特定する複数の突然変異を組込む請求の範囲第73項記載の方法。 80．PIVの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更を特定する突然変異が、１又は複数のカウンターパートPIV１又はPIV２ HN及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換された、１又は複数のPIV３ HN又はＦ糖タンパク質遺伝子を有するゲノム又はアンチゲノムを含んで成るキメラPIVバックグラウンドに組込まれる請求の範囲第73項記載の方法。 81．JS cp45の１又は複数の突然変異が、カウンターパートPIV１又はPIV２ HN 及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換された両PIV３ HN及びＦ糖タンパク質遺伝子を有するゲノム又はアンチゲノムを含んで成るキメラバックグラウンドにおいて組込まれる請求の範囲第80項記載の方法。 82．前記JS cp45の１又は複数の突然変異が、Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｆ、又はHNから選択された１又は複数のPIVタンパク質、又は３’リーダー又はＮ遺伝子開始配列から選択されたPIV遺伝子外配列において生じる請求の範囲第81項記載の方法。 83．前記異種配列が、PIVの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更を特定する請求の範囲第73項記載の方法。 84．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、RSVからの異種配列を組込む請求の範囲第52項記載の方法。 85．前記RSVからの異種配列が、Ｇ又はＦ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第84項記載の方法。 86．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチドが麻疹ウィルスからの異種配列を組込む請求の範囲第52項記載の方法。 87．前記麻疹ウィルスからの異種配列が、HA又はＦ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第86項記載の方法。 88．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、 i）ｐ218(131)(配列番号１)； ii）ｐ３／７(131)(配列番号14)； iii）ｐ３／７(131)２Ｇ(配列番号15)；又は iv） HPIV１配列、HPIV２配列、BPIV配列又はMPIV配列から選択された異種PIV配列の導入により、又はPIVの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されている、i）、ii）又はiii）のポリヌクレオチド分子から選択される請求の範囲第52項記載の方法。 89．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、 i）ｐ218(131)(配列番号１）； ii）ｐ３／７(131)(配列番号14)； iii）ｐ３／７(131)２Ｇ(配列番号15)；又は iv） HPIV１配列、HPIV２配列、BPIV配列又はMPIV配列から選択された異種PIV配列の導入により、又はPIVの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する前記異種PIV配列の前記導入とは異なる、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されている、i）、ii）又はiii）のポリヌクレオチド分子から選択される請求の範囲第52項記載の方法。 90．前記PIVゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、哺乳類宿主において保護免疫応答を誘発することができる、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、又は微生物病原体のタンパク質から選択された非−PIV分子をコードするよう修飾される請求の範囲第52項記載の方法。 91．組換えPIVゲノム又はアンチゲノム、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質を含んで成る単離された感染性PIV粒子。 92．サブウィルス粒子である請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 93．ウィルスである請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 94．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムがRSV又は麻疹ウィルスからの異種配列を組込む請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 95．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムがcDNAである請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 96．ヒトPIVである請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 97．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、HPIV１，HPIV２，HPIV３，BPI V、又はMPIV配列から選択された異種PIV配列のキメラである請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 98．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、 i）ｐ218(131)(配列番号１)； ii）ｐ３／７(131)(配列番号14)； iii）ｐ３／７(131)２Ｇ(配列番号15)；又は iv） HPIV１配列、HPIV２配列、BPIV配列又はMPIV配列から選択された異種PIV配列の導入により、又はPIVの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されている、i）、ii）又はiii）のゲノム又はアンチゲノムから選択される請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 99．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、 i）ｐ218(131)(配列番号１)； ii）ｐ３／７(131)(配列番号14)； iii）ｐ３／７(131)２Ｇ(配列番号15)；又は iv） HPIV１配列、HPIV２配列、BPIV配列又はMPIV配列から選択された異種PIV配列の導入により、又はPIVの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する前記異種PIV配列の前記導入とは異なる、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されている、i）、ii）又はiii）のゲノム又はアンチゲノムから選択される請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 100．前記カウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントが、HPIV１又はHPIV ２のHN又はＦ糖タンパク質遺伝子の遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 101．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムがRSV又は麻疹ウィルスからの異種配列を組込む請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 102．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、PIVの弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更をコードする、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾される請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 103．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、複数のts突然変異を組込む請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 104．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、複数の非−ts弱毒化突然変異を組込む請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 105．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、JS cp45の少なくとも１つの突然変異を組込む請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 106．前記JS cp45の突然変異が、前記ポリメラーゼＬタンパク質におけるアミノ酸置換を特定する請求の範囲第105項記載の単離された感染性PIV粒子。 107．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数のts突然変異を組込む請求の範囲第97項記載の単離された感染性PIV粒子。 108．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数の非−ts弱毒化突然変異を仕込む請求の範囲第97項記載の単離された感染性PIV粒子。 109．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、JS cp45の１又は複数の突然変異を組込む請求の範囲第97項記載の単離された感染性PIV粒子。 110．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、又は宿主範囲制限から選択された表現型をそれぞれ特定する複数の突然変異を組込む請求の範囲第109項記載の単離された感染性PIV粒子。 111．前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、rcp45，rcp45 3'NCMFHN，rcp45 3'NL，rcp45 3'N、又はrcp45 Fに存在する、少なくとも１つの及び十分な数までの突然変異を組込む請求の範囲第109項記載の単離された感染性PIV粒子。 112．PIVの弱毒化、感温性、低温適合体、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更を特定する突然変異が、１又は複数のカウンターパートPIV１又はPIV２HN及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換された、１又は複数のPIV３ HN又はＦ糖タンパク質遺伝子を有するゲノム又はアンチゲノムを含んで成るキメラPIVバックグラウンドに組込まれる請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 113．JS cp45の１又は複数の突然変異が、前記キメラバックグラウンドにおいて組込まれる請求の範囲第112項記載の単離された感染性PIV粒子。 114．前記JS cp45の１又は複数の突然変異が、Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｆ、又はHNから選択された１又は複数のPIVタンパク質において、又は３’リーダー又はＮ− 遺伝子開始配列から選択されたPIV遺伝子外配列において生じる請求の範囲第113項記載の単離された感染性PIV粒子。 115．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、哺乳類宿主において保護免疫応答を誘発することができる、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ；制限部位マーカー、又は微生物病原体のタンパク質から選択された非−PIV分子をコードするよう修飾される請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 116．哺乳類宿主において、RSVに対して保護免疫性を誘発するRSV抗原又はエピトープをさらに含んで成る請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 117．ｒ942,ｒ992,ｒ1558,ｒ942／992,ｒ992／1558，ｒ942／1558、又はｒ942 ／992／1558，rcp45 3'N，rcp45 C，rcp45 M，rcp45 F，rcp45 HN，rcp45L，rcp 45 3'NL，rcp45 3'NCMFHN、及びrcp45から選択される請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV粒子。 118．医薬的に許容できるキャリヤーに、組換えPIVゲノム又はアンチゲノム、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を含んで成る感染性PIV粒子の免疫原的有効量を含んで成る免疫原組成物。 119．前記感染性PIV粒子が、サブウィルス粒子である請求の範囲第118項記載の免疫原組成物。 120．前記感染性PIV粒子がウィルスである請求の範囲第118項記載の免疫原組成物。 121．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、RSV又は麻疹ウィルスからの異種配列を組込む請求の範囲第118項記載の免疫原組成物。 122．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、感染性キメラ PIV粒子を形成するために、HPIV１，HPIV２，HPIV３、BPIV、又はMPIV配列から選択された異種PIV配列のキメラである請求の範囲第118項記載の免疫原組成物。 123．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムがヒトPIVをコードし、ここで遺伝子又は遺伝子セグメントが異種PIVからのカウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントにより置換される請求の範囲第118項記載の免疫原組成物。 124．HPIV１の１又は両HN及びＦ糖タンパク質遺伝子が、前記感染性キメラPIV 粒子を形成するために、HPIV３のHN及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換される請求の範囲第123項記載の免疫原組成物。 125．前記感染性キメラPIV粒子の組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、PIVの弱毒化、感温性、低温適合性、、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更をコードする、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾される請求の範囲第123項記載の免疫原組成物。 126．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、弱毒化された感染性キメラPI V粒子を形成するために、ts及び非−ts弱毒化突然変異から選択された複数の突然変異を組込む請求の範囲第125項記載の免疫原組成物。 127．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、JS cp45の突然変異を組込む請求の範囲第118項記載の免疫原組成物。 128．前記組換えPIVゲノム又はアンチゲノムが、JS cp45の複数の突然変異を組込む請求の範囲第118項記載の免疫原組成物。