KR20010012893A - 클로닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된파라인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법 - Google Patents
클로닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된파라인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20010012893A KR20010012893A KR1019997010859A KR19997010859A KR20010012893A KR 20010012893 A KR20010012893 A KR 20010012893A KR 1019997010859 A KR1019997010859 A KR 1019997010859A KR 19997010859 A KR19997010859 A KR 19997010859A KR 20010012893 A KR20010012893 A KR 20010012893A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sequence
- piv
- seq
- cdna
- type
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 337
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title claims abstract description 98
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 title claims description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 68
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title description 4
- 101150034575 piv gene Proteins 0.000 claims abstract description 519
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 325
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 293
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 156
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 156
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 156
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 133
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract description 98
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 78
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 72
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 33
- 238000000917 particle-image velocimetry Methods 0.000 claims description 491
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 239
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 131
- 241000712003 Human respirovirus 3 Species 0.000 claims description 129
- 125000003729 nucleotide group Chemical class 0.000 claims description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 102
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 100
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 85
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 75
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 75
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 75
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 61
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 60
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 51
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 51
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 claims description 48
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 45
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 42
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 42
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 41
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 39
- 241000726041 Human respirovirus 1 Species 0.000 claims description 34
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 32
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 29
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 29
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 29
- 241001559187 Human rubulavirus 2 Species 0.000 claims description 27
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 26
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 26
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 26
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 25
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 25
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 23
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 claims description 22
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 claims description 22
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 18
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 16
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 claims description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims description 14
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 claims description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 11
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 claims description 9
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 claims description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 9
- -1 T-helper epitopes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 7
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 claims description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 claims description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 claims description 2
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 claims 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 3
- 208000005141 Otitis Diseases 0.000 claims 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 claims 1
- 208000019258 ear infection Diseases 0.000 claims 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 abstract description 19
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 abstract description 11
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 abstract description 11
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 abstract 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 142
- 108700004031 HN Proteins 0.000 description 105
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 89
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 81
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 68
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 62
- 239000000047 product Substances 0.000 description 59
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 58
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 58
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 49
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 44
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 37
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 32
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 32
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 32
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 30
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 28
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 25
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 20
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 20
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 19
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 19
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 19
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 19
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 18
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 17
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 17
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 16
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 15
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 14
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 13
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 12
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 12
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 11
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 11
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 11
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 11
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 11
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 11
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 11
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 10
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 10
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 10
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 9
- 101150008820 HN gene Proteins 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 9
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 9
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 9
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 8
- 244000144992 flock Species 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 8
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 7
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 7
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 7
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 7
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 6
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 6
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 6
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 5
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 5
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 5
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 4
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 101000892448 Neisseria gonorrhoeae Type II restriction enzyme NgoMIV Proteins 0.000 description 4
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 4
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 4
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 4
- 229920006235 chlorinated polyethylene elastomer Polymers 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 description 4
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 4
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 210000004417 patella Anatomy 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 3
- 108091080980 Hepatitis delta virus ribozyme Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 3
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 3
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 101100519159 Arabidopsis thaliana PCR3 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 2
- 108010079245 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Proteins 0.000 description 2
- 102100023419 Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Human genes 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 101150102573 PCR1 gene Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000000739 chaotic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N (2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N 0.000 description 1
- ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N (z)-octadec-9-enoate;tris(2-hydroxyethyl)azanium Chemical compound OCCN(CCO)CCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N 0.000 description 1
- RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 2-(4,4-difluoropiperidin-1-yl)-6-methoxy-n-(1-propan-2-ylpiperidin-4-yl)-7-(3-pyrrolidin-1-ylpropoxy)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCC(F)(F)CC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000666833 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 20.8 kDa protein in FGF-VUBI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000977027 Azospirillum brasilense Uncharacterized protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000962005 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 23.6 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 101100473864 Brucella melitensis biotype 1 (strain 16M / ATCC 23456 / NCTC 10094) frr gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010051093 Cardiopulmonary failure Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000122205 Chamaeleonidae Species 0.000 description 1
- OPPGAHUCKDKQJR-UHFFFAOYSA-N Coelonin Natural products C1CC2=CC(O)=CC=C2C2=C1C=C(O)C=C2OC OPPGAHUCKDKQJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 244000163122 Curcuma domestica Species 0.000 description 1
- 235000003392 Curcuma domestica Nutrition 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001533413 Deltavirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101000785191 Drosophila melanogaster Uncharacterized 50 kDa protein in type I retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 101000747704 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp1 Proteins 0.000 description 1
- 101000861206 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Uncharacterized protein EF_A0048 Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000769180 Escherichia coli Uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000635799 Homo sapiens Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Proteins 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000026633 IL6 Human genes 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010065602 L Protein parainfluenza 3 virus Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 201000008197 Laryngitis Diseases 0.000 description 1
- 101000976301 Leptospira interrogans Uncharacterized 35 kDa protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 108010059724 Micrococcal Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 description 1
- 241000711513 Mononegavirales Species 0.000 description 1
- 241000712045 Morbillivirus Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- DTERQYGMUDWYAZ-ZETCQYMHSA-N N(6)-acetyl-L-lysine Chemical compound CC(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O DTERQYGMUDWYAZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N N(omega)-methyl-L-arginine Chemical compound CN=C(N)NCCC[C@H](N)C(O)=O NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N N-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 101000658690 Neisseria meningitidis serogroup B Transposase for insertion sequence element IS1106 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010069013 Phenylalanine Hydroxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100038223 Phenylalanine-4-hydroxylase Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000748660 Pseudomonas savastanoi Uncharacterized 21 kDa protein in iaaL 5'region Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 229940124679 RSV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000584469 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P1 Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 1
- 101000818096 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 15.5 kDa protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000766081 Streptomyces ambofaciens Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in unstable DNA locus Proteins 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 101000804403 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HIT-like protein Synpcc7942_1390 Proteins 0.000 description 1
- 101000750910 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator Synpcc7942_2319 Proteins 0.000 description 1
- 101000644897 Synechococcus sp. (strain ATCC 27264 / PCC 7002 / PR-6) Uncharacterized protein SYNPCC7002_B0001 Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011053 TCID50 method Methods 0.000 description 1
- 241000030538 Thecla Species 0.000 description 1
- 101000865057 Thermococcus litoralis DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000005324 Typha latifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 101000916336 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 82 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001000760 Zea mays Putative Pol polyprotein from transposon element Bs1 Proteins 0.000 description 1
- 101000678262 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 65 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;ethanol Chemical compound CCO.O=C=O OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000000136 cloud-point extraction Methods 0.000 description 1
- 244000118869 coast club rush Species 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 235000003373 curcuma longa Nutrition 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007366 host health Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 210000000537 nasal bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 230000000803 paradoxical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960002816 potassium chloride Drugs 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000017610 release of virus from host Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- YWDBSCORAARPPF-VWUMJDOOSA-N tixocortol Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CS)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 YWDBSCORAARPPF-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 229960004631 tixocortol Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229940117013 triethanolamine oleate Drugs 0.000 description 1
- 235000013976 turmeric Nutrition 0.000 description 1
- 230000007501 viral attachment Effects 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
- C12N2760/18622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18611—Respirovirus, e.g. Bovine, human parainfluenza 1,3
- C12N2760/18634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
분리된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 재조합 PIV 백신 생산을 위한 재조합 PIV 게놈 및 안티게놈이 제공된다. 이 재조합 게놈 또는 안티게놈은 핵단백질 (N), 인단백질 (P), 및 대형(L) 폴리머라제 단백질과 함께 발현되어 분리된 감염성 PIV 입자를 생산할 수 있다. 소망되는 변경이 발생되도록, 예컨대 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이주로부터 약독화 돌인변이를 인코포레이션하거나, 백신 용도를 위해 약독화된 면역원성 바이러스를 생산하기 위해 키메릭 PIV 클론을 형성하도록 재조합 PIV 게놈과 안티게놈을 변형시킬 수 있다.
Description
인간의 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), HPIV1, HPIV2 및 HPIV3는 영아와 아동에서 일어나는 세기관지염, 후두염 및 폐렴의 중요 발병원인이다. Karron 외, J. Infect. Dis. 172: 1445-50 (1995); Collins외 "Parainfluenza Viruses", p.1205-1243. B.N. Fields외, 편. Fields Virology, 3판, vol. 1. Lippincott-Raven Publ., Philadelphia (1996); Murphy외, Virus Res. 11:1-15 (1988). 이들 바이러스에 감염되면 3세 미만의 아동들에게 실질적인 이환을 일으키고, 호흡기 감염으로 인한 유아와 아동의 입원 비율의 약 20%가 이로 인한 것이다.
HPIV에 대한 효과적인 백신요법을 개발하기 위해 많은 노력이 기울여져 왔음에도, HPIV 균주나 HPIV 관련 질환을 완화시키는 인정된 백신 제제는 아직까지 개발되지 못했다. 현재까지, 단 2가지의 살아있는 약독화 PIV 백신 후보가 특히 주목을 받고 있다. 이들 후보 중 하나는 소의 PIV(BPIV) 균주로서 이 균주는 HPIV3과 항원적으로 연관이 있으며 HPIV3으로부터 동물을 보호해주는 것으로 나타났다. BPIV3은 아동과 유아에 있어서 약독화되어, 유전적으로 안정한 면역원이다 (Karron외, J. Inf. Dis. 171:1107-14 (1995a); Karron외, J. Inf. Dis. 172: 1445-1450, (1995b)). 두번째 PIV3 백신 후보인 JS cp45는 HPIV3의 JS 야생형 (wt)의 감기-적응 돌연변이이다 (Karron외, (1995b), 상기문헌; Belshe 외, J. Med. Virol. 10:235-42 (1982)). 살아있는 이 약독화된 감기-계대 (cp: cold-passaged) PIV3 백신 후보는 감온성 (ts: temperature sensitive), 감기-적응화 (ca: cold-adpatation) 및 약독화 (att: attenuation) 표현형으로서 생체내에서 바이러스 복제후에도 안정하다. cp45 바이러스는 동물 실험에서 인간의 PIV3 챌린지에 대해 방어성을 나타내고 혈청음성 유아 및 아동에 있어서 약독화되고 유전적으로 안정하며 면역원성이다 (Hall외, Virus Res. 22:173-184 (1992); Karron외, (1995b), 상기문헌.
HPIV3은 파라믹소바이러스과 (Paramyxovirus科) 모노네가바이레일즈목 (Mononegavirales目)의 파라믹소바이러스속에 속한다. 이것의 게놈은 음성-센스 RNA 15462 뉴클레오타이드 (nt) 길이의 단일가닥으로서 (Galinski외, Virology 165: 499-510, (1988); Stokes 외, Virus Res. 25:91-103 (1992)) 적어도 8개의 단백질을 코딩한다 (Collins외, 상기문헌, (1996); Galinski, 상기문헌 (1991); Spriggs 및 Collins, J. Gen. Virol. 67:2705-2719, (1986)). 이 단백질들 중 3가지는 RNA 게놈과 연관되어 뉴클레오캡시드를 형성한다; 즉, 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 및 대형 폴리머라제 서브유닛 L이 이들이다. 또 다른 3가지 단백질은 엔벨롭과 연관이 있는 것으로, 바이러스 부착 및 방출을 매개하는 것으로 알려진 매트릭스 단백질 M, 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 단백질 HN, 및 융합단백질 F가 그들이다. 나머지 2가지 단백질 HN 및 F는 PIVs의 무력화 및 보호 항원을 나타낸다 (Collins외, In Fileds Virology, 3판, 1:1205-43 (1996)). 다른 5가지 PIV 중에서도 이들 2가지 보호 항원의 커다란 서열 다양성은 이들 병원균에 대한 보호적인 면역성의 특이성 유형의 기초가 된다.
PIV의 또 다른 단백질인 C 단백질은 P 단백질 mRNA의 중복 오픈 리딩 프레인 (ORF)에 의해 코딩되며, D 단백질은 P 시스트론의 RNA 편집에 의해 생산된다 (Galinski외, Virology 186:543-50 (1992)). P mRNA는 또한 내부 ORF를 함유하는데 이것은 V라 불리우는 시스테인이 풍부한 대역을 코딩할 가능성이 있다. V ORF는 또한 다른 파라믹소바이러스에서도 발견되며 RNA 편집에 의해 종종 접근되지만 PIV의 경우는 그렇지 않다. 현재, PIV V ORF가 발현되는지는 알려져 있지 않다.
PIV의 바이러스 게놈 역시 외부유전자 (extragenic) 리더 및 트레일러 대역을 함유하며, 바이러스의 복제와 전사에 필요한 프로모터를 지닌다. 따라서, PIV 유전자 지도는 3' 리더-N-P/C/D-M-F-HN-L-트레일러로 표시된다. 전사는 3' 말단에서 개시되어 유전자 바운더리에서 발견되는 짧게 보존된 모티프에 의해 가이드되는 서열 개시-종결 메카니즘에 의해 진행된다. 각각의 유전자의 업스트림 말단은 해당 mRNA의 개시를 지시하는 유전자 개시 (GS) 시그날을 함유한다. 각각의 유전자의 다운스트림 말단은 폴리아데닐화 및 종결을 지시하는 유전자-종결 (GE) 모티프를 함유한다.
cp45 및 기타 PIV3 백신 후보들에 있어서 약독화 변이를 동정하는 것은 여러 이유로 해서 관심을 끌고 있다. 특히, 이들 및 기타 파라믹소바이러스, 그 중에서도 소아환자 입원의 7%를 차지하는 HPIV1 및 HPIV2에 맞서 사용하는데 임상적으로 허용가능한 백신을 제공하는데 있어서는, 약독화된 HPIV3 균주의 분자 바이러스학 및 병원성을 규명하고 약독화의 유전적 기초를 이해하는 것이 유용할 것이다. 이러한 목적 및 관련 목적을 달성하는데 있어서는, cp45 바이러스 중 어떤 돌연변이(들)이 ts, ca 및 att 표현형을 특정하는지, 그리고 BPIV3의 어떤 유전자(들)이 약독화된 표현형을 특정하는지를 결정하기 위해 cDNA로부터 wt 표현형을 갖는 바이러스를 생산하는 것이 필요하다.
프로토타잎 PIV3 균주, 및 JS wt HPIV3 및 cp45 균주의 완전한 뉴클레오타이드 서열이 결정되었다 (Stokes 외, 상기문헌 (1992); Stokes외, Virus Res. 30:43-52 (1993)). 이들 연구결과로부터, cp45 균주는 모균주인 JS 25 HPIV3 균주에 비할 때 적어도 17개의 뉴클레오타이드가 치환된 것으로 나타났는데 이들 중 8개는 바이러스 단백질의 변화와 관련이 있다. 그러나, 이들 동정된 변이 중 어떤 것이 소망되는 표현형, 예컨대 ts, ca 및 att 표현형을 특정하는지는 이제까지 밝혀지지 않았다. 최근, 비허용적인 온도에서의 cp45 성장이 47885 wt PIV3 균주의 L 유전자의 cDNA 클론의 공동 발현에 의해 보완되는 것으로 보고된 바 있는데 (Ray 외, J. Virol. 70:580-584 (1996), 이는 L 유전자가 cp45의 ts 표현형에 기여하는 하나 이상의 변이를 함유하는 것일 수 있음을 시사하는 것이다. 그러나, 이 연구의 결과는 47885 균주가 cp45의 JS 모균주와 동질계가 아니라는 사실과 뒤얽혀있다 (예컨대, 이들 2가지 바이러스는 뉴클레오타이드 수준에서는 4$ 상이하고, 41 아미노산 위치에서 L 단백질이 다르다 (Stokes외, 상기문헌 (1992); Virus Res. 27:96 (1993)에서 오식 보임; Virus Res. 25:91-103). 또한, 이 상보법은 cp45의 전제적인 ts 표현형에 기여하는 L 유전자 변이(들)의 상대적인 기여도를 명확하게 측정해주지 못한다.
PIV3 및 기타 RNA 바이러스에 있어서 약독화 변이의 구제 및 분석에는 목적하는 특정 바이러스에 대한 cDNA를 효과적으로 조작하기 위한 방법이 필요하다. PIV에 대한 cDNA를 동정하는 이전의 진전에도 불구하고, 이들 및 기타 음성-센스 RNA 바이러스의 게놈 RNA를 조작하는 것은 어려운 것으로 밝혀졌다. 이와 관련한 한가지 중요한 문제점은 이 바이러스들의 벗은 (naked) 게놈 RNA가 비감염성이라는 것이다.
비-세그먼트화 음성 스트랜드 RNA 바이러스의 성공적인 유전자 조작 방법은 최근에 들어서야 개발되기 시작했다 (Conzelmann, J. Gen. Virol. 77:381-89 (1996); Palese외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11354-58, (1996)). 게놈성 또는 안티게놈성 RNA와 N, P 및 L 단백질을 코딩하며 T7 RNA 폴리머레이즈 프로모터를 포함하는 별도로 형질도입된 플라스미드의 세포내 공동발현에 의해 기능적인 뉴클레오캡시드가 성공적으로 제조되었다. 세포내 cDNA 발현은 백시니아 재조합 바이러스에 의한 공동-감염에 의해 생산된 T7 폴리머레이즈에 의해 추진된다. 이러한 접근방식은 cDNA-코딩된 미니레플리콘의 전사 및 복제 요구인자를 결정하는데 처음으로 이용되었다. 이들 일반적인 방법을 적용하여, 뉴클레오캡시드 N, 인단백질 P, 및 대형 폴리머라제 서브유닛 L의 존재 하에 cDNA-코딩된 항게놈성 RNA로부터 감염성 광견병 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 홍역 바이러스 및 Sendai 바이러스를 구제하는 것이 성공된 바 있다 (Garcin 외, EMBO J. 14:6087-6094 (1995); Lawson 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:4477-81 (1995); Radecke 외, EMBO J. 14:5773-5784 (1995); Schnell 외, EMBO J. 13:4195-203 (1994); Whelan 외 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:8388-92 (1995)). 호흡기 융합 바이러스 (RSV: respiratory synctial virus) 역시 cDNA 코딩된 안티게놈으로부터 복원된 바 있지만 이것은 M2 ORF 1 전사 연장 인자를 코딩하는 부가적인 플라스미드의 형질도입을 요한다 (Collins 외, 1995).
감염성 PIV 바이러스 및 그 밖의 모노네가바이레일즈의 구제는 이들의 비-세그먼트화된 음성-스트랜드 RNA 게놈으로 인해 복잡화된다. 인플루엔자와 같은 세그먼트화된 게놈 바이러스의 게놈 리보핵단백질 복합체 (RNPs)는 일반적으로 크기가 작고 성긴 구조를 가지며 RNA로부터 생체외에서 조립가능하고 바이러스 단백질을 필요로 한다. 그러나, PIV 및 기타 모노네가바이레일즈들은 훨씬 크고 보다 밀집된 RNPs 구조를 가지며, 이는 생체외에서의 기능적 연관을 다루기 어렵게 한다. 뿐만 아니라, HPIV3 P mRNA의 코딩 포텐셜은 공동전사 "RNA 편집"에 의해 복잡해진다 (Galinsky외, Virology 186: 543-50 (1992)). 결과적인 리딩 프레임의 이동은 P의 N-말단부에 융합된 키메라로서 발현된 내부 ORFs에 접근할 수 있다. 또한, HPIV3는 상기한 바와 같이 키메릭 V 단백질을 발현시키는 대부분의 다른 파라믹소바이러스와는 다른 것으로 나타났다. HPIV3 편집으로부터의 해당 단백질 세트는 이제까지 동정되지 않았으며, HPIV3의 내부 V ORF가 수많은 번역 종결 코돈에 의해 편집 부위로부터 분리된다 (Galinski외, 1992 상기문헌). 또 다른 복잡한 인자는 BPIV3 및 HPIV3에 의한 편집으로 인해, P의 업스트림 절반이 제 2의 내부 ORF에 의해 코딩된 대역에 융합된 새로운 키메릭 단백질 D를 생산된다는 것이다 (Pelet외, EMBO J. 10:443-448 (1991); Galinski외 상기문헌 (1992)). D 단백질은 다른 파라믹소바이러스에서 대응부분을 갖지 않는다.
전기 설명에 비추어 볼 때, PIV에 기인하는 심각한 건강상의 문제, 특히, HPIV3에 기인하는 유아 및 아동의 질환을 경감시키기 위한 안전하고도 효과적인 백신을 제조하기 위한 도구 및 방법을 개발할 것이 시급하게 요청되고 있다. 놀랍게도, 본 발명은 이러한 요구사항 및 관련된 기타의 필요성을 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 감염성 PIV 내에 정의된, 소정의 구조적 및 표현형 변화를 도입하기 위한 새로운 도구 및 방법을 제공한다. 본 발명의 한가지 구체예에 따라 작동적으로 연결된 전사 프로모터, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 전사 터미네이터를 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자가 제공된다.
PIV 게놈 또는 안티게놈은 인간 또는 비인간 PIV 서열 또는 그의 재조합적으로 변형된 변형체일 수 있다. 한가지 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 소의 PIV(BPIV)로부터의 유전자 또는 유전자 세그먼트와 같은 비인간 PIV 서열과 재조합적으로 연결된 인간의 PIV 서열을 포함하는 키메릭 게놈 또느 ㄴ안티게놈을 코딩한다. 또 다른 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 비인간 PIV로부터의 서열과 인간 또는 비인간 기원의 하나 이상의 다른 PIV와의 키메라를 코딩한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 PIV (rPIV) 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 분리된 감염성 PIV 입자를 제공한다. 분리된 감염성 PIV 입자는 바이러스 또는 서브바이러스성 입자일 수 있다. 본문에서 서브바이러스성 입자란 예컨대 유전자 세그먼트, 유전자, 단백질, 또는 단백질 기능 대역 등과 같이 완전한 바이러스내에는 존재하는 구조 요소가 결핍된 모든 감염성 PIV 입자를 가리키는 것이다 (예컨대 완전한 게놈 또는 안티게놈, 뉴클레오캡시드 및 엔벨롭을 비롯한 조립된 비리온). 따라서, 본 발명의 서브바이러스성 입자의 한가지 예는 게놈 또는 안티게놈, 및 N, P, 및 L 유전자를 함유하는 감염성 뉴클레오캡시드이다. 다른 서브바이러스성 입자들은 비-필수 구조 요소 중에서도 비-필수 유전자 및/또는 그들의 산물 (예컨대 F, HN, M, 또는 C)의 부분 또는 완전한 결실 또는 치환에 의해 생산된다.
분리된 감염성 PIV 입자는 인간의 PIV인 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는 인간의 PIV3 (HPIV3)인 것이 좋다. 본 발명은 또한 소 또는 쥐의 PIV (BPIV 또는 MPIV)로부터 분리된, 감염성 입자 뿐만 아니라, 예컨대 HPIV3 및 HPIV1로부터의 서열, HPIV3 및 HPIV2 서열로부터의 서열, 또는 HPIV3 및 BPIV 서열을 함유하는 2가지 이상의 상이한 PIV 게놈으로부터의 키메릭 서열을 함유하는 입자도 제공한다.
본 발명과 관련된 측면들에서, HPIV1, HPIV2, BPIV 또는 MPIV와 같은 이질적인 PIV로부터의 한가지 이상의 서열에 연결된 HPIV3으로부터의 뉴클레오타이드 서열이 합쳐진 분리된 감염성 PIV 입자가 제공된다. 예컨대, HPIV3의 유전자 전체는 PIV1 또는 PIV2의 HN 및/또는 F 당단백질 유전자와 같은 다른 형태의 PIV로부터의 대응 유전자에 의해 치환될 수 있다. 다른 한편, 선별된 유전자 세그먼트, 예컨대 HPIV1 또는 HPIV2의 HN 또는 F의 세포질 테일, 투과막 대역 또는 엑토도메인과 같은, 선택된 유전자 세그먼트는 상응하는 HPIV3 유전자 중 대응하는 유전자 세그먼트와 치환되어 예컨대 PIV1 또는 PIV2의 엑토도메인에 융합된 PIV3의 세포질 테일 및/또는 투과막 대역을 갖는 융합단백질을 코딩하는 구축물을 생산할 수 있다. 다른 한편, 결과적인 클론 내에 신규한 면역원성 특성을 창조하기 위해 이질적인 PIV 백그라운드 내에서 하나의 PIV로부터의 유전자 또는 유전자 세그먼트가 부가되리 수 있다 (즉, 치환없이).
PIV 게놈 또는 안티게놈 내로 약독화, 감온성, 감기-적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한, 향상된 생체외 성장 또는 PIV의 면역원성 에피토프의 변화를 야기하는 것과 같이 소망되는 표현형 변형을 코딩하도록 선택된 뉴클레오타이드 삽입, 재배치, 결실 또는 치환을 도입함으로써 다른 변형을 일으킬 수 있다. 본 발명의 한가지 측면에서, 생물학적으로 유도된, 약독화된 PIV 내에서 일어나는 돌연변이들이 동정되어 완전한 길이의 PIV 클론 내로 단독으로 또는 조합되어 도입된다. 일반적으로 이러한 돌연변이들은 예컨대 ts, ca 또는 att 표현형을 갖는 PIV 변이주에 의해 나타나는 변경과 같이, 야생형 PIV에 대한 생물학적으로 유도된 변이 바이러스에 의해 나타나는 단일 아미노산 변경이다. 생물학적으로 유도된 변이주 PIV로부터의 이러한 변경은 재조합 PIV 클론내로 인코포레이션되어 결과적인 바이러스에서 소망되는 특성을 지정하게 된다. 대표적인 돌연변이에는 HPIV3 균주 JS cp45에서 약독화된 표현형을 특정하는 아미노산 변화가 포함된다. 이러한 예시적인 변이들 중에서도, JS 야생형 PIV 균주의 Tyr942, Leu992및/또는 Thr1558에서 일어나는 아미노산 치환과 같은, ts, ca 또는 att 표현형을 특정하는 PIV 폴리머레이즈 유전자 L내에서 발생하는 변이를 들 수 있다. 보다 구체적인 측면에서, 약독화된 PIV 재조합체가 설명된다. 여기서 Tyr942는 His에 의해, Leu992는 Phe에 의해/ 또는 Thr1558은 Ile에 의해 치환된다.
또한, 본 발명에 따라, 약독화, 온도감응성, 감기-적응성, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 한정 등을 포함하는 소망되는 특성을 나타낼 수 있도록 감염성 클론의 게놈 또는 안티게놈 내로 선택된 조합으로 도입된 복수의 표현형-특이적인 돌연변이를 갖는 재조합 PIV도 제공된다. 예컨대, HPIV3 JS cp45로부터의 2가지 ts 변이와 같이, 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이주로부터 채택된 2개 이상의 별개의 돌연변이를 포함하는 PIV 클론이 제공된다. 따라서 동정된 병변의 "메뉴"로부터 돌연변이를 선택하여 이러한 돌연변이를 여러가지로 조합하여 도입함으로써 백신 바이러스의 약독화, 면역원성 및 안정성의 선택된 수준으로 보정함으로써 다중적으로 약독화된 바이러스가 얻어지는 것이다.
부가적인 구체예에서, 본 발명은 예컨대 ts, ca 또는 att 돌연변이와 같이 생물학적으로 유도된 PIV로부터 채택된 한가지 이상의 변이를 보강하기 위해, 같거나 다른 유전자와 관련된 부가적인 유형의 돌연변이를 제공한다. 이 맥락에서 돌연변이의 표적 유전자에는 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 대형 폴리머레이즈 서브유닛 L, 매트릭스 단백질 M, 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 단백질 HN, 융합 단백질 F 및 C, D 및 V ORF 산물이 포함된다. 바람직한 측면에서, 생물학적으로 유도된 PIV로부터 채택된 약독 돌연변이는 예컨대 HPIV3 및 HPIV1의 두가지 모두, 또는 PIV와 BPIV 바이러스의 두가지 모두로부터의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 PIV 재조합체와 같은 키메릭 PIV 재조합체에 인코포레이션된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 예컨대 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 바이러스성 또는 서브바이러스성 입자와 같은 감염성 PIV 입자를 생산하기 위한 방법을 제공한다 (1997년 5월 23일자 미국잠정특허출원 60/047575호, 본 발명에 참조됨). 이 방법에 따라 감염성 PIV 입자를 제조하기 위해, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 벡터를 PIV의 N, P, 및 L 단백질을 코딩하는 한가지 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 세포계 또는 무세포계에서 공동발현시킴으로써, 감염성 PIV 입자를 제조한다.
PIV 게놈 또는 안티게놈과 N, P, 및 L 단백질은 단일 발현 벡터, 또는 개별적인 발현 벡터들에 의해 공동발현될 수 있다. 또 다른 구체예에서, N, P 및 L 단백질은 개별적인 발현 벡터들 상에 각각 코딩된다.
전술한 방법들 중, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 인간, 소 또는 쥐의 PIV의 게놈 또는 안티게놈 서열에 대응할 수 있다. 다른 한편, PIV 코딩 폴리뉴클레오타이드는 인간의 PIV 게놈 또는 안티게놈 서열의 키메라 및 하나 이상의 인간의 PIV 게놈 또는 안티게놈 서열의 키메라일 수 있다. 감염성 PIV를 제조하는 부가적인 방법에서, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 예컨대 인간의 PIV1 또는 인간의 PIV2와 같은 인간의 PIV의 한가지 이상의 관련된 형태로부터의 서열에 결합된 HPIV3으로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 인간의 PIV3의 개별적인 유전자들은 PIV1 또는 PIV2의 HN 및 F 당단백질 유전자와 같은 이종의 PIV로부터의 대응 유전자에 의해 치환됨으로 해서 키메릭 PIV를 코딩하는 변형된 게놈 또는 안티게놈을 생산할 수 있다. 다른 한편, HPIV1 또는 HPIV2의 HN 또는 F의 세포질 테일, 막투과 대역 또는 엑토도메인과 같은 선택된 이질적 유전자 세그먼트는 예컨대 HPIV3의 HN 또는 F와 같은 상이한 PIV 유형 또는 상이한 유전자 중의 대응 유전자 세그먼트를 치환하여 예컨대 PIV1 또는 PIV2의 엑토도메인에 융합된 PIV3의 세포질 테일 및/또는 막투과 대역을 갖는 융합단백질과 같은 키메릭 단백질 코딩하는 구축물을 생산할 수 잇다.
감염성 PIV을 제조하기 위한 또 다른 부가적인 방법에서는 PIV 게놈 또는 안티게놈을 변형시켜, 인간 및 소의 두가지 모두의 PIV로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와 같은 한가지 이상의 비-인간 PIV 서열 및 인간의 PIV 게놈 또는 안티게놈 서열의 키메라를 생산할 수 있다.
감염성 PIV를 제조하기 위한 또 다른 방법에서는, PIV의 면역원성 에피토프의 변화, 약독화, 온도-감응성, 감기-적응, 작은 플라크 크기, 또는 숙주 범위 한정 등을 일으키는 것과 같은 소망되는 표현형 변경을 코딩하도록 선택된 뉴클레오타이드 삽입, 재배열, 결실 또는 치환에 의해 PIV 게놈 또는 안티게놈을 변형시킨다. 다른 한편, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 목적 숙주에서 보호성 면역 응답을 이끌어낼 수 있는 상이한 미생물 병원균 (예컨대 바이러스, 세균 또는 진균)의 시토카인, T-헬퍼 에피토프, 제한 효소 부위 마커, 또는 단백질과 같은 비-PIV 분자를 코딩하도록, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 변형시킬 수 있다. 한가지 구체예에서, PIV 게놈 또는 안티게놈을, 인간의 RSV 또는 홍역 바이러스로부터의 단백질을 코딩하도록 변형시킨다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 함유하는 발현 벡터, 및 PIV의 N, P, 및 L 단백질을 코딩하는 한가지 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 벡터를 인코포레이션하는 세포계 또는 무세포계 발현계 (예컨대 무세포 라이세이트)가 제공된다. 발현시, 게놈 또는 안티게놈 및 N, P, 및 L 단백질은 서로 결합하여 바이러스 또는 서브바이러스성 입자와 가은 감염성 PIV 입자를 생산한다. PIV 게놈 또는 안티게놈 및 PIV의 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 코딩하는 분리된폴리뉴클레오타이드 분자는 단일 벡터에 의해 발현될 수 있으며, 또는 게놈 및 하나 이상의 N, P 및 L 단백질은 2가지 이상의 분리된 벡터내로 인코포레이션될 수 있다.
본 출원은 1997년 5월 23일자 미국잠정출원 60/047,575호 및 1997년 9월 19일자 미국잠정출원 60/059,385호의 일부계속출원으로서 35조에 규정에 따라 상기 출원들의 수익을 주장한다. 상기 출원들은 본 발명에 통합되었다.
도 1은 HPIV3 게놈 RNA의 완전한 복제물을 코딩하는 플라스미드 p218(131)의 구축방법을 도시한 도면이다. p218 (A*A'CC'D*E) (좌상측)의 다이아그램은 HPIV 게놈의 뉴클레오타이드 1에 인접한 델타 리보자임 및 T7 터미네이터의 위치를 도시한다. p(E*FF'GHIJKL*)의 우상측 다이아그램은 7가지 시퀀싱 마커 (꽃표), (다음 도 2 설명 참조), 및 HPIV3의 뉴클레오타이드 15462에 인접한 T7 프로모터를 도시한다. 완전한 길이의 게놈 cDNA를 구축하는데 사용되는 15가지 중복 클론들은 2개의 플라스미드의 외부에 문자로 표시되어 있다. 아래쪽에 도시된 HPIV3의 완전한 음성-센스 게놈 RNA를 코딩하는 p218(131)을 클로닝하기 위해 독특한 제한효소 부위 NgoMI 및 XHoI를 사용하였다.
도 2는 HPIV3의 HN(1) 및 L(2) 유전자의 cDNA 코딩된 게놈 RNA 중의 마커를 설명한 도면이다. 서열들은 음성 센스이고, 변이부분은 박스안에 표시하였다.
1) 7903에서 비-코딩 nt 치환에 의해 JS wt로부터 Hga I 부위가 제거된다. 7913 및 7915에서의 JS cDNA 중의 뉴클레오타이드 치환에 의해 Sca I 부위가 생성되고 아미노산 370이 프롤린에서 쓰레오닌으로 변경되며, mAb 170/7 및 423/6에 의해 인식된 항체 에피토프가 절제된다. 또한, HN 유전자는 nt7593에서 부가적인 포인트 변이를 함유하는 것으로 밝혀졌는데 이는 이전까지는 인식된 바 없었다. 이로 인해 HN 단백질의 아미노산 위치 263에서 쓰레오닌이 이소류신으로 변경된다.
2) 플라스미드 구축 또는 조립시 발생하는 JS cDNA의 L 유전자에서의 3가지 부수적인 비-코딩 돌연변이를 박스에 표시하였다.
도 3은 PIV3-CAT cDNA (위, 원형 플라스미드로 그려짐) 및 코딩된 미니게놈 RNA (아래, 음성-센스 RNA, 3'에서 5')의 다이아그램이다.
플라스미드: T7 프로모터는 전사 방향을 가리키는 검은색 화살표로 표시되었다. 델타 리보자임, T7 전사 터미네이터, 삽입된 백시니아 바이러스 전사 터미네이터 (T7CT 및 T5AT), 제한효소 부위, 및 코딩된 미니게놈의 여러가지 대역에 해당하는 코딩 서열의 위치를 표시하였다.
미니게놈 RNA: 2개의 비바이러스성 G 잔기를 연장시키는데 기여하는 T7 RNA 폴리머레이즈에 대한 프로모터에 의해 미니게놈의 5' (오른손쪽) 말단이 정의된다. 이들은 길이를 계산하는데는 산입되지 않았다. 3' 말단은 리보자임에 의해 정의되며 이질적인 뉴클레오타이드는 전혀 없다. PIV3-특이적인 대역은 오픈 박스로서 나타내었다. CAT ORF는 빗금표시하고 번역 개시 (UAC) 및 종결 (AUU) 코돈의 음성-센스 상보서열을 나타냈다. 뉴클레오타이드 위치는 쇼테스트, 898-뉴클레오타이드 미니게놈에 따라 표시하였다. 특정 대역의 뉴클레오타이드 길이를 괄호안에 나타내었다. 위치 90 내지 124의 서열 (3'부터 5', 음성-센스)을 바닥 쪽에 표시하였다; PIV3-특이적인 서열에 밑줄표시하고, 백시니아 바이러스 전사 터미네이터의 보체는 윗줄표시하였으며, XvaI 부위의 보체는 이탤릭체로, CAT ORF에 대한 번역 개시 코돈의 보체는 굵은 글씨체로 나타내었다. PIV3-CAT 0 내지 +6을 초래한 0 내지 6 G 잔기가 삽입된 부분을 표시하였다. 약어: GS, 전사적 유전자-개시 모티프; GE, 전사적 유전자-말단 종결/폴리아데닐화 모티프; NT, 번역되지 않은 유전자 서열.
도 4는 미니게놈 PIV3-CAT 0 내지 +6에 의한 CAT 효소의 발현을 도시한다. 표시된 PIV-3 CAT 미니게놈 및 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 플라스미드로 세포들을 형질도입시키고 이와 동시에 T7 RNA 폴리머레이즈를 발현시키는 백시니아 바이러스 재조합 vTF7-3에 의해 감염시켰다. 용균물을 48시간 동안 포스트-감염시키고, 3000개 세포를 나타내는 샘플을 CAT 활성에 대해 분석하였다. 활성은 6의 배수인 +2 미니게놈에 대해, 100으로서 표시한다. L 플라스미드가 생략된 샘플은 이러한 조건 하에서 검색가능한 CAT 활성을 갖지 않았다.
도 5A 및 5B는 PIV3-3CAT 미니게놈 0 내지 6+에 의한 미니-안티게놈 RNA의 합성을 도시한다. 세포들을 형질도입시키고, 대조군 N 플라스미드 (레인 1) 또는 L 플라스미드 (레인 2)가 생략된 것을 제외하고 도 4에 설명된 바와 같이 감염시켰다. 각각의 경우 형질도입된 PIV3-CAT 미니게놈 플라스미드를 표시하였다. 세포 용해물을 48시간 후-형질도입하여 제조하였다: 1 분주액을 마이크로코커스 뉴클리아제로 처리하고 (처리군), 두번째 것은 모방-처리하였다 (미처리군). 이어서 RNA 정제에 의해 프로세싱하였다. RNAs를 음성-센스 CAT 리보프로브로 Nothern 블롯 하이브리다이제이션에 의해 분석하였다. 뉴클리레이즈 처리를 위한 대조군 및 마커로서 RSV-CAT C2 미니게놈 (Grosfeld외, J. Virol. 69:5677-5686 (1995), 본 발명에 참조됨)을 RSV N, P 및 L 단백질에 의해 상보시키고 나란히 프로세싱하였다 (레인 10). 하이브리다이제이션된 블롯의 오토다이아그램을 도 5A에 나타내었다. 도 5B는 +2 미니게놈에 상대적인 하이브리다이제이션양을 처리된 샘플과 미처리 샘플에 대해 각각 산출한 포스포이미지 분석 결과를 보여준다.
도 6A 및 6B는 PIV-CAT 미니게놈 0 내지 +6에 의한 폴리아데닐화된 mRNA의 합성을 도시한다. 도 5A및 5B에 도시된 바와 같이 동 실험으로부터의 세포 분주액을 이용하여, 48시간 후-형질도입시에 총 세포내 RNA를 수확하고 올리고(dT) 크로마토그래피에 의해 결합된 분획 및 미결합 분획으로 분획화시키고, 이를 음성-센스 CAT 리보프로브를 이용하여 Nothern 블롯 하이브리다이제이션에 의해 분석하였다. 도 6A는 하이브리다이제이션된 블롯의 오토라디오그램을 나타낸다. 도 6B는 +2 미니게놈의 결합된 RNA 분획에 대해 상대적으로 하이브리다이제이션 양이 정상화된 포스포이미지 분석 결과를 나타내며, 이를 결합 분획과 미결합 분획에 대해 별도로 산출하였다.
도 7A 및 7B는 PIV-CAT 미니게놈 0 내지 +6을 코딩하는 플라스미드에 대한 세포내 미니게놈의 축적을 도시한다. 이것은 도 5A 및 5B에 도시된 실험의 연속실험이다. 따라서, 미니게놈과 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질도입되어 vTF7-3으로 감염된 세포들을 48시간 후-형질도입 수확하고 세포 용해물을 제조하였다. 용해물의 1 분주액을 마이크로코커스 뉴클리레이드로 처리하고 (처리군) 다른 하나는 모방-처리하였다 (미처리군). 이어서, RNA 정제에 의해 프로세싱하였다. 도 5A에서는 리보프로브가 음성-센스였던 반면, 이 실험에서는 양성-센스 CAT 리보프로브를 이용하여 RNA를 Northern 블롯 하이브리다이제이션에 의해 분석하였다. 도 7A는 하이브리다이제이션된 블롯의 오토라디오그램을 도시한다. 도 7B는 +2 미니게놈에 상대적으로 하이브리다이제이션 양을 처리 및 미처리 샘플에 대해 개별적으로 산출한 포스포이미지 분석결과를 도시한다.
도 8-10은 p3/7(131)2G의 구축을 도시한 것이다. p3/7(131)2G는 완전한 양성-센스 HPIV3 안티게놈을 코딩하며 안티게놈의 뉴클레오타이드 1과 T7 프로모터 사이에 2개의 G 잔기를 함유한다. 음성-센스 게놈을 코딩하는 cDNA 218(131)의 왼쪽 절반과 오른쪽 절반을 별도로 변형시켜 구축하였다. 동일한 계획에 따라, 두번째 cDNA, p3/7(131)을 구축하였으며 이것은 2개의 G 잔기가 생략되니 것을 제외하고 p3/7(131)2G와 동일하다.
도 8은 p218(A*A'CC'D*E)의 T7 전사 터미네이터 및 리보자임을 2개의 G 잔기를 포함하는 T7 프로모터로 치환함으로써 p(Left+2G)를 구축하는 방법을 도시한 것이다. T7 프로모터를 도입한 좌측 PCR 프라이머를 이용하여 HPIV3 게놈 ("PIV3seq"로 표시된 검은 사각형)의 좌측 1224 뉴클레오타이드를 증폭시키는 PCR에서 p218(A*A'CC'D*E)을 템플레이트로서 사용하였다. 이 PCR 단편을 p218(A*A'CC'D*E)의 MluI-PmlI 윈도우내로 클로닝시켜 p(Left+2G)를 얻었다.
도 9는 양성-센스(안티게놈) 스트랜드 내에 PIV3 뉴클레오타이드 15462에 인접하여 위치한 T7 터키메이터와 리보자임으로 p(E*FF'GHIHKL*)의 프로모터를 치환함으로써 p(Right+)를 구축하는 것을 도시한다. p(E*FF'GHIHKL*)을 PCR에서 템플레이트로서, 델타 리보자임 (자연발생적인 RsrII 위치)의 일부를 부가한 돌연변이 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 HPIV3 게놈 ("PIV3 seq"로 표시된 검은 사각형)의 우측 649 뉴클레오타이드를 증폭시켰다. 이 PCR 산물을 p3/7의 RsrII-BssHII 윈도우내로 클로닝시켜 pPIV3-3/7을 생산하고, T7 터미네이터에 의해 플랭크된 완전한 리보자임을 재구축하였다. pPIV3-3/7의 SwaI-NgoMI 단편을 p(E*FF'GHIHKL*)의 SwaI-NgoMI 윈도우내로 클로닝시켜, p(Right+)를 얻었다. 7개의 서열 마커의 위치를 꽃표(*)로 표시하였다.
도 10은 p3/7(131)2G의 구축을 도시한다. p(Right+)의 NgoMI-XhoI 단편을 p(Left+2G)의 NgoMI-XhoI 윈도우 내로 클로닝시켜 p3/7(131)2G를 얻었다. HPIV3 유전자의 위치를 표시하였다 (not to scale). 서열 마커의 위치를 꽃표로 표시하였다.
도 11은 음성 센스 재조합 PIV3의 서열 확인도이다. 7903, 7913, 및 7915에서의 돌연변이를 포함하는 1379 bp 단편(뉴클레오타이드 7334-8713)을 감염된 세포로부터의 RNA의 RT-PCR에 의해 제조한 다음 사이클-시퀀싱에 의해 분석하였다. JS와 구별되는 재조합 PIV의 돌연변이를 화살표로 표시하였다. nt7897 내지 7922에 걸친 완전한 서열을 각각의 겔 옆의 여백에 나타내고, 3개의 상이한 뉴클레오타이드는 굵게 표시하였다.
도 12는 L 단백질 서열 중 942, 992, 및 1558 위치에서 아미노산 치환된 PIV3 L cDNA를 함유하는 플라스미드 pTM(L)942/992/1558의 지도를 도시한다. 각각의 코딩 변경의 상대적인 위치를 aa 위치와 함께 표시하고, 마커로서 고의로 절제시킨 자연발생적인 제한효소 위치를 함께 표시하였다. 클로닝에 사용된 제한효소 위치 (SphI, PinAI, BamHI 및 NheI)를 표시하였다. 화살표는 L 단백질 코딩 서열의 방향을 나타내며 아미노산 위치에 따라 번호를 매겼다.
도 13은 본 발명 범위에서 대표적인 변이를 나타내는 재조합 PIV3 바이러스의 대표적인 도면이다.
도 14는 PIV3 HN 및 F ORF가 PIV1에 의해 치환된 키메릭 PIV3-PIV1 안티게놈을 코딩하는 cDNA의 구축을 도시한 도면이다. 먼저 (좌하측부터 시작) 완전한 길이의 PIV3 cDNA 클론 p3/7(131)2G (패널 A)로부터 PIV3 F 및 HN 유전자를 서브클로닝시켜 (BspE-II-Xho I 및 Ecor I-Spe I 단편으로서) 각각 pLit.PIV3.F3a 및 pLit.PIV3.HN4를 제조하였다 (패널 B). PCR 돌연변이 (패널 C)를 수행하여 PIV3 F 및 HN 유전자의 완전한 코딩 대역을 삭제하고 새로운 제한효소 부위 (박스 표시)를 도입하였다. PIV1 F 및 HN cDNA를 RT-PCR에 의해 감염된- 세포 RNA로부터 제조하고 pLITMUS28 내로 클로닝시켰다 (패널 D). 이 클론들, pLIt.1Fwt 및 pLit.1HNwt을 이들의 개시코돈 및 종결코돈에서 PIV1 F 및 HN 유전자의 변형을 위해 템플레이트로서 사용하여 PIV3 결실에 이들이 도입된 것과 적합성을 갖는 새로운 제한효소 부위를 도입하였다 (패널 E). 키메릭 F 및 HN 유전자를 함께 조립하여 pSE.PIV3-1.hc를 제조하였다 (패널 G). BspE I-Sph I 단편을 치환함으로써 완전한 길이의 PIV3 클론 p3/7(131)2G 내로 F 및 HN 키메릭 세그먼트를 도입하여 pFLC.2G+.hc를 제조하였다 (패널 H). 유전자들 사이의 작은 박스는 유전자 말단, 유전자내부, 및 유전자 개시 대역을 나타내며, 선은 비-코딩 대역을 나타낸다. 빗금친 부분은 PIV1으로부터, 오픈 박스는 PIV3으로부터 유리한다. 검은색 화살표는 T7 프로모터를, 검은색 박스는 간염 델타 바이러스 (HDV) 리보자임을 가리킨다.
도 15A는 키메릭 rPIV3-1 (중간)의 키메릭 HN 및 F 유전자와 함께 rPIV3/JS (위; rJS 및 JS wt rPIV3이라고도 칭함) 및 PIV1/Wash64 (아래)의 다이아그램이다. PIV3으로부터 PIV1까지의 서열 이동을 함유하는 4개의 접합 대역을 박스로 표시하고 I 내지 IV료 표시하였다. 유전자들 사이의 각각의 작은 박스는 유전자 말단, 유전자 내부, 및 유전자 개시 대역을 나타내며 선은 비-코딩 대역을 나타낸다. PIV3 M 및 L 유전자 (위쪽 프라이머쌍 A)에 특이적이거나, 또는 PIV1 M 및 HN 유전자 (아래쪽 프라이머쌍 B)에 특이적인 RT-PCR 프라이머를 사용하였다. 도 14B는 화살표로 나타내었다.
도 15B는 도 14A에 설명된 PIV3- 또는 PIV1-특이적인 프라이머쌍 및 템플레이트로서 비리온 RNA (vRNA)를 이용하여 제조된 RT-PCR 산물을 평가한 도면이다. 표시된 바와 같이, 각각의 템플레이트에서 역전사 단계를 중복 생략하여 PCR 산물이 RNA로부터 유래됨을 확인하였다. rPIV3-1의 경우, PIV3-특이적인 프라이머쌍 A는 예상됐던 4.6 kb 산물을 얻게한 반면, rPIV3-1에 존재하지 않는 PIV-1 서열에 특이적인, 프라이머쌍 B는 생성물을 형성하지 않았다. rPIV3/JS (rPIV3으로 표시) 또는 PIV1/Wash64 (PIV1으로 표시)를 이용한 양성 대조군을 함께 나타내었다.
도 16은 도 14B에 도시된 rPIV3-1의 RT-PCR 산물 중 PIV3-PIV1 접합 서열을 나타낸다. 4개의 접합 대역 (대역 I-IV) 각각의 서열을 제시하였으며, RT-PCR 산물로부터 나랄히 시퀀싱된 상응하는 rPIV3/JS (위쪽의 선)과 PIV1/Wash64 (아래쪽 선)에 해당하는 대역과 정렬시켰다. 수직 막대는 서열 동일성을 가리키며, 박스표시한 대역은 도입된 돌연변이 및 제한효소 부위를 가리킨다. 키메릭 F 유전자 중의 Gln에서 Glu로의 코돈 변화를 빅금친 박스 안에 나타내었다. 개시 코돈과 종결 코돈에는 밑줄을 그었다.
도 16은 rPIV3 (좌측) 또는 PIV1 (우측)과 비교한 rPIV3-1의 RT-PCR 산물의 대역 III (좌측) 및 IV(우측)의 시퀀싱 겔을 도시한다. 개시 코돈과 종결 코돈을 박스로 표시하고, 제한효소 위치는 화살표로 표시하였다.
도 18은 조직 배양액 중 모친 및 키메릭 PIVs의 멀티사이클 성장을 도시한 것이다. LLC-MK2 세포 단층에 바이러스를 0.01 MOI로 접종하고, 바이러스-감염된 세포를 32℃에서 트립신 존재 하에 인큐베이션시켰다. 조직 배양 상등액을 24시간 간격으로 수확, 냉동하고 혈액흡착을 이용한 동 TCID50분석에 의해 바이러스-감염된 배양체를 동정하였다. 각각의 점(포인트)은 세가지 별도 배양체의 평균 적정치를 나타낸다. S.E. 표시함. 점선으로 표시한 수평선은 바이러스 검색 하한치를 가리킨다.
도 19는 cp45의 세가지 L 유전자 돌연변이를 키메릭 바이러스 rPIV3-1의 안티게놈 cDNA 클론인 pFLC.2G+hc내에 도입하는 것을 도시한다. pTM(L)942/992/1558 (A)는 cp45에서 발견된 3가지 돌연변이를 갖는 L 유전자의 플라스미드 클론이다. PIV3 L 단백질 중 아미노산 위치 942에서의 돌연변이는 tyr(wt)를 his(cp45)로 치환한 것이고 그 옆의 Eae I 위치는 이 위치를 표시하기 위해 개열시켰다. 마찬가지로, 992 돌연변이는 leu를 phe로 변경한 것이고 (Bsr I 위치를 개열) 1558 돌연변이는 thr을 ile로 변경한 것으로 Ava II 위치가 개열된 것이다. pTM(L)942/992/11558에 존재하는 2.9kb SphI-NheI 단편을, rPIV3-1의 완전한 길이의 cDNA 클론을 갖는 플라스미드인 pFLC.2G+hc(B) 내로 도입하여 pFLC+hc.cp45L(C)를 제조하였다. (B) 및 (C)의 구축에 있어서, 검은색 박스는 간염 D 바이러스 리보자임의 위치 및 T7 터미네이터의 위치를 나타내고, 빗금친 부분은 PIV1 HN 및 F ORFs를 나타내며, 오픈 박스는 PIV3으로부터 유도된 서열들을 가리킨다. pFLC.2G+.hc.cp45L을 형질도입에 이용하여 rPIV3-1.cp45L로 표시된 약독화 키메릭 재조합 바이러스를 생산하였다.
cDNA로부터 rPIV가 회수되었는지를 확인하기 위해서, 7개 삽입된 마커 돌연변이을 둘러싼 4개 프라이머쌍을 이용하는 RT-PCR방법으로 야생형 JS 균주 HPIV3와 함께 그것을 분석하였다. 얻어진 각각의 PCR산물은 RT을 포함여부에 의존적이었으며,이러한 사실은 각각이 오염 cDNA로부터가 아니라 RNA로부터 유래되었음을 나타낸다. 4개 PCR산물의 순환-서열분석(cycle-sequencing)에 의해, rPIV의 서열이 각각의 7개 마커를 포함함을 확인하였으며, 3가지 마커를 나타내는 서열분석 자료가 도 11에 나타나 있다. 7903, 7913 및 7915 nt를 포함하는 HN 유전자에서 rPIV와 JS wt간의 서열차이가 분명하다. 7593, 10355, 11333, 및 15248 nt위치에서 다른 4개의 마커에 대해서도 유사한 서열분석 실험을 행하였으며, rPIV는 각 돌연변이를 가지고 있었다.
이러한 결과는 (-)센스 게놈 RNA를 코딩하는 cDNA로부터 감염성 rPIV의 회수가 성공적이었음을 나타낸다. 이것은 단편화되지 않은 (-) cDNA사슬 바이러스의 회수에 대한 많은 공지된 보고서와는 다르며, 이러한 보고서에서는 바이러스 회수를 위해 사용된 cDNA는 (+)센스 안티게놈 RNA를 코딩하기 위해 고안되었다(Baron and barrett, 상기문헌, 1997; Collin et al., 상기문헌, 1995; Conzelmann, 상기문헌, 1996; Garcin et al., 상기문헌, 1995; Lawson et al., 상기문헌, 1995; Radcke et al., 상기문헌, 1995; Whelan et al., 상기문헌, 1995). 게놈RNA를 코딩하는 cDNA로부터 감염성 바이러스의 회수는 Sendai 바이러스에 대해서만 이전에 보고되었고 회수율은 안티게놈 RNA를 코딩하는 cDNA에 대한 것보다 훨씬 낮았다(Kato et al., 1996). 대부분의 다른 연구에서, 바이러스의 회수는 게놈cDNA가 아니라 안티게놈 cDNA로 이루어졌다(Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995). 이러한 예상치 못한 결과를 설명하는 많은 잠재적인 문제점이 있는데, 보조 플라스미드에 의해서 생산된 mRNA와 cDNA가 코딩하는 게놈RNA가 접합할 수 있어 불활성 하이브리드를 생성할 수 있다(Conzelmann, 상기문헌, 1996; Lawson et al., 상기문헌, 1995). 또한, T7 RNA폴리머라제는 게놈RNA의 유전자 접합부(junction)에서 우선적으로 종결되며, 이는 아마도 GE 신호의 올리고 U트랙이 T7 RNA폴리머라제에 의한 전사종료를 위한 자연신호와 유사하기 때문일 것이다(Whelan et al., 상기문헌, 1995).
실시예 VII
(+)-센스 안티게놈 RNA을 코딩하는 cDNA로부터 재조합 바이러스의 회수
상술한 바와 같이, 재조합 PIV를 생성하는 (+)센스 안티게놈을 코딩하기 위해서 p3/7(131) 및 p3/7(131)2G를 제조하였다. 플라스미드 p3/7(131)2G는 p3/7(131)와 동일하나, T7프로모터와 안티게놈의 첫번째 뉴클레오타이드사이에 두개의 G잔기를 첨가한 것이 다르다. T7프로모터와 첫번째 HIV3 뉴클레오타이드 p3/7(131)G2 사이에 두개의 G잔기 첨가는 두개의 첨가된 G잔기의 존재로 실질적으로 미니레플리콘(minireplicon)의 복제가 증가됨을 설명하는 이전의 실시예에 기초한 것이다.
N, P 및 L 보조 플라스미드와 함께, 두 안티게놈 cDNA {p3/7(131) 및 p3/7(131)2G}로서 별도로 세포를 형질감염시키고, p218(131)에 대해 이전에 기술한 동일한 절차로 MVA-7 재조합 바이러스를 동시에 감염시켰다. 각 안티게놈 cDNA로부터 감염성 바이러스가 회수되고 아마도 mAbs423/6 및 170/7과 반응할 수 있는 그의 능력에 기초하여 cDNA유도가 확인되었다.
게놈 cDNAp218(131)에 대하여 각각의 안티게놈 cDNA에 대해 바이러스 회수율을 측정하였다. 두 cDNA로부터의 바이러스 회수율을 비교하기 위해서, (+)센스 안티게놈 cDNA p3/7(131)2G(SEQ ID NO: 15)를 사용하여 12회 형질감염과 병행하여, (-)센스 게놈 cDNA p218(131)(SEQ ID NO: 1)를 사용하여 12회 형질전환을 수행하였다. 각 웰로부터 1ml의 형질감염 수확물을 LLC-MK2 세포에 떨어뜨리고 나머지 2ml를 신선한 LLC-MK2세포로 계대배양하였다(계대배양 1). 5일째에, 계대배양 1을 수확하고 상술한 바와 같이 농도를 측정하였다. 재조합 바이러스를 p3/7(131)2로 형질감염된 12/12웰과 p218(131)로 감염된 4/12웰로부터 회수하였다. (+)센스 안티게놈으로부터 계대배양한 바이러스의 배양물에 존재하는 바이러스의 평균 농도는 105.0이며, 이는 (-)센스 게놈에 대한 농도(104.1)보다 거의 10배가 높았다. 그러나, 한번의 추가 증폭으로 농도가 동일하게 되었다.
(1) 재조합 바이러스를 생산함에 있어서 게놈 cDNA 또는 안티게놈 cDNA중 어느 것이 더 효율적인지를 결정하기 위해서, (2) 두개의 추가 5' G잔기가 재조합 바이러스의 수율에 미치는 영향을 결정하기 위해서, HPIV3 RNA 게놈 및 안티게놈를 코딩하는 3가지 완전한 길이의 플라스미드로부터 재조합 바이러스의 회수율을 조사하였다(표 2). 불행하게도, 나머지 MVA-T7이 LLC-MK2 단층배양에서 rJS의 플락 형성을 방해하기 때문에, 플락 농도측정에 의해서 혈질감염 수확물에 대해서 직접적으로 농도를 측정할 수 없다. 따라서, 먼저, 우리는 다수의 독립적인 형질감염으로부터 rJS의 회수율을 비교하였으며, 다른 실험에서 알 수 있는 바와 같이, rJS는 p218(131)로 형질감염시킨 배양물로부터의 회수보다 p3/7(131)로 형질감염시킨 배양물로부터 더 빈번히 회수되었다. p218(131)로 감염된 것을 포함하는 각각의 형질전환 수확물 다른 실험에서 rJS를 생산하기 때문에, 재조합 바이러스의 상대적인 생산율을 비교하기 위해서 이러한 분석방법을 사용할 수 없다. 따라서, 우리는 형질감염 수확물의 1 대 계대배양을 콩해 바이러스의 양을 정량화함으로써 형질감염 수확물에 존재하는 바이러스의 상대적인 양을 측정하였다(표 2). 동일한 바이러스(rJS)를 생산하기 위해서 각 플라스미드를 고안하였기 때문에, 계대배양된 바이러스의 농도차이는 형질감염 수확물에 존재하는 바이러스 농도의 차이를 반영하는 것으로 간주된다. 상기 실험에서, 5' 말단 G잔기를 갖는 구조물이 rJS를 생산하는데 가장 효과적이었다. 이것은 첨가된 두 잔기가 회수율을 증가시킴을 나타내나, 이러한 약간의 효율증가의 기작은 모른다. 이러한 발견은 HPIV3 cDNA로 돌연변이를 도입하기 위해서 고안된 미래의 실험의 기질로서 p3/7(131)을 사용할 수 있다. 이는 작지만 측정할 수 있는 장점을 제공한다. 5' 말단에 3개의 G잔기를 포함하는 안티게놈 cDNA로부터 VSV가 회수되었을 지라도, 이 구조물로부터 바이러스의 회수율을 여분의 잔기가 없는 동일한 구조물로부터 회수와 구별할 수 없다(Whelan, et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 92:3238-8392 (1995). 본문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨. 센다이(Sendai) 바이러스와 홍역(measles) 바이러스로 행한 실험과 대조적으로, 안티게놈의 5' 말단에서 여분의 바이러스 G잔기는 재조합 바이러스의 회수에 유해하지 않으며, 사실상 유리한 것 같다(Garcin et al., 상기문헌. 1995; Radecke et al., 상기문헌, 1995; Kato et al., 1996).
상술한 실험과 유사한 실험에서, p3/7(131)(SEQ ID NO: 14)로부터 바이러스 회수율을 p3/7(131)2G(SEQ ID NO: 15) 및 p128(131) (SEQ ID NO: 1)의 바이러스 회수율과 비교하였다. p3/7(131)으로부터 회수는 p217 (131)의 회수율과 비슷해다. 회수는 여분의 G들을 포함하는 안티게놈 cDNA 둘다 일정하고 효율적으로 회수하였다(표 2).
실시예 VII
허용온도 및 제한 온도에서 rPIV의 플락형성율
상술한 바와 같으나 다음과 같은 변형으로, LLC-MK2 단층 배양물에서 두 p128(131) 및 p3/7(131)2G로부터 유래된 rPIV와 대조 바이러스의 생체외 복제의 온도민감성 정도를 32℃, 37℃, 39℃ 및 40℃에서 결정하였다(Hall et al., Virus Res. 22: 173-184, 1992). 본 문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨. 24-웰 플레이트상의 LLC-MK2 단층에서 10배 희석 시리즈로 바이러스를 배야하였다. 그런후, 2mM 글루타민 및 0.8%의 메틸셀룰로스가 보충된 L-15 1ml를 상기 배양물위에 중층하고, 상기 플레이트를 5일간 지시 온도에서 배양하였다. 메틸셀룰로스 중층을 제거하고 1시간동안 4℃에서 80%의 메탄올로 상기 단층을 고정하였다. 이전에 기술한(Murphy et al., Vaccine 8: 497-502 (1990), 본문헌은 본명세서에서 참고문헌으로 병합됨) 쥐의 항체에 대해 특이적인 면역퍼옥시다제 염색법을 사용하여, 1:500희석으로 아시테스 용액으로서 HPIV3-특이적 안티-HN 쥐의 mAbs 101/1 및 66/4의 혼합물로 단층에 존재하는 바이러스 플락을 세었다.
(+) 또는 (-) 센스 cDNA 둘중 어느 하나로부터 유래된 재조합 바이러스가 JS wt바이러스와 유사한 표현형을 가지는 지를 결정하기 위해서, 상기 바이러스의 특성을 32℃, 37℃, 39℃, 및 40℃플락 분석으로 분석하였다. (+) 또는 (-) 센스 rPIV 둘다는 39℃ 및 40℃의 증가된 온도에서 복제의 수준이 JS wt 바이러스와 유사하였다(표 3). 이것은 37℃에서 30배 농도 감소를 나타내나, 39℃ 또는 40℃에서 플락을 형성하기 못하는 변이체 JS cp45와 대조적이다.
JS cp45서열을 완전히 결정하고 리더, N, P, M, F, HN 및 L 유전자에서 돌연변이를 확인하였다. 그러나, 돌연변이가 ca, att, 또는 ts 표현형의 원인인지는 모른다. 발명의 전형적인 rPIV는 모 JS wt와 같은 ts 표현형을 설명하기 때문에, 각각의 돌연변이 또는 이들의 결합 효과를 정확히 나타내기 위해서, 예를 들면 증가된 온도에서 관심있는 돌연변이을 포함하는 재조합 바이러스의 복제를 측정함으로써, 다른 알려지거나 이제까지 발견된 PIV에 대한 cp45 돌연변이를 단독으로 또는 공동으로 완전한 길이의 cDNA로 도입할 수 있다. 따라서 다음에 기술하는 바와 같이, 확인된 돌연변이를 효과적이로 약독화시킨 백신제에 포함시킬 수 있다. 코돈당 2이상의 뉴클레오타이드를 치환시켜 생물학적으로 유도된 돌연변이 균주에 비해 재조합 바이러스가 유전적으로 더욱 안정하도록, 예를 들면, 돌연변이야기와 같은 방법으로 재조합 PIV에 포함된 이러한 돌연변이 및 다른 돌연변이를 추가로 최적화할 수 있다.
실시예 VIII
햄스터에서 rPIV의 복제
36 내지 16-주령 골든 시리안 햄스터를 9마리씩 4그룹으로 나누고, (-)센스 cDNA로부터 회수된 rPIV, (+)센스 cDNA로부터 회수된 rPIV인 JS cp45, 또는 JS wt 바이러ㅅ스중 어느 하나를 105.5pfu를 함유하는 액 0.1ml를 비강으로 접종하였다. 4일째, 상기 햄스터를 희생하고 폐와 코의 갑개골을 수확하였다. 2.5㎍/ml 암포테리신 B (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD), 200㎍/ml 피페리실린(Lederle Laboratories, Pearl River, NY), 및 50㎍/ml 젠타미신(Quality Biologicals)을 함유하는 20% w/v L-5 현탁액에서 상기 폐를 균질화하였다. 유사하게 상기 코갑개골을 10% w/v L-5현탁액에서 균질화하였다. 그런 후에, 상기 샘플을 나누고 드라이아이스-에탄올 베쓰에서 급속하게 냉동시켰다. 접종후 5 및 7일에 CPE를 세어서 32℃에서 LLC-MK2세포를 갖는 96웰상에서 상기 샘플에 존재하는 바이러스의 농도를 측정하였다. 각 그룹의 9마리 햄스터에 대해서 평균 log10TCID50/gm를 계산하였다.
표 4는 (-)센스 cDNA로부터 회수된 rPIV, (+)센스 cDNA로부터 회수된 rPIV가 햄스터의 상부 및 하부 호흡관에서 JS wt와 실질적으로 같은 수준으로 복제함을 나타낸다. 이것은 각 위치에서 약독화되는 JS cp45바이러스와 상반된다.
따라서, 본발명의 전형적인 rPIV가 생물학적으로 유래된 JS wt 모균주가 햄스터에서 나타내는 복제능을 보유할 수 있으며, 인간이 아닌 영장류 및 사람을 포함하는 다른 숙주 및 햄스터에서 복제가 제한되는 JS cp45 백신후보에 존재하는 것과 같은 돌연변이를 확인할 수 있으며, 아래의 실시예에서 기술한 바와 같이 본발명의 변형된 rPIV 균주내에 포함된다.
실시예 IX
약독화 표현형을 구체화하는 HPIV3에서 아미노산 치환의 동정, 및 감염, 약독화된 PIV클론으로 약독화 독연변이의 도입
cDNA로부터 감염성 PIV를 생성하는 능력이 살아있는-약독화된 파라인플루엔자 바이러스 백신의 개발을 용이하게 한다. 더욱 구체적으로는, 본명세서에서 기술된 방법과 도구를 사용함으로써 PIV 백신후보의 약독화의 유전적 근거을 용이하게 결정할 수 있고, cDNA로부터 얻은 감염성 PIV백신을 고안하여 약독화정도 및 면역원성을 미세하게 조절된 수준으로 달성할 수 있다.
추가로, 본발명의 방법과 도구는 사람의 질병에 있어서 가장 중요한 모든 3가지 사람의 파라인플루엔자 바이러스, HPIV1, HPIV2, 및 HPIV3 바이러스에 대한 백신개발을 위해서도 제공된다. 예를 들면, 본발명내에서 효과적인 HPIV3백시제를 제조하고 선택하기 위해서, 생물학적 유로 유래된 HPIV3 백신후보 또는 약독화된 BPIV3 바이러스의 원화는 표현형과 관련된 돌연변이, 예를 들면 약독화 돌연변이를 동정하고 rPIV로 병합할 수 있다. 이러한 방법을 적용함으로써, 약독화와 면역원성간에 바람직한 균형을 갖는 rPIV, 즉 사람에서 복제하고 약독화 표현형을 가진 것을 제조하기 위해서, 다수의 후보중에서 얻은 약독화 돌연변이를 선택하고 결합한다.
본 실시예에서, 살아있는 약독화 바이러스인 PIV3 JS cp45의 온도민감성(ts)와 생체내 약독화(att)표현형에 대한 유전적 근거를 기술하고 있다. 완전한 길이으의 안티게놈 cDNA로부터 7가지 전형적인 재조합 PIV3 바이러스(한군데 손상된 3가지 바이러스, 두군데 손상된 3가지 바이러스 및 세군데 손상된 한가지 바이러스)를 회수하고 이들의 ts 및 att 표현형을 분석하였다. 이들 재조합체는 JS wt 모바이러스의 cDNA클론내에서 채택된, JS cp45(혹은 본명세서에서 cp45라고 함)의 L유전자에 존재하는 하나이상의 아미노산 치환을 가지고 있었다. 이들 3가지 전형적인 생물학적으로 유래된 돌연변이는 모두 Vero 세포에서 배양된 JS cp45의 대표적인 균주에 존재하며, 이를 JS cp45 Vero라고 지정하며, 부다페스트 조약에 따라 미국 매릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이드 12301에 위치한 ATCC에 1997년 8월 21에 기탁되었으며, 기탁번호 ATCC VR 2588 를 받았다.
다음에서 제시된 전형적인 PIV 재조합체의 분석은 L에 있는 3가지 전형적인 돌연변이 (Tyr942을 His로, Leu992를 Phe로, Thr1558를 Ile로)는 cp45의 ts 및 att 표현형에 기여하고, 재조합 백신 바이러스의 생산에 유용하다.
바이러스 및 세포
이전에 기술된 대로(Hall et al., Virus Res 22:173-184 (1992)), PIV3 JS wt 및 cp45 바이러스를 LLC-MK2세포에서 배양하였다. vTF7-3 재조합 백신 바이러스는 Fuerst등의 virology 225:419-422 (1996)에 기재되어 있고, T7 폴리머라제를 발현하는 변형된 백시니아 바이러스 안카라(Ankara)(MVA)는 Wyatt등의 Virology 210: 202-205 (1995)에 기재되어 있다(각 문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합되어 있음). HEp-2 세포(ATCC CCL 23)과 LLC-MK2 (ATCC CCL 7.1)세포를 2%의 FBS 및 젠타미신 설페이트(㎍/ml)가 보충된 OptiMEM(Life Technologies)에서 유지시켰다.
PIV3의 L유전자에서 점돌연변이의 제조
부위 특이적 돌연변이에 의해서 L유전자에 점돌연변이를 도입하기 위해서, pUC19를 변형하여 JS wt PIV3 L 유전자의 단편을 포함하도록 하였다. 첫째, pUC 19(N)을 제조하기 위해서, Nhe I제한효소자리를 포함하는 상보적 올리고뉴클레오타이드(5'GATCGATGCTAGCCC3')(SEQ ID NO: 23) 및 5' GATCGGGCTAGCATC 3'(SEQ ID NO: 24)쌍을 pUC19 Hind III접합함으로써 유일한 제한 효소자리인 Nhe I을 pUC19에 도입하였다. cp45에서 3개의 코딩 변화가 일어나는 위치를 포함하고 직접적으로 완전한 길이의 PIV3 cDNA(아래를 참조)에 도입될 수 있는, pTM(L)의 Sph I(PIV3 net 11317)내지 Nhe I (PIV3 nt 14087) 단편을 pUC19 (N)의 Sph I 및 Nhe I 자리로 클로닝하여 pUCL(N-S)를 만들었다. (1) L 단백질의 942, 992, 1558위치에서 전형적인 아미노산 치환을 제조하고, (2) 마커로서 각 코돈 치환에 인접한 자연적으로 일어날 수 있는 하나의 특이적 제한효소자리를 삭제하기 위해서, Transformer mutagenesis kit(Clontech, Palo Alto, CA)으로 변이형성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 pUCL (N-S)로 점돌연변이를 도입하였다.(표 5를 참조)
플라스미드 DNA의 다이데옥시뉴클레오타이드 서열분석을 함으로써 pUCL (N-S) 유도체에 도입된 돌연변이를 증명하였다. cp45 개별 L 유전자 변이를 포함하는 pUCL(N-S)의 Sph I 내지 BamHI(nt 13733) 단편을 pTM(L)의 Sph I내지 BamHI 자리로 서브클로닝하여 pTM(L) -942, -992, -942/992 및 -1558를 만들었다; pin AI 및 Nhe I자리를 사용하여 다른 이중 돌연변이 및 삼중 돌연변이를 모았다(도 12).플라스미드가 코딩하는 미니게놈 RNA 및 N, P, 및 L단백질로 이루어지는 미니레플리콘 시스템에서, 클로로암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제의 발현을 지시하는 능력에 대해서, 허용온도(32℃)에서 돌연변이체 pTM(L) 플라스미드를 각각 테스트하였다(Durbin et al., Virology 234: 74-78 (1997), 본문헌은 명세서에 참고문헌으로 병합됨). 여러가지 변이 L 플라스미드가 마커 유전자 발현을 wt L의 75-106%수준으로 지지하였으며, 이는 각각의 가공된 cDNA가 상당한 가짜 변이가 아님을 나타냈다(결과를 나타내지 않음). 각 변이 pTM(L) 플라스미드의 Sph I 내지 Nhe I 단편을 완전한 길이의 PIV3 JS 안티게놈 cDNA p3/7(131)의 Sph I 내지 Nhe I 윈도우로 서브클로닝하여 3가지 치환의 모든 가능한 조합을 나타내는 7가지 완전한 길이의 PIV3 cDNA 클론을 제조하였다.
cp45 L 단백질의 하나, 둘, 또는 세개의 치환을 포함하는 재조합 PIV3(rPIV3)의 회수
위에서 상술한 바와 같이, LipofectACE(Life Technologies) 및 MVA-T7을 사용하여 6웰 플레이트(Costar, Cambridge,MA)상의 HEp-2 세포로, 3가지 보조 플라스미드, pTM(N), pTM(P), pTM(L)과 함께, 하나이상의 cp45 L 유전자 변이를 포함하는 각각의 완전한 길이의 안티게놈 cDNA을 형질감염시켰다. 32℃에서 4시간동안 배야양한후에, 6웰 플레이트상의 HEp-2세포로 형질감염 수확물을 계대배양하고, 이를 32℃에서 4일간 배양하였다. 각각의 계대배양 1 상등액을 취하여 LLC-MK세포의 T-25 플라스크로 계대배양하였다. 제 2 계대배양 상등액을 수확하고, 바이러스 플락을 안티-HN 단클론 항체(mab) 77/5로 면역퍼옥시다제 염색을 함으로써 최초로 재조합 바이러스의 존재를 확인하였다. 상기 단클론 항체 77/5는 생물학적 유래 및 재조합 JS PIV3 모두에 결합할 수 있으나, 그의 에피토페가 제거되어 마커로서 작용하므로 cDNA유도 바이러스에는 결합할 수 없다. 이전에 기술된 바와 같이, 계대배양 1에 존재하는 바이러스를 LLC-MK2세포상에서 2회 또는 3회 플락 정제를 수행하였다. LLC-MK2 세포, 32℃에서 생물학적으로 클로닝된 각 재조합 바이러스를 2회 증폭하여 추가로 특성화하기 위한 바이러스를 생산하였다. 폴리에틸렌 글리콜 침전으로 분리된 매질로 부터 바이러스를 농축하고, 트리졸 시약(Life Technology)으로 바이러스의 RNA(vRNA)를 추출하였다. 임의의 헥사머 프라이머로 Superscript II kit(Life Technologies)를 사용하여 vRNA에서 역전사를 행하였다. Advantge cDNA PCR kit (Clontech, Palo Alto, CA)와, PIV3 L유전자에 특이적인 센스 프라이머 (5' nt 1190-GCATTATCTAGATGTGTCTTCTGGTCAGAG 3' nt-1219)(SEQ ID NO: 31) 및 안티센스 프라이머(5' net-14140 CCTGAATATAATAATTAACTGCAGGTCCT 3' nt-14111)(SEQ ID NO: 32)를 사용하여 Sph I 내지 Nhe I 단편 영역을 증폭하였다. L유전자에서 3개 cp45 변이의 삽입도중에 제한효소자리가 제거된 각각의 제한효소로 분해함으로써, 상기 PCR 단편을 분석하였다(표 5를 참조).
하나, 둘,또는 세가지 cp45 L 단백질 아미노산 치환을 가지는 rPIV3의 허용온도 및 제한 온도에서의 플락형성율
LLC-MK2 단층 배양물에서 재조합 바이러스와 대조구 바이러스의 생체외 복제의 온도민감성 정도를 32℃, 37℃, 39℃, 40℃ 및 41℃에서 결정하였고, 메틸셀룰로스 중층을 제거한 후에 기니아피그 적혈구로 혈액흡착함으로써 플락을 결정하였다. 혹은, 두가지 PIV3 특이적 안티-HN 쥐의 mAbs 101/1 및 454/11을 1:500으로 희석된 혼합물로 면역퍼옥시다제 염색법으로 단층에 존재하는 바이러스 플락을 확인하였다(Murphy et al., 상기문헌, 1990).
햄스터 연구
4내지 16주령 골든 시리안 햄스터로 이루어진 6그룹에게 비강으로 하나이상의 cp45 L 단백질 치환을 포함하는 하나의 rPIV3, PIV3 cp45 바이러스, rPIV3 JS wt를 105.5pfu를 함유하는 액을 동물당 0.1ml OPtiMEM 1으로 비강으로 접종하였다. 4일째, 상기 햄스터를 희생하고 폐와 코의 갑개골을 수확하였다. 상술한 방법으로 바이러스를 정량하였다. 각군의 6마리 햄스터에 대해서 평균log10TCID50/g를 계산하였다.
결과
wt JS rPIV3로 PIV3 cp45 L 단백질 아미노산 치환의 도입
위에서 주목한 바와 같이, cp45의 L단백질에 3개 아미노산 치환을 각각 또는 선택된 조합으로 그의 wt 모바이러스, PIV3 JS균주를 코딩하는 안티게놈 cDNA로 도입하였다. 각각의 도입된 돌연변이를 가공하여 회수된 rPIV3에서 돌연변이의 조절을 용이하게 하는, 근처의 자연적으로 존재하는 제한효소자리가 제거된 표현형이 나타나지 않는(silent) 변이로 표시했다(표 5, 도 12). cp45에서의 하나의 뉴클레오타이드치환에 비해 생체외 또는 생체내 복제동안 그 자리에서 복귀기회를 감소시키기 위해서, 서아미노산 1558자리에서의 코돈 변화를 고안하여 r1558에서 두 뉴클레오타이드 변화를 포함하였다.
백신 바이러스 MVA/T7 폴리머라제 재조합의 동시감염과, pTM(N), pTM(P) 및 pTM(L) 보조플라스미드와 함께 각각의 안티게놈 cDNA의 형질감염에 의한 조직배양물에서 cp45로부터 하나, 둘 또는 세가지 아미노산 치환을 갖는 7개 rPIV3를 회수하였다(Wyatt et al., 상기문헌, (1995)). 각 rPIV3는 안티게놈 cDNA을 가공함으로써 HN유전자에 도입된 Mab저항성 마커를 가진다. 각각의 바이러스 제제가 유전적으로 균질함을 보장하기 위해서, rPIV3를 생물적으로 클로닝하여 2주기 또는 3주기 플락 계대배양을 하였다. 이러한 예비주의가 필요한 이유는 백신 바이러스가 안티게놈 cDNA와 보조플라스미드간에 재조합을 매개하기 때문이다.
7개 rPIV3 각각은 L유전자에 가공된 돌연변이를 함유하는지를 확인하기 위해서, 침전된 비리온으로부터 RNA를 정제하고 RT-PCR법에 의해서 cDNA로 역전사하고 증폭하였다. RT-PCR산물의 생성을 위해서는 RT단계가 필요하다는 대조구 반응은 오염된 cDNA가 아니라 RNA 주형이 RT-PCR 산물의 생성에 필요함을 나타낸다. 삽입된 코딩변화에 대한 마커로서 제한효소의 인식자리가 삭제된 그 3가지 제한효소로 RT-PCR산물을 분해하였다. 예상된 대로, 각각의 세가지 효소에 희새서 JS wt rPIV3의 RT-PCR은 적절한 회수로 절단되었으나, r942/992/1558은 각각의 cp45 코딩변화의 제조중에 각각의 세가지 자리가 절단되어 없다. 다른 rPIV3는 적절한 제한효소자리가 없으며, 이는 돌연변이가 도입되었음을 나타낸다.
cp45 L 변이를 갖는 rPIV3의 32℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃ 및 41℃에서의 플락형성율
다양한 조합의 cp45 L 아미노산 치환을 갖는 7가지 rPIV3에 대해, 32℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃ 및 41℃에서 LLC-MK2단층상에서 이들의 플락형성물을 분석하였다. 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, JS wt rPIV3 모바이러스가 테스트한 어떤 온도에서 플락형성이 제한된데 반해, cp45 aa치환을 갖는 rPIV3는 ts이었다. r942, r992 및 r1558의 플락형성의 셧오프(shut-off) 온도는 40℃이었다. r942는 40℃에서 플락형성율이 700배나 감소하였으며, 이는 r942의 복제가 이 제한온도에서 크게 감소하였음을 나타낸다. 그러나, 40℃에서 r942의 플락크기도 또한 크게 감소하였으며, 이는 또한 그의 복제가 JS wt에 비해서 이온도에서 크게 감소하였음을 나타낸다. 41℃에서 r942의 복제는 완전히 제한되었다(자료는 나타내지 않음). r942 및 r1558는 40℃에서 플락형성이 크게 감소하였다(1,000,000배 이상의 감소). 이러한 결과는 비록 r942변이가 덜 제한적이기는 하지만, 각각의 세 cp45 L유전자 변이가 별개로 ts 표현형을 특정한다는 것을 나타낸다. 이중 변이 바이러스 r942/r1558 과 삼중 변이 r942/r992/1558은 셧오프 온도가 39℃이나, r942/992 및 cp45는 38℃이다. 이중 변이, r942/1588은 r942 단일변이보다 온도민감성이 적다. r942와 같이, r942/1588은 41℃에서 완전히 플락형성이 제한된다. 이중 또는 삼중 변이의 온도민감성 수준은 각 단독변이에 의한 온도민감성으로부터 예측할 수 없는 세가지 rPIV 변이의 복잡한 상호작용에 기인한다. 또한, r942/992/1885는 cp45보다 온도민감성이 적으며, L유전자의 바깥 다른 돌연변이도 또한 cp45의 온도민감성 표현형에 기여할 것이기 때문에, 본발명의 범위내에서 추가의 변이를 대표한다.
햄스터에서의 성장
JS wt rPIV3, 생물학적 유래 cp45, 또는 하나이상의 cp45 L 단백질 아미노산 치환을 함유하는 rPIV를 6마리 골든 시리안 햄스터의 그룹들에게 비강으로 접종하였다. 폐 및 코갑개골에서 바이러스의 복제를 결정하였다. 이 실험에서(표 7), 단일 아미노산 치환을 포함하는 rPIV3는 상부 및 하부 호흡관에서 복제가 제한되었다(표 7). 그러나, 온도 민감성이 가장 적은 r942은 두번째 실험에서 상부 및 하부 호흡관에서 복제가 최소한으로 억제되었다. 이러한 자료는 3개 아미노산 치환중 2개가 단일손상 재조합 바이러스에 존재하는 att표현형에 기여함을 설명한다(예, r942/992는 r942 단독변이보다 더욱 약독화되었다). 따라서, L유전자에서 각각의 아미노산 치환은 단독으로 작용하거나 다른 L 아미노산 변이와 함께 작용하여 att 표현형에 기여한다. 이중 변이의 약독화는 생체내 복제후 L유전자의 세개 아미노산 치환중 어느 것이 손실되어 여전히 약독화 바이러스로 남는다. 이것은 생이전에 설명한 체내 복제후에 cp45의 ts표현형의 높은 안정성에 대한 부분적인 설명이다. 삼중변이 r942/992/1588은 상부 및 하부 호흡관에서 cp45만큼 복제가 제한된다는 사실은 L유전자의 세개 아미노산 치환이 cp45의 att 표현형의 주요원인이다.
상기 결과를 요약하면, L 단백질 아미노산 992와 1558의 치환은 40℃에서 세포배양물에서 각각 플락형성율이 1,000,000배 감소했다. 따라서, 각각의 세개 변이가 별개로 ts 표현형에 기여한다. 3개 L 돌연변이 모두를 가지는 삼중 재조합체는 cp45보다 온도민감성이 약간 적으며, 이러한 사실은 cp45의 L유전자의 바깥에서 일어난 변이가 또한 온도민감성 표현형에 기여할 것임을 제시한다. L에서 세개 각각의 변이중 두개가 햄스터의 상부 또는 하부 호흡관에서 제한된 복제에 기여하였고, 이것은 생체내 복제동안 cp45의 ts 및 att표현형의 안정성이 관찰됨을 설명한다. 중요하게도, 재조합 백신균주의 생체외에서의 온도 민감성 수준은 생체내의 약독화를 근접하게 예측할 수 있다. 세가지 변이를 모두 갖는 재조합 바이러스는 햄스터의 상부 및 하부 호흡관 모두에서 cp45 변이만큼 복제가 제한되었으며, 이러한 사실은 cp45 바이러스의 L유전자가 후보 백신균주의 주요한 약독화 성분임을 나타낸다. 반면에 각각의 변이는 그자체로 ts 표현형을 특성화하지만, 그들은 함께 존재할 때 단지 축적적이 아니라 서로 영향을 미친다. 삼중 변이체에서 세가지 변이의 공동효과는 측정된 두 이중 변이체에서 관찰된 온도민감성의 수준을 증가시키기 보다는 감소시키는 것 같다. 흥미롭게도, 992 또는 1558 치환중 어느 하나의 복귀에 의한 손실은 온도민감성 수준을 감소시키기 보다는 증가시킬 것이다. 이는 적어도 몇몇의 cp45 L변이를 유지하기 위한 예상치못한 선택압을 제공해야 한다. 함께 고려될 때, 이러한 발견은 cp45 바이러스의 ts 및 att 표현형의 높은 안정성 수준은 L유전자의 다중 ts변이가 att표현형에 기여하는 것에 기인하는 것을 나타낸다. cp45 바이러스의 주요한 약독화 변이는 제조와 사람에서의 복제의 모든 단계동안 조절바이러스에 대한 기초를 제공한다.
추가로, 942에서 티론신에서 히스티딘으로의 변이는 세개 변이중 가장 보존적인 치환이며, 이는 온도민감성이 최소이다. PIV3의 L폴리머라제는 2233 아미노산 길이의 큰 폴리펩타이드이며, P 단백질과 복합체 형성, RNA 결합, RNA 폴리아데닐화, RNA전사 및 RNA복제에 요구되는 것을 포함하는 다수의 도메인를 코딩하는 다기능 단백질이라고 여겨진다(Collins et al., 상기문헌, (1996)). 942와 992위치에서 L유전자의 아미노산 치환은 다른 파라믹소바이러스 패밀리중 잘 보존된 영역 근처에 존재한다(Blumberg et al, Virology 164: 487-497 (1982); Galinski et al., Virology 165:499-510 (1988)). 1588위치에서의 변이는 다른 L폴리머라제와 서열동일성을 덜 공유하는 폴리머라제 영역이다. 비록 L유전자에서 삼중 아미노산 치환에 의해 부여되는 ts 표현형의 기작은 모르지만, 다중 L 단백질 및 활성은 영향을 박거나, L의 다양한 활성이 관련되는 기작은 영향을 받는다.
실시예 X
온도민감성, 저온적응성 및 약독화 표현형을 특정하는, 생물학적 유래 생-약독화 HPIV 유형 3 바이러스(cp 45)에서의 변이를 직접 동정, 및 재조합 백신 바이러스로 재구성
상기 실시예는 cp 45의 L폴리머라제 단백질에서 각각의 3 아미노산 치환이 온도민감성(ts)과 약독화 표현형(att)을 부여하지만, 저온적응성 표현형(ca)을 부여하지 않는다(Skiadopoulos et al., J. Virol 72(3): 1762-8, 1998). cp45는 다른 단백질(N, C, M, F 및 HN), 또는 잠재적인 시스-작용 서열(리더 영역 및 N유전자의 전사유전자 개시(GS)신호)에 추가의 12 변이를 포함하며, 상기 표현형에 이들이 기여함은 이전에 정의되지 않았다. 추가로 본실시예는 사람 또는 사람을 제외한 영장류에서 cp45의 복제이후에 이들 표현형의 높은 안정성의 관찰에 대한 기초와 관련한 추가의 정보를 제공하기 위해서, cp 45의 ts, ca 및 att표현형에 대한 유전적 근거를 특성화한다. 이 연구의 한가지 측면에서, 15 cp45-특이적 변이를 모두 포함하는 재조합 cp45 (rcp45)를 역유전적 시스템을 이용하여 제조하였고, 생물학적으로 유래된 바이러스와는 플락크기, 온도민감성, 저온적응성의 수준 및 햄스터의 상부 및 하부 호흡관에서의 복제수준에 근거하여 본질적으로 구별된다. 또한, (1) CC, M, F 또는 HN 단백질상에서 cp45-특이적 변화, (2) 결합된 리더 및 N유전자 변이, (3) cp45변이의 수개의 조합을 포함하는 재조합 바이러스를 제조하였다. 이들 재조합 바이러스의 분석에 의하면, 게놈에 분산되어 있는 다수의 cp45 변이가 ts, ca, 및 att 표현형에 기여함을 보여주었다. C 및 F 유전자에서 변이는 40℃에서 온도민감성이 없었으나, 그럼에도 불구하고 att 표현형을 나타냈다. 따라서 이들은 온도민감성은 아니나 att 표현형이다. HN 변이는 ca, ts, att 표현형을 부여하지 않았다. 3' 리더 및 N 변이를 갖는 바이러스는 ts이나, 햄스터의 하부 호흡관에서 약간의 약독화만을 나타냈다. 수개의 변이의 조합을 갖는 재조합체는 cp45 보다 높은 온도민감성을 나타냈으나, 증가된 온도민감성의 수준은 생체내에서 약독화 증가에 반영되지 않았다. 이들 후자의 발견은 cp45에서 동정된 다중 변이는 생체외의 복제에 상호작용하여 영향을 미친다. cp 45에서 다중 ts 및 비-ts 약독화 변이는 높은 수준의 약독화와 표현형의 안정성에 기여할 것이다. 본명세서에서 제공된 cp45의 다양한 변이와 관련된 표현형을 아는 것은 본발명의 범위내에서 유용한 백신 재조합체의 큰 조합체를 달성하기 위해서 생물학적 유래 PIV바이러스의 정확한 조절 및 재조합 바이러스의 용이한 조작을 가능하게 한다.
바이러스 및 세포
상술한 바와 같이, 시미안 LLC-MK2세포에서 본실시예에서 기술된 rPIV3s, PIV3 JS wt 및 cp45 바이러스를 배야하였다(Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997a; Hall et al., Virus Res. 22(3): 173-184, 1992; Skiadopoulos et al., J. Virol 72(3): 1762-8, 1998). 상술한 대로, 변형된 백신 바이러스를 제공한다. 2% FBS 및 젠타미신 설페이트(50㎍/mL)이 보충된 OPtiMEM I(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 또는 10% FBS 및 젠타미신 설페이트(㎍/mL) 및 2mM 글루타민이 보충된 EMEM에서 HEp-2(ATCC CCL 23)과 LLC-MK2 세포를 유지하였다. 10% FBS, 2mM 글루타민, 20mM 헤페스, 1mM 비필수 아미노산 및 100 유니트 스트렙토마이신-네오마이신/ml이 보충된 Earl's MEM(Life Technologies)에서 L-132 세포(ATCC CCL 5)를 배양하였다.
PIV3에서 점돌연변이 야기
다음의 단편을 흡수하도록 변형된 pUC19벡터에 표준 분자클로닝 방법을 사용하여 상기에서 감염성 바이러스를 회수하기 위해 사용된 PIV3 JS wt의 안티게놈 cDNA인 p3/7(131)2G의 서브게놈 단편을(Durbin et al., Virology 235:323-332, 1997a; Skiadopoulos et al., J. Virol. 72(3): 1762-8, 1998) 클로닝하였다. 이전에 기술된 대로, Transformer Mutagenesis Kit(Clotech, Palo Alto, CA)를 사용하여, 표현형으로 나타나지 않는 제한효소인식서열을 제거 또는 생성하기 위한 변이 뿐만 아니라 cp45에서 확인된 변이에 대응하는 점돌연변이를 도입하였다(표 8).
돌연변이를 약기한 후에, 제한효소 단편의 서열을 완전히 분석하고 완전한 길이의 클론인 p3/7(131)2G로 다시 클로닝하였다. PIV3 cp45 비리온 RNA로부터 직접 RT-PCR법을 사용하여 3'리더와 N변이를 증폭하고 pLeft+20(위를 참조) 또는 추가의 조작을 위해서 변형된 pUC19에 클로닝하였다. 표준 분자 클로닝법으로 돌연변이의 조합을 만들었다. cp45변이를 포함하는 완전한 길이의 플라스미드 클론, pFLCcp45의 서열을 완전히 분석하여 클로닝과정동안 외부 변이가 도입되었으나 나타내지 않는지를 결정하였다.
재조합 PIV3(rPIV3)의 회수
세가지 보조 플라스미드, pTM(N), pTM(P, C아님), pTM(L)과 함께, cp45 변이를 포함하는 각각의 완전한 길이의 안티게놈 cDNA로 상술한 LipofectACE(Life Technologies, 케티스버그, MD) 및 MVA-T7을 사용하여 6웰 플레이트상의 HEp-2세포(Costar, Cambridge, MA)를 형질감염시켰다. 32℃에서 4일간 배양한 후에, 형질감염 수확물을 T-25플라스크에 있는 LLC-MK2으로 1차 계대배양을 하였으며, 4내지 8일간 32℃에서 배양하였다. 이 수확된 바이러스를 1차 계대배양이라 하고, 상술한 바대로 LLC-MK2에서 3회 플락 정제를 하였다. 각각의 생물학적으로 클로닝된 재조합 바이러스를 32℃에서 LLC-MK2세포에서 2회 증폭하여 추가의 특성화를 위한 바이러스를 제조하였다. 폴리에틸렌 글리콜 침전(Mbiguino and Menezes, J. Virol Methods 31:2-3, 1991, 본문헌 전체가 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)으로 분획화된 매질로부터 바이러스를 농축하고, 바이러스 RNA(vRNA)를 트리졸 시약(Life Technologies)으로 추출하였다. 임의의 헥사머 프라이머로 Super script II Preamplification System(Life Technologies)를 사용하여 vRNA상에서 역전사를 수행하였다. Advantage cDNA PCR 키트(Clontech) 및 PIV3 게놈의 다양한 부분에 특이적인 센스와 안티센스 프라이머를 사용하여 제한효소 분석을 위한 단편을 증폭하였다. 변이중 제한효소자리를 제거하거나 생성시킨것에 대한 각각의 제한효소로 분해하여 상기 PCR 단편을 분석하였다(표 8).
허용온도 및 제한온도에서 cp45변이를 가진 rPIV3의 플락형성율(EOP)
상술한 LLC-MK2 단층배양물에서 32℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃, 41℃에서 대조구 바이러스 또는 재조합 바이러스의 생체외 플락형성의 온도민감성을 결정하였다(Hall et al., Virus Res. 22(3) : 173-184, 1992, 본문헌은 그 전체로서 본명세서의 참고문헌으로 병합됨). 메틸셀룰로스 중층을 제거하고 기나아 피그 적혈구를 사용하는 혈액흡수법으로 플락을 세었다. 또는, 1:250으로 희석한 2 PIV3-특이적 안티-HN 쥐의 mAb 101/1 및 454/11의 혼합물로 면역퍼옥시다제 염색법으로 단층에 존재하는 바이러스를 확인하였다(Murphy et al. Vaccine 8(5) :497-502, 1990; van Wyke Coelingh et al., Virology 143 (2): 569-582, 1985).
rPIV3 변이바이러스에 대한 저온 적응성 표현형의 평가
24웰 조직배양 플레이트상에 준비된 풍부한 L-132 세포단층에 32℃ 및 20℃에서 wt rPIV3 및 변이 rPIV3의 성장을 측정하였다. 각각의 2 플레이트의 이중 웰에 0.2ml의 변이체나 wt rPIV3 바이러스를 MOI 0.01로 접종하였다. 실온에서 한시간동안 흡착시킨 후에, 상기 접종원을 흡수하고 단층을 웰당 1ml의 PBS로 세척하였다. 상기 접종된 배양물에 10% FBS, 2mM 글루타민, 20mM 헤페스, 1mM 비필 수 아미노산 및 100 유니트의 스테렙토마이신-네오마이신/ml을 보충한 Earl's MEM 0.5ml을 중층하였다. 방수 파우치(Kapak)로 플레이트 하나를 밀봉하여 13일간 20℃배쓰에 잠가 두었다. 32℃에서 3일간 CO2배양기에 이중 플레이트를 두었다. 배양기간 말기에, 냉동/해동으로 바이러스를 수확하였다. 플락을 보는 기니아피그 적혈구르 사용하는 혈액흡수로 32℃에서 LLC-MK2세포상에서 플락분석을 통해, 각 웰에서 회수한 바이러스 농도를 결정하였다. wt 및 두 cp45 참조 스톡을 대조구로 사용하였다.
햄스터 연구
JS wt rPIV3, PIV3 cp 45 바이러스, 또는 하나 이상의 변이체 rPIV3를 106.0pfu함유하는 0.1ml OptiMEM I를 비강으로 5주령 골든 시리안 햄스터 5마리로 이루어진 그룹에게 접종하였다. 감염성 4일째, 상기 햄스터를 희생하고, 폐와 코갑개골을 수확하고, 상기한 대로 바이러스를 정량화하였다. 32℃에서 평균 log10TCID50/그램을 각 햄스터 그룹에 대해서 계산화였다.
결과
JS wt rPIV3로 PIV3 cp45 변이체를 도입
부위특이적 돌연변이, 또는 원하는 변이를 갖는 cp24 cDNA의 단편을 직접 PCR증폭을 함으로써, cp45의 3'리더, N GS 신호, 및 N, C, M, F, HN 및 L단백질에서 15개 돌연변이를 완전한 PIV3안티게놈 cDNA에 도입하였다(표 8). 다음의 안티게놈 cDNA를 만들었다(도 13 참조): (i) 리더영역의 4개 점돌연변이, N GS 신호에서의 점돌연변이, 및 N단백질에서 두 아미노산 치환을 포함하는 rcp45 3'N; (ii) C 단백질에서 단일 아미노산변화를 포함하는 rcp45 C; (iii) M에서 단일 아미노산 변화를 포함하는 rcp45 M; (iv) F에서 두 아미노산 변화를 포함하는 rcp45F;(v) 상기대로 HN에서 단일아미노산 변화를 포함하는 rcp45HN; (vi) 상기한 대로 L에서 3개 아미노산 변화를 포함하는 rcp45 L; (vii) 상기 i, vi로부터의 변이를 포함하는 rcp45 3'NL; (viii) L에서 3개를 제외하고는 모든 변이를 함유하는 rcp45 3'NCMFHN; 및 (ix) 표 8에 표시한 모든 15개 cp45변이를 포함하는 cp45. 각각의 cp45 변이를 가공하여 대부분의 경우에, 제한효소자리가 제거되거나 도입되어 하나이상의 근처 발현되지 않은 변화가 수반된다(표 8). 이들은 회수된 바이러스 및 cDNA에서 변이의 존재를 확인하기 위한 마커로 작용한다. 또한, 두 아미노산 코딩변화(표 8에서 변이 번호 10 및 15)cp45에서 발견된 단일 뉴클레오타이드 변화가 아니라 2 뉴클레오타이드 변화에 의해서 제조하며, 이는 wt로 같은 자리 복귀의 가능성을 감소시킨다. 표 8에 나타난 모든 15개 cp45 변화를 포함하는 cp45 cDNA를 사용하여 다른 안티게놈 cDNA에 cp45를 도입한다; 그것 전체로서 서열을 분석하고 단지 목적한 변이만을 함유하도록 확인하였다. 이것은, 돌연변이나 PCR을 하고 클로닝으로 조작한 모든 여역이 바람직한 서열을 가지며 다른 바람직하지 않은 변이를 포함하지 않음을 나타낸다. 상기한 대로 재조합 PIV3를 제조하기 위해서 보조 플라스미드 및 MVA-T7과 함께 하나이상의 cp45 변이를 갖는 각각의 완전한 길이의 플라스미드로 HEp-2 세포를 형질감염시켰다. 표 8에 나타낸 돌연변이를 포함하는 RP-PCR 단편의 분석을 도 13에 나타난 다양한 재조합 바이러스의 비리온 RNA로부터 증폭하였으며 이는 도입된 변이의존재를 확인하며, 다른 목적하지 않은 변이가 발견되지 않았다.
플락형태
LLC-MK2세포에서 테스트한 경우에, 수가지 재조합 바이러스는 다양한 바이러스 플락형태를 나타냈다. JS wt rPIV3 플락은 1mm 평균크기이었고, 생물학적 유래 JS wt PIV3아 크기면에서 구별되지 않는다. 이는 생물학적 유래 및 재조합 cp45바이러스가 이러한 표현형에 대해 유사함을 설명한다.
허용온도 및 제한온도, LLC-MK2상에서 cp45변이를 가진 rPIV3의 플락형성율
32℃ 내지 41℃ 범위의 제한온도 및 허용온도에서 rPIV3가 플락을 형성하는 능력에 대해 rPIV3를 분석하였다(표 9). 각 성분의 cp45를 갖는 ts 표현형 바이러스는 rcp45 3'N 및 rcp45 M 바이러스가 40`의 셧오프 온도를 가지고, rcp45 C변이는 41℃의 셧오프 온도를 가지는 것을 나타낸다. rcp45 F 및 rcp45 HN 변이의 셧오프 온도는 41℃이상이었다. 상기 결과에 일치되게, rcp45 L바이러스의 셧오프 온도는 39℃이다. 예를 들면, 40℃에서 바이러스의 복제감소(즉, 32℃ 농도에서 40℃ 농도를 빼기)가 40℃의 wt 바이러스의 복제감소의 약 100배이상인 경우에 이 바이러스는 ts 표현형을 가지는 것으로 간주된다. 이 정의를 적용하면, 현재의 결과는 cp45의 적어도 두 영역(3'N 및 L)이 ts 표현형에 기여하게 된다.
표 9에서 나타낸 바와 같이, 모든 cp45 변이를 포함하는 rcp45의 셧오프 온도는 38℃이며, 이는 생물학적 유래 cp45와 동일한다. 이 결과는 cp45의 ts 표현형이 rcp45에서 성공적으로 재현됨을 나타낸다. 추가로, 이러한 결과는 cp45의 서열분석과 후속적으로 재조합 바이러스로 변이를 재구성하는 것을 유효하게 한다.
rcp45 3'NCMFHN 바이러스는 3 개의 L 변이가 없다는 것을 제외하고는 rcp45와 동일하며, 셧오프 온도가 36℃이다. L변이가 단독으로 그리고 합동으로 온도민감성을 부여하는 것으로 알려져 있기 때문에, rcp45 3'NCMFHN이 cp45보다 온도민감성이 크다는 것은 역설적이다. 이는 cp45의 변이간에 상호작용에 의해서 각각 변이의 합보다 온도민감성이 낮게 된다.
이들 요소 모두가 RNA합성도중에 상호작용하는 것으로 믿어지기 때문에, L 변이가 리더 및/또는 N 변이와 상호작용하는지를 결정하기 위해서 바이러스 rcp45 3'NL을 구성하였다. rcp45 3'N 및 rcp45 L의 셧오프 온도가 각각 40℃ 및 39℃인데 비해, 이 바이러스의 셧오프 온도는 36℃이다. 이러한 결과는 3'N과 L변이의 상호작용이 있으며 이 결과 온도민감성이 증가함을 제시하고 있다. 또한 이결과는 완전한 세트의 변이를 갖는 cp45보다 cp45변이의 서브셋이 온도민감성이 크다는 다른 실시예를 제공하고 있다.
cp45변이를 갖는 rPIV3의 ca 표현형
cp45의 어떤 요소가 ca 표현형을 특정하는지를 알아보기 위해서 rPIV3를 분석하였다(표10). rcp45 L이 ts 및 att이나 ca는 아님을 위에서 설명하였다. 이는 ca표현형의 더 큰 부분을 특정하는 유전적 요소가 L유전자 밖에 존재함을 나타낸다. 중간표현형을 나타내는 rcp45 3'NCMFHN을 제외하고는, 3'리더 및 N변이를 갖는 각각의 rPIV는 ca이다. 이는 ca 표현형이 대부분 3'N영역내에 특정되었다는 것을 보여준다. 3'N단편을 갖는 바이러스의 ca수준이 cp45 또는 rcp45의 단편보다 더 적다는 발견은, 비록 다른 각각의 영역의 분석으로부터 명백하지는 않지만 cp45의 다른 영역이 ca 표현형에 기여함을 나타낸다. rcp45 3'NL바이러스의 ca가 rcp45 3'N바이러스보다 크다는 것은, L변이가 약간의 기여를 할 것이다는 것을 제시한다. 생물학적 유래 cp45와 rcp45 바이러스가 동등한 수준의 ca를 나타낸다는 것은, 플락 크기 및 ts표현형과 마찬가지로, 이러한 표현형이 본명세서에 제공된 재조합 cp45바이러스에서 성공적으로 재생성된다는 것을 의미한다. 따라서, ts표현형과 마찬가지로, ca표현형은 유전적 요소가의 상호작용에 의한 기여뿐만 아니라 각각의 전체 표현형에 기여를 반영하는 복합 표현형이다.
햄스터에서 rcp45 변이 바이러스의 성장
5마리 골든 시리안 햄스터 그룹에게 재조합 또는 생물학적 유래 바이러스를 106LCID50을 비강으로 투여하고, 폐 및 코갑개골에서 바이러스 복제수준을 4일후에 측정하였다(표 11). 접종후 4일째에 wt 및 cp45 바이러스는 햄스터에서 바이러스 복제가 최대가 됨을 이전에 기술하였다(Crookshanks and Belshe, J. Med. Virol. 13(3): 243-9, 1984, 본문헌을 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). rcp45바이러스의 복제는 코갑개골에서 약 40배 감소하였고, 폐에서는 1000배 감소하였으며, 따라서 생물학적 유래 cp45바이러스 만큼 약독화되었다. 이러한 결과는, cp45의 약독화 표현형이 재조합체로서 성공적으로 재생산되었음을 나타낸다. cp45의 각각의 표현형이 rcp45에서 완전히 재생되었으므로, 본실시예에서는 포함되지 않았으나 cp45에서 추가의 5개 변이가 cp45의 특성에 약간 기여할 것이다.
상기한 바와 같이, cp45의 L유전자에서의 변이가 이 바이러스의 대부분의 약독화 표현형을 특정하는 것이다. 본 실시예에서, 한 그룹으로서 L의 바깥 cp45변이을 조사하였다. rcp45 3'NCMFHN 변이체만이 코갑개골에서 복제가 약간 감소하였으마, 폐에서는 100배 이상이 감소하였다. 이러한 사실은 추가 약독화 변이가 L단백질의 바깥쪽에 존재함을 나타낸다. 중요하게도, rcp45의 L유전자상의 각기 3개 변이가 야생형 서열로 복귀하는 경우에, 얻어진 바이러스, rcp45 3'NCMFHN은 여젼히 약독화 표현형을 가질 것이다. rcp45 M 및 PIV3 HN 변이 바이러스는 햄스터의 호흡관에서 복제능이 있으며, PIV3 3'N바이러스는 하부호흡관에서 단지 약간의 복제감소를 나타낸다. 이는 3'리더, N유전자 개시 자리, 및 N, M 및 HN 단댁질에 존재하는 변이가 그자체로는 약독화되지 않음을 나타낸다. 그런, 이러한 변이는 다른 cp45내에서 cp45의 전체 약독황 기여할 수 있을 것이다. 또한, 3' N 영역내의 다른 개별 변이가 함께 변이 세트를 분석한 경우에 분명하지는 않지만 영향을 미칠 수 있으며, 이는 본명세서에 따라 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
PIV3 C 및 PIV3 F 변이체의 복제는 코갑개골 및 폐에서 약 100배 감소하였으며, 이는 cp45의 C 및 F단백질내의 변이가 비록 약독화 수준이 cp45 L 변이에 의한 것만큼 크지 않지만, 햄스터에서 약독화표현형에 기여한다는 것을 설명한다. 상기한 바와 같이, PIV3 C 및 PIV3 F 변이 바이러스는 ts표현형을 가지지 않으므로, C 및 F단백질에서 일어난 변이는 온도민감성이 아닌 약독화 변이라고 여겨진다.
실시예 XI
헤마글루티닌 및 융합 당단백질이 PIV 1에서 유래된 대응 당단백질로 치환된 재조합 키메릭 PIV3의 회수
본실시예내에서, PIV유래 이종 유전자 또는 큰 폴리뉴클레오타이드 서열이 다른 rPIV 환경으로 도입된 키메릭 rPIV 바이러스를 제조하고 선택한다. 본발명의 범위내에서, PIV의 각 유전자들 또는 유전자 단편들을 이종 PIV 또는 다른 출처의 대응 서열로서 치환하였다. 본실시예에 기술된 한 구체에에서, 치환, 예를 들면, HPIV1및 HPIV2의 HN 및/또는 F을 재조합 HPIV3로 도입하여 살아있는 약독화 바이러스를 개발에 적합한 키메릭 재조합체를 생산하는 도구와 방법을 제공한다.
바이러스와 세포
본 연구에서 사용된 PIV1 균주, PIV1/Washington/20993/1964 (PIV1/Wash64)를 1964년 워싱턴 디.씨.에서 분리하였으며, 성인 지원자에 대한 임상연구에서 병원성 야생형 바이러스임을 확인하였다(Murphy et al. Infect. Immun. 12:62-8(1975), 본문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). 50 ㎍/ml 젠타미신 설페이트, 2 mM 글루타민 및 0.75 ㎍/ml 트립신이 보충된 Opti-MEM I(Life Technologies)에서 LLC-MK2(ATCC CCL 7.1)세포상에서 증식되었다(카탈로그 번호 3741, Worthington Biochemical Corp., Freehol, NJ). 헤마글루틴-저해 분석(HAI)에 사용된 사람 PIV2의 그리어(Greer)균주(카탈로그 번호 v-322-001-020, NIAID Respository, Rockville, MD)을 동일한 방식으로 증식하였다. 사람 PIV3의 JS균주 및 cDNA로부터 유래된 이의 재조합 유도체를 야생형과 함께 상기한 바와 같이 증식하였다. 박테로오파지 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 변형된 백시니아 안카라(Ankara)(MVA) 재조합체가 Wyatt등의 Virology 210:202-205 (1995)에 기재되어 있다(본문헌은 본명세서의 참고문헌으로 병합함). HEp-2세포는 ATCC로부터 받았으며, 50 ㎍/ml 젠타미신 설페이트, 2 mM 글루타민 및 소 태아의 혈청 2%를 포함하는 Opti-MEM I(Life Technologies)에서 유지하였다.
완전한 키메릭 PIV3-PIV 1안티게놈을 코딩하는 cDNA의 제조
PIV3 HN 및 F가 PIV1의 대응부로 치환된 완전한 길이의 안티게놈 RNA을 코딩하는 cDNA를 도 14에서와 같이 제조하였다. PIV1/Wash 64의 HN 및 F 유전자의 cDNA클론을 PIV1/Wash 64 야생형 바이러스로 감염시킨 LLC-MK2세포로부터 추출된 RNA로 제조하였다. 임의의 헥사머를 사용하는 Superscript Preamplification System(Life Technologies)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. GeneBank에 있는 공통 서열에 기초한 유전자 특이적 프라이머쌍을 사용하여 Vent DNA 폴리머라제(New England Biolabs, Beverly, MA)로 PIV1 F 및 HN cDNA를 증폭하였다. 아래에 기술된 모든 프라이머는 주석을 붙여 PIV3특이적 서열은 밑줄을 그었으며, 제한효소자리는 이탤릭체로 표시하였고, 야생형에서 변형된 뉴클레오타이드는 더 낮게 표시하였고, 개시 및 종료코돈은 진하게 표시하였다. 개시코돈의 상부 69-97과 혼성화하는 (+)센스 PIV1 F프라이머는 5'-GGGAAAGAAtCCAGAGACAAGAACGG-3' (SEQ ID NO: 34)이다. F 종료코돈의 하류 36-61 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 (-)센스 PIV1 F 프라이머는 5'-GGTGAAGTTGTGGATccATTGATTG-3'(SEQ ID NO:34)이다. 이것은 BamH I 자리를 가지고 있다. PIV1 HN에 대한 (+) 센스 프라이머는 5'-CAACCTGTAAGGtAcCAGCATCCG-3'(SEQ ID NO: 35)이다. 이는 HN 개시코돈의 상류 13-36 뉴클레오타이드와 혼성화하며, Kpn I자리를 가진다. (-)센스 PIV 1 HN프라이머는 5'-GATATGGTGTTaGGcCTTGATCTGTTC-3'(SEQ ID NO:36). 이는 종료코돈의 마지막 2 뉴클레오타이드서열 및 추가의 하류 25 뉴클레오타이드와 혼성화하며, Stu I 자리를 가진다. BamH I 및 블런트-말단 단편을 BamH I-EcoR으로 절단한 pLITMUS28(New England Biolabs)으로 PIV1 F cDNA를 클로닝하였으며, Kpn I-Stu I 단편으로 동일한 벡터에 PIV 1 HN을 클로닝하였다. pLit.1Hwt pLit.1Fwt(GeneBank 수탁번호: AF016280, AF016279)로 명명한 얻어진 플라스미드의 뉴클레오타이드 서열을 Circumvent Sequencing Kit(New England Biolabs)로 분석하였다. 변이형성 PCR 프라이머를 사용하여 이들 두 클론을 변형시켜(도 14), 키메릭 HN및 F유전자를 제조하기 위해서 이들의 비코딩 영역을 제거하고 개시 및 종료코돈을 둘러싼 새로운 제한효소자리를 도입하였다. (+) 및 (-)센스 PIV1 F 변이형성 프라이머의 서열은 5'-CgccATGgAAAAATCAGAGATCCTCTTCT-3' (SEQ ID NO: 37) 5'-CtggatcctAATTGGAGTTGTTACCCATGTA-3' (SEQ ID NO: 38)이다. 도입된 제한효소자리는 Nco I 및 BamH I이다. (+)및 (-)센스 PIV1 HN 변이형성 프라이머의 서열은 5'-AACcATGGCTGAAAAAGGGAAAA-3' (SEQ ID NO: 39) 및 5'-GGTGAaGCTtAAGATGTGATTTTATATTTTA-3'(SEQ ID NO: 40 )이고, 도입된 제한효소자리는 Nco I 및 Hind III이다.
두번째 단계는, 위에서 제조된 PIV1 코딩영역의 수용체로 작용하는 PIV3 HN및 F유전자의 변형이 관련된다. 완전한 길이의 클론 PIV3/JS, P3/7(131)2G로부터 수단계로 PIV3 F 및 HN유전자를 서브클로닝하여 pLit.HN.4 및 pLit.PIV3.F.3a(도 14)를 제조하였다. PIV3 F 및 HN 코딩영역을 PCR 변이로 제거하고 상기한 PIV1 HN 및 F cDNA를 받아들이기에 적합하도록 제한효소자라로 치환하였다. PIV3 F (+)센스 및 (-)센스 변이형성 프라이머의 서열은 5'-AAATAggatccCTACAGATCATTAGATATTAAAAT-3' (SEQ ID NO:41) 및 5'-CgcCATgGTGTTCAGTGCTTGTTG-3'(SEQ ID NO: 42)이며, 도입된 제한효소자리는 BamH I 및 Nco I이다. PIV3 HN (+) 및 (-) 센스 변이형성 프라이머의서열은 5'-CCACAAgCtTAATTAACCATAATATGCATCA-3' (SEQ ID NO:43) 및 5'-TTCCATggATTTGGATTTGTCTATTGGGT-3'(SEQ ID NO: 44)이며, 도입된 제한효소자리는 Hind III 및 Nco I이다. 키메릭 HN에 대한 종료코돈은 변이된 PIV1 HN카세트에 접합하여 제조하였다. 상기 PIV1 HN 및 F cDNA를 HN에 대해서는 Nco I-Hind III단편으로서, F에 대해서는 Nco I-BamH I 단편으로서 도입하여, pLit.PIV3-1.HNhc 및 pSE.PIV3-1.Fhc를 제조하였다. 이들 두 cDNA를 pSE.PIV3-1.Fhc로 함께 넣은 후에, 완전하게 서열분석하였다. 그런 후에, p3/7(131)2G에 BspE I-Sph I단편을 삽입하여 pFLC.2G+.hc(도 14)를 제조하였다. 키메릭 F 및 HN유전자를 포함하는 BspE I-Sph I단편의 뉴클레오타이드 서열은 GeneBank에 있다(수탁번호 AF016281). 중요하게도, cDNA가공은 최종 rPIV3-1 안티게놈이 6배 규칙(Durbin et al. Virology 234: 74-78 (1997), 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 일치하도록 고안하였다. rPIV3-1 키메라를 코딩하는 플라스미드 pFLC.2G+.hc를 부다페스트조약에 따라 1997년 9월 17일에 미국 메릴랜드 20852, 록빌, 12301 파크론에 위치한 Amerian Type Culture Collection (ATCC)에 기탁하였다.
형질감염
6웰 플레이트(Costar Corp, Cambridge, MA)에서 HEp-2 단층세포를 풍부히 성장시키고, 상기한 바와 같이 형질감염시킨다. 50 ㎍/ml 젠타미신, 2mM 글루타민을 함유하는 혈청이 없는 Opti-MEM I의 0.8ml에서 3moi로 MVA-T7으로 상기 단층세포를 감염시키고, 세가지 보조플라스미드, 즉 0.4 ㎍의 pTM(N), 0.4 ㎍의 pTM(P), 0.4 ㎍의 pTM(L) 및 5 ㎍의 PIV3-1 안티게놈 cDNA로 형질감염시켰다. 상기 플라스미드를 12㎕ LipofectACE (Life Technologies)을 함유하는 Opti-MEM I의 0.2ml에서 혼합하고, 각웰에 첨가하였다. PIV3/JS cDNA 플라스미드, p3/7(131)2G는 야생형 PIV3/JS 안티게놈 RNA을 코딩하며, 이를 (+)대조구로서 동일하게 형질감염시켰다. 12시간동안 32℃에서 배양한 후에, 형질감염된 배지를 50㎍/ml의 젠타미신을 함유하는 신선한 Opti-MEM I으로 바꾸어 배양물을 32℃에서 추가로 2일동안 배양하였다. 형질감염후 3일째에 최종농도 0.75㎍/ml로 트립신을 첨가하였다. 4일째에 세포배양물의 상징액을 수확하여, 신선한 LLC-MK2 단층세포로 계대배양하였다(1차 계대배양이라고 함). 하룻밤 흡착후에, 0.75㎍/ml 트립신 함유한 신선한 Opti-MEM I으로 배지를 바꾸었다. 32℃에서 4일간 계대배양 1은 배양하고, 증폭된 바이러스를 수확하여 LLC-MK2배지로 계대배양하고(계대배양 2로 함), 0.75㎍/ml 트립신 존재하에서 32℃에서 또다시 4일간 배양하였다. PIV1 HN당단백질을 갖는 바이러스에 대해 닭 적혈구를 사용하였으나 대신에 PIV3에 대해 기니아피그 적혈구를 사용하였다는 점에르 제외하고는 이전에 기술된 헤마글루틴-저해 분석(HAI)법(van Wyke Coelingh et al., 상기문헌, (1985))에서 토끼 PIV1 항혈청, 기니아피그 PIV2 항혈청, 및 두 PIV3 HN 단클론항체와 반응으로 회수된 바이러스의 특성을 분석하였다. rPIV3가 cDNA로부터 회수된 바이러스를 표시하는 변이에 내성이 있는 단클론항체(MARM)을 가지는지, 또는 rPIV3-1이 PIV1 HN을 가지는지를 결정하기 위해서 HAI를 수행하였다.
뉴클레오타이드 서열 분석
완전한 클론인 pFLC.2G+.hc에 최종 조합을 하기전에, Circumvnet Sequencing Kit (New England Biolabs)를 사용하여 키메릭 cDNA 구조물인 pSE.PIV3.hc의 서열을 분석하였다. RNA분석을 위해서, T75플라스크의 LLC-MK2세포상에서 적합한 PIV를 증폭하였다. 감염후 5일째 바이러스를 수확하고 폴리에틸렌 글리콜 침전을 사용하여 농축하였다(Mbiguino et al., J. Virol. Methods 31:161-70(1991)). 바이러스 RNA를 바이러스 펠렛으로부터 추출하고, Superscript Preamplification System(Life Tchnologies)를 사용한 역전사에 사용되었다. Advantage cDNA systhesis kit(Clotech) 및 PIV1와 PIV3 특이적 프라이머쌍을 사용하여 RT-PCR를 수행하였다. 전기영동법으로 RT-PCR 산물을 겔정제하고, NA 45 DEAE-니트로셀룰로스 막(Schleicher & Schnuell, Keene, NH)으로부터 용출, 분리하고, 서열을 분석하였다.
LLC-MK2세포에서 PIV의 복제
PIV1 및 PIV3-1 바이러스의 경우에 트립신을 첨가하는 것을 제외하고는 이전에 기술된 것과 같이 LLC-MK2단층상의 플락을 계산하였다(Hall et al., Virus Res. 22:173-84, (1992)). 요컨대, 6웰 플레이트의 LLC-MK2세포위에 일련의 희석된 바이러스를 접종하였다; 바이러스는 32℃에서 1시간동안 흡착하였다; 첨가된 트립신을 포함하거나 포함하지 않으며 0.8%의 아가로스을 함유하는 L-15배지(Life Technologies)에 배양물을 중층하였다; 그리고, 기니아피그 적혈구로 혈액흡수(HAD)시킨후에 아가로스 중층을 제거함으로써 플락을 확인하였다.
바이러스를 moi 0.01로 12웰 플레이트의 풍부한 LLC-MK2 단층을 감염시킴으로써 조직배양물에서 PIV바이러스의 성장을 측정하였다.32℃에서 1시간동안 흡착한후에, 상기 접종원을 젠타미신(50 ㎍/ml 및 트립신(0.75㎍/ml)이 보충된 1.5ml/웰의 Opti-MEM I으로 바꾸고 추가로 32℃에서 6시간동안 배양하였다. 24시간 간격으로, 0.3ml의 배지를 각각의 웰에서 제거하고 트립신이 포함된 신선한 배지 0.3ml를 첨가한다. 이전에 기술된 액상 중충법을 사용하여 LLC-MK2단층세포위에서 혈액흡착법으로 32℃에서 바이러스 농도를 결정하였고(Hall et al., Virus Res. 22:173-84 (1992)), 농도를 log10TCID50/ml로 표시하였다.
햄스터의 호흡관에서 PIV의 복제
rPIV3/JS, rPIV3-1, PIV1/Wash64를 105pfu로 포함하는 L-15배지 0.1ml를 비강으로 12마리의 골든 시리안 햄스터 그룹에게 각각 접종하였다. 접종후 4일 및 5일째에, 각 그룹에서 6마리의 햄스터를 희생시키고, 이들의 폐 및 코갑개골을 수확하여 균질화하고, 샘플에 존재하는 바이러스를 32℃ LLC-MK2 단층세포상에서 농도를 측정하였다. 상기 농도를 각 그룹의 6마리 햄스터에 대해서 평균log10TCID50/ml로 표시하였다.
결과
키메릭 바이러스 rPIV3-1로부터 회수된 완전한 길이의 키메릭 PIV3-1 안티게놈 RNA을 코딩하는 cDNA의 구조물
위에서 언급한 바와 같이, JS 야생형 PIV3 HN 및 F 당단백질 유전자의 ORF가 PIV1/Wash64의 코딩 서열의 것으로 대체된 PIV3 및 PIV1 키메릭 cDNA의 최종 구조물(도 14)은 15,516nt의 PIV3-1 키메릭 안티게놈 RNA 을 코딩하며, 이는 6배 규칙과 일치한다(Durbin et al., Virology 234:74-78 (1997)). 키메릭 PIV3-1 안티게놈을 코딩하는 pFLC.2G+.hc cDNA로 HEp-2세포를 N, P, 및 L 보조플라스미드와 함께 감염시켰다. 키메릭 PIV3-1 안티게놈을 코딩하는 pFLC.2G+.hc cDNA로 HEp-2세포를 N, P, 및 L 보조플라스미드와 함께 감염시켰다. JS wt rPIV3 안티게놈을 코딩하는 p3/7(131)2G cDNA로 동일하게 감염시켜 rPIV3대조구 모바이러스를 제조하였다. 각 형질감염으로부터 회수하고 이어서 LLC-MK2에서 두번째 증폭을 하였고, 각 재조합 바이러스가 cDNA로부터 유래된 것인지를 확인하기 위한 연구를 개시하였다.
혈청형-특이적 항-HN 단클론항체 및 다클론항체를 사용하여 HAI 분석으로 PIV1 또는 PIV3 HN당단백질의 존재를 먼저 분석하였다. 표 12에 나타낸 바와 같이, 예상한 대로 rPIV3는 단지 두 PIV3 mAb중 하나와만 반응하였으나, 그의 생물학적 유래 모 PIV3/JS는 둘다와 반응하였다. 이것은 rPIV3가 cDNA로부터 유래된 것임을 표시하는 도입된 MARM변이를 함유하고 있음을 확인하는 것이다. rPIV3-1 바이러스는 PIV1 HN 당단백질에 특이적인 항체와 반응하였으나, PIV3 또는 PIV2의 HN에 특이적인 항체와는 반응하지 않았다는 사실은, 상기 바이러스가 예상한대로 PIV1 HN유전자를 가짐을 나타낸다.
다음으로, rPIV3-1 바이러스는 가공된 키메릭 PIV3-1 HN 및 F유전자를 함유함을 확이하였다. 고안된 대로, rPIV3-1의 유전적 구조는 그의 모바이러스 PIV1/Wash64,또는 rPIV3/JS중 어느 것에 비하여 4개 접합부분에서 유일하다(도 15A의 박스). 이 영역은, 서열이 PIV3 비코딩영역에서 PIV1코딩으로 영역으로, 그다음 PIV1코딩영역에서 PIV3 비코딩영역으로 변환되는 전이점이다. PIV3 M 및 L에 특이적인 프라이머쌍 A, 또는 PIV1 M에 특이적인 프라이머쌍 B 및 HN 유전자의 3'말단을 사용하여, rPIV3-1, rPIV3/JS, PIV1/Wash64로부터 비리온-유래 RNA을 위한, RT-PCR산물을 제조하였다. 대조반응은, RT-PCR산물의 생성에 RT단계가 필요하다는 것을 나타내며, 이는 오염 DNA가 아니라 RNA주형이 RT-PCR산물의 제조에 필요하다는 것이다. rPIV3-1이 키메릭 바이러스라는 초기 제시는, 단지 PIV3-특이적 프라이머쌍 A만이 F 및 HN유전자에 걸치는 예상된 4.6kb cDNA상물을 생성한다는 발견에서 얻는다(도 15B). 따라서, rPIV3-1 바이러스는 단지 HPIV1-특이적 HN당단백질만을 포함하는 반면에(표 12), 비코딩영역은 PIV3에 특이적이다. 역으로, PIV1 특이적 프라이머쌍 B는 PIV1 대조구로부터 적절한 크기로 증폭되나, rPIV3-1로부터는 아니다. 제한효소분해 분석법은, rPIV3-1 RT-PCR 산물은 rPIV3/JS PIV1/Wash64와는 다른 제한효소 패턴을 가지며, 그의 예상된 서열에 적합하다.
rPIV3-1의 4.6kb RT-PCR산물의 뉴클레오타이드 서열을 4영역에서 결정하고(도 15A), rPIV3/JS 및 PIV1/Wash64와 비교하였다(도 16). rPIV3-1 서열은 이에서 유래된 cDNA와 완전히 일치하였다. 세가지 RT-PCR 산물에 대한 영역 I-IV의 서열배영의 조사는, rPIV3-1은 변형된 개시 및 종료코돈을 가지고 PIV3의 5'및 3'비코딩영역으로 둘러싸인 rPIV1 F 및 HN 당단백질 ORF을 가진다는 것을 설명한다. rPIV3/JS 또는 PIV1/Wash64와 나란히 비교하여, rPIV3-1의 영역 III 및 IV에 걸치는 서열 래더(ladder)의 예를 측정하였다(도 17). 이러한 분석은, rPIV3-1이 유래된 cDNA와 그 구조가 완전히 일치하는 재조합 키메릭 바이러스임을 확인하였다.
생체외에서 rPIV3-1의 트립신-의존성 및 세포변성(cytopathicity)
센다이 바이러스와 유사하나 PIV3와 대조적으로, PIV1은 계속적인 조직세포주상에서 다수의 주기로 복제하기 위해서, 그의 F 당단백질의 절단에 트립신이 요구된다(Frank et al., J.Clin. Microbiol. 10:32-6 (1979)). 추가로, PIV3가 쉽게 광범위한 CPE를 생성함에 비해, PIV1은 비세포변성 바이러스이다(Collins et al., In fields Virology, 3rd ed., 1:1205-43 (1996)). 이러한 특성에 기초하여 rPIV3-1, rPIV3, PIV1/Wash64를 비교하였다. PIV1/Wash64와 마찬가지로, rPIV3-1은 기니아피그가 아니라 닭의 적혈구를 이용하여 분석하면 더 높은 HA농도를 가진다(표 13). PIV1/Wash64 모바이러스와 마찬가지로, rPIV3-1은 효과적인 플락형성뿐만 아니라 액상중층의 배양물에서 효과적인 복제를 위해서는 트립신을 요구한다. rPIV3-1은 32, 37, 또는 40℃에서 비슷한 효율로 플락을 형성한다. 따라서, rPIV3-1이 PIV1 모바이러스의 F당단백질을 가지나 온도민감성이 아님은 분명하다. 다른 한편, 세포주기 및 바이러스 감염 다층에서 분리로 나타난 바와 같이, rPIV3-1가 그의 PIV3 모바이러스와 같은 정도로 CPE를 생산한다는 것은 이 생물학적 특성이 HN 및 F 코딩영역의 바깥에 존재하는 그의 PIV3유전자의 기능임을 제시한다. 따라서, rPIV3-1은 두 모바이러스로부터 유래된 생물학적 특성을 지니며, 이러한 사실은 이것이 키메릭 바이러스라는 발견과 일치한다. 본발명의 범위내인 이 전형적인 재조합, 키메릭 바이러스를 부다페스트 조약에 따라 미국 매릴랜드 20852, 록빌, 파크론 드라이드 12301에 위치한 ATCC에 1998년 5월 21에 기탁하였다.
LLC-MK2세포 및 햄스터에서 rPIV3-1과 이의 모바이러스의 복제비교
LLC-MK2 조직배양물 세포위에 moi 0.01로 접종하고 rPIV3, rPIV3-1, PIV1 Wash64의 복제 다중주기를 관찰하였다(도 18).상기 세 바이러스의 복제수준의 크기 및 동역학이 유사함을 알 수 있다. 이는 PIV3의 HN 및 F유전자에 대해 PIV1의 HN 및 F유전자의치혼이 생체외에서 바이러스를 약독화시키지 않음을 나타낸다. 다음으로, rPIV3-1이 생체내의 약독화, 특히 햄스터의 상부 및 하부 호흡관에서 복제를 측정하였다(표 14). rPIV3-1의 관찰된 복제수준은 약간 크지 않다면, 햄스터의 상부 및 하부 호흡관에서의 모바이러스와 동일하였다.
요약하면, 본 실시예는 rPIV1의 HN 및 F가 PIV3의 HN및 F유전자로 치환된 rPIV3-1 키메릭 바이러스의 회수가 성공적임을 설명한다. 이 키메릭 바이러스는 그의 야생형 PIV1 및 PIV3 모바이러스와 마찬가지로 생체외 및 생체내에서 복제하였으며, 이러한 사실은 당단백질 ORF의 치환이 rPIV3-1을 약독화시키지 않음을 나타낸다. PIV1의 HN및 F당단백질을 갖는 재조합 PIV3의 성공적인 회수는 놀라운 것이다. 왜냐하면, 다른 혈청형(serotype)을 나타내는 두 바이러스가 밀접하게 연결되어 있지 않기 때문이다. 특히, 두 모바이러스 뿐만 아니라 키메릭 재조합 바이러스가 성장한다는 것은 주목할 만하다. 주목할만하게도, 당단백질 유전자상의 치환을 갖는 키메릭 재조합 바이러스는 또한 소포 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus)에 대새서도 회수된다(Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4477-81 (1995)). 구체적으로, 인디아나 혈청형의 VSV G당단백질을 단지 50%의 아미노산 동일성을 가지는 뉴저지 혈청형으로 치환하였다. rPIV3-1과 대조적으로, 키메릭 재조합 VSVI/NJ는 재조합 VSVI또는 생물학적 유래 VSV의 수준의 10%로 복제된다.
본실시예에서, HN 및 F당단백질은 PIV1과 PIV3사이에 43% 및 47%의 서열동일성을 가진다. 두 당단백질을 함께 전달하는 것은 당단백질-대-당단백질의 비호환성을 제거할 것이다(Tanabayashi, K. and Compans, R.W. J. Virol. 70:6 112-18 (1996)). 다른 한편, 당단백질은 이들의 세포질쪽 도메인(CT) 또는 막관통(TM) 도메인을 통해 M당백질(PIV1 와 PIV3간에 63% 서열동일성이 있음)과 상호작용하며, 이러한 상호작용이 비리온 형태생성에 중요함은 일반적으로 알려져 있다. 이러한 점에서, TM 및 CT도메인에서 두 혈청형의 HN 및 F당단백질간의 서열동일성의 정도는 낮다: TM 도메인에 대해서 각각 30%와 20%이고, CT도메인에 대해서 각각 9%와 11%이다. 이런 낮은 수준의 서열 관련성에 비추어, 각 당단백질의 PIV1 외부 도메인이 PIV3 TM 및 CT 도메인에 융합된 키메릭 당단백질을 제조하는 동일한 전략을 추구할 수 있다. M 단백질과 다른 내부 단백질과의 가능한 상호작용과 관련하여, 전하띤 아미노산의 배열과 같은 보존된 구조가 보존된 서열보다 중요하다. 또는, 당단백질의 TM 및 CT 도메인과 내부 단백질간의 상호작용이 이전에 생각된 것보다 훨씬 중요할 거이다. 본명세서에서 제ㅈ공된 도구와 방법을 사용하여 이러한 인자들을 더욱 자세히 조사할 수 있을 것이다. 예를 들면, 이러한 인자들은 PIV2의 HN 및 F를 갖는 PIV3 를 제조하기 위하여 상기 기술된 방법을 적용함에 의해서 추가로 명백해질 것이다.
rPIV3-1은 PIV1 F당단백질에 의해 부여되는 특성때문에 효과적인 복제를위해는 트립신이 필요할 것임을 예상할 수 있으며, 이러한 것은 흔히 발견되는 것이다. 그러나, PIV3 모바이러스와 더욱 유사하게도 rPIV3-1이 CPE를 초래한다는 것을 흥미롭다. 이러한 사실은 HN 또는 F이외에 PIV3의 유전자가 이러한 표현형을 특정함을 나타낸다. 비세포변성 PIV1 및 세포변성 PIV3간에 추가적인 유전자의 교환으 위해서 본명세서에서 제공된 방법과 도구를 사용함으로써, 이러한 역할은 또한 추가로 밝혀질 것이다.
실시예 XII
PIV3 유형의 내부 단백질과 PIV 1유형의 표면 당단백질을 코딩하는 살아있는-약독화 키메릭 재조합 PIV의 회수
본 실시예에서, 살아있는-약독화 cp45 PIV3 백신후보 바이러스(rPIV3-1.cp45L이라함)의 L유전자에서 발견된 3개의 온도 민감성 및 약독화 아미노산 코딩변화를 갖는 rPIV3-1 유도체는 동일한 3개 변이를 갖는 재조합 rPIV3-1.cp45L의 것과 유사하게, 38℃의 셧오프온도를 갖는 온도민감성 표현형을 나타내는 것으로 보여준다. rPIV3.cp45L과 같은 정도로, rPIV3-1.cp45L이 햄스터으 호흡관에서 약독화되었다. rPIV3-1.cp45L로 햄스터의 감염으로 wt PIV1에 대해 헤마글루티닌-저해 항체의 중간수준을 나타냈으며, 야생형 PIV1로 자극에 대한 완전한 내성을 유도하였다. 이것은 본발명이 약독화 키메릭 PIV는 PIV1에 대해서 매우 효과적인 면역반응을 유도할 수 있는 것이다. 이러한 기재는 또한 파라인클루엔자 바이러스의 표면 당단백질이 동질 바이러스 자극에 대한 높은 수준의 내성을 유도하는데 충분하다는 것을 나타내는 상기 자료를 확인한다. 예기치 못하게도, PIV1의 표면 당단백질 및 PIV3의 내부 유전자을 가지는 재조합 키메릭 바이러스 rPIV3-1.cp45L 또는 rPIV3-1도 또한 PIV3자극 바이러스의 복제에 대하여 중간수준의 내성을 유도한다. 이는 PIV3의 내부 유전자가 독립적으로 설치류에서 PIV3 에 대한 보호면역을 유도할 수 있음을 나타낸다. 따라서 본명세서에 기술된 대로, PIV3에 대한 역 유전적 시스템은 받아들여진 모델 대상에서 약독화되고 보호되는 살아있는 약독화 PIV1백신호부를 제조한다.
바이러스 및 세포
본연구에서 사용된 wt PIV1은 PIV1/Washinton/20993/1964 (Murphy et al. Infect. Immun. 12:62, 1975, 본문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)이다. PIV3 HN 및 F ORF가 상기한 바대로 및 Tao등의 J. Virol 72:2955-1998(본문헌을 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 기재된 대로 PIV1/Wash64로 치환된 키메릭 PIV3 cDNA로부터 키메릭 rPIV3-1을 회수된다. 50 ㎍/ml 젠타미신 설페이트 및 0.75㎍/ml 트립신(카탈로그 번호 3741, Worthington Biochemical Corp., Freehold. NJ)이 보충된 Opti-MEM (Life Technologies)에서 LLC-MK2 세포(ATCC CCL 7.1)에서 상기 바이러스를 증식하였다. 이러한 조건에서 성장시킬 때 PIV3가 아닌 PIV1의 F당단배질은 절단을 위해 외부 트립신에 의존적이기 때문에, 트립신이 포함된다. 사람 PIV3 바이러스의 wt JS 균주 및 cDNA로부터 유래된 이의 재조합 유도체(rPIV3/JS)를 상기한 대로 및 Durbin등의 Virology 235:323, 1997 (본문헌을 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 기재된 대로 증폭하였다. cp45, wt PIV3/JS의 약독화 유도체(Karron et al., J. Infect. Dis 171:1107, 1995(본문헌을 본명세서의 참고문헌으로 병합됨), 및 cp45의 L유전자에서 발견된 세개의 ts 변이를 가지는 재조합 PIV3인 rPIV3cp45L을 상기한 대로 및 Skiadopoulos 등의 J. Virol. 72:1762, 1998(본문헌을 그 전체로서 본명세서의 참고문헌으로 병합됨)에 기술된 대로 증폭하였다. 박테리오파지 T7 RNA폴리머라제를 발현하는 변형된 백시니아 안카라(MVA)는 Virology 210:1995에 기술되어 있다(본 문헌 전체를 참고문헌으로 본명세서에 병합함).
형질감염에 사용된 HEp-2세포는 ATCC(ATCC CCL 23)에서 얻어서 50㎍/ml 젠타미신 설페이트, 및 2%의 소태아 혈청(FBS)를 포함하는 Opti-MEM I에서 유지하였다.
L변이를 안티게놈 cDNA로 도입
상기한 대로(Skiadopoulos et al., J Virol 72:1762, 1998), pTM(L)942/992/1558 플라스미드에 존재하는 cp45의 세개 L변이를 2.8kb Sph I-Nhe I 단편(PIV3 안티게놈 cDNA에서 11313 nt 내지 14092 nt)로서 키메릭 cDNA pFLC.2G+.hc(Tao et al., J Virol 72:2955, 1998)로 도입하여 PIV1 F 및 HN ORF, 및 cp45 L의 세개 변이을 가진 완전한 길이의 pFLC.2G+.hc.cp45 L을 제조한다(도 29). pTM(L)942/992/1558에 존재하는 구체적 변이를 도 19에서 설명으로 나타낸다.
형질감염
6웰 플레이트에서 HEp-2 단층세포를 풍부하게 성장하였으며, 상기한 대로(Tao et al., J Virol 72:2955, 1998) 형질감염을 수행하였다. 4일째 수확하기전에 형질감염후 3일째에 최종농도 0.75㎍/ml가 되도록 트립신을 첨가하였다. 세포배양물 상징액을 분획하고 신선한 LLC-MK2세포단층에 계대배양하였다(계대배양 1이라 함). 하룻밤 흡착한 후에, 배지를 0.75 ㎍/ml 트립신을 함유한 신선한 Opti-MEM I으로 바꾸었다. 계대배양 1 배양물을 32℃에서 4시간동안 배양하고, 상등액에 존재하는 바이러스를 수확하고 동일한 조건에서 계대배양하였다(계대배양 2라 함). 상기에 기재된 대로(Tao et al., J Virol 72:2955, 1998), 헤마글루티닌-저해 (HAI)분석법으로 PIV1 HN단백질의 존재에 대해서 계대배양 2의 수확물에 존재하는 바이러스를 테스트하였다.
다양한 온도에서 LLC-MK2에서 PIV의 복제
PIV1, rPIV3-1 rPIV3-1.cp45L의 경우에 아가로스 중층에 0.75㎍/ml의 트립신이 첨가된 LLC-MK2 단층에서 플락계산을 상기한 대로 수행하였다(Tao et al., J Virol 72: 2955, 1998). 6일간 다양한 온도에서 배양한 후에, 아가로스 중충을 제거하고 기니아피그 적혈구를 사용한 혈액 흡착법으로 플락을 확인하였다.
햄스터의 호흡관에서 PIV의 복제
rPIV3/JS, rPIV3.cp45L, cp45, PIV1/Wash64, rPIV3-1 또는 rPIV3-1.cp45L을 105pfu로 포함하는 L-15배지 0.1ml를 비강으로 5마리의 골든 시리안 햄스터 그룹에게 각각 접종하였다. 접종후 4일째에 햄스터를 희생하고, 이들의 폐 및 코갑개골을 수확하여 균질화하고, 상기한 대로 및 Tao등의 J Virol 72:2955, 1998에 기재된 대로 샘플에 존재하는 바이러스를 32℃ LLC-MK2 단층세포상에서 농도를 측정하였다. 상기 농도를 각 그룹의 6마리 햄스터에 대해서 평균log10TCID50/각 그룹의 조직 그램으로 표시하였다.
햄스터에서 면역 및 자극연구
상기한 대로, 햄스터당 105pfu 바이러스로 10마리 햄스터 그룹에게 비강으로 면역화하였다. 감염전 및 33일째에 HAI분석을 위한 혈청을 수집하였다. 항체로서 PIV1/Wash64 및 PIV3/JS10를 사용하여, 마리 햄스터의 각 그룹의 혈청에 존재하는 HAI항체 수준을 결정하고, 결정된 HAI 농도를 평균 log2로 표시하였다(Tao et al., J Virol 72:2955, 1998).
면역후 35일째, 각 그룹에서 5마리의 햄스터를 PIV1/Wash64 또는 rPIV3/JS로 105pfu로 비강으로 자극하였다. 이들 자극된 햄스터의 코갑개골 및 폐을 자극후 4일 째에 수확하였다. 상기한 대로 및 Tao등의 J. Virol 72:2955, 1998에 기재된 대로, LLC-MK2세포에서 조직 샘플에 존재하는 바이러스 농도를 결정하고, 농도는 평균log10TCID50/조직그램으로 표시하였다.
결과
재조합 키메릭 바이러스 rPIV3-1.cp45L의 회수 및 특성화
상기한 바와 같이, PIV3의 F 및 HN를 코딩하는 ORF를 PIV1의 것으로 치환한, PIV3의 완전한 길이의 안티게놈 cDNA인, cDNA 클론 pFLC.2G+.hc를 cp45의 L단백질에서확인된 세개 아미노산 코딩변화를 도입함으로써(L단백질상의 아미노산 위치에 따라서 942, 992, 1558로 지정함) 변형시켰으며, 독립적인 ts 및 att변이를 나타낸다(eh19; Skidopouls et al., J. Virol 72:1762, 1998). 자연적으로 존재하는 제한효소자리를 제거하는 연속적으로 번역하는 발현되지 않는 뉴클레오타이드 치환을 함께 도입함으로써 각 코딩변화를 표시하였다(도 19; 표 8). 최종 완전한 기링의 플라스미드 구조물, pFLC.2G+.cp45L(도 19)는 15516 뉴클레오타이드 길이를 가진 PIV3-1 키메릭 재조합 RNA를 코딩하며, 6배 규칙과 일치한다(Durbin et al., Virology 234:74, 1997, 본문헌을 그 전체로서 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). 적합한 제한효소의 분해로 pFLC.2G+.cp45L의 존재를 확인하였다. 상기한 대로 및 Tao등의 J. Virol 72:2955, 1998에 기재된 대로, pFLC.2G+.cp45L cDNA로 HEp-2세포를 PIV3 N, P 및 L 보조플라스미드와 함께 감염시키고, MVA-T7에 감염시켰다. LLC-MK2 세포에서 2회 계대배양한 후에 회수된 바이러슨, rPIV3-1.cp45L를 플락-대-플락-대-플락 계대배양으로 생물학적으로 클로닝하였고, 상기 바이러스가 PIV1당단백질 및 L유전자에 도입된 세개의 변이를 가지는 지를 확인하기 위해서 증폭된 바이러스를 분석하였다. 먼저, 상기한 대로 및 Tao등의 J. Virol 72:2955, 1998에 기재된 대로, HAI 분석에서 PIV1 특이적 항체와의 반응성으로 rPIV3-1.cp45L에서 PIV1 HN 단백질의 존재를 확인하였다. 상기한 대로 및 Tao등의 J. Virol 72:2955, 1998에 기재된 대로, 비리온 RNA에서 생성된 RT-PCR 산물의 제한효소분해 또는 뉴클레오타이드 서열분석으로 rPIV3-1.cp45L 게놈 RNA에서 도입된 L유전자 변이뿐만 아니라 키메릭 PIV3-1 HN 및 F 유전자의 존재를 확인하였다. 이러한 자료는 rPIV3-1.cp45L이 cp45의 L유전자의 3개 코돈치환을 갖는 재조합 키메릭 바이러스임을 확인하였다.
rPIV3-1.cp45L는 온도민감성이다.
cp45의 세개 L 유전자 변이가 wt PIV3로 도입된 경우에 ts 표현형에 기여함이 상기에서 나타나고 있다(Skiadopoulos et al. J. Virol 72:1762, 1998). 키메릭 바이러스에서 이들의 존재가 동일한 효과를 가지는지를 확인하기 위해서, rPIV3-1.cp45L의 플락형성율을 다양한 온도에서 결정하였다. 표 15에서 나타난 바와 같이, 세개의 L유전자 변이가 키메릭 바이러스에 ts 표현형을 부여하였다. 재조합 바이러스 rPIV3-1.cp45L 및 rPIV3.cp45L에서 cp45 L변이에 의한 구체화되는 온도민감성의 수준은 동일하며(표 15), 이는 변이의 효과가 PIV3 또는 PIV1의 HN 및 F 당단백질에 독립적임을 나타낸다. 비록 rPIV3-1.cp45L이 L유전자의 바깥에 변이를 가지고 있을 지라도, rPIV3-1.cp45L 및 rPIV3.cp45L의 온도민감성 수준이 생물학적 유래 cp45바이러스의 것과 동등하다(Strokes et al., Virus Res 30:43, 1993,본문헌을 본명세서의 참고문헌으로 병합됨).
햄스터에서 rPIV3-1.cp45L의 복제수준
cp45의 세개 L유전자 변이가 wt PIV3에 도입된 경우에 햄스터의 상부 및 하부 호흡관에서 바이러스 복제의 약독화에 기여함으로 앞에서 나타냈다(Skiadopouls et al., J. Virol 72:1762, 1998). 표 16에서 나타낸 바와 같이, 햄스터에 비강감염에 의해서 키메릭 바이러스에 대한 이러한 효과를 측정하였다. 이러한 발견은 rPIV3-1.cp45L가 두자리 모두에서 약독화되고, 더구나 그 약독화 수준이 rPIV3.cp45L와 동등하다는 것을 나타낸다. 따라서, 온도 민감성과 마찬가지로, cp 45 L변이가 약독화에 기여하는 능력은 표면 당단백질의 항원특이성과 독립적이다.
PIV3의 내부 단백질 및 PIV1의 당단백질을 포함하는, rPIV3-1.cp45L 또는 rPIV3-1의 감염은 햄스터에서 PIV1자극에 대한 내성을 부여한다.
햄스터에서 면역원성과 보호효율성에 대해 키메릭 rPIV3-1 및 이의 약독화 바이러스 rPIV3-1.cp45L 유도체를 측정하였다. 표 17에 나타낸 바와 같이, 둘중 어느 하나의 감염으로 PIV3가아니라 PIV1에 대한 HAI항체를 유도하며, 이러한 사실은 이들 키메릭 바이러스가 PIV1 HN 당단백질을 가지며 매우 면역원성이 크다는 것을 확인하였다. rPIV3-1.cp45L에 의해 유도되는 HAI 항체의 수준은 rPIV3-1의 것보다 2배 낮다는 사실은, 그의 약독화가 중간 수준의 면역원성 감소를 초래한다는 것을 나타낸다. 유사하게, rPIV3 alc rPIV3.cp45L는 PIV1이 아니라 PIV3에 대한 HAI항체를 유도하며, 약독화 바이러스에 의해 유도되는 수준는 약 2배 더 낮다. cp45 L변이를 갖는 재조합 바이러스의 햄스터에서의 복제가 제한될 지라도, rPIV3.cp45L 또는 rPIV3-1.cp45L의 감염이 동종 당단백질을 갖는 자극 바이러스의 복제에 대하여 완전한 내성을 유도한다.
또한 rPIV3-1.cp45L감염이 PIV3에 대한 내성을 부여한다.
내성면에서 PIV의 비NH 또는 F당단백질(내부 단배질)의 역활에 관한 정보는 제한되어 있다. 면역화 및 자극 바이러스의 복제가 공유한 유일한 유전자들이 내부 단배질 유전자이기 때문에, 본명세서에서 rPIV3-1 및 rPIV3-1.cp45L의 기재 및 용도는 PIV3의 자극에 대한 내성에 있어서 내부단백질의 역할을 조사하는 기회를 제공한다. PIV3 자극 바이러스의 복제는 rPIV3-1 또는 rPIV3-1.cp45L로 햄스터를 감염시킴으로써 상부 및 하부 호흡관 모두에서 상당히 제한되었다(표 17). 따라서 이러한 자료는 HN 및 F단백질과 마찬가지로, PIV3의 내부 단백질이 자극 PIV3의 복제에 대한 부분적인 내성을 유도할 수 있다.
상기의 면역원성 및 효율 연구에 의해서 설명되는 발견중에서, 특히 예상치 못한 발견은 wt 및 att rPIV3의 감염이 폐에서 PIV1 자극 바이러스의 복제가 100배 감소한다는 것이다. 따라스, 하나의 혈청형 PIV로 감염시킴으로써 이종 혈청형에 대한 상당한 보호를 할 수 있다. 이전의 연구는 한가지 유형의 사람 PIV로 동물을 감염시킴으로써 다른 사람 혈청형에 속하는 PIV에 대한 상당한 이종보호를 유도할 수 없으며, 이는 사람 PIV감염에 대한 면역은 주로 유형특이적이다는 것과 일치하기 때문에, 이러한 발겨은 부분적으로 예기치 못한 것이다(e.g., Cook et al., Amer. Jour. Hyg. 77:150, 1963; Ray et al. J. Infect. Dis. 162:746, 1990, 각각의 문헌은 그 전체로서 본명세서에 참고문헌으로 병합됨).
본실시예는 PIV1에 대한 살아있는 약독화 바이러스 백신후보의 빠리고 합리적인 개발을 추가로 제공하기 위해, PIV3 백신의 생산을 위해 개발된 시약 및 새로운 개발 방법을 설명하는 것이다. 이들의 PIV3대응부에 대한 PIV3 HN 및 F 보호항원을 코딩하는 ORF의 치환함으로써 감염성 PIV3를 코딩하는 cDNA를 변형시켰다. 이어서, 예를 들면, cp45 PIV3의 L유전자에 있는 세개 약독화 변이와 같은 약독화 변이를 이들 변형된 키메릭 PIV3-PIV1 cDNA내로 도입하였다. cDNA로부터 PIV1의 HN 및 F유전자, PIV3의 내부 단백질 및 PIV3 cp45 L유전자 변이를 갖는 재조합 바이러스를 회수하였다. 이 재조합체, 즉 PIV3-1.cp45L는 온도민감성이며, 햄스터에서 매우 약독화되었으며, 햄스터에서 PIV1의 자극에 대해 큰 내성이 있었다. PIV3-1.cp45L의 온도민감성, 약독화, 및 면역원성의 수준은 cp45 PIV3와 유사하였으며, 이는 cp45 L유전자변이의 셋에 의한 표현형이 HN 및 F 표면 당단백질과 독립적임을 나타낸다. 이러한 발견은 역유전학에 의해서 생성된 첫번째 살아있는 약독화 PIV1 백신 후보를 나타내며, PIV1에 대한 백신의 개발에 일반적으로 성공적인 방법을 제공한다.
파라인플루엔자 바이러스의 내부 단백질이 이종 바이러스의 재감염에 대한 내성을 가지는 역할에 관한 정보가 거의 없다. N, N내에 에페토프, 또는 M을 발현하는 백시니아 재조합체로 감염시킴으로써 자극 바이러스의 복제에 대한 내성이 유도된다고 보고되나, 그 내성의 크기는 HN 또는 F당단백질을 갖는 백시니아 재조합체에 의한 것보다 적다(Kast et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2283, 1991; Thomson et al., J. Immunol. 157:822, 1996, 각 문헌은 그 전체로서 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). 이들 연구는, 내부 단백질이 단지 재감염에 대한 내성에 부수적인 기여을 한다는 것을 제시하고 있다. 따라서, 본명세서는, rPIV3-1.c45L, 또는 rPIV3-1로 햄스터를 전게 감염시킴으로써 폐 및 코갑개골에서 PIV3의 복제가 250 배 내지 4000배 감소함을 보임으로써 예기치 못한 결과를 제시한다. 이들 두 키메릭 재조합 바이러스는 PIV3가 아니라 PIV1의 HN 및 F당단백질을 가지나 자극바이러스와 모든 다른 유전자를 공유한다는 점에서, PIV3 자극 바이러스와 다르다. PIV3가 아닌 PIV1의 HN 및 F당단배질은 PIV3의 것과 각각 47% 및 43%의 서열동일성을 공유한다. 공유된 내부 단백질이 관찰된 내성을 매개하는 것같을 지라도, 또한 PIV1 및 PIV3의 HN 및 F당단배질간에 공유한 단백질 서열이 관찰된 면역성에 기여할 수도 있다. 예를 들면, PIV1및 PIV3사이에 공유된, 적어도 9개 아미노산잔기로 걸쳐있는 HN에 5스트레치 및 F에 2개 스트레치(strech)가 있어 보호 CTL에피토페로서 작용할 잠재력이 있다. 공유된 내부 단백질이 wt PIV3 자극 바이러스의 복제제한에 기여한다로 여기는 것인 합리적일 수 있다. 왜냐하면 이러한 수준의 교차면역성은 이전 연구에서는 없었던 것이기 때문이다(Cook et al., Amer Jour. Hyg. 77:150, 1963, 본문헌은 그 전체로서 본명세서에 참고문헌으로 병합됨).
rPIV3-1,및 PIV3-1.cp45L 키메라의 내부 PIV3 단백질이 PIV3 자극 바이러스에 대한 내성을 부여한다는 발견은 PIV3의 약독화 유도체가 PIV1 및 PIV2 보호항원에대한 벡터로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다. 본발명의 개시에 따르면, 하나의 PIV3-기초한 살아있는-약독화 백시니아 바이러스로 면역화함으로써 후속적으로 투여한 다른 PIV3-기초한 백신 바이러스의 복제를 제한함으로써 두번째 바이러스의 면역원성을 감소시킬 수 있다. RSV와 같이, PIV3는 영아에 있어서 상당한 질병을 유도하기 때문에, 2-4주 유아에게 사용하기 위한 RSV-PIV3 복합 백신이 본발명의 주요한 점이다(Collins et al., Fields Virology 3rd ed. Philadelphia: Lipponcott-Raven Publishers, 1204(1), 1996; Reed et al., J. Infect. Dis. 175L807, 1997, 상기 각문헌을 그 전체로서 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). 본발명의 이러한 점에 따르면, 대부분의 PIV1 및 PIV2 질병은 6개월이후에 발생하기 때문에, PIV1-PIV2 백신의 면역화는 약 생후 6개월에 시작하는 것이 바람직하다. rPIV3cp45에 의한 면역으로 이것이 내부 단백질 유전자를 공유하는 키메릭 재조합 PIV3-1 백신 바이러스의 복제를 상당히 저해가능한 조건에서, 재조합 PIV3-1 백신의 성공적인 면역화를 이룰 수 있다. 이러한 경우에, 삼중 PIV백신을 순차적이 아니라 동싱에 투여함으로써, 상기 언급한 저해를 방지할 수 있을 것이다. 백신 또는 wt PIV3의 감염이 이종 wt PIV1의 폐 바이러스 복제를 100배 감소시킬 것이라는 본명세서의 기재는, 분명히 예기치 못한 것이다. 그 이유는 부분적으로 사람의 PIV바이러스는 혈청학적으로 무력화분석에 의한 것과 다르며, 햄스터에서 이전연구는 한가지 유형의 PIV의 이전 감염이 다른 PIV 유형을 높은 투여량의 자극에 대하여 내성을 유도하지 못하였기 때문이다(Cook et al., Amer. Jour. Hyg. 77:150, 1963; Ray et al., J. Infect. Dis. 162: 746, 1990; Cook et al., Amer, Jour, Hyg, 69:250, 1959). 더욱이, 한 PIV의 이전감염은 이종유형의 PIV의 후속적인 감염을 상당히 변형시킨다는 약간의 전염병 자료가 있다.
요약하면, 본발명의 실시예는 F 및 HN당단백질을 코딩하는 ORF를 치환함으로써, 알려진 약독화 변이를 PIV3 내부 유전자에 도입함으로써, rPIV3를 PIV1에 대한 백신으로 성공적로 변환시킨 것을 보여준다. 따라서 본명세서에서 제공된 다양한 방법과 도구는 직접적으로 및 예측하건데 살아있는-약독화 PIV2 백신 바이러스의 생성뿐만 아니라, rPIV3-1키메릭 바이러스의 PIV3 골격을 약독화시키는데 적용할 수 있다.
상기 개시를 통해, 본명세서에서 PIV 및 관련 백신의 광범위한 조합을 위한 개발방법 및 도구를 제공한다. 이러한 맥락에서, PIV3 및 PIV2사이에 살아있는 면역원성 키메라는 백신용 재조합 PIV 바이러스를 개발하는 강력하고 새로운 도구를 제공한다. 이러한 연구와 관련하여, 자연적으로 일어나는 PIV변이, 예를 들면 cp45 및 BPIV3백신 후보의 약독화에 대한 본발명에 기재한 기술에 따른 유전적 기초의 동정과 특성화도 재조합 백신후보의 다양한 숙주와 서브바이러스 입자의 개발을 가능하게 한다. 특히, 상기한 바와 같이, 생물학적 유래 변이 바이러스에 존재하는 바람직한 변이를 단독으로 또는 공동으로 야생형, 부분적으로 약독화된 또는 키메릭 PIV환경으로 도입함으로써 용이하게 확인하고 선택할 수 있을 것이다. 이러한 발견은, 본발명의 범위내에서 백신 재조합체에서 약독화 및 면역원성을 조절하기 위해 PIV클론으로 도입될 수 있는 전형적인 약독화 변이의 메뉴를 확장할 것이다. 또한, 생물학적 유래 변이를 다른 유형의 변이를 갖는, 예를 들면 유전자 또는 유전자 단편의 삭제, 치환, 또는 변형에 관련된 변이를 갖는 PIV클론내로 도입할 수 있다. 본발명의 이러한 점내에서, C, D V ORF이 결실된 rPIV와 같은 선택된 유전자의 삭제, 첨가 또는 치환을 갖는 재조합 PIV를 제공한다. 본명세서에 따라, 생물학적으로 유래된 변이 PIV로부터 채택된 ts, ca 또는 att표현형중 하나이상의 변이, 예를 들면, r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558 r942/1558, r942/992/1558을 도입함으로써 상기 택일적으로 변이된 클론를 추가로 변형시킬 수 있다. 본 발명의 추가의 양상에서, 생물학적으로 유래된 변이를 자연에 존재하지 않는 원시적 약독화 변이, 예컨대 유전자, C, D 또는 V ORF의 결실과 결합할 수 있다. 1997년 7월 15일에 출원된 미국 특허출원 제 08/892, 403호(본문헌은 본명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 기재된 재조합 RSV 백신 균주에 대해 기술된 조합변이의 범위와 유사하게, 원하는 표현형적 특징을 부여하는 본명세서에 기재된 다른 유형의 변이도 또한 생물학적으로 유래된, 약독화 변이와 결합될 수 있다. 유사한 변이를 예를 들면, 키메릭 바이러스로 도입하여 키메릭 백신 균주에서 바람직한 수준의 약독화 및 면역원성을 달성할 수 있다. 이같은 방식으로, 본발명의 범위내에서 다른 원하는 표현형 특성과 함께 원하는 균형의 약독화와 면역원성을 갖는 다양한 조합의 살아있는 약독화 rPIV백신을 가공하는데 유용한 다양한 메뉴의 변이를 제공한다.
상기 발명을 이해의 명확화를 위해 예시 및 실시예로서 자세히 설명되었을 지라도, 어떠한 변화나 변형도 다음에 첨부된 특허청구범위내에서 가능하다는 것은 명백할 것이다.
특정 구체예의 설명
본 발명은 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자, 바람직하게는 cDNA로부터, 감염성 PIV를 제조 빛 변형시키기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 감염성 PIV 입자는 감염성 PIV 내로 소정의 변경을 도입시킬 수 있는 재조합 공동발현계에 의해 생산한다. 이러한 변형은 소정의 약독화 돌연변이를 나타내는 살아있는 약독화 백신 균주의 개발을 비롯한 광범위한 응용분야에 유용하다.
본 발명의 감염성 PIV는 PIV 게놈 또는 안티게놈 RNA를 코딩하는 하나 이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드와 전사, 복제 뉴클레오캡시드를 생산하는데 필요한 바이러스 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 함께 세포내 또는 무세포 공동발현시킴으로써 제조한다. 감염성 PIV를 생산하기 위한 공동발현에 유용한 바이러스 단백질로는 주요 뉴클레오캡시드 단백질 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 대형 (L) 폴리머라제 단백질, 융합 단백질 (F), 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 당단백질 (HN), 및 매트릭스 (M) 단백질이 있다. 또한 PIV의 C, D 및 V ORFs의 산물도 유용하다.
PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 필요한 바이러스 단백질과 함께 세포내 또는 생체외에서 공동발현시켜 감염성 PIV를 형성시킨다. "PIV 안티게놈"이란 후대개체 (progeny) PIV 게놈을 합성하는데 있어서 템플레이트 역할을 하는 분리된 양성-센스 폴리뉴클레오타이드 분자를 가리킨다. 바람직하게는 전사, 복제 뉴클레오캡시드를 생산하는데 필요한 단백질을 코딩하는 상보적인 서열의 양성-센스 전사체와의 하이브리다이제이션 가능성을 최소화하기 위해 복제 매개물 RNA, 또는 안티게놈에 상응하는 PIV 게놈의 양성-센스 버젼인 cDNA를 구축하는 것이 바람직하다.
본 발명의 몇가지 구체예에서 재조합 PIV (rPIV)의 게놈 또는 안티게놈은 바이러스 또는 서브바이러스 입자로 하여금 감염성을 갖도록 코딩되도록 할 유전자 또는 그의 일부 유전자를 함유하기만 하면 된다. 또한, 상기 유전자 또는 그의 일부는 한가지를 초과하는 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 제공될 수 있다. 즉, 별도의 뉴클레오타이드 분자로부터 상보 또는 그와 유사한 수단에 의해 유전자가 제공될 수 있다. 다른 구체예에서는, PIV 게놈 또는 안티게놈은 플라스미드 또는 헬퍼 세포주에 의해 제공되는 헬퍼 바이러스 또는 바이러스의 작용의 참여 없이 바이러스 성장, 복제 및 감염에 필요한 모든 기능을 코딩할 수 있다.
"재조합 PIV"라 함은 재조합 발현계로부터 직접 또는 간접적으로 유도되거나 또는 그에 의해 생산된 바이러스 또는 서브바이러스 입자로부터 전파된 PIV 또는 PIV-유사 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 가리킨다. 재조합 발현계는 예컨대 PIV RNA로 전사되는 구조 또는 코딩 서열, 프로모터, 및 적절한 전사 개시 및 종결 서열과 같이, 적어도, PIV 유전자 발현에 있어서 조절 기능을 갖는 유전적 요소 또는 요소들의 조립체로 이루어진 작동적으로 연결된 전사 단위를 포함하는 재조합 발현 벡터를 이용하게된다.
cDNA-발현된 PIV 게놈 또는 안티게놈으로부터 감염성 PIV를 제조하기 위해, 게놈 또는 안티게놈을 (i) RNA 복제가능한 뉴클레오캡시드의 제조, 및 (ii)RNA 복제와 전사의 두가지 모두를 수행할 수 있는 자손 뉴클레오캡시드를 제공하는데 필요한 PIV N, P 및 L 단백질과 함께 공동발현시킨다. 게놈 뉴클레오캡시드에 의한 전사에 의해 다른 PIV 단백질이 제공되고 생산적인 감염 (productive infection)이 개시된다. 다른 한편, 생산적 감염에 필요한 부가적인 PIV는 공동발현에 의해 공급되리 수 있다.
예컨대, 전사-번역 결합 반응에 이어 세포내로 형질도입시킴으로써 상기 바이러스 단백질과 PIV 안티게놈 또는 게놈을 함께 합성하는 것 역시 생체외 (무세포)에서 가능하다. 다른 한편, 안티게놈 또는 게놈 RNA는 생체외 합성가능하며 PIV 단백질을 발현하는 세포 내로 형질도입가능하다.
본 발명의 특정 구체예에서, 한가지 이상의 헬퍼 바이러스에 의해 전사, 복제 PIV 뉴클레오캡시드를 생산하는데 필요한 단백질을 코딩하는 상보적인 서열이 제공된다. 이러한 헬퍼 바이러스들은 야생형 또는 돌연변이일 수 있다. 바람직하게는, 헬퍼 바이러스가 PIV cDNA에 의해 코딩된 바이러스로부터 표현형적으로 구별될 수 있다. 예컨대, 헬퍼 바이러스와는 면역학적으로 반응하나 PIV cDNA에 의해 코딩된 바이러스와는 반응하지 않는 모노클로날 항체를 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 무력화 항체일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 재조합 바이러스로부터 헬퍼 바이러스를 분리하기 위한 친화 크로마토그래피에 이 항체들을 이용할 수 있다. 이러한 항체들의 확보를 돕기 위해, PIV cDNA내로 돌연변이를 도입하여 HN 또는 F 당단백질 유전자와 같은 헬퍼 바이러스로부터 항원 다양성을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, N, P, L 및 기타의 소망되는 PIV 단백질들이 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것과 같거나 다를 수 있는, 한가지 이상의 비-바이러스성 발현 벡터에 의해 코딩될 수 있다. 소망되는 경우 그 밖의 다른 단백질들 역시, 그 자신의 벡터 또는 한가지 이상의 N, P, L 및 기타 소망되는 PIV 단백질 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 벡터에 의해 각각 코딩될 수 있다. 형질도입된 플라스미드로부터 게놈 또는 안티게놈 및 단백질의 발현은, 예컨대 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 예컨대 백시니아 바이러스 MVA 균주 재조합체와 같은 T7 RNA 폴리머라제에 대한 발현계에 의한 감염, 형질도입 또는 트랜스덕션에 의해 공급된 T7 RNA 폴리머라제를 위한 프로모터의 통제하에 각각의 cDNA에 의해 달성될 수 있다 (Wyatt 외, Virology, 210:202-205 (1995), 본 발명에 참조됨). 바이러스 단백질, 및/또는 T7 RNA 폴리머라제 역시 형질전환된 포유류 세포 또는 수행된 mRNA 또는 단백질의 형질도입에 의해 제공될 수 있다.
PIV mRNA 또는 게놈 RNA의 역전사 복제물의 클로닝된 cDNA 세그먼트를 조립하고, 완전한 안티게놈을 폴리머라제 연쇄반응 등 (PCR; 예컨대 미국특허 4,683,195 및 4,683,202, 및 PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Innis 외, 편, Academic Press, San Diego (1990), 모두 본 발명에 참조됨)에 의해 응집체로서 제공하는 등에 의해 PIV 안티게놈을 구축하여 본 발명에 이용할 수 있다. 예컨대, 안티게놈의 좌측 말단을 함유하는 cDNA를 포함하고, 적절한 프로모터 (예컨대 T7 RNA 폴리머라제 프로모터)를 함유하며 플라스미드, 코스미드, 파지 또는 DNA 바이러스 벡터와 같은 적절한 발현 벡터 내에 조립된 제 1 구축물을 제조한다. 이 벡터는 용이한 조립을 위해 고안된 독특한 제한효소 부위를 함유하는 합성 폴리링커의 돌연변이 및/또는 삽입에 의해 변형될 수 있다. 용이한 제조를 위해 N, P, L 및 기타 소망되는 PIV 단백질들을 한가지 이상의 개별적인 벡터 내에서 조립할 수 있다. 안티게놈 플라스미드의 우측 말단에는 소망에 따라 플랭킹 리보자임 및 탠덤 T7 전사 터미네이터과 같은 부가적인 서열이 함유될 수 있다. 리보자임은 단일의 비바이러스 뉴클레오타이드를 함유하는 3' 말단을 생산하는 망치머리형 (hammerhead type) (예컨대, Grosfeld 외, (1995), 상기문헌), 또는 비-PIV 뉴클레오타이드의 3' 말단이 없는 간염 델타 바이러스의 리보자임과 같은 기타 적절한 리보자임일 수 있다 (Perrotta외, nature 350:434-436 (1991). 본 발명에 참조됨. 이어서 좌측 및 우측 말단을 통상적인 제한효소 위치를 통해 결합시킨다. 여러가지 뉴클레오타이드 삽입, 결실 및 재배열은 cDNA의 구축중 또는 구축 후에 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에서 수행할 수 있다. 예컨대, 특정한 소망 뉴클레오타이드 서열을 합성하여 간편한 제한효소 부위를 이용함으로써 cDNA내의 적절한 대역에 삽입할 수 있다. 다른 한편, 위치-특이적인 돌연변이, 알라닌 스캐닝, PCR 돌연변이 또는 기타 기술분야에 잘 알려진 그러한 기술을 이용하여 cDNA에 돌연변이를 도입할 수 있다.
게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 구축하는 또 다른 방법에는 서브유닛 cDNA 성분의 수를 하나 또는 2 조각정도로 작은 수로 감소시키기 위해 향상된 PCR 조건을 이용한 역전사-PCR이 포함된다 (예컨대 Cheng 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699 (1994)에 설명됨. 본 발명에 참조됨). 다른 구체예에서는 보다 큰 크기의 게놈 또는 안티게놈에 잘 적용시키기 위해 상이한 프로모터를 사용하거나 (예컨대 T3, SP6), 또는 상이한 리보자임 (예컨대 간염 델타 바이러스), 상이한 DNA 벡터 (예컨대 코스미드)를 사용하여 전파시킬 수 있다.
게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 (예컨대 cDNA)를 예컨대 HEp-2, FRhL-DBS2, LLC-MK2, MRC-5, 및 Vero 세포와 같이, 생산적인 PIV 감염을 뒷받침할 수 있는 적절한 숙주세포 내로 형질도입, 일렉트로포레이션, 기계적 삽입, 트랜스덕션 등에 의해 삽입시킬 수 있다. 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열의 형질도입은 예컨대 칼슘 포스페이트-매개된 형질도입 (Wigler외, Cell 14:725 (1978); Corsaro 및 Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603 (1981); Graham and Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)), 일렉트로포레이션 (Neumann외, EMBO J. 1:841-845 (1982)), DEAE-덱스트란 매개된 형질도입 (Ausubel외, (편). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY (1987), 양이온성 지질-매개된 형질도입 (Hawley-Nelson외, Focus 15: 73-79 (1993)) 또는 시판되는 형질도입 시약, 예컨대 LipofectACE(Life Technoligies, Gaithersburg, MD) 등 (전술한 문헌은 모두 본 발명에 참조됨)에 의해 배양된 세포 내로 도입될 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 몇몇 구체예에서, N, P, L 및 다른 소망되는 PIV 단백질들은 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것들과는 표형형질적으로 구별되는 하나 이상의 헬퍼 바이러스에 의해 코딩된다. N, P, L 및 기타 소망되는 PIV 단백질 역시 게놈 또는 안티게놈 및 이들의 다양한 조합을 코딩하는 것들과 같거나 다를 수 있는 한가지 이상의 발현 벡터들에 의해 코딩될 수 있다. 부가적인 단백질들은 한가지 이상의 N, P, L 및 다른 소망되는 PIV 단백질들, 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 벡터에 의해 또는 그 자신의 벡터에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 선택된 PIV 단백질의 기능 또는 발현을 변경시키기 위한 소정의 돌연변이를 이용한 PIV 분자 생물학 및 병원성 메카니즘의 분석 및 조작을 가능케한다. 이들 방법 및 조성물을 이용하여, 침묵하는 부수적인 돌연변이 (silent incidental mutations)로부터 소망되는 표현형 변경의 원인이 되는 돌연변이를 구별할 수 있고 백신 제조를 위하 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈내로 인코포레이션을 위한 표현형-특이적인 돌연변이를 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 PIV 변형은 바이러스 약독화 및 백신 면역원성의 개선, 바람직하지 못한 면역병원성과 관련된 에피토프의 제거, 항원 드리프트 적응 등을 위한 것과 같으 개선된 백신 바이러스를 제조하는데 그 목적이 있다. 이러한 목적 및 기타 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 조성물 및 방법은 감염성, 재조합 PIV 내로의 인코포레이션을 위해 PIV 게놈 또는 안티게놈 내로 광범위한 변형을 일으키도록 한다. 예컨대, 보호적인 항원 또는 에피토프를 코딩하는 외래 유전자 또는 유전자 세그먼트들을 PIV 클론 내에 첨가하여 PIV와 다른 바이러스 또는 보호적인 항원이 유도된 시약 모두에 대해 면역성이 유도될 수 있는 PIV 바이러스 균주를 제조할 수 있다. 다른 한편, 시토카인과 같이 면역계의 모듈레이터를 코딩하는 외래유전자를 부분적으로 또는 전체적으로 삽입하여 백신 바이러스의 면역원성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 PIV 클론에 포함될 수 있는 다른 돌연변이들로는 에컨대 PIV 클론 내에서 이종성 유전자 또는 유전자 세그먼트 (예컨대 당단백질 유전자의 세포질 테일을 코딩하는 유전자 세그먼트)를 그에 대응하는 유전자 또는 유전자 세그먼트로 치환하는 것이 포함된다. 다른 한편, PIV 클론 내의 유전자의 상대적인 순서를 변경할 수 있고, PIV 게놈 프로모터를 그의 안티게놈 대응체로 치환시킬수 있으며, 선택된 유전자(들)을 비기능적으로 할 수도 있다 (예컨대 그 유전자의 발현을 방지하기 위해 종결 코돈의 도입과 관련된 기능을 절제함으로써). PIV 클론 내에서의 여러가지 비-코딩 또는 코딩 대역 또는 다른 부위에서의 독특한 제한효소 위치를 삽입하는 등, 조작을 용이하게 하기 위해 PIV 클론 내에서 다른 종류의 변형을 가할 수도 있다. 또한, 미번역 유전자 서열을 제거하여 외래 서열의 삽입가능성을 증가시킬 수 있다.
따라서, PIV의 감염성 클론을 제공함으로써 본 발명은 PIV 게놈 (또는 안티게놈) 내에서 재조합적으로 제조될 광범위한 변경을 가능케하며, 소망되는 표현형 변경을 특정하는 소정의 돌연변이를 일으킬 수 있는 것이다. "감염성 클론(infectious clone)"이라 함은 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 게놈을 제조하기 위한 템플레이트 역할을 할 수 있는 게놈 또는 안티게놈 RNA내로 전사될 수 있는 감염성 비리온 내로 직접 인코포레이션될 수 있는 RNA 또는 cDNA 또는 그의 산물을 의미한다. 상기한 바와 같이, 다양한 종래기술 (예컨대 위치-지향된 돌연변이)에 의해 게놈 또는 안티게놈의 cDNA 복제물 내로 소정의 돌연변이를 도입할 수 있다. 설명된 바와 같이 완전한 게놈 또는 안티게놈 cDNA를 조립하기 위해 게놈 또는 안티게놈 cDNA 서브단편하면 각 대역이 별도로 조작될 수 있어, 작은 cDNA 서브젝트가 큰 cDNA 서브젝트보다 다루기가 더 쉽고 그로 인해 완전한 cDNA로 쉽게 조립될 수 있다는 장점을 누릴 수 있다. 따라서, 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA, 또는 선택된 그의 서브단편을 올리고뉴클레오타이드-지향된 돌연변이의 템플레이트로서 사용가능하다. 이는 Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA)의 MUTA-gen키트를 사용하는 것과 같이 단일-가닥 파지미드 형태의 중간체를 통하거나, 또는 Strategene (La Jolla, CA)의 Chameleon돌연변이 키트와 같은 템플레이트로서 이중-가닥 플라스미드를 직접 사용하는 방법, 또는 목적하는 돌연변이(들)을 함유하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 템플레이트를 사용하는 폴리머라제 연쇄반응을 이용하여 수행할 수 있다. 이어서 돌연변이된 서브단편을 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA로 조립할 수 있다. 다른 많은 돌연변이 기술이 알려져 있으며 본 발명의 PIV 안티게놈 또는 게놈 cDNA에 목적하는 돌연변이를 일으키는데 사용될 수 있다.
Bio-Rad Laboratories사의 돌연변이발생 키트를 이용하여 생체외에서 MUTA-gene파지미드에 의해 돌연변이를 일으키는 방법을 예시한다. 간략히 설명하면, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 플라스미드 pTZ18U내로 클로닝시켜 CJ236 세포 (Life Technologies)를 형질전환시킨다. 파지미드 제제는 제조업자의 지침에 따라 제조한다. 올리고뉴클레오타이드는 게놈 또는 안티게놈의 소망되는 위치로 변경된 뉴클레오타이드를 도입함으로써 돌연변이발생에 알맞게 고안한다. 유전적으로 변경된 게놈 또는 안티게놈을 함유하는 플라스미드를 증폭시킨다.
돌연변이는 단일 뉴클레오타이드 변경부터 하나 이상의 유전자 또는 게놈 세그먼트를 함유하는 커다란 cDNA 세그먼트를 도입, 삽입 또는 치환하는 것에 이르기까지 매우 다양할 수 있다. 게놈 세그먼트는 단백질의 엑토도메인, 세포질, 또는 투과막과 같은 구조 및/또는 기능성 대역, 상이한 단백질과의 결합 또는 기타 생화학적 상호작용을 매개하는 부위와 같은 활성부위, 항체 결합 및/또는 체액성 또는 세포성 매개된 면역응답을 자극하는 부위등과 같은 에피노프 부위등에 상응할 수 있다. 이와 관련해서 유용한 게놈 세그먼트는 약 50, 75, 100, 200-500 및 500-1,500개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 달하는 에피토프 부위와 같은, 단백질의 작은 기능적 대역을 코딩하는 15 내지 35개의 뉴클레오타이드들이다.
소정의 돌연변이를 감염성 PIV내로 도입할 수 있음으로 해서 PIV 병원성 및 면역원성 메카니즘의 조작을 비롯한 많은 응용이 가능하다. 예컨대, N, P, M, F, HN 및 L단백질 및 C, D 및 V ORF 산물을 비롯한 PIV 단백질의 기능은 단백질 발현의 정도를 제거 또는 감소시키거나 돌연변이 단백질을 생산하는 돌연변이를 도입함으로써 조작할 수 있다. 이러한 한가지 예시적인 변형에서, F단백질의 절단 부위에서의 서열을 변경시키고 조직배양시 성장에 미치는 이 변경의 효과 및 결과적인 PIV의 감염 및 병원성을 동물실험을 통해 일상적으로 측정할 수 있다.
예컨대 프로모터, 인터제닉 대역, 및 전사 시그날과 같은 여러가지 게놈 RNA의 구조적 특성 역시 본 발명의 방법과 조성물을 이용하여 쉽게 조작할 수 있다. 트랜스-작용성 단백질과 시스-작용성 RNA 서열의 효과를 예컨대 PIV 미니게놈을 함께 이용하는 분석에 있어서 완전한 안티게놈 cDNA를 이용하여 쉽게 측정할 수 있는데 (Dimock 외, J. Virol. 67:2772-8 (1993), 본 발명에 참조됨), 이것의 구제-의존 상태는 복제-독립적인 감염성 바이러스에서 복구되기에는 지나치게 억제적일 수 있는 돌연변이주들을 특징화하는데 유용하다.
본 발명은 또한 예컨대 감염성 야생형 PIV의 게놈 또는 안티게놈 내로, 서스펙트 돌연변이를 개별적으로 그리고 여러가지로 조합하여 도입함으로써 침묵 우발적인 돌연변이와 표현형 변화를 일으키는 돌연변이를 쉽게 구별하는 도구 및 방법을 제공한다 (즉, 선택된 숙주에서의 복제, 온도 감응성 등과 같은 한가지 이상의 표현형 특성에 있어서). 이 방법에 의해 약독화, 온도 감응성, 감기-적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 한정 등과 같은 소망되는 백신 표현형에 기여하는 돌연변이를 동정할 수 있다. 이어서 이들 방법에 의해 동정된 돌연변이를 여러가지 조합으로 도입하여 백신 바이러스를 소망되는 적절한 약독화 수준이 되도록 변형시킨다. 또한, 본 발명은 여러가지 바이러스 균주로부터의 돌연변이를 단일 백신 균주내로 조합시킬 수 있는 가능성을 제시한다.
상기한 바와 같이, 재조합적으로 변경된 PIV 클론에 도입된 돌연변이들은 선택된 단백질의 발현 및/또는 기능을 변경시키고, 목적하는 표현형 변화를 일으키거나, 또는 기타 다양한 목적에 따른 이들의 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 소망되는 표현형 변화에는 예컨대 배양시 바이러스 성장 변화, 온도 감응성, 플라크 크기, 약독화, 및 면역원성의 변화 등이 포함된다. 예컨대, 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 약독화, 온도 감응성, 감기-적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 한정, 유전자 발현 변경, 또는 면역원성 에피토프의 변화 등을 특정하는 뉴클레오타이드 삽입, 재배열, 결실 또는 치환에 의해 변형시킬 수 있다.
본 발명의 한가지 측면에서, 생물학적으로 유도된 돌연변이, 약독화된 PIV는 완전한 길이의 PIV 클론으로 개별적으로 또는 조합적으로 동정 및 도입하여, 도입된 돌연변이를 함유하는 구제된 재조합 바이러스의 표현형을 측정한다. 예시적인 구체예에서, ts, ca 또는 att 표현형을 갖는 PIV 돌연변이에 의해 나타나는 변화와 같이, 야생형 PIV에 대해 생물학적으로 유도된 돌연변이 바이러스에 의해 나타나는 아미노산 변화를 재조합 PIV 클론에 도입한다. 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV로부터의 이러한 변화는 HPIV3 돌연변이주 JS cp45로부터 채택된 변이에 의해 특정되는 약독화 표현형과 같이, 결과적인 클론에 소망되는 특성을 특정해준다. 이러한 변화는 상응하는 야생형 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이 서열에 비해 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드를 변화시켜 재조합 바이러스내로 도입하는 것이 바람직하며, 이로 인해 유전학적인 귀선변이 (reversion)에 대해 돌연변이를 안정화시키는 효과가 있다.
본 발명은 또한 감염성 클론의 게놈 또는 안티게놈 내로 도입된 복수개의 표현형-특정 변이를 선택된 조합으로서 갖는 재조합 PIV를 제공한다. 이 프로세스는, 표현형 평가와 함께, 약독화, 온도 감응성, 감기-적응성, 작은 플라크 크기, 숙주범위 한정등과 같은 소망되는 특성을 갖는 돌연변이 재조합 PIV를 제공한다. 따라서, 본문에 JS cp45와 같이 생물학적으로 유도된 PIV 변이주로부터 채택된 ts, ca 또는 att 변이와 같은 약독화 돌연변이가 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상 인코포레이션된 PIV 클론이 개시된다. 이러한 맥락에서 재조합 PIV 중에 생물학적으로 유도된 변이를 채택하기 위한 표적 유전자는 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 대형 폴리머라제 서브유닛 L, 매트릭스 단백질 M, 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 단백질 HN, 융합 단백질 F 및 C, D 및 V ORF 산물을 포함한다. 또한 PIV 게놈의 3' 리더 또는 트레일러 대역의 서열, N 유전자 개시 시그날과 같은 유전자 개시 및 유전자 종결 서열과 같은 시스-작용 요소 중의 서열등, 외래 서열도 표적화된다. 재조합 PIV에 인코포레이션된 예시적인 돌연변이에는 예컨대 Tyr942, Leu992, 및/또는 Thr1558와 같이 폴리머라제 L 유전자에서 아미노산 변화(들)을 특정하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환이 포함된다. 예컨대, Tyr942가 His에 의해, Leu992가 Phe에 의해, 및/또는 Thr1558이 Ile에 의해 치환된 PIV 재조합체가 개시된다. 이러한 돌연변이는 후술되는 실시예에서 설명된 r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558, r942/1558, 또는 r942/992/1558을 비롯한 다양한 PIV 재조합체에서 성공적으로 인코포레이션된 바 있다. 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이주로부터 채택된 다른 예시적인 돌연변이들에는 JS cp45의 Val96또는 Ser389잔기에 대응하는 위치에서의 특정 돌연변이를 비롯하여 N 단백질에서 하나 이상의 돌연변이가 포함된다. 보다 구체적으로 이러한 돌연변이들은 Val96에서 Ala 또는 Ser389에서 Ala로서 표시된다. 후술하는 실시예에서는 JS cp45의 Ile96에 대응하는 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 Til96에서 Thr로의 치환으로 표시되는 돌연변이와 같이, C 단백질에서의 아미노산 치환을 코딩하는 재조합 PIV가 개시된다. 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이로부터 채택된 또 다른 예시적인 돌연변이에는 JS cp45의 Ile420또는 Ala450잔기, 바람직하게는 Ile420에서 Val 또는 Ala450에서 Thr의 산치환에 대응하는 위치에서 JS cp45로부터 채택된 돌연변이를 비롯하여, F 단백질에서의 한가지 이상의 돌연변이가 포함된다. 본 발명의 기타 PIV 재조합체는 이하에서 JS cp45의 Val384잔기에 해당하는 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 Val384에서 Ala로의 치환으로 표시되는 돌연변이가 적용된 재조합 PIV에 의해 예시되는 바와 같이 HN 단백질에서의 한가지 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명의 이러한 측면의 또 다른 구체예에는 외래 서열, 예컨대, 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈의 3' 리더 서열에서 한가지 이상의 돌연변이가 인코포레이션된 재조합 PIV가 포함된다. 이러한 돌연변이의 예로는 JS cp45의 뉴클레오타이드 23, 24, 및/또는 28에 해당하는 하나 이상의 위치에서 일어나는 3' 리더에서의 돌연변이가 포함된다. 예컨대 뉴클레오타이드 23에서 T가 C로 변경되는 것, 뉴클레오타이드 24에서 C가 T로 변경되는 것, 또는 뉴클레오타이드 28에서 G가 T로 변경되는 것이 이에 해당한다. JS cp45의 뉴클레오타이드 62에 해당하는 위치에서 N 유전자 개시 서열 중 돌연변이에 의해, (바람직하게는 A로부터 T로 변화되는 것) 예시되는 바와 같이, N 유전자 개시 서열 중의 한가지 이상의 돌연변이가 부가적인 외래 돌연변이의 한 예이다. 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV로부터 채택된 상기 예시적인 돌연변이를 평가하여 하기 실시예의 재조합 PIV내로 조합시키면 rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 c'N, 및 rcp45 F와 같은 신규한, 약독화 후보 백신 균주가 개별적으로 및/또는 조합적으로 제조된다. 본 발명의 다른 PIV 재조합체는 하나 이상의 이러한 예시적인 재조합체에 존재하는 돌연변이 뿐만 아니라 본 발명의 내용에 따라 재조합 PIV에서 동정 및 채택된 돌연변이 PIV 균주로부터 생물학적으로 유도된 다른 돌연변이주에서 동정된 돌연변이의 완전한 요소도 복수개 인코포레이션하게 될 것이다.
본 발명에 따른 방법에서 동정된 돌연변이들은 "메뉴"로 컴파일되어 선택된 약독화도, 면역원성 및 안정성을 갖는 백신 바이러스를 보정할 수 있도록 여러가지 조합으로 도입된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 생물학적으로 유도된 PIV로부터 채택된 한가지 이상의 돌연변이, 예컨대 ts, ca 또는 att 돌연변이들에 더해, 같거나 다른 유전자와 관련된 부가적인 유형의 돌연변이들를 함께 제공한다. 이러한 맥락에서 돌연변이의 표적 유전자 역시 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 대형 폴리머라제 서브유닛 L, 매트릭스 단백질 M, 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 단백질 HN, 융합 단백질 F 및 C, D 및 V ORF 산물도 포함한다. 한가지 측면에서, 적어도 하나의 약독화 변이가 PIV 폴리머라제 유전자 L에서 발생하고 생물학적으로 유도된 돌연변이 PIV 균주, 예컨대 JS cp45로부터 채택된 ts 또는 att 표현형을 특정하는 뉴클레오타이드 치환과 관련된 재조합 PIV가 제공된다. 본 발명에서 개시된 HPIV3 재조합체의 예로는 r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558, r942/1558, r942/992/1558 재조합체를 들 수 있다. 이들 예시적인 PIV 클론들은 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환을 인코포레이션하여 예컨대 Tyr942, Leu992, 및/또는 Thr1558과 같은 폴리머라제 유전자에서 아미노산 변경을 일으킨다. 예컨대, Tyr942가 His에 의해, Leu992가 Phe에 의해/또는 Thr1558이 Ile에 의해 치환된 PIV 재조합체가 개시된다. 바람직하게는, 2개 또는 3개의 돌연변이를 표현형 리버젼(reversion)에 대해 증가된 안정성을 부여하는 약독화 변이를 특정하는 코돈에 인코포레이션시키는 것이 좋다.
부가적인 측면에서, 단독 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이주 PIV로부터 채택된 한가지 이상의 약독화 변이와 함께 감염성 재조합 PIV 내로의 인코포레이션을 위해 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈 내에 다양한 기타 유전적 변경을 일으킬 수 있다. 이종성 유전자 (상이한 PIV 균주 또는 예컨대 RSV 또는 홍역 바이러스와 같은 기타 바이러스와 같은 비-PIV 소스)를 전체 또는 부분적으로 삽입 또는 치환시킬 수 있으며, 유전자 순서를 변경시키거나, 유전자 중복을 제거, PIV 게놈 프로모터를 그의 안티게놈 대응물로 치환시키고, 심지어 비-필수적인 유전자 전체를 삭제한다. 한가지 측면에서 선택된 PIV 유전자, 예컨대, C, D, 또는 V ORF를 기능적으로 삭제하여 예컨대 생체외에서의 성장이 향상되고 및/또는 생체내에서 약독화된 새로운 표현형질 특성을 갖는 재조합 PIV를 생산할 수 있다. 본 발명의 감염성 PIV 클론은 또한 그의 면역원성을 증강시켜 자연감염에 의해 제공되는 보호도보다 더 큰 보호도를 유도하고, 또는 바람직하지 못한 면역병원성 반응과 관련된 에피토프를 제거하도록 엔지니어링할 수 있다. 본 발명에 의해 생산되는 백신의 증강된 면역원성은 PIV를 제어하는데 있어서 가장 큰 장애물 중의 하나, 즉, 자연적인 감염에 의해 유도된 면역성의 불완전한 특성을 해소하고자 하는 것이다. 이러한 관점에서, 부가적인 유전자(들) 또는 유전자 세그먼트(들)을 공통적인 또는 독립적인 전사 시그날 세트의 통제 하에 위치시킬 수 있는 PIV 게놈 또는 안티게놈내로 삽입하거나 근사화시킬 수 있다. 표적 유전자들은 T 헬퍼 세포 에피토프에 풍부한 단백질 및 시토카인 (예컨대 IL2 내지 IL-15, 특히 IL2, IL6 및 IL12, 등)을 코딩하는 것들을 포함한다. 부가적인 단백질은 별도의 단백질로서 또는 HN과 같은 어느 하나의 PIV 단백질의 제 2 복제물로부터 엔지니어링된 키메라로서 발현될 수 있다. 이것은 PIV에 대한 면역응답을 정량적으로 그리고 정성적으로 변형 및 향상시키는 능력을 제공한다.
본 발명에서 유용한 다른 돌연변이는 게놈의 3'말단을 안티게놈으로부터의 그의 대응물로 치환하는 것을 포함하며 이는 RNA 복제 및 전사 변화와 연관이 있다. 또한, 인터제닉 대역의 서열 내용물을 단축 또는 연장 또는 변경시킬 수 있다. 또 다른 측면에서, 백신 형성에 유용한 PIV를 간편하게 변형시켜 순환 바이러스의 항원성 드리프트를 적응시킬 수 잇다. 일반적으로 변형은 HN 및/또는 F 단백질에서 일어날 것이다. 예컨대, 완전한 HN 또는 F 유전자의 선택된 항원 형태 또는 그의 특정 면역원성 대역을 코딩하는 세그먼트를, 감염성 클론 중에서 대응 대역으로 치환하거나, 또는 몇가지 항원 형태가 결과적인 클론에서 나타날 수 있도록 유전자의 복제물을 하나 이상 첨가함으로써 인코포레이션시킨다. 변형된 PIV cDNA로부터 생산된 자손 바이러스들을 출현 균주들에 대한 백신화 프로토콜에 이용한다.
본 발명의 감염성 PIV에 사용되는 기타 돌연변이에는 PIV 미니게놈의 돌연변이 분석시 동정되는 시스-작용 시그날의 돌연변이가 포함된다. 예컨대, 리더 및 트레일러 및 플랭킹 서열의 삽입 및 결실 분석으로 바이러스 프로모터와 전사 시그날이 동정되며 RNA 복제 또는 전사의 환원도를 달리하는 일련의 돌연변이가 제공된다. 이러한 시스-작용 시그날의 포화 돌연변이 (이로 인해 각각의 위치가 각각 뉴클레오타이드 대체몰로 변경됨)는 또한 RNA 복제 또는 전사를 감소 또는 증가시키는 변이를 동정한다. 상기한 바와 같이 이들 돌연변이는 모두 완전한 안티게놈 또는 게놈에 삽입될 수 있다.
다양한 인터제닉 대역 또는 그 밖의 위치에서 독특한 제한효소 부위를 삽입하는 등, PIV 클론에 대해 부가적인 변형을 가하여 조작을 용이하게 할 수 있다. 미번역 유전자 서열을 제거하여 외래 서열 삽입 용량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 재조합 PIV 내에서의 유전자 또는 유전자 세그먼트의 특정 치환, 삽입, 결실 또는 재배열 (예컨대 세포질 테일, 투과막 대역 또는 엑토도메인, 에피노프 부위 또는 대역, 결합부위 또는 대역, 활성 부위 또는 활성부위를 포함하는 대역 등과 같이 선택된 단백질 또는 단백질 대역을 코딩하는 유전자 세그먼트의 치환)은 같거나 다른 PIV 또는 다른 소스로부터의 기존의 "대응(counterpart)" 유전자 또는 유전자 세그먼트에 대해 구조적 또는 기능적인 관계에서 행해진다. 이러한 변형으로 인해 야생형 또는 모친 PIV 또는 기타 바이러스 균주에 비해 소망되는 표현형 변화를 갖는 신규한 재조합체가 생산된다. 예컨대, 이러한 유형의 재조합체는 한가지 PIV의 엑토도메인과 다른 PIV의 세포질 테일 및/또는 막투과 대역이 융합된 키메릭 단백질을 발현할 수 있다. 이러한 유형의 또 다른 예시적인 재조합체는 이중 면역원성 대역과 같이 중복적인 단백질 대역을 발현한다.
본문에서 "대응(counterpart)" 유전자, 유전자 세그먼트, 단백질 또는 단백질 대역은 일반적으로 이종 소스로부터 유래하는 것이다 (예컨대 상이한 PIV 유전자로부터, 또는 상이한 PIV 유형 또는 균주 중 동일한 (즉 동종적 또는 대립적) 유전자 또는 유전자 세그먼트를 나타냄). 이러한 관점에서 전형적인 대응물은 예컨대, 세포질 대역, 투과막 대역, 엑토도메인, 결합 부위 또는 대역, 에피토프 부위 또는 대역 등과 같이 전체적인 구조적 특성은 공유한다. 대응 대역 또는 그들의 코딩 유전자 세그먼트는 대역 또는 유전자 세그먼트 변종 중 공통적인 생물학적 활성에 의해 정의되는 크기 및 서열 다양성 범위를 갖는 종들의 집합을 포함한다. 예컨대, 본 발명에서 대응 유전자 세그먼트에 의해 코딩된 2개의 선택된 단백질 대역은 실제로 질적으로 동일한 활성, 예컨대, 동일한 막 확장(스패닝) 기능, 특이적인 결합활성, 면역학적 인식 부위 등의 활성을 공유한다. 더욱 일반적으로, 대응물들, 예컨대 선택된 단백질 세그먼트 또는 단백질 간에 공유되는 특정 생물학적 활성은 정량적으로도 실제로 유사할 것이다. 즉, 이들은 각각의 정량적인 활성수준에 있어서의 차이는 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 5-10 정도에 지나지 않을 것이다.
본 발명에서 재조합 PIV를 생산하기 위한 대응 유전자 및 유전자 세그먼트, 그리고 본 발명에서 설명된 기타 폴리뉴클레오타이드들은 선택된 폴리뉴클레오타이드 "레퍼런스 서열", 예컨대 또 다른 선택된 대응 서열과 실제로 서열 성동성을 갖는 것이 바람직하다. 본문에서 "레퍼런스 서열"이란 예컨대 완전한 길이의 cDNA 또는 유전자, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열 세그먼트와 같으 서열 비교의 기초로서 사용된다. 일반적으로, 레퍼런스 서열은 길이가 20 뉴클레오타이드, 종종 적으로 25개 이상의 뉴클레오타이드, 더욱 흔하게는 50개 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 2개의 폴리뉴클레오타이드는 각각 (1) 2개의 폴리노클레오타이드간에 유사한 서열 (즉, 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부)를 함유하고, (2) 2개의 폴리뉴클레오타이드 간에 서로 다른 서열을 부가적으로 함유할 수 있을 것이므로, 2개 (또는 그 이상)의 폴리뉴클레오타이드의 서열 비교는 일반적으로 2개의 폴리뉴클레오타이드의 서열을 "비교창"을 통해 비교함으로써 서열 유사성의 위치 대역을 동정 및 비교하게된다. 본문에서 "비교창(comparison window)"라 함은 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오타이드 위치로 된 개념적인 세그먼트로서, 여기서 폴리뉴클레오타이드 서열은 적어도 20개의 연속적인 뉴클레오타이드로 된 레퍼런스 서열과 비교되고, 비교창내의 폴리뉴클레오타이드 서열 부분이 레퍼런스 서열 이 두 서열이 최적상태로 정렬되도록 레퍼런스 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비해 20퍼센트 미만의 부가 또는 결실 (즉 갭)을 포함할 수 있다. 비교창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 Smith & Waterman, Adv. Appl. math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리듬, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리듬, Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사방법 (이들은 본 발명에 참조됨), 이들 알고리듬의 컴퓨터화 설정 (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0의 GAP, GETFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Groups, 575 Science Dr, madison, WI 본 발명에 참조)에 의해 수행될 수 있으며 또는 검사, 및 여러가지 방법에 의해 발생된 최상의 정렬 (즉, 비교창을 통해 최고의 서열 유사 백분율을 초래하는 정렬)이 선택된다. "서열 동일성 (sequence identity)"란 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열이 비교창을 통해 동일하다는 의미이다 (즉, 뉴클레오타이드-뉴클레오타이드 기준으로). "서열 동일성의 백분율"은 최적 정렬된 2개의 서열을 비교창과 비교하여, 2가지 모두의 서열에서 동일한 핵산 염기 (예컨대, A, T, C, G, U 또는 I)가 발생하는 위치의 수를 측정하여 매치된 위치의 수를 구하고, 상기 매치된 위치의 수를 비교창의 총 위치수 (즉, 윈도우 크기)로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱함으로써 서열 동일성의 백분율을 구한다. 본문에서 "서열 동일성"이란 폴리뉴클레오타이드 서열의 특성을 가리키며 적어도 20개의 뉴클레오타이드 위치, 종종 적어도 25-50개 뉴클레오타이드 위치의 비교창을 통해 레퍼런스 서열과 비교할 때 그 폴리뉴클레오타이드가 적어도 85 퍼센트 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90 내지 95 퍼센트 서열 동일성, 더욱 일반적으로는 적어도 99퍼센트 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 특성을 칭하는 것으로서, 여기서 서열 동일성의 백분율은 비교창에 대해 레퍼런스 서열의 총 20퍼센트 미만을 차지하는 결실 또는 삽입을 포함할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열과 레퍼런스 서열을 비교함으로써 구한다.
이러한 폴리뉴클레오타이드 서열 관계에 부가하여, 본 발명의 재조합 PIV에 의해 코딩된 단백질 대역 역시 보존적 관계를 갖도록, 즉 선택된 레퍼런스 폴리펩타이드와 실질적인 서열 동일성 또는 서열 유사성을 갖도록 선택된다. 폴리펩타이드에 적용되는 바와 같이, "서열 동일성"이란 펩타이드가 해당 위치에서 동일한 아미노산을 공유함을 의미한다. "서열 유사성"이란 펩타이드가 해당 위치에서 동일 또는 유사한 아미노산 (즉, 보존적 치환)을 가짐을 의미한다. "실질적인 서열 동일성"이란 2개의 펩티드 서열이 최적상태로 정렬될 경우, 예컨대 디폴트 갭 중량을 이용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 정렬될 경우, 적어도 80% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상의 서열 동일성 (예컨대 99% 서열 동일성)을 공유함을 의미한다. "실절적인 유사성"이란 2개의 펩티드 서열들이 서열 유사성의 해당 백분율을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적인 아미노산 치환에 의해 구별된다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 가리킨다. 예컨대, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 쓰레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴과 글루타민; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 아르기닌, 및 히드티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아ㅣ노산기는 시스테인과 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다. 본 발명에서 사용되는 20가지 자연발생적인 아미노산의 약칭은 통칭에 따랐다 (Immunology - A Synthesis (2판, E.S. Golub & D.R. Gren, 편, Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991), 본 발명에 참조됨). 20가지 통상적인 아미노산의 입체이성체 (예컨대 D-아미노산), 비자연적인 아미노산, 예컨대 α,α-이치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 기타 통상적이지 않은 아미노산 역시 보노 발명의 폴리펩타이드의 적절한 성분이 될 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예로는: 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시라이신, ω-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사한 아미노산과 이미노산 (예커ㅌ대 4-히드록시프롤린)을 들 수 있다. 또한, 아미노산은 글라이코실화, 포스포릴화 등에 의해 변형될 수 있다.
cDNA-발현된 게놈 또는 안티게놈으로부터 생산된 감염성 PIV는 PIV 또는 PIV-유사 균주, 예컨대 인간, 소, 쥐 등의 균주일 수 있다. 보호적인 면역 응답을 일으키기 위해, PIV 균주는 면역화될 대상에 내재적인 것일 수 있다. 예컨대 인간을 면역화시키기 위해 인간의 PIV를 이용할 수 있다. 그러나 게놈 또는 안티게놈은 이종성 PIV 유전자 또는 유전자 세그먼트, 또는 예컨대 RSV 또는 홍역바이러스와 같은 다른 이종성 소스로부터의 유전자 또는 유전자 세그먼트를 발현시키기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 인간에게 투여되도록 의도된 감염성 PIV는 약독화 목적과 같이 소 또는 쥐의 PIV 유형으로부터의 유전자 또는 유전자 세그먼트를 함유하도록 변형된 인간의 PIV일 수 있다. BPIV3은 레수스 (rhesus) 원숭이와 인간에 있어서 그의 복제를 제한하는 숙주 범위 돌연변이를 지닌다 (Karron외, 상기문헌, 1995ㅁ; van Wike Coelingh외, 1988), 각기 본 발명에 참조됨). 예컨대 숙주 범위 한정과 같이 바람직한 표현형을 특정하는 BPIV3의 유전자(들), 돌연변이 및 시스-작용 조절 서열은 본 발명의 rPIV 중의 상응하는 서열에 대한 그들의 치환에 의해 동정될 것이며 한층 더 변형된 rPIV내로 인코포레이션되어 더욱 부가적으로 유용한 백신 제제를 개발하는데 이용될 수 있다. 마찬가지로, 레수스 원숭이에 대해 비-ts 숙주-범위 약독화를 부여하는 것으로 알려진 (Hall외, 상기문헌, (1992)) JS cp45의 변이도 동정되어 본 발명의 변형된 rPIV 백신 제제 내로 인코포레이션될 수 있다. 다른 한편, 소의 PIV는 인간의 PIV 감염에 대한 보호성을 이끌어내는 단백질 또는 면역원성 에피토프를 코딩하는 유전자를 함유하도록 변형시킬 수 있다. 예컨대, 인간의 PIV 당단백질 유전자는 소의 PIV가 인간의 PIV 균주에 대해 인간에 있어서 보호적인 면역 응답을 이끌어내도록, 대응하는 소의 당단백질 유전자로 치환될 수 있다.
예시적인 구체예에서, 하나의 PIV의 개별적인 유전자, 유전자 세그먼트 또는 단일 또는 복수개의 뉴클레오타이드들을 이종성 PIV 또는 기타 소수로부터의 대응 서열(들)에 의해 치환시킨다. 예컨대, 하나의 PIV로부터의 선택된 단백질의 세포질 테일, 투과막 대역 또는 엑토도메인, 에피토프 부위 또는 대역, 결합 부위 또는 대역, 활성 부위 또는 활성 부위를 함유하는 대역 등을 코딩하는 것과 같은 이종성 유전자 세그먼트를 또 다른 PIV에서 대응하는 유전자 세그먼트로 치환시켜 예컨대 하나의 PIV의 세포질 테일 및/또는 투과막 대역과 다른 PIV의 엑토도메인이 융합된 키메릭 단백질을 발현시키는 재조합체와 같은 신규한 재조합체를 제조할 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 게놈 세그먼트는 예컨대 에피토프 부위와 같이 단백질의 작은 기능성 대역을 코딩하는 유전자 세그먼트의 경우 약 15 내지 35개 뉴클레오타이드부터, 커다란 대역 또는 단백질 영역을 코딩하는 유전자 세그먼트의 경우 약 50, 75, 100, 200-500, 또는 500-1,500개 이상의 뉴클레오타이드 크기에 달한다.
본 발명의 한가지 측면에서, 한가지 PIV 균주의 HN 및/또는 F 단백질의 선택된 대역을 이종성 PIV 클론으로 치환시켜 면역화된 숙주에서 2가지 모두의 PIV 균주에 대한 교차-보호적인 면역 응답을 자극할 수 있는 재조합 바이러스를 제조한다. 또 다른 측면에서, 예컨대 인간과 소의 PIV 두가지 모두로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와 같이, 적어도 하나의 비-인간 PIV 서열과 인간의 게놈 또는 안티게놈 서열의 키메라를 포함하는 변형된 PIV 클론이 제공된다. 인간의 PIV 코딩 서열 또는 비-코딩 서열 (예컨대, 프로모터, 유전자-말단, 유전자-개시부, 인터제닉 또는 다른 시스-작용성 요소)을 대응하는 소 또는 쥐의 PIV 서열로 치환함으로써 여러가지 가능한 약독화 효과를 갖는 재조합체가 생산된다. 예컨대, 인간 세포에서는 효과적으로 기능하지 않는 이종성 PIV 유전자로부터, 생물학적으로 상호작용성인 인간의 PIV 서열 또는 단백질과 이종성 서열 단백질의 부적합성 (예컨대 바이러스 전사, 번역, 조립 등 치환된 서열 또는 단백질과 보통 협력하는 서열 또는 단백질) 이종성 서열 또는 단백질로부터, 다른 유용한 약독화 효과 중에서도 숙주범위 효과가 종종 발생할 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 외래 유전자 또는 유전자 세그먼트의 삽입, 및 몇몇 경우 비코딩 뉴클레오타이드 서열을 PIV게놈 내로 삽입하면 도 다른 소망되는 표현형 효과를 일으키는 게놈 길이의 소망스런 증가가 초래된다. 게놈 길이가 증가하면, 부분적으로는 삽입 길이에 의존적으로, 결과적인 PIV 클론의 약독화가 초래될 것으로 기대된다. 또한, 재조합체 PIV내로 삽입된 유전자로부터 특정 단백질의 발현에 의해 단백질 작용에 기인한 바이러스의 약독화가 초래될 것이다. 이것은 백시니아 바이러스에서 발현된 IL-2에 대해 이미 설명된 바 있으며 (예컨대 Flexner외, Nature 33:-259-62 (1987)), 감마 인터페론의 경우에도 예상될 수 있다.
본 발명의 재조합 PIV 중 전체적인 바이러스 유전자 또는 유전자 세그먼트의 변화와 관련된 결실, 삽입, 치환 및 기타 변이는 고도로 안정한 백신 후보를 생산하며, 이들은 특히 면역억압된 환자에게 있어서 중요하다. 이들 많은 돌연변이들은 결과된 백신 균주의 약독화를 초래하는 반면, 다른 것들은 소망되는 표현형 변화의 상이한 유형을 특정할 것이다. 예컨대, 인간의 면역성을 특이적으로 간섭하는 단백질을 코딩하는 어떤 바이러스 유전자가 알려진 바 있다 (예컨대 Kato외, EMBO. J. 16:578-87 (1997) 참조). 백신 바이러스에서의 이러한 유전자의 제거는 독성 (virulence) 및 병원성을 감소시키고/또는 면역원성을 개선시킬 것으로 기대된다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 변형된 PIV 클론은 예컨대 HPIV1 및 HPIV2와 같이 한가지 이상의 이종성 인간 PIV의 서열에 연결된 HPIV3으로부터의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 클론과 같이, 2가지 이상의 인간의 PIV 게놈의 키메라를 나타낸다. 따라서, 인간의 PIV3의 개별적인 유전자 또는 유전자 세그먼트는 HPIV1 또는 ㅉ2로부터의 대응 유전자 또는 유전자 서열에 의해 치환 또는 보충될 수 있고 그 역도 마찬가지이다. 후술하는 한가지 실시예에서, 본 발명은 HPIV1의 HN 및 F 당단백질 유전자의 2가지 모두가 HPIV3 백그라운드에서 그들의 대응 유전자에 의해 치환됨으로 해서, 두가지 모균주 모두에 대표적인 면역학적 특성을 갖는 키메릭 바이러스를 생산하는, PIV 클론, rPIV3-1을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상술한 바와 같이 유전자 또는 유전자 세그먼트의 기탈 변형을 갖는 키메릭 PIV 또는 PIV 클론에 예컨대 HPIV3 JS cp45와 같은 생물학적으로 유도된 변이주 PIV로부터 채택된 한가지 이상의 약독화 변이를 도입시킴으로써, 약독화를 달성함으로써 추가로 변형시키거나, 또는 추가로 약독화시켜, 키메릭 돌연변이 유도체를 만들 수 있다. 예컨대, 폴리뉴클레오타이드를 코딩하거나 코딩하지 않는 한가지 이상의 인간의 PIV를 이종성 인간 PIV, 소의 PIV 또는 쥐의 PIV로부터 상기한 바와 가티 대응 서열로 치환할 수 있고, 이러한 치환은 예컨대 생물학적으로 유도된 약독화 PIV 변이주로부터 채택된 ts, ca 또는 att 표현형을 특정하는 한가지 이상의 돌연변이와 조합되어 약독화 또는 추가로 약독화된 (즉 키메릭 클론이나 생물학적으로 유도된 모 바이러스에 비해서) 백신 바이러스를 생산할 수 있다. 다른 한편, C, D 또는 V ORF와 같은 비필수적인 유전자 또는 유전자 세그먼트의 기능적인 결실을 생물학적으로 유도된 PIV돌연변이주로부터 ts, ca 또는 att 표현형을 특정하는 한가지 이상의 돌연변이와 재조합 PIV에서 조합시켜 약독화된 백신 균주를 만들 수 있다. 선택된 여러가지 돌연변이의 조합 효과에 의해, 이러한 조합적인 변형에 의해 소망되는 표현형 특성, 예컨대 증가된 바이러스 수율, 개선된 약독화, 및/또는 약독화 표현형으로부터의 리버젼에 대한 유전적 내성을 갖는 재조합 PIV를 만들 수 있다.
한가지 조합적인 돌연변이 디자인에 있어서, 인간의 PIV게놈 또는 안티게놈 서열과 적어도 한가지의 비-인간 PIV 서열, 예컨대, 인간과 소의 PIV 두가지 모두로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와의 인간의 PIV 게놈의 키메라를 포함하는 변형된 PIV가 제공된다. 이것은 또한 예컨대 하나 이상의 자연발생적인 ts, ca 또는 att 변이와 같이 생물학적으로 유도된 PIV로부터 채택된 한가지 이상의 변이를 인코포레이션한다. 다른 한편, 변형된 PIV는 예컨대 HPIV1 및 HPIV2와 같은 한가지 이상의 이종성 인간의 PIV로부터의 서열에 연결된 HPIV3으로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와 같이 2가지 이상의 인간의 PIV 게놈의 키메라일 수 있으며, 이것은 하나 이상의 ts, ca, att 또는 생물학적으로 유도된 PIV로부터 선택된 기타 돌연변이를 부가적으로 인코포레이션한다 (예컨대 JS cp45와 같이 생물학적으로 유도된 변이주 PIV로부터 채택된 ts, ca 또는 att 표현형을 특정하는 뉴클레오타이드 치환). 보다 구체적인 측면에서, 약독화된 클론, 또는 예컨대 대형 폴리머라제 L 유전자에서 ts 돌연변이를 일으키는 아미노산 치환을 코딩하는 뉴클레오타이드 변경에 의해 추가로 약독화된 클론에서 인간의 PIV3의 개별적인 유전자 또는 유전자 세그먼트들을 HPIV1 또는 HPIV2로부터의 대응 유전자 또는 유전자 세그먼트로 치환 또는 보충하거나 또는 그 역으로 수행할 수 있다. 예컨대, 본 발명은 HPIV3 백그라운드에서 그들의 대응 유전자가 치환된 HPIV1의 HN 및/또는 F 당단백질을 갖는 PIV 클론을 제공한다. 여기서 결과적인 키메릭 클론의 표현형은 하나 이상의 N, P, L, M, HN, F, C, D 및 V 유전자에서 코딩된 ts, ca 또는 att 돌연변이(들)에 의해 부가적으로 변형된다. 본 발명에 개시된 가능한 돌연변이 메뉴로부터 여러가지 조합을 만들어서, 예컨대 복수의 PIV 균주의 대표적인 면역학적 특성을 갖는 만족스러울 정도로 약독화된 면역원성, 키메릭 바이러스를 만들 수 있도록, 백신 바이러스를 선택된 수준의 약독화, 면역원성 및 안정성을 갖도록 보정할 수 있다. 한가지 측면에서, 키메릭 PIV 백그라운드에 인코포레이션된 PIV 폴리머라제 유전자 L에서 적어도 하나 이상의 약독화 돌연변이가 발생된 재조합 PIV가 제공된다 (후술되는 실시예에서 설명되는 바와 같이 재조합체 r942, r992, r1558, r942/992, r942/1558, r992/1558, 또는 r942/992/1558). 예컨대, 본 발명의 이러한 측면의 유용한 키메릭 PIV 재조합체는 이종성 백그라운드, 예컨대 HPIV3 클론에서 그의 대응 유전자(들)로 치환된 예컨대 HPIV1로부터의 HN 및/또는 F 당단백질 유전자의 하나 이상의 유전자 또는 유전자 세그먼트를 갖고, 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터 폴리머라제 유전자의 아미노산 변경 (942 위치에서 예컨대 Tyr로부터 His로의 변경, 992 위치에서 Leu로부터 Phe로의 변경, 및/또는 1558위치에서 Thr로부터 Ile로의 변경등)을 일으키는 뉴클레오타이드 치환과 같이 하나 이상의 부가적인 약독화 변경이 인코포레이션될 수 있다. 다음에 예시되는 이러한 키메릭, 약독화 재조합의 하나는 JS cp45로부터 상기 특정된 세가지 L 유전자 변이가 모두 인코포레이션된 rPIV3-1의 유도체인 rPIV3-1.cp45L이다.
백신 균주 개발을 위해 키메릭 PIV 백그라운드에서 인코포레이션될 수 있는 또 다른 돌연변이는 다른 유전자에서 생물학적으로 유도된 돌연변이로부터 선택하거나, 또는 표준 위치 지향된 돌연변이 또는 기타 순수한 재조합 돌연변이법에 의해 재조합 게놈에서 de novo 합성하게 된다. 여기서 재조합 PIV 중 생물학적으로 유도된 돌연변를 채택하거나 신규한 돌연변이를 생성하기 위한 표적 유전자에는 뉴클레오타이드 단백질 N, 인단백질 P, 대형 폴리머라제 서브유닛 L, 매트릭스 단백질 M, 헤마글루티닌-뉴라미니데이즈 단백질 HN, 융합 단백질 F 및 C, D 및 V ORF 산물이 포함된다. 또한 PIV 게놈의 3' 리더 또는 트레일러 대역의 서열과 같은 엑스트라젠 서열도 표적화된다. 비-키메릭, 재조합 PIV 중에 동정 및 인코포레이션된 상기 예시적인 돌연변이들을 예컨대 rPIV3-1과 같은 키메릭 PIV 백그라운드에 쉽게 인코포레이션시킬 수 있다. 이러한 예시적인 돌연변이에는 JS cp45의 Val96또는 Ser389잔기에 해당하는 위치에서 특정 돌연변이를 비롯하여 N 단백질 중 하나 이상의 돌연변이가 포함된다. 보다 상세한 측면에서, 이들 돌연변이들은 Val96에서 Ala로 또는 Ser389에서 Ala로서 표시된다. 키메릭 PIV 재조합체에 인코포레이션될 것이 소망되는 또 다른 돌연변이는 상술한 바와 같이 JS cp45의 Ile96에 해당하는 위치에서의 돌연변이, 바람직하게는 Ile96에서 Thr로의 치환으로 표시되는 돌연변이와 같이 C 단백질 중의 돌연변이이다. 키메릭 PIV 백그라운드에서 인코포레이션되기 위한 또 다른 예시적인 돌연변이에는 F 단백질에서의 하나 이상의 돌연변이가 포함되며 예로서 Ile420에서 Val로, 또는 Ala450에서 Thr로의 치환과 같이 Ile420또는 Ala450잔기에 해당하는 위치에서 JS cp45로부터 채택된 것을 들 수 있다. 본 발명의 또 다른 키메릭 재조합체는 Val384에서 Ala로의 치환과 같이 JS cp45의 Val384잔기에 해당하는 위치에서의 돌연변이처럼, HN 단백질 중의 한가지 이상의 아미노산 치환을 채택할 것이다. 또 다른 키메릭 재조합체는 예컨대 재조합체 게놈 또는 안티게놈의 3' 리더 서열과 같은 엑스트라제닉 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 인코포레이션하게 될 것이다. 이러한 돌연변이의 예로는 JS cp45의 뉴클레오타이드 23, 24, 28 및/또는 45에 해당하느 하나 이상의 위치에서 일어나는 3' 리더 돌연변이를 들 수 있고, 예컨대 뉴클레오타이드 23에서 T가 C로, 뉴클레오타이드 24에서 C가 T로, 뉴클레오타이드 28에서 G가 T로, 또는 뉴클레오타이드 45에서 T가 A로 변경되는 것을 들 수 있다. 키메릭 PIV 백그라운드에서의 또 다른 엑스트라젠 돌연변이에는 N 유전자 개시 서열에서의 한가지 이상의 돌연변이를 들 수 있는데, 예컨대 JS cp45의 뉴클레오타이드 62에 해당하는 위치에서 N 유전자 개시 서열의 돌연변이가 그것으로서 예컨대 A가 T로 변경되는 것이다. 후술되는 실시예에서 재조합 PIV내로 평가 및 결합될 이러한 예시적인 돌연변이들은 본 발명에 설명된 방법 및 도구를 이용함으로써 키메릭 PIV 재조합체 내로 쉽게 인코포레이션될 수 있으며 소망되는 표현형 변화를 개별적으로 및/또는 조합적으로 특정하여 본 발명 범위의 더욱 부가적으로 약독화된 키메릭 백신 균주를 생산할 수 있게 한다.
부가적인 조합적 돌연변이 디자인에 있어서, 본 발명의 PIV 클론에서 생물학적으로 유도된 PIV 또는 재조합적으로 발생된 것으로부터 채택된 하나 이상의 외래 ts, ca 또는 att 돌연변이를, 별개의 상이한 다른 돌연변이 (예컨대 PIV N, P, L, M, HN, F, C, D 또는 V유전자 또는 유전자 세그먼트, 또는 RSV 또는 홍역 바이러스와 같은 다른 소스로부터의 유전자 또눈 유전자 세그먼트의 결실, 부가, 또는 재배열)와 조합적으로 인코포레이션하는 변형된 PIV가 제공된다. 이 경우, 본 발명에 설명된 돌연변이 메뉴로부터 다양한 조합을 만들어 백신 바이러스의 약독화, 면역원성 및 안정성을 선택된 수준으로 조정할 수 있다. 따라서, JS cp45에서 발견되는 PIV 폴리머라제 유전자 L에서의 돌연변이와 같이 생물학적으로 유도된 PIV 돌연변이체로부터의 또는 재조합적으로 발생된 돌연변이와 같은 적어도 하나의 약독화 돌연변이를 나타내고, 비-PIV 소스 (예컨대 면역원성 RSV 또는 홍역 유전자 또는 에피토프, 또는 시토카인 코딩 유전자)로부터의 이종성 유전자 또느 ㄴ유전자 세그먼트의 치환 또는 도입, 발현 수준을 변경시키기 위한 바이러스 유전자스ㅣ 순서 변화, 유전자 중복 제거, PIV 프로모터를 그의 안티게놈 대응물로 치환하는 것, 예컨대 외래 서열의 삽입 용량을 증가시키기 위해 인터제닉 대역을 단축, 연장 또는 제거하는 것, RNA 복제 또는 전사를 증가시키거나 감소시키기 위한 시스-작용 시그날에 있어서의 돌연변이, 독특한 제한효소 부위의 삽입, 또는 심지어 비필수 유전자 전체를 결실시키는 것 중에서 선택된 한가지 이상의 부가적인 변경이 인코포레이션된 재조합 PIV가 제공된다.
백신 용도를 위해, 본 발명에 따라 제공된 바이러스는 백신 제제 중에 직접 이용되거나 또는 당업자에게 잘 알려진 동결건조 프로토콜을 이용함으로써 동결건조시켜 이용될 수 있다. 동결건조된 바이러스는 일반적으로 약 4℃에서 유지될 것이다. 사용될 준비가 되면, 동결건조된 바이러스를 예컨대 염수 또는 SPG, Mg++및 HEPES를 포함하는 염수 등에 어쥬번트를 첨가하거나 첨가하지 않은 상태로 안정화 용액 중에 재조성시켜 사용한다. 이에 대해서는 다음에 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 PIV 백신은 활성성분으로서 상술한 바와 같이 생성된 PIV을 면역학적으로 유효한 양으로 함유한다. 변형된 바이러스는 생리학적으로 허용가능한 담체 및/또는 어쥬번트와 함께 숙주내로 도입될 수 있다. 유용한 담체는 기술분야에 잘 알려져 있으며 예컨대 물, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글라이신, 히알루론산 등을 들 수 있다. 얻어진 수용액은 그대로 사용되기 위해 포장되거나 또는 동결건조시키며, 동결건조된 제제는 상기한 바와 같이 투여전에 멸균용액과 합쳐 사용한다. 이 조성물은 생리조건에 알맞게 조정되도록 약학적으로 허용되는 보조물질, 예컨대 pH 조정제, 완충제, 등장성 조정제, 습윤제 등, 예컨대 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 등을 포함할 수 있다. 허용가능한 어쥬번트로는 특히 불완전 Freund's 보조제, MPLTM(3-o-탈아실화 모노포스포릴 지질 A: RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) 및 IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA)를 들 수 있다.
상기한 바와 같이 PIV 조성물을 이용한 면역화시 에어로졸, 점적제, 경구, 국소용 또는 기타 경로를 통해 투여하며 숙주의 면역계가 예컨대 F 및 HN 당단백질과 같이 PIV 바이러스 단백질에 특이적인 항체를 생산함으로써 백신에 반응하게 된다. 본 발명에 설명된 바와 같이 생산된 PIV의 면역학적 유효량으로 백신화한 결과, 숙주는 적어도 부분적으로 또는 완전히 PIV 감염에 대해 면역적이거나, 또는 중간 또는 심한 PIV 감염, 특히 하기도의 PIV 감염에 대해 저항성을 갖게된다.
백신이 투여될 숙주는 PIV 또는 그와 밀접히 연관된 바이러스에 의한 감염에 민감한 포유동물이면 어느 것이든 무방하고 그러한 숙주는 백신화 균주의 항원에 대해 보호적인 면역 응답을 일으킬 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명은 인간 및 여러가지 수의용 용도를 위한 백신 개발법을 제공한다.
본 발명의 PIV를 함유하는 백신 조성물은 PIV 감염에 민감하거나 감염될 위험이 있는 숙주에게 투여되어 숙주 자신의 면역 응답 능력을 향상시킨다. 이러한 양은 "면역학적 유효량"이라 칭한다. 이러한 용례에서, 유효량 범위내에서 투여될 PIV의 정확한 양은 숙주의 건강상태와 체중, 투여방식, 제제의 특성등에 따라 달라질 수 있으나 일반적으로 숙주 당 약 103내지 106플라크 형성 단위 (PFU: plaque forming units)의 바이러스, 더욱 일반적으로는 숙주 당 약 104내지 106PFU 바이러스가 될 것이다. 어떠한 경우에도, 백신 제제는 본 발명의 변형된 PIV를 심각하거나 생명을 위협하는 PIV 감염에 대해 숙주 환자를 효과적으로 보호하는데 충분한 양으로 공급하여야 한다.
본 발명에 따라 제조된 PIV는 복수개의 PIV 혈청형 또는 균주에 대한 보호를 획득하기 위해 다른 PIV 혈청형 또는 균주의 바이러스와 결합될 수 있다. 다른 한편, 설명된 바와 같이 하나의 바이러스 내로 엔지니어링된 복수 혈청형 또는 균주들의 보호적인 에피토프를 결합시킴으로써 복수 PIV 혈청형 또는 균주에 대한 보호가 획득될 수 있다. 일반적으로, 상이한 바이러스들이 투여될 경우 이들은 동시에 혼합 및 투여되겠지만, 따로따로 투여해도 된다. 한가지 균주에 의한 면역이 같거나 다른 혈청형의 여러 균주들에 대해 보호작용을 제공할 수 있다.
몇가지 경우에는 본 발명의 PIV 백신을 다른 제제, 특히 다른 아동 바이러스에 대해 보호적인 응답을 유도하는 백신들과 결합시키는 것이 요망될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서 PIV를 호흡기 융합 바이러스 (RSV) 또는 홍역 바이러스와 같은 다른 병원균의 보호적인 항원을 코딩하는 서열들을, 감염성 PIV를 생산하는데 사용된 PIV 게놈 또는 안티게놈내로 인코포레이션시킴으로써 다른 병원균의 보호적인 항원들에 대한 벡터로서 이용할 수도 있다. RSV cDNA의 클로닝 및 본 발명과 관련된 기타 설명이 본 출원인의 공동계류중인 미국특허출원 제 08/534,768, 60/021,773, 08/720,132, 60/046,141, 60/047,634, 및 08/892,403 및 PCT 특허출원 PCT/US97/12269에 설명되어 있으며 이들은 본 발명에 참조되었다.
본 발명의 백신 조성물의 단일 또는 복수 투여를 수행할 수 있다. 신생아 및 유아에 있어서는, 충분한 면역수준을 이끌어내기 위해 여러차례의 투여가 요구될 수 있다. 투여는 생후 첫달 이내에, 그리고 천연 (야생형) PIV 및/또는 기타 바이러스 감염에 대한 충분한 보호수준을 유지하는데 필요하도록, 아동기 내내 예컨대 2개월, 6개월, 1년 및 2년 등의 간격으로 투여하여야 한다. 마찬가지로, 건강관리 직종 종사자, 어린이 보호 직종 종사자, 어린 아동이 있는 가족 구성원, 심폐기능이 떨어진 노인 및 개인등과 같이 반복되거나 심각한 PIV 감염의 위험이 있는 성인들도 보호적인 면역 응답을 수립 및/또는 유지하기 위해 복수회의 면역화가 필요할 수 있다.
본 발명의 백신에 의해 제공되는 유도 면역 수준은 무력화된 분비성 및 혈청 항체의 양을 측정함으로써 모니터할 수 있다. 이러한 측정에 기초해서, 백신 투여량을 조정하거나 요망되는 보호도를 유지하는데 필요한 만큼 백신화를 반복시킬 수 있다. 또한, 여러가지 수용체 그룹에 대해서는 상이한 백신 바이러스들이 유리할 수 있다. 예컨대, T 세포 에피토프에 풍부한 부가적인 단백질을 발현하는 엔지니어링된 PIV 균주들이 유아보다 성인에게 특히 이로울 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서는 PIV를 호흡기의 일과성 유전자 요법을 위한 벡터로서 이용한다. 이 구체예에 따라 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈은 목적하는 유전자 산물을 코딩할 수 있는 서열을 인코포레이션한다. 목적하는 유전자 산물은 PIV 발현을 제어하는 것과 같거나 다른 종류의 프로모터의 조절을 받는다. 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈과 N, P, L 및 다른 소망되는 PIV 단백질을 공동발현시킴으로써 생성되고 목적하는 유전자산물을 코딩하는 서열을 함유하는 감염성 PIV를 환자에게 투여한다. 에어로졸, 네불라이저, 또는 기타 국소투여에 의해 환자의 호흡기로 투여한다. 재조합 PIV를 소망되는 유전자 산물을 치료 또는 진단 수준으로 발현시키는데 충분한 양으로 투여한다. 이 방법으로 투여될 수 있는 대표적인 유전자 산물은 예컨대 인터류킨-2, 인터류킨-4, 감마-인터페론, GM-CSF, G-CSF, 에리쓰로포이에틴, 및 기타 시토카인류, 글루코세레브로시데이즈, 페닐알라닌 히드록시레이즈, 시스틱 피브로시스 투과막 콘덕턴스 레귤레이터 (CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼레이즈, 시토톡신, 종양억압 유전자, 안티센스 RNAs, 및 백신 항원이다.
다음에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 I
음성 센스 PIV 게놈 RNA를 코딩하는 플라스미드 p218(131)의 제조
HPIV3 JS 균주의 완전한 15462 nt 게놈 서열을 코딩하는 완전한 cDNA 클론 p218(131 (도 1: 서열 1) (부다페스트 조약에 따라 American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.에 기탁되고 수탁번호 97991로 수탁됨) 제조하였다. 자체-절단에 의해 HPIV3의 3' 말단이 생성되도록 간염 델타 리보자임을 게놈 서열의 3' 말단에 인접하게 위치시켰다 (Perrotta 및 Been, Nature 350:434-436, (1991), 본 발명에 참조됨). 델타 리보자임 다음으로 T7 전사 터미네이터를 위치시켰다. T7 프로모터는 HPIV3 게놈의 5'말단 뉴클레오타이드가 첫번째로 합성된 뉴클레오타이드가 되도록 게놈 서열의 5' 말단에 인접하게 위치시켰다. 이러한 배열에서, cDNA는 어떠한 부가적인 이종성 뉴클레오타이드 없이 정확한 게놈 말단들을 함유하는 PIV3 게놈 RNA의 완전한 음성-센스 복제물을 코딩한다.
cDNA수크로스 구배 원심분리에 의해 정제한 비리온으로부터 분리된 RNA의 역전사 (RT) 및 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 제조된 14개의 중복 서브클론 (A*-L로 표시, 괄호안의 문자는 개별적인 플라스미드를 나타내는 것으로서 특정 바이러스 유전자를 가리키는 것은 아님)으로부터 HPIV3 cDNA를 조립하였다 (Stokes 외, 상기문헌, 1992; Stokes 외, 상기문헌, 1993, 두가지 모두 본 발명에 참조됨). 서브 클론들은 게놈 RNA의 다음 뉴클레오타이드에 걸쳐있다 (3' 말단을 위치 1로 표시함): 1-2058(A*), 1874-3111(A'), 3086-5140 (C), 4348-5276(C'), 5072-6695(D*), 5904-8532(E), 7806-9898(F), 9632-10740(F'), 9760-10955(G), 10862-11925(H), 11835-12868(I), 12426-13677(J), 13630-14496(K), 및 14467-15462(L). 각각의 단편을 통상적인 클로닝 기술을 이용하여 pBluescript KSII (Strategene, La Jolla, CA)내로 클로닝시켜 완전한 서열을 분석하였다.
이어서 플라스미드 p(L)을 위치-지향 돌연변이시켜 MUTA-GENE 공정 (BioRad, Hercules, CA)에 따라 단일-가닥 DNA 중간체를 경유하여 T7 프로모터를 도입하였다. 음성-센스 돌연변이 프라이머: 5'-AATACGACTCACTATA*ACCAAACAAGAGAAG-3' (서열 2; T7 서열은 이탤릭체로 나타내고, HPIV3-특이적인 서열은 밑줄 그었으며, 5'-말단 HPIV3 뉴클레오타이드, 게놈 위치 15462는 꽃표시 함)를 이용하여 HPIV3 게놈의 정확한 5' 말단에서 전사가 개시되도록 T7 프로모터를 위치시켰다. 이렇게 변형된 p(L)을 p(L*)로 표시하였다. 음성-센스 돌연변이 올리고뉴클레오타이드 5'-CCAAGTACTATGAGATGCTTGATT-3' (서열 3)플라스미드 p(E)를 변형시켜 HPIV3 위치 7903, 7913, 7915에서 HN 유전자 내로 3가지 뉴클레오타이드 치환 (밑줄)을 삽입하였다 (도 1). 이들 치환들은 Hga I 부위를 제거하고, Sca I 부위를 삽입하며, 코딩된 HN 단백질의 아미노산 370을 변형시켜 모노클로날 항체 (mAb) 423/6 및 170/7에 의해 인식된 에피토프가 절제되도록 하였다 (van Wyke Coelingh외, J. Virol. 61:1473-1477, (1987), 본 발명에 참조됨). p(E*) 내지 p(K) 서브클론들을 p(L*) 플라스미드로 단계적으로 조립하여 p(E*FF'GHIJKL*)을 얻었다 (도 1A). 이 플라스미드는 게놈의 5' 말단에 뉴클레오타이드 15462에 인접한 T7 프로모터와 함꼐 HPIV3 뉴클레오타이드 5904-15462를 포함한다. 서브클론 p(A*) 내지 p(E)를 HPIV3 뉴클레오타이드 1-8532를 함유한 두번째 중복 서브클론 p(A*A'CC"D*E)로 어셈블시켰다.
p(E*FF'GHIJKL*)과 p(A*A'CC'D*E)의 두가지 서브클론의 서열을 완전히 분석하였다. 상기 도입된 포인트 돌연변이에 더해, 상기 cDNA는 N 유전자 내의 1615 위치에서 하나의 뉴클레오타이드가 치환되고 코딩된 단백질에서 아미노산 506의 치환을 일으키는 점에서 정통한 JS HPIV3 서열 (Stokes외, 상기문헌 1992)과 달랐다. L 유전자 중의 10355, 11333 및 15242 위치에서 3가지 또 다른 뉴클레오타이드 치환이 발견되었는데 이들은 코딩된 단백질을 변경시키지는 않았다 (도 2). 이들 3가지 비코딩 변경은 cDNA로부터 유도된 재조합 바이러스 (rPIV로 표시)를 동정하기 위한 부가적인 서열 마커로서 유지되었으며 N 유전자 내의 돌연변이는 후술되는 바와 같이 보정되었다.
이어서 간염 델타 바이러스 리보자임과 HPIV3 위치 1에 인접한 T7 터미네이터를 삽입하도록 서브클론 p(A*A'CC'D*E)를 변형시켰다. 플랭킹 간염 델타 바이러스 안티게놈 리보자임 (부분적으로 굵게 표시)의 자체-절단을 통해 HPIV3 게놈의 3'말단 (GGT↓GGG)(밑줄)이 발생된 HPIV3 미니게놈을 먼저 제조하였다 (Dimock and Collins, J. Virol. 67: 2772-2778, (1993); Perrotta and Been, 상기문헌 (1991). 본 발명에 참조됨). 리보자임에 이어 T7 전사 터미네이터가 뒤를 이었다. 리보자임 절단 부위에 인접한 서열을 Sma I 부위 (CCC↓GGG)로 변형시키고 T7 터미네이터의 다운스트림쪽에 ApaI 부위 (GGGCC↓C)를 위치시키는 PCR 반응에서 상기 미니게놈 cDNA를 템플레이트로서 사용하였다. BssHII에 의해 절단되어 충전에 의해 블런트-말단화된 pKSII내로 이 PCR 산물을 클로닝시켜 p218을 만들었다.
블런트-말단 접합에 의해 개방된 Sma I 부위로 모든 서열이 도입될 수 있도록 하고 그의 RNA 전사체가 델타 리보자임 절단 부위 (NNN↓GGG)에서 절단되도록 p218을 디자인하였다. p(A*A'CC'D*E) 서브클론을 Hga I 및 Sal I (8533)으로 절단하여 HPIV3 cDNA를 방출시키고 dNPTs 및 T4 DNA 폴리머라제로 충전시켜 블런트 말단을 얻었다. Hga I 부위는 HPIV3 위치 1의 10 뉴클레오타이드 업스트림이고 절단 및 충전시, HPIV3 위치 1로부터 시작되는 블런드 말단을 남긴다. 변형된 Hga I-Sal I 단편을 겔 정제시키고 p218의 Sma I 부위로 클로닝시켰다. N 유전자 (nt 1615에서 T)에서의 돌연변이를 Kunkel 돌연변이발생 (Kunkel외, methods Enzymol. 154: 367-382, (1987), 본 발명에 참조됨)을 이용하여 JS wt 서열 (nt 1615에서 A)로 보정하였다 (GenBank accession #Z11575, 본 발명에 참조됨). 이 플라스미드를 p218(A*A'CC'D*E)라 칭하였다 (도 1).
뉴클레오타이드 7438-15462로부터의 HPIV3 cDNA와 T7 프로모터를 함유한 p(E*FF'GHIJKL*)의 Xho I-Ngo MI 단편을 p218(A*A'CC'D*E)의 Xho I-Ngo MI 윈도우내로 클로닝시켰다 (도 1). 이로부터 HPIV3 뉴클레오타이드 7538에서 HPIV3 cDNA의 2개의 단편이 결합되어, L 유전자에서 3가지 부수적인 돌연변이와 HN 유전자에서 3가지 소망되는 돌연변이를 음성-센스 게놈 RNA와 함께 코딩하는 완전한 길이의 HPIV3 cDNA를 함유하는 플라스미드를 생산하였다. 이어서 마지막 구축물, p218(131) (도 1: 서열 1)을 Taq DYE Deoxy Terminator 사이클 서열분석 키트 (ABI, Foster City, CA)를 이용하여 NCI Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD)에서 자동화 서열분석에 의해 서열 전체를 분석하였다. 이 분석에 의해 HN 유전자에서의 부가적인 변경, 즉, HN 아미노산 263을 쓰레오닌으로부터 이소류신으로 변경시킨 위치 7593에서의 HN 유전자의 C에서 T로의 변경이 동정되었다 (도 2 참조)
실시예 II
HPIV3의 전사 및 RNA 복제 시스템
이 실시예는 인간의 파라인플루엔자 바이러스 타잎 3 (HPIV3)에 있어서 재구성된 전사 및 RNA 복제 시스템을 생산하기 위한 조성물 및 방법을 설명한다. 이 예시적인 시스템은 백시니아 바이러스 재조합체에 의해 공급된 T7 RNA 폴리머라제에 의해 추진된 형질도입된 플라스미드로부터 세포내 발현된 성분들을 이용함으로써 개발되었다. 이 시스템은 HPIV3 게놈 RNA의 음성-센스 아날로그에 기초한 것으로서 여기서 바이러스 유전자는 결실되고, 세균성 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼레이즈 (CAT)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 치환되었다. N, P 및 L 단백질을 공동형질도입된 플라스미드로부터 발현시켜 효과적인 전사 및 RNA 복제가 가능토록 하였다. 이 실시예에 따른 전사에 의해 서브게놈 폴리아데닐화된 mRNA가 생산되고, 이는 예컨대 올리고 (dT)크로마토그래피에 의해 쉽게 분리되었다 이 실시예에 따른 RNA 복제에 의해 미니-안티게놈과 자손 안티게놈이 생산되며, 이들은 마이크로코컬 뉴클리아제에 의한 절단에 대한 내성에 기초해서 봉입되는 것으로 나타났다.
A) 바이러스 및 세포
Furst등 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 8122-8126, 1986, 본 발명에 참조됨)의 설명에 따라 박테리오파지 T7 RNA 폴리머레이즈를 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체, vTF7-3을 제공하였다. HEp-2 모노레이어 배양체를 37℃에서 5% CO2중 2% 소의 태아 혈청 (FBS)을, 50μg/ml 겐타마이신 설페이트 및 2mM 글루타민이 보강된 OptiMEM 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD)와 함께 유지시켰다.
B) cDNAs
HPIV3의 JS 균주의 N, P 및 L 유전자의 ORFs에 해당하는 cDNA (GenBank #11575; Stokes외, 1992)를 플라스미드 pTM-1의 Nco I-Sal I 윈도우 내로 클로닝시키고, 여기서 전사는 T7 RNA 폴리머레이즈에 의해 매개되며 번역은 외래 ORF에 선행되는 내부 리보좀 엔트리 부위에 의해 매개된다 (Elroy-Stien외, Proc.Natl.Acad. Sci. U.S.A. 86:612606130 (1989), 본 발명에 참조됨). 각각의 유전자를 폴리머레이즈 연쇄반응 (PCR)에 의해 먼저 변형시켜 번역개시 부위에서 Nco I 또는 Nco I-적합부위 및 다운스트림 말단에서 Sal I 위치를 지정하였다.
플라스미드 p(131)은 간염 델타 바이러스 리보자임을 결여하는 것을 제외하고 p218(131)과 마찬가지로 각각의 PCR에 대해 템플레이트로서 이용되었다. N ORF를 증폭시키는데 사용된 프라이머는 CCCTATAATTTCAACATGTTGAGCCTATTTG (서열 4; 양성-센스에 상대적인 포워드 프라이머) 및 GATTAAAATGTTGGTCGACTTAGTTGCTTCC 였다 (서열 5; 이탤릭체는 제한효소 위치를를 나타내고, 번역 개시 부위는 굵은 글씨로 표함). PCR 산물인 Afl III 및 Sal I 부위에 의해 플랭킹된 1578bp 단편을 pTM-1의 Nco I-Sal I 윈도우 내로 클로닝시켜 pTM(N)을 얻었다.
PIV3 인단백질 (P) ORF를 증폭시키는데 사용된 프라이머는 5-'CCATAGAGAGTCCATGGAAAGCGATGCTAAAAACTATC-3' (서열 6; 포워드 프라이머) 및 5'-CGGTGTCGTTTCTTTGTCGACTCATTGGCAATTGTTG-3' (서열 7; 역프라이머)였다. 게놈 RNA의 완전한 길이의 JS 균주의 cDNA (p311)을 PCR의 템플레이트로서 이용하였다. 얻어진 PCR 산물은 Nco I 및 Sal I 제한효소 위치 (이탤릭체)에 의해 플랭킹된 1851 bp 단편이었다. 이어서 PCR 산물을 pTM-1의 Nco-Sal I 윈도우내로 클로닝시켜 pTM(P)를 생산하였다.
두번째 PCR을 수행하여 C ORF 없이 PIV3 인단백질 P ORF를 증폭시켰다. p131을 다시 템플레이트 cDNA로서 사용하였다. 상이한 포워드 프라이머와 동일한 역프라이머를 이용하여 C 없이 PIV3 P ORF를 증폭시켰다; 5'-CCATAGAGAGTCCATGGAAAGCGACGCTAAAAACTATC-3' (서열 74; 포워드 프라이머) 및 5'-CGGTGTCGTTTCTTTGTCGACTCATTGGCAATTGTTG-3' (서열 7: 역프라이머). 얻어진 PCR 산물은 Nco I 및 Sal I 제한효소부위 (이탤릭체로 표시)에 의해 플랭크된 1851 bp 단편이었다. 포워드 프라이머에서 밑줄친 뉴클레오타이드는 P ORF에서는 침묵하나 C ORF의 개시 코돈을 쓰레오닌으로 변경시키는 뉴클레오타이드 치환을 나타낸다. C ORF에 대한 다음 개시 코돈은 400개 이상의 뉴클레오타이드 다운스트림이다. 따라서, P 단백질만이 생산될 것이다. 이어서 PCR 산물을 pTM-1의 Nco I-Sal I 내로 클로닝시켜 두번째 플라스미드, pTM(p no C)를 만들엇다.
HPIV3의 L ORF를 세부분으로 나누어 pTM-1로 클로닝시켰다; 말단은 PCR 산물로부터 유도되고 몸체는 p218(131)로부터의 제한단편이었다. L ORF의 업스트림 말단은 프라이머 GCAAAGCGTGCCCGGGCCATGGACACTGAATCTAACAATGGC (서열 8)과 GAAATTCCTTAATCGATTCTCTAGATTC (서열 9)를 이용하여 증폭시켰다. 이로부터 완전한 길이 게놈의 8625-9645 위치가 업스트림 말단상의 Sma I 및 Nco I 부위 및, 다운스트림 말단상의 Cla I 부위에서 플랭크된 1,020-bp PCR 산물 L1이 생산되었다 (세 부위 모두 이탤릭체). L ORF의 다운스트림 말단을 프라이머 CCCATCAACTGTAACATACGTAAGAAAGAC (서열 10) 및 GGTTAGGATATGTCGACATTGTATTTATG (서열 11)을 이용하여 증폭시켰다. 이로부터 완전한 길이의 게놈의 13,645-15,378 위치가 SnaB I 및 Sal I 위치 (이탤릭체)에 의해 플랭크된 1,733-bp PCR 산물 L2가 생산되었다. 플라스미드 p(131)을 Cla I 및 Pst I으로 절단하여 완전한 길이의 게놈의 9,630-14,120 위치를 함유하는 4,487-bp 단편 L을 생산하였다. L1 및 L 미들을 공통적인 Cla I 부위에서 결합시켜 pBluescript의 Sma I-Pst I 윈도우내로 클로닝시켜 p(L1+L 미들)을 생산하였다. 이어서 L2 단편을 p(L1+L 미들)의 Pst I-Sal I 윈도우내로 클로닝시켜 Nco I 및 Sal I에 의해 플랭크된 완전한 L ORF를 얻었다. 이어서 이것을 pTM-1의 NcoI-SalI 윈도우내로 클로닝시켜 pTM(L)을 얻었다. pTM(L) (서열 20), pTM(P) (서열 21), 및 pTM(L) (서열 22)의 PCR-생산대역의 서열을 디데옥시뉴클레오타이드 서열분석법에 의해 확인하였다.
T7 전사의 효율을 증대시키기 위해, PIV3-CAT(-)라 불리우는 음성-센스 PIV 미니게놈을 코딩하는 cDNA 구축물에 특정 변형을 가하였다 (Dimock 및 Collins, J. Virol. 67:2772-2778 (1993), 본 발명에 참조됨). PIV3-CAT(-)는 CAT ORF의 음성-센스 복제물에 융합된 HPIV3 게놈의 3'-말단 111 뉴클레오타이드 및 5'-말단 115 뉴클레오타이드를 포함한다. 이 cDNA는 HgaI에 의한 선형화 및 T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사시 HPIV3 게놈의 정확한 말단을 함유하는 미니게놈을 생산하도록 디자인되었다. cDNA 말단에 연속적인 연장을 부가한 돌연변이 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 2개의 연속적인 PCR 라운드를 이용하여 HgaI 부위를 간염 델타 리보자임 (Perotta and Been, Nature 350:434-436(1991) 본 발명에 참조됨)으로 치환하여, 자체-절단에 의해 3'HPIV3 게놈 엔드가 발생토록 하였다. T7 전사 종결 시그날을 리보자임 직후에 삽입하여 (도3) PIV3-CAT-델타를 제조하였다.
PIV-CAT-델타 cDNA를 PCR 돌연변이에 의해 변형시켜 트레일러와 T7 프로모터를 플랭킹하는 제한효소 부위를 이용하여 T7 프로모터와 미니게놈의 5' 말단 사이에 1개, 2개 또는 3개의 G 잔기를 삽입하였다. 이 변형에 의해 T7 전사의 효능이 증가되었다. 예비실험에서, 2개의 G잔기를 함유하는 미니게놈 (PIV3-CAT-GG라 명명)이 후술되는 재구성된 전사 및 번역 시스템에서의 CAT 발현에 가장 활성적이었으며 이후의 모든 유도체에 대해 이를 이용하였다.
PIV3-CAT-GG cDNA를 중복 PCT 돌연변이에 의해 더욱 변형시켜 다음과 같이 2개 부위에서 동시에 변형을 일으켰다. 먼저, 백시니아 바이러스 초기단계 RNA 폴리머라제 (T5NT)에 대한 탠덤 전사 종결 모티프를 함유하는 서열 T7CT (Yuen and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:6417-6421 (1987), 본 발명에 참조됨)을 델타 리보자임과 T7 전사 터미네이터 사이의 양성 센스 스트랜드 cDNA 스트랜드내로 삽입하였다 (도 1). 이 모티프와 후술될 두번째 모티프를 첨가하여 백시니아 바이러스 초기 RNA 폴리머라제에 의한 CAT 유전자의 혼란스런 전사를 방지하였다. 두번째로, (i) 코딩된 미니게놈에 대해 103-109위치에서 양성-센스 cDNA 스트랜드 내로 두번째 백시니아 바이러스 종결 모티프 (T5AT)를 삽입하고 (ii) 미니게놈 위치 112에서 0 내지 6G 잔기 (음성-센스)를 삽입하기 위해 (도 3) N 미번역 영역과 CAT 유전자 사이의 접합부에서 미니게놈 cDNA 삽입물을 변형시켰다. 3세트의 반응 (PCR 1, 2 및 3)이 관련된 중복 PCR 돌연변이는 다음과 같이 수행하였다. PCR 1은 템플레이트로서 PIV3-CAT-GG cDNA를 사용하고 프라이머로서 다음듸 2가지 돌연변이 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 7 세트의 평행 반응이었다 [PCR1(0) 내지 (+6)]: 포워드 프라이머는-111GGGGTTATGCTACTGCAGGCTTTTTTTCTCCCTTAGCCATCCG-62(서열 12) 였고 역프라이머는124CTCCATTCTAGA(N)TTATAAAAATTATAGAGTTCCC90(서열 13)이었다. 첫번째 올리고뉴클레오타이드의 굵은 글씨체 서열은 업스트림 탬덤 백시니아 터미네이터이고, 두번째 올리고뉴클레오타이드의 굵은 글씨체 서열은 두번째 터미네이터이다. 이 반응은 리보자임 및 인접하는 리더 대역을 증폭시키고 상기 돌연변이를 삽입시켰다. PCR 2는 템플레이트로서 PIV3-CAT-GG cDNA를 사용하고 독특한 NgoMI 부위의 플라스미드 서열 업스트림에서 하이브리다이즈된 것을 포워드 프라이머로 (도 3), 반응 1의 포워드 프라이머에 상보적인 역프라이머를 사용하는 단일 반응이었다. 따라서, PCR 1 및 2의 산물은 이 후자의 서열에서 중복되었다. PCR 1 (0) 내지 (+6) 및 PCR 2의 산물을 겔 정제시켰다. PCR1 (0) 내지 (+6)의 산물을 각각 PCR 2 산물 분주액과 별도로 혼합하고 PCR 2의 포워드 프라이머 및 PCR 1의 역프라이머를 함유하는 세번째 반응 (PCR3 (0) 내지 (+6))에서 증폭시켰다. PCR3 (0) 내지 (+6)의 산물을 플라스미드-특이 서열을 절단하는 NgoMI, 및 CAT 유전자의 업스트림 말단을 절단하는 XbaI로 절단하고 (도 3), PIV3-CAT-GG의 NgoMI-XbaI 윈도우 내로 클로닝시켰다. 이로부터 삽입된 G 잔기수에 따라 명명된 미니게놈을 코딩하는 cDNA 패널을 얻었다: PIV3-CAT 0 내지 PIV3-CAT +6. PCR로부터 유래한 모든 DNA 대역의 구조를 디데옥시뉴클레오타이드 서열분석에 의해 확인하였다.
c) 형질도입
6웰 플레이트에서 HEp-2 세포를 90% 점성도(confluence)까지 배양시켰다. 6-웰 플레이트 각각의 웰 (1.5 X 106세포)을 0.4μg pTM(P), 0.4μg pTM(N), 0.05μg pTM(L), 및 0.4μg 미니게놈 플라스미드로 형질도입시켰다. 이 플라스미드들 0.1 ml OptiMEM (Life Technologies)에 첨가하고 LipofectACE (Life Technologies) 12μl를 함유하는 OptiMEM 0.1 ml와 혼합하였다. 실온에서 약 15분간 인큐베이션시킨 후, 2% 송아지 혈청과 vTF7-3 1.5 x 107pfu를 함유하는 OptiMEM 1 0.8 ml를 각각의 웰에 첨가하였다. 이 플레이트들을 37℃에서 12시간 인큐베이션시킨 다음, 2% 소의 혈청을 함유하는 신선한 OptiMEM 1 으로 배지를 갈아주었다. 이어서 세포를 37℃에서 총 48시간 인큐베이션시킨 다음 RNA 분석과 CAT 분석을 위해 수확하였다. 각각의 미니게놈을 3회 (3웰) 수행하고 배지에서 스크랩하여 모았다.
D) CAT 분석
상기 설명된 바와 같이 수확된 세포의 각각의 샘플 3.33% (1.5 x 105세포)씩의 분주액을 CAT 분석을 위해 덜어내었다. 분주액을 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상등액을 폐기하였다. 세포 현탁액을 40mM Tris 1 ml, pH 7.5, 1mM EDTA, 150mM NaCl로 세척하고 50μl 0.25M Tris, pH 7.5에 재현탁시켰다. 냉동과 해동을 3회 반복하여 용해물(lysate)을 제조하고 8,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 청정화하였다. 통상적인 분석법 (Gorman 외 Mol. Cell. Bio. 2:1044-1051 (1982), 본 발명에 참조됨)을 이용하여 용해물 1μl에 대해 D-쓰레오-[디클로로아세틸 1-14C]클로람페니콜 (Amersham)을 아세틸화하는 능력을 분석하였다. 박층 크로마토그래피에 의해 아세틸화를 가시화시키고 포스포이미지 분석 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)에 의해 정량하였다.
E) RNA 분석
수집된 각 샘플의 나머지 세포 수확물을 캡시드화 RNA, 총 RNA 및 mRNA의 분리를 위해 3가지 동등부로 나누었다. 이 세가지 분주액을 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상등액을 버렸다. 세포 현탁액 분주액 2개를 1% Triton X-100, 0.5% DOC를 함유하는 RSB (10mM NaCl, 10mM Tris, pH 7.5, 1.5mM MgCl2) 50μl에 재현탁시켰다. 이어서 한 분주액에 10mM Tris 7.5, 1mM CaCl2, 및 20μg (1mg/ml 원액)의 마이크로모커스 뉴클리아제를 첨가하고 나머지 분주액에도 마이크로코커스 뉴클리아제를 뺀 동일한 혼합물을 첨가하였다 (Baker & Moyer, J. Virol. 62: 834-838 (1988), 본 발명에 참조됨). 마이크로코커스 뉴클리아제의 첨가목적은 캡시드와되지 않은 RNA를 파괴하여 사용 조건을 예비실험에 최적화시키기 위한 것이었다. 혼합물들을 30μ℃에서 30분간 인큐베이션시키고 공급자 지침에 따라 RNA를 Trizol (Life Technologies)을 이용하여 분리하였다. 세포 현탁액의 세번째 분주액을 Trizol을 이용하여 RNA 정제하고 정제된 RNA를 올리고(dT) 셀룰로스 크로마토그래피에 의해 폴리아데닐화 및 비폴리아데닐화 분획으로 분리하였다 (Grosfeld외, J. 퍄개ㅣ. 69:5677-5686 (1995), 본 발명에 참조됨). 0.44M 포름알데히드를 함유하는 1.5% 아가로스 겔 상에서 RNA 샘플을 러닝시키고 니트로셀룰로스에 옮기고 (Chomczynski, Anal. Biochem. 201:134-139 (1992), 본 발명에 참조됨), 스트랜드 특이적인 리보프로브를 이용하여 하이브리다이제이션시킨 다음 포스포이미지 분석에 의해 정량하였다.
실시예 III
변형된 PIV3 미니게놈의 제조 및 발현
이 실시예에서는, 단일 뉴클레오타이드 증가분의 길이가 다른 PIV3 미니게놈을 코딩하도록 cDNA 패널을 제조하였다. 이 재구성 시스템에서 전사 및 RNA 복제가 미니게놈에 대해 가장 효과적이었는데 미니게놈의 길이는 6배에 달하였다. 이 맥락에서, Paramyxovirus 및 Morbillivirus 속의 바이러스들은 전형적으로 "6의 규칙", [즉, 게놈 (또는 미니게놈)이 그들의 뉴클레오타이드 길이가 6의 배수인 경우에만 효과적으로 복제되는 것 (캡시드화 NP 단백질에 상대적으로 뉴클레오타이드 잔기의 정확한 공간을 위해 요구되는 것으로 여겨짐)]에 따라 체류한다. 그러나, 본 발명자들은 길이가 6배보다 한 뉴클레오타이드만큼 길거나 짧은 미니게놈도 놀랍게도 활성적임을, 특히 RNA 복제에서 활성적임을 발견하엿다.
단일 뉴클레오타이드 증가분만큼 길이가 차이나는 PIV3-CAT 0 내지 6+로 명명된 7개의 PIV3-CAT 미니게놈을 코딩하도록 7개의 cDNA 패널을 구축하였다 (도3). 각각의 미니게놈은 HPIV3 게놈 RNA의 짧은 음성-센스 동족체로서 여기서 바이러스 유전자들은 CAT ORF의 음성-센스로 치환 및 결실되었다. CAT ORF를 게놈 RNA의 N 및 L 유전자, N GS 및 L GE 전사 모티프, 및 3' 리더 및 5' 트레일러 엑스트라젠 말단의 미번역 세그먼트에 의해 플랭크시킨다. 각각의 PIV3-CAT 미니게놈의 5' 말단은 T7 RNA 폴리머라제의 인접 프로모터에 의해 정의된다. 이 프로모터를 상술한 바와 같이 코딩된 미니게놈의 5' 말단에 2개의 비바이러스성 G잔기를 연장시키도록 구축하였다. T7 프로모터의 미전사 중심에 인접한 부가적인 G잔기가 존재하면 그의 전사 효율이 증가되고 예비실험결과 2개의 G 잔기가 존재함으로 해서 후술되는 재구성 시스템에서 최고도의 활성을 나타낸 것으로 밝혀졌다. 이러한 2개의 G잔기는 미니게놈 길이 계산에 산입하지 않는다. 3' 미니게놈의 말단은 인접 간염 델타 바이러스 리보자임에 의해 자체-절단에 의해 생산하며 이것은 정확한 3'-말단 뉴클레오타이드를 생산게할것이다. 7개의 PIV3-CAT 미니게놈은 N 미번역 대역과 CAT 유전자 사이의 접합부에서 0 내지 6G 잔기의 삽입으로 인해 길이가 증가되며 (도 3), 길이범위는 898 내지 904 뉴클레오타이드이다. PIV3-CAT +2 미니게놈은 6의 짝배수인 유일한 것이다 (각각의 미니게놈은 T7 프로모터로 인해 5' 말단에 2개의 부가적인 비바이러스성 G 잔기를 함유하지만, 이들은 세포내 HPIV3-매개된 RNA 복제에 의해 사라질 것으로 추정된다).
각각의 PIV3-CAT cDNA를 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체인 vTF7-3으로 감염된 HEp-2 세포내로 형질도입시켰다. T7 프로모터의 통제하에 N, P 및 L단백질을 코딩하는 플라스미드를 나란히 형질도입하였다. 상기한 바와 같이 C ORF의 번역 개시부를 제거하기 위한 위치-지향 돌연변이에 의해 p cDNA를 변형시켰다. 세포들을 48시간 후-감염후 수확하였다. 세포 현탁액 한 분주액을 CAT 효소 분석을 위해 프로세싱하였다 (도 4). 나머지 세포들을 3개의 동등 분주액으로 나누어 후술하는 바와 같이 RNA 분석을 위해 프로세싱하였다.
PIV3-CAT 삽입물의 양성-센스 플라스미드 스트랜드 업스트림에서 2개의 탠덤 백시니아 바이러스 초기-유전자 전사 종결 모티프 (T7NT), 및 CAT ORF의 동일 스트랜드의 바로 직후의 업스트림 중의 세번째 모티프 (T5AT)를 함유하도록 미니게놈 cDNA를 더 변형시켰다 (도 3). 이들은 백시니아 바이러스 폴리머라제에 의해 CAT ORF의 혼란스런 전사를 최소화하기 위해 고안된 것이다 (Grosfeld 외, (1995) 상기문헌). PIV3-CAT 미니게놈 각각을 N, P 및 L 플라스미드에 의해 상보시키자 CAT 발현이 반복적으로 검색되었으며 CAT 검색은 세가지 모두의 PIV3 단백질에 의존적이었다. 그러나, 발현정도는 뉴클레오타이드 길이가 6의 짝수배인 PIV3-CAT+2에서 훨씬 높았다. 미니게놈과 서포트 플라스미드의 바람직한 비율 및 양을 CAT 효소 발현에 기초하여 측정하였다.
실시예 IV
PIV 미니게놈에 의한 양성-센스 RNA의 합성
PIV 미니게놈의 전사 및 복제를 두가지 공정 모두의 RNA 산물을 검색함으로써 확인하였다. 전기 실시예에서 설명한 바와 같이, RNA 분석을 위해 세포 상등액을 3가지 동등 분주액으로 나누었다. 한 분주액은 후술되는 바와 같이 올리고(dT) 분석을 위해 사용하였다. 나머지 2개의 분주액들은 세제로 용균시키고 마이크로코커스 뉴클리아제와 함께 인큐베이션시키거나 모방-처리하였다. 이어서 RNA를 분리하고 포름알데히드 아가로스 겔 상에서 전기영동시켜 분리한 다음 니트로셀룰로스로 이동시켜 음성-센스 CAT 리보프로브를 이용하여 하이브리다이제이션에 의해 분석하였다. 마이크로코커스-처리된 용균물 및 모방-처리된 용균물로부터의 RNA를 각각 도 5A에 상부 및 하부 패널로서 나타내었다.
모방-처리된 용균물로부터의 RNA 분석결과 각 미니게놈을 N, P 및 L 플라스미드로 상보시키면 931-뉴클레오타이드 RSV-CAT C2 미니게놈에 의해 발현된 RNA로 구성된 마커와 매우 유사한 크기를 갖는 RNA 밴드가 합성되는 것으로 나타났다 (Grosfeld 외, (1995), 상기문헌). 포스포이미지 분석결과를 도 5B에 나타내었다. N 또는 L 플라스미드가 생략된 경우에는 RNA가 거의 또는 전혀 검색되지 않았는데, 이는 이들 RNA가 재구성된 PIV3 폴리머라제의 산물임을 확인해준다.
각각의 PIV3-CAT 미니게놈은 2개의 양성-센스 RNAs, 즉, 미니-안티게놈과 서브게놈 CAT mRNA를 코딩할 것으로 기대된다. 각각의 미니-안티게놈은 898-904 길이의 뉴클레오타이드인 그의 미니게놈의 정확한 상보물일 것으로 예상된다. 예측된 서브게놈 mRNA를 GS 및 GE 시그날에 의해 정의하고, 길이는 804 뉴클레오타이드, 100 내지 200 뉴클레오타이드의 폴리A 테일을 함유할 것으로 예상된다.
도 5A (하부 패널)의 양성-센스 RNA의 단일 밴드의 검색 결과는 안티게놈과 mRNA가 겔 전기영동에 의해 분해되지 않았음을 시사했다. 따라서, 마이크로코커스 뉴클리아제 처리를 이용하여 안티게놈 RNA를 동정하였는데, 이는, mRNA가 아닌 안티게놈 (및 게놈)이 캡시드와되어 절단되지 않을 것이기 때문이다. 이 목적을 위한 마이크로코커스 뉴클리아제의 이용은 잘 수립되어 있으며 (Baker & Moyer (1988), 상기문헌), 선택된 조건은 RSV 미니레플리콘에 대해 입증되어 잇고 HEp-2 세포 용균물에 함유된 mRNA를 완전히 분해시키는 것으로 나타났다. 나머지 RNA를 음성-센스 리보프로브 (도5A, 상부 패널)를 이용하여 Nothern 블롯 분석에 의해 분석하고 포스포이미지에 의해 정량하였다 (도 5B: 이 분석에서 마이크로코커스-처리 RNA 및 미처리 RNA의 양을 별도로 정상화 하였음을 주목). 이러한 연구결과는 양성-센스 캡시드와된 미니-안티게놈에 해당하는 보호된 RNA 집단이 존재함을 확인해주었다. 몇몇 실험에서, 이것은 양성-센스 RNA의 약 3 내지 15%에 해당하는 RNA를 보호해주었다.
총 RNA 및 마이크로코커스-내성 RNA의 두가지 모두에 있어서 누적은 길이가 900 뉴클레오타이드이고 따라서 6의 배수인 +2 미니게놈의 경우 더 컸다. 그러나, RNA의 실제량은 길이가 6 뉴클레오타이드의 배수가 아닌 미니게놈, 특히, +2 미니게놈보다 하나 더 그커나 작은 +1 및 +3 미니게놈의 경우에도 누적되었다. 사실, +1 및 +3 미니게놈에 의해 생산된 캡시드화된 안티게놈의 양윽 +2 미니게놈의 85% 및 72%에 해당하였다 (도 5B). 효율이 가장 낮은 미니게놈인 +5 미니게놈의 경우에조차, 투적된 캡시드와 RNA의 양을 측정하자 활성이 +2 미니게놈 활성의 20%에 달하였다. 총 양성-센스 RNA를 검색하기 위한 측정시 +1 및 +3 미니게놈은 총 +2 미니게놈의 52% 및 45%에 해당하는 양으로 생산되었다.
서브게놈 mRNA가 존재하는지를 확인하기 위해, 수확된 세포 현탁액의 최종 분주액을 RNA 정제를 위해 프로세싱하였다. 이어서 RNA를 올리고(dT) 크로마토그래피로 처리하였다. 결합되지 못한 RNAs들과 결합된 RNA 들을 저염도 완충액에서 용출시키고 Northen 블롯 하이브리다이제이션 (도 6A)에 의해 분석한 다음 포스포이미지 분석하였다 (도6B; 이 경우 결합된 것과 되지 않은 것을 +2 미니게놈의 결합 RNA에 상대적으로 정상화시켰다). 이 분석에 의해 서브게놈 mRNA에 대해 기대된 바와 같이 양성-센스 mRNA의 약 64%가 폴리아데닐화된 것으로 밝혀졌다. mRNA의 누적량은 =2 미니게놈의 경우 가장 컸다. 그러나, 실질적인 양의 mRNA가 다른 미니게놈에서도 관찰되었다. +1 및 +3 미니게놈에 의해 합성된 mRNA의 양은 +2 미니게놈에 의해 합성된 양에 비해 각각 30% 및 20%였고, 활성이 가장 작은 미니게놈은 약 13%였다.
실시예 V
PIV 미니게놈에 의한 음성 센스 RNA의 합성
전술한 실시예에 설명된 여러 가지 PIV3-CAT 미니게놈은 mRNA 및 양성-센스 캡시드화 미니-안티게놈의 합성을 지향했으며, 여기서 후자는 RNA 복제의 첫 번째 단계를 나타낸다. RNA 복제의 두 번째 단계는 미니-안티게놈 산물로부터의 캡시드화된 자손 미니게놈의 합성에 관계된다. 이 후자의 프로세스를 평가하기 위해, 전술한 실시예에서 설명된 뉴클리아제-처리된 용균물과 모방-처리된 용균물로부터의 RNA 샘플을 양성-센스 CAT 리보프로브를 이용하여 Northern 블롯 하이브리다이제이션에 의해 분석하고 (도 7A) 포스포이미지에 의해 정량하였다 (도7B).
모방-처리된 용균물로부터의 RNA 분석결과 (도7A, 하부 패널) N 또는 L 서포트 플라스미가 생략된 음성 대조군을 비롯하여, 모든 샘플에서 상당량의 미니게놈이 세포내 축적된 것으로 나타났다. 도 5A-B 및 도6A-B에 설명된 분석은 양성-센스 RNA가 이러한 조건 하에서는 무의미함을 가리켜주었다. 따라서, N 또는 L의 부재하에 관찰된 미니게놈은 재구성된 HPIV3 폴리머라제에 의해 매개된 RNA 복제의 산물일 리가 없고, 그 대신 형질도입된 플라스미드의 T7 전사산물임이 분명하다.
재구성된 HPIV3 폴리머라제에 의해 생산된 미니게놈은 캡시드와될 것으로 예상되는 반면, T7 RNA 폴리머라제에 의해 생산된 미니게놈의 대부분은 캡시드화되지 않을 것으로 기대된다. 따라서, 도5A-B에 설명된 동일한 마이크로코커스 뉴클리아제-처리된 샘플로부터의 RNA를 이용하여 양성-센스 CAT 리보프로브와 하이브리다이제이션시킨 두 번째 블롯을 제조하였다 (도7A, 상부 패널). 그 결과 N 단백질 부재하에 누적된 모든 미니게놈 RNA가 예상된 바와 같이 분해된 것으로 나타났다 (도 7A, 상부 패널, 레인 1). L 단백질 부재하에 축적된 미니게놈 역시 기본적으로 모두 분해에 민감하였다 (도 7A, 상부 패널, 레인 2). L부재하, 그리고 N과 P 단독의 존재하에 합성된 플라스미드-유도된 미니게놈은 효과적으로 나타나지 않았다.
세가지 서포트 플라스미드의 완전한 세트가 존재할 경우에는, 각각의 미니게놈에 있어서 상당량의 마이크로코커스 뉴클리레이즈-내성 미니게놈 RNA가 누적되었다 (도 7A, 상부 패널). 양성-센스 RNA의 경우와 마찬가지로, +2 미니게놈의 경우 가장 많은 양의 자손 미니게놈이 관찰되었다 +1 및 +3 미니게놈은 그 다음으로 풍부하였다. 이들의 게놈 RNA 수준은 +2 미니게놈의 게놈 RNA 수준에 비해 각각 67% 및 42%였다.
전술한 실시예는 HPIV3 N, P 및 L 단백질들이 효과적인 전사 및 RNA 복제에 필요충분함을 입증해준다. 재구성된 PIV3 폴리머라제에 의해 매개되는 전사 및 RNA 복제의 이러한 강건한 특성은 코딩된 단백질의 기능성을 확인해주었다. 또한, 발현계 내의 부가적인 바이러스 단백질의 포함은 이러한 프로세스를 개시 또는 변형시킬 것으로 기대된다. 본 발명의 조성물 및 방법의 범위 내에서 PIV C, D 및 잠정적으로 V의 공동발현은 예컨대 RNA 복제의 개시 및/또는 변형에 유용할 것이다. 이러한 목적으로 전기 방법에 따라 플라스미드를 제조 및 분석하여 이러한 요소들을 한가지 이상 공동발현시킴으로써 적절한 감염 모델의 PIV 표현형에 대해서 뿐만 아니라 PIV 전사 및 RNA 복제에 미치는 이들의 효과를 측정하였다.
실시예 VI
cDNA로부터 감염성, 재조합 PIV의 제조
다음의 실시예들은 4가지 플라스미드-산생 cDNA로부터 세포내 공동발현에 의한 감염성, 재조합 PIV (rPIV)의 제조방법을 설명한 것이다. 이들 cDNA는 완전한 HPIV3 게놈과 HPIV3 뉴클레오캡시드 단백질 N, 인단백질 P, 및 폴리머라제 단백질 L을 각각 코딩한다.
A) 바이러스 및 세포
박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체인 변형 백시니아 균주 Ankara (MVA)를 Wyatt 등, Virol. 210:202-205, 1995 (본 발명에 참조됨)에 따라 제공하엿다. HEp-2 모노레이어 배양체를 2% FBS, 50μg/ml 겐타마이신 설페이트 및 2mM 글루타민이 보강된 OptiMEM 1 (Life Technologies)와 함께 5% CO2중에서 37℃ 유지시켯다. HPIV3의 JS wt 균주와 그의 약독화 ts 유도체인 JS cp45를 Hall 등, Virus Res. 22:173-184 (1992) (본 발명에 참조됨)에 설명된 바와 같이 LLC-MK2 세포내에서 증식시켰다.
B) cDNAs
HPIV3의 완전한 게놈 서열을 코딩하고 있는 p218(131)로 표시되는 완전한 cDNA 클론 (도 1, 서열 1)을 상기한 바와 같이 제조하였다. 완전한 HPIV3 서열을 코딩하는 두 번째 cDNA 클론 p3/7(131)(서열 14) (부다페스트 조약에 의거하여 ATCC에 기탁하고 수탁번호 97990을 부여받음)를 제조하였다. p3/7(131)은 HPIV3 cDNA 삽입물에 상대적인 T7 프로모터 및 리보자임/T7 터미네이터의 위치가 상호교환되었다는 점에서 p218(131)과 차이가 난다. 따라서, p3/7(131)에서 합성된 첫 번째 뉴클레오타이드는 안티게놈의 5' 말단, 즉, 게놈 위치 1의 양성-센스 상보물이고, 리보자임 절단에 의해 정의되는 3' 안티게놈 말단은 게놈 위치 15462의 상보물이다. p3/7(131)2G (서열 15) (부다페스트 조약에 의해 ATCC에 기탁되고 수탁번호 97989를 부여받음)로 표시되는 세 번째 클론 역시, T7 프로모터와 안티게놈의 5' 말단 사이에 2개의 G잔기가 삽입된 것을 제외하고 p3/7(131)과 동일하게 제조되었다.
p37(131)2G 및 p3/7(131)의 제조를 위해, 2개의 플라스미드 p(A*A'CC'D*E) 및 p(E*FF'GHIJKL*)을 변형시키고 HPIV3의 완전한 양성-센스 안티게놈을 코딩하도록 연결시켰다. 먼저, PCR을 이용하여 p(A*A'CC'D*E)의 3'말단에 인접한 델타 리보자임과 T7 터미네이터를 T7 프로모터로 치환하였다 (도 8). 양성-센스 프라이머 5'-GGCCCGTCGACGCCGTAATACGACTCACTATAGGACCAAACAAGAG-3' (서열 18)은 전사 효율을 향상시키기 위해 이들 2개 요소 사이에 2G 잔기가 삽입된 HPIV3의 3'리더 (밑줄친 HPIV3 서열)에 인접한 T7 프로모터를 위치시켰다. 클로닝 목적을 위해 t7 프로모터의 업스트림에 독특한 Mlu I 사이트 (이탤릭체)를 위치시켰다. 음성-센스 프라이머 5'-1224CGGCATCACGTGCTAC1209-3' (서열 19)는 HPIV3 N 유전자의 nt 1209-1224에 스패닝하였고 천연 HPIV3 서열에 존재하는 독특한 Pml I 사이트 (이탤릭체)를 포함하였다. PCR 산물과 모 템플레이트 p218(A*A'CC'D*E)의 두가지를 모두 Mlu I 및 Pml I로 절단하고 PCR 산물을 Mlu I-Pml I 윈도우 내로 클로닝시켰다. HPIV3의 3' 말단과 T7 프로모터 사이에 2G 잔기가 삽입되지 않은 양성-센스 프라이머와 동일한 음성-센스 프라이머를 이용하여 두 번째 PCR 반응을 수행하였다. 이들 플라스미드는 p(Left + 2G) 및 p(Left +)로 명명하였다. p(Left + 2G)의 제조는 도 8에 도시하였으며, p(Left +)도 동일 계획에 따라 제조하였다.
플라스미드 p(E*FF'GHIJKL*)을 PCR에 의해 변형시켜 HPIV3의 5' 말단에 인접한 T7 터미네이터와 델타 리보자임을 위치시켰다 (도 9). 양성-센스 프라이머: 5'-GGATTTGCGCGC14813AATTTAAATCATCTGG14828-3' (서열 16)에는 HPIV3의 L 유전자 (HPIV3 특이 서열은 밑줄침) 중 독특한 Swa I 사이트 (이탤릭체, 밑줄침) 바로 업스트림에 BssH II 사이트 (이탤릭체)가 도입되었다. 음성-센스 프라이머: 5'-CCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCAGCCC1546 2AAACAAGAGAAGAACTCTGTTTGG15435-3' (서열 17)에는 HPIV3 게놈(음성-센스 밑줄침)의 5' 말단에 인접한, 자연발생적인 독특한 Rsr II 사이트 (이탤릭체)를 포함하는 델타 리보자임 (굵은 글씨)의 일부가 위치한다. 플라스미드 p3/7은 델타 리보자임과 T7 터미네이터가 역방향인 것을 제외하고 p218과 동일하다. 상기 삽입물을 함유하는p3/7 플라스미드를 pPIV3-3/7이라 칭하였으며 이것은 HPIV3의 5' 말단 651 뉴클레오타이드에 인접한 T7 터미네이터와 완전한 델타 리보자임을 함유하였다. 이어서 플라스미드 pPIV3-3/7의 SwaI 및 NgoMI 단편을 분리하고 p(E*FF'GHIJKL*)의 SwaI-NgoM I 윈도우내로 클로닝시켯다. 얻어진 플라스미드 p(Right+)는HPIV3의 5' 말단에 인접한 T7 터미네이터와 완전한 델타 리보자임을 포함하였다 (도 9). p(Right+)의 Xho-NgoM I 단편을 p(Left +) 및 p(Left + 2G)의 Xho I - NgoM I 윈도우 내로 클로닝시켜 각각 플라스미드 p3/7(131) (서열 14)와 p3/7(131 2G) (서열 15)를 얻었다. 이들은 각각 HPIV3 안티게놈 RNA의 완전한 양성-센스 동족체를 코딩하며 후자는 전사 효율 향상을 위해 T7 프로모터에 인접한 2개의 G 잔기를 함유하는 cDNA를 코딩한다.
C) 형질도입
6웰 플레이트 중에 HEp-2 세포를 90% 점성도가 되도록 배양하였다. 6-웰 플레이트의 각각의 웰 (1.5 X 106세포)을 앞서 설명한 3가지 서포트 플라스미드, 즉, 0.4μg pTM(P), 0.4μg pTM(N), 0.05μg pTM(L)과 완전한 길이의 게놈 또는 안티게놈 HPIV3 cDNA 5μg으로 형질도입시켰다. 플라스미드를 LipofectACE (Life Technologies)를 함유하는 0.2 ml OptiMEM1 (Life Technologies)에 첨가하였다. 실온에서 약 15분간 인큐베이션시킨 후, 2% 소의 태아 혈청과 1.5 x 107pfu의 MVA-T7을 함유하는 OptiMEM 1 0.8ml를 각각의 웰에 첨가하였다. 배양체들을 32℃에서 12시간 인큐베이션시킨 다음 2% 소의 태아 혈청 함유하는 신선한 OptiMEM 1로 배지를 갈아주었다. 배양체를 32℃에서 다시 3일간 인큐베이션시킨다음 수확하여 신선한 HEp-2 모노레이어상에서 계대시켰다 (1차 계대물이라 칭함). 이 1차 계대 배양체를 32℃에서 5일간 인큐베이션시키고 배양체 중에 존재하는 바이러스를 수확한 다음 LLC-MK2 배지에서 한번 계대시키고 van Wyke Coelin호 등, Virol. 143:569-582 (1985) (본 발명에 참조됨)의 설명에 따라 헤마글루틴화-억제 (HAI)에 의해 특징화하여 이것이 cDNA로부터 회수된 바이러스를 표시하는 모노클로날 항체 내성 변이 (MARM)을 지니는지 결정하였다.
D) 재조합 바이러스의 서열결정
재조합 PIV중 HN 및 L 유전자의 뉴클레오타이드 서열 마커의 존재여부를 회수된 비리온으로부터 분리된 RAN의 RT-PCR에 의해 결정하였다. rPIV (1x 105pfu/ml, 2차 계대) 1ml를 얼음과 함께 1시간 인큐베이션시킴으로써 25% 폴리에틸렌 글리콜 200μl와 함께 침전시키고 12,000 g에서 15분간 원심분리시켰다. RNA를 TRIzol 시약 (Life Technologies)을 이용하여 제조업체의 지침에 따라 정제하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 Superscript 키트 (Life Technologies)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR 산물이 바이러스 RNA로부터만 유래하고 오염가능성이 있는 cDNA 플라스미드로부터 유래되지 않도록 하기 위해 대조군 반응은 반응에 역전사가 생략된 것을 제외하고 동일하게 하였다. 4개의 프라이머쌍을 이용하여 nt 7334-8715, 9364-10854, 10939-15392, 및 13623-15392로부터 PCR 산물을 얻었다. 얻어진 PCR 산물을 사이클 디데옥시뉴클레오타이드 서열 분석기 (New England Biolabs, Beverly, MA)을 이용하여 서열분석하였다.
실시예 VII
음성-센스 게놈 RNA를 코딩하는 cDNA로부터 재조합 바이러스의 회수
플라스미드 p218(131)과 3가지 서포트 플라스미드 pTM(N), pTM(P), 및 pTM(L)을 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 MVA를 이용하여 HEp-2 세포내로 형질도입하였다. pTM(N), pTM(P), pTM(L) 및 MVA로 구성된 대조군을 p218(131)없이 HEp-2 세포내로 공동형질도입하였다. 제 4일에, 형질도입체를 수확하고, 신선한 HEp-2 세포 모노레이어상에서 5일간 계대시킨 다음, LLC-MK2 배양체 상에서 다시 5일간 계대시켰다 (2차 계대). 2차 계대 수확물중에 존재하는 바이러스를 HAI에 의해 더욱 자세히 특징화하였다. 완전한 길이의 클론 p218(131) 없이 3가지 서포트 플라스미드만을 받은 형질도임 그룹으로부터의 배양체는 HPIV3을 생산하지 않았다. rPIV 회수 바이러스는 HPIV3에 특이적인 mAbs 77/5, 101/1, 및 454/11과 HAI 분석에서 반응하였기 때문에 HPIV3인 것으로 확인되었다 (표 1). 이것은 mABs 170/7 및 423/6과는 반응하지 못하였기 때문에 cDNA-유도된 것으로 추정되었는데, 이는 cDNA에 도입된 바 있는 MARM 돌연변이와도 일치하는 것이다.
rJS-NS는p218(131) 완전-길이 음성 센스 cDNA 내로 도입된 MARM 돌연변이를 함유함 | |||||
헤마글루티닌-억제 | 항체 적정 | 표시된 mAb의 (역수) | |||
바이러스 | 77/51 | 101/11 | 454/111 | 170/12 | 423/62 |
JS wt3 | 800 | 6400 | 6400 | 25,600 | 25,600 |
rJS-NS4 | 3200 | 25,600 | 6400 | ≤25 | ≤25 |
1mAb 77/5는 항체 에피토프 IIB를, mAbs 101/1과 454/11은 HN 당단백질의 항체 에피토프 IIIA를 인식하며, 이들은 모두 p218(131)에서 변형되지 않았다.
2JSwt의 항체 에피토프 I를 인식하는 mAbs 170/7과 423/6는 두가지 모두 이 부위에서의 MARM 돌연변이 때문에 rJS를 인식하지 못한다.
3생물학적으로 유도된 야생형 HPIV3 JS.
4음성-센스 게놈 cDNA로부터 유도된 재조합 JS 바이러스.
Claims (128)
- 작동가능하게 연결된 전사 프로모터, PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 전사종료인자로 이루어지는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자로서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 키메릭 PIV게놈 또는 안티게놈을 형성하는 HPIV1 서열, HPIV2 서열, HPIV3 서열, BPIV 서열, 및 MPIV서열로 이루어지는 군에서 선택되는 이종 PIV서열을 도입함으로써 변형된, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 1 항에 있어서, 사람의 PIV3의 유전자 또는 유전자 단편이 이종 PIV의 대응 유전자 또는 유전자 단편인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 2 항에 있어서, 상기 대응 유전자 또는 유전자 단편이 HPIV1 또는 HPIV2의 HN 또는 F 당단백질 유전자 또는 유전자 단편인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 2 항에 있어서, HPIV1 또는 HPIV2의 HN 또는 F 당단백질 유전자가 HPIV3의 대응 HN 또는 F 당단백질 유전자로 치환되는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 1 항에 있어서, 상기 게놈 또는 안티게놈을코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 BPIV 유전자 또는 유전자 단편을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 1 항에 있어서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자는 RSV의 이종 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 6 항에 있어서, 상기 RSV의 이종 서열이 G 또는 F 유전자 또는 유전자단편인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 1 항에 있어서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자가 홍역바이러스(measles)의 이종 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 8 항에 있어서, 상기 홍역 바이러스의 이종 서열이 HA 또는 F 유전자 또는 유전자 단편인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 작동가능하게 연결된 전사 프로모터, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 전사 종결인자로 이루어지는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자로서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이a) p218(131) (SEQ ID NO: 1);b) p3/7(131) (SEQ ID NO: 14);c) p3/7(131) (SEQ ID NO: 15); 및d) HPIV1 서열, HPIV2 서열, HPIV3 서열, BPIV 서열, 및 MPIV서열로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV서열을 도입함으로써, 또는 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성, 작은 플락크기, 숙주범위제한, 및 PIV의 면역에티토페의 변화로 이루어지는 군에서 선택된 표현형 변형을 특정하는 뉴클레오타이드의 삽입, 재배열, 결실, 또는 치환을 함으로써 변형된, a), b) 또는 c)의 분리된 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 작동가능하게 연결된 전사 프로모터, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 전사 종결인자로 이루어지는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자로서, PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드의 삽입, 재배열, 결실 또는 치환으로 변형된 것인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드의 삽입, 재배열, 결실 또는 치환이 약독화, 온도-민감성, 저온-적응성, 작은 플락크기, 숙주범위제한, 및 PIV의 면역원성 에피토페의 변화로 이루어지는 군에서 선택된 표현형적 변화를 특정하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 12 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 다중 ts변이를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 12 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 다중 비-ts 약독화 변이를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 하나이상의 JS cp45의 변이를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 15 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 폴리머라제 L단백질에서 하나이상의 아미노산 치환을 코딩하는 것인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 16 항에 있어서, 폴리머라제 L단백질에서의 아미노산 치환이 JS cp45의 Tyr942, Leu992, 또는 Thr1558위치에 대응하는 위치에서 일어나는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 N 단백질에서 하나이상의 아미노산 치환을 코딩하는 것인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 18 항에 있어서, N 단백질에서의 아미노산 치환이 JS cp45의 Val96, 또는 Ser389잔기에 대응하는 위치에서 일어나는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 C 단백질에서 하나이상의 아미노산 치환을 코딩하는 것인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 20 항에 있어서, 상기 C 단백질에서의 아미노산 치환이 JS cp45의 Ile96잔기에 대응하는 위치에서 일어나는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 F 단백질에서 하나이상의 아미노산 치환을 코딩하는 것인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 22 항에 있어서, 상기 F 단백질에서의 아미노산 치환이 JS cp45의 Ile420또는 Ala450잔기에 대응하는 위치에서 일어나는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 HN 단백질에서 하나이상의 아미노산 치환을 코딩하는 것인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 24 항에 있어서, 상기 HN 단백질에서의 아미노산 치환이 JS cp45의 Val384잔기에 대응하는 위치에서 일어나는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 3'리더에서 하나이상의 변이를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 26 항에 있어서, 3'리더에서의 변이가 JS cp45의 뉴클레오타이드 23, 24, 28, 또는 45에 대응하는 위치에서 일어나는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 N 유전자 개시서열에서 하나이상의 변이를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 28 항에 있어서, N 유전자 개시서열에서의 변이가 JS cp45의 뉴클레오타이드 62에 대응하는 위치에서 일어나는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 12 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N 또는 rcp45 F에존재하는 복수의 변이 및 완전한 전량의 변이까지 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 12 항에 있어서, 안티게놈 cDNA가 rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N, rcp45 F, rcp45 M, rcp45 HN, 및 rcp45 C로 이루어지는 군에서 선택되는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이, 변이를 특정하는 코돈에서 다중 뉴클레오타이드 치환에 의해 안정화되는 변이를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이, 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 형성하는 HPIV1 서열, HPIV2 서열, HPIV3 서열, BPIV 서열, 및 MPIV서열로 이루어지는 군에서 선택되는 이종서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 33 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 하나이상의 ts 변이를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 33 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 하나이상의 비ts 약독화변이를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 33 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 하나이상의 JS cp45의 변이를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 36 항에 있어서, 하나이상의 JS cp45의 변이가 L, M, N, C, F 또는 HN중에서 선택된 하나이상의 PIV단백질, 또는 3'리더 또는 N-유전자 개시서열중에서 선택되는 PIV 유전자외 서열에서 일어나는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 33 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 플락 크기, 및 숙주범위제한으로 이루어지는 군에서 선택된 표현형을 특정하는 수개의 변이를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 33 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N 또는 rcp45 F에존재하는 복수의 변이 및 완전한 전량의 변이까지 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 33 항에 있어서, 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 플락 크기, 숙주범위제한 및 PIV의 면역원성 에피토페의 변화로 이루어지는 군에서 선택된 표현형을 특정하는 변이는, 하나이상의 대응 PIV1 또는 PIV2의 HN 또는 F당단백질 유전자에 의해 치환된 하나이상의 HPIV3 HN 또는 F 당단백질 유전자를 가지는 게놈 또는 안티게놈으로 이루어지는 키메릭 PIV 백그라운든(background)환경에 병합된, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 33 항에 있어서, 상기 이종서열이 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 플락 크기, 숙주범위제한 및 PIV의 면역원성 에피토페의 변화로 이루어지는 군에서 선택된 표현형변화를 특정하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자가 HPIV1, HPIV2, HPIV3, BPIV, 또는 MPIV의 시스작용 조절서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자가 RSV의 이종서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 43 항에 있어서, 상기 RSV의 이종서열이 G 또는 F 유전자 또는 유전자단편인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자가 홍역 바이러스의 이종서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 45 항에 있어서, 상기 홍역 바이러스의 이종서열은 HA 또는 F 유전자 또는 유전자 단편인, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자가 사이토키닌, T-헬퍼 에피토페, 제한효소마커, 또는 포유동물숙주에서 보호면역반응을 유발할 수 있는 미생물적 병원의 단백질중에서 선택되는 비PIV 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
- PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자, 및 PIV의 N, P, L단백질을 코딩하는 하나이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 발현벡터를 포함하는 세포 또는 무세포 조성물로서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈 및 N, P, L단백질의 발현으로 감염성 PIV입자를 제조하는, 세포 또는 무세포 조성물.
- 제 48 항에 있어서, 상기 감염성 PIV입자가 바이러스인 세포 또는 무세포 조성물.
- 제 48 항에 있어서, 상기 감염성 PIV입자가 서브바이러스인 세포 또는 무세포 조성물.
- 제 48 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드및 PIV의 N, P, L단백질을 코딩하는 하나이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드가 하나의 벡터에 병합된, 세포 또는 무세포 조성물.
- PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현벡터, 및 PIV의 N, P, L단백질을 코딩하는 하나이상의 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 발현벡터를 세포 또는 무세포 시스템에서 함께 발현하여, 감염성 PIV입자를 제조하는 것으로 이루어지는, PIV를 코딩하는 하나이상의 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자로로부터 감염성 PIV임자를 제조하는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV게놈과 N, P, L 단백질이 동일한 발현벡터에 의해서 발현되는, 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 N, P, L단백질이 2이상의 다른 발현벡터에 코딩되는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 하나이상의 N, P, L단백질이 PIV의 공동감염으로 제공되는 방법.
- 제 52 항에 있어서, PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 cDNA인 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 감염성 PIV입자가 바이러스인 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 감염성 PIV입자가 서브바이러스 입자인 방법.
- 제 52 항에 있어서, PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 사람, 소 또는 쥐의 PIV서열인 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 야생형 PIV균주의 서열을 코딩하는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 HPIV3를 코딩하는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 생물학적 유래 PIV균주의 약독화 변이를 포함하는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 하나이상의 ts 변이를 포함하는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 하나이상의 비-ts 약독화 변이를 포함하는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 하나이상의 JS cp45의 변이를 포함하는 방법.
- 제 65 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 다수의 JS cp45의 변이를 포함하는 방법.
- 제 65 항에 있어서, 상기 JS cp45의 변이가 폴리머라제 L단백질에서 하나이상의 아미노산 치환을 특정하는, 방법.
- 제 67 항에 있어서, 상기 폴리머라제 L단백질에서 아미노산치환이 JS cp45의 Tyr942, Leu992, 또는 Thr1558위치에 대응하는 위치에서 일어나는, 방법.
- 제 65 항에 있어서, 상기 JS cp45의 변이가 L, M, N, C, F, HN중에서 선택된 PIV단백질에서 변화, 또는 3'리더 또는 N유전자 개시서열중에서 선택되는 PIV유전자외 서열에서 변화를 특정하는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이, 변이를 특정하는 코돈에서 다중 뉴클레오타이드 치환에 의해 안정화되는 변이를 포함하는 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N 또는 rcp45 F에존재하는 복수의 변이 및 완전한 전량의 변이까지 포함하는 방법.
- 제 69 항에 있어서, 안티게놈 cDNA가 rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N, rcp45 F, rcp45 M, rcp45 HN, 및 rcp45 C로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이, 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 형성하는 HPIV1 서열, HPIV2 서열, HPIV3 서열, BPIV 서열, 및 MPIV서열로 이루어지는 군에서 선택되는 이종서열을 포함하는, 방법.
- 제 73 항에 있어서, 상기 PIV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이, HPIV1 서열, HPIV2 서열, HPIV3 서열, BPIV 서열, 또는 MPIV서열의키메라인 방법.
- 제 74 항에 있어서, HN 또는 F당단백질의 유전자 또는 유전자 단편을 코딩하는 HPIV1 또는 HPIV2중에서 선택된 이종 서열이 HPIV3의 대응 유전자 또는 유전자 단편으로 치환된 방법.
- 제 73 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈은 하나이상의 ts 변이를 포함하는 방법.
- 제 73 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 하나이상의 비-ts 약독화 변이를 포함하는 방법.
- 제 73 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 하나이상의 JS cp45의 변이를 포함하는 방법.
- 제 73 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 플락 크기, 및 숙주범위제한으로 이루어지는 군에서 선택된 표현형변화를 특정하는 다수의 변이를 포함하는 방법.
- 제 73 항에 있어서, 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 플락 크기, 숙주범위제한 및 PIV의 면역원성 에피토페의 변화로 이루어지는 군에서 선택된 표현형을 특정하는 변이가, 하나이상의 대응 PIV1 또는 PIV2의 HN 또는 F당단백질 유전자에 의해 치환된 하나이상의 HPIV3 HN 또는 F 당단백질 유전자를 가지는 게놈 또는 안티게놈으로 이루어지는 키메릭 PIV 백그라운드에 병합된 방법.
- 제 80 항에 있어서, 상기 하나이상의 JS cp45 변이가 대응 PIV1 또는 PIV2의 HN 또는 F당단백질 유전자에 의해 치환된 HPIV3 HN 및 F 당단백질 유전자를 모두 가지는 게놈 또는 안티게놈으로 이루어지는 키메릭 PIV 백그라운드에 병합된 방법.
- 제 81 항에 있어서, 상기 하나이상의 JS cp45 변이가 L, M, N, C, F, HN중에서 선택된 PIV단백질에서, 또는 3'리더 또는 N유전자 개시서열중에서 선택되는 PIV유전자외 서열에서 일어나는 방법.
- 제 73 항에 있어서, 상기 이종 서열은 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 플락 크기, 숙주범위제한 및 PIV의 면역원성 에피토페의 변화로 이루어지는 군에서 선택된 표현형변화를 특정하는, 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 RSV의 이종서열을 포함하는 방법.
- 제 84 항에 있어서, 상기 RSV의 이종서열이 G 또는 F 유전자 또는 유전자단편인 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 홍역 바이러스의 이종서열을 포함하는 방법.
- 제 86 항에 있어서, 상기 홍역 바이러스의 이종서열은 HA 또는 F 유전자 또는 유전자 단편인 방법.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법:a) p218(131) (SEQ ID NO: 1);b) p3/7(131) (SEQ ID NO: 14);c) p3/7(131) (SEQ ID NO: 15); 및d) HPIV1 서열, HPIV2 서열, HPIV3 서열, BPIV 서열, 및 MPIV서열로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV서열을 도입함으로써, 또는 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성, 작은 플락크기, 숙주범위제한, 및 PIV의 면역에티토페의 변화로 이루어지는 군에서 선택된 표현형 변형을 특정하는 뉴클레오타이드의 삽입, 재배열, 결실, 또는 치환을 함으로써 변형된, a), b) 또는 c)의 분리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제 52 항에 있어서, 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법:a) p218(131) (SEQ ID NO: 1);b) p3/7(131) (SEQ ID NO: 14);c) p3/7(131) (SEQ ID NO: 15); 및d) HPIV1 서열, HPIV2 서열, HPIV3 서열, BPIV 서열, 및 MPIV서열중에서 선택된 이종 PIV서열을 도입함으로써, 또는 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성, 작은 플락크기, 숙주범위제한, 및 PIV의 면역에티토페의 변화중에서 선택된 표현형 변형을 특정하는 상기 도입된 이종 PIV서열과 다른 뉴클레오타이드의 삽입, 재배열, 결실, 또는 치환을 함으로써 변형된, a), b) 또는 c)의 분리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제 52 항에 있어서, 상기 상기 PIV게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자가 사이토키닌, T-헬퍼 에피토페, 제한효소마커, 또는 포유동물숙주에서 보호면역반응을 유발할 수 있는 미생물적 병원의 단백질중에서 선택되는 비PIV 분자를 코딩하도록 변형된 방법.
- 재조합 PIV 게놈 또는 안티게놈, N단백질, P단백질, 및 L단백질로 이루어지는 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 분리된 감염성 PIV 입자가 서브바이러스 입자인, 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 분리된 감염성 PIV 입자가 바이러스인 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 RSV 또는 홍역바이러스의 이종서열을 포함하는 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 cDNA인 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 분리된 감염성 PIV 입자가 사람 PIV인 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 HPIV1 서열, HPIV2 서열, HPIV3 서열, BPIV 서열, 또는 MPIV서열의 키메라인 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 분리된 감염성 PIV 입자:a) p218(131) (SEQ ID NO: 1);b) p3/7(131) (SEQ ID NO: 14);c) p3/7(131) (SEQ ID NO: 15); 및d) HPIV1 서열, HPIV2 서열, HPIV3 서열, BPIV 서열, 및 MPIV서열로 이루어지는 군에서 선택된 이종 PIV서열을 도입함으로써, 또는 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성, 작은 플락크기, 숙주범위제한, 및 PIV의 면역에티토페의 변화로 이루어지는 군에서 선택된 표현형 변형을 특정하는 뉴클레오타이드의 삽입, 재배열, 결실, 또는 치환을 함으로써 변형된, a), b) 또는 c)의 분리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제 91 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 분리된 감염성 PIV 입자:a) p218(131) (SEQ ID NO: 1);b) p3/7(131) (SEQ ID NO: 14);c) p3/7(131) (SEQ ID NO: 15); 및d) HPIV1 서열, HPIV2 서열, HPIV3 서열, BPIV 서열, 및 MPIV서열중에서 선택된 이종 PIV서열을 도입함으로써, 또는 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성, 작은 플락크기, 숙주범위제한, 및 PIV의 면역에티토페의 변화중에서 선택된 표현형 변형을 특정하는 상기 도입된 이종 PIV서열과 다른 뉴클레오타이드의 삽입, 재배열, 결실, 또는 치환을 함으로써 변형된, a), b) 또는 c)의 분리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제 91 항에 있어서, 상기 대응 유전자 또는 유전자 단편이 HPIV1 또는 HPIV2의 HN 또는 F당단백질의 유전자 또는 유전자단편인 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 RSV 또는 홍역바이러스의 이종서열을 포함하는 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도민감성, 저온적응성, 작은 플락크기, 숙주범위제한, 또는 PIV의 면역원성 에피토페의변화를 특정하는 표현형 변화를 코딩하는 뉴클레오타이드의 삽입, 재배열, 결실 또는 치환에 의해서 변형된, 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 다수의 ts변이를 포함하는 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 다수의 비ts 약독화 변이를 포함하는 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 하나이상의 JS cp45의 변이를 포함하는 분리된 감염성 PIV입자.
- 제 105 항에 있어서, 상기 JS cp45의 변이가 폴리머라제 L단백질에서 하나이상의 아미노산 치환을 특정하는 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 97 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 하나이상의 ts 변이를 포함하는 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 97 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 하나이상의 비ts 약독화 변이를 포함하는 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 97 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 하나이상의 JS cp45의 변이를 포함하는 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 109 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 플락 크기, 또는 숙주범위제한중에서 선택되는 각각의 표현형을 특정하는 다수의 변이를 포함하는 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 109 항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N 또는 rcp45 F에존재하는 복수의 변이 및 완전한 전량의 변이까지 포함하는 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 플락 크기, 숙주범위제한 및 PIV의 면역원성 에피토페의 변화로 이루어지는 군에서 선택된 표현형을 특정하는 변이가, 하나이상의 대응 PIV1 또는 PIV2의 HN 또는 F당단백질 유전자에 의해 치환된 하나이상의 HPIV3 HN 또는 F 당단백질 유전자를 가지는 게놈 또는 안티게놈으로 이루어지는 키메릭 PIV 백그라운드에 병합된, 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 112 항에 있어서, 상기 하나이상의 JS cp45 변이가 상기 키메릭 PIV 백그라운드에 병합된, 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 113 항에 있어서, 상기 하나이상의 JS cp45의 변이가 L, M, N, C, F 또는 HN중에서 선택된 하나이상의 PIV단백질, 또는 3'리더 또는 N-유전자 개시서열중에서 선택되는 PIV 유전자외 서열에서 일어나는, 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 사이토키닌, T-헬퍼 에피토페, 제한효소마커, 또는 포유동물숙주에서 보호면역반응을 유발할 수 있는 미생물적 병원의 단백질중에서 선택되는 비PIV 분자를 코딩하도록 변형된, 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 추가로, 면역화된 숙주에 있어서 RSV에 대한 보호면역을 유발하는 RSV항체 또는 에피토페로 이루어지는, 분리된 감염성 PIV 입자.
- 제 91 항에 있어서, 분리된 감염성 PIV 입자가 r942, r992, r1558, r942/992, r992/1558, r942/992/1558, rcp45 3'N, rcp45 C, rcp45 M, rcp45 F, rcp45 HN, rcp45 L, rcp45 3'NL, rcp45 3'NCMFHN, 및 rcp45로 이루어지는 군에서 선택된 분리된 감염성 PIV 입자.
- 약리적으로 허용되는 담체중에 감염성 PIV 입자를 면역원성으로 유효량 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 PIV입자는 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈, N단백질, P단백질, 및 L단백질로 이루어지는, 면역원성 조성물.
- 제 118 항에 있어서, 상기 감염성 PIV입자가 서브바이러스 입자인 면역원성 조성물.
- 제 118 항에 있어서, 상기 감염성 PIV입자가 바이러스인 면역원성 조성물.
- 제 118 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 RSV 또는 홍역 바이러스의 이종서열을 포함하는 면역원성 조성물.
- 제 118 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 감염성 키메릭 PIV 입자를 형성하는 HPIV1 서열, HPIV2 서열, HPIV3 서열, BPIV 서열, 및 MPIV서열로 이루어지는 군에서 선택되는 이종서열을 포함하는, 면역원성 조성물.
- 제 118 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈은 이종 PIV의 대응 유전자 또는 유전자단편으로 치환된 유전자 또는 유전자단편을 가진 사람의 PIV를 코딩하는 면역원성 조성물.
- 제 123 항에 있어서, HPIV1의 HN 또는 F당단백질 유전자중 하나 또는 두개 모두가 HPIV3 HN 또는 F 당단백질 유전자로 치환되어 상기 감염성, 키메릭 PIV입자를 형성하는 면역원성 조성물.
- 제 123 항에 있어서, 상기 감염성 키메릭 PIV입자의 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 약독화, 온도민감성, 저온 적응성, 작은 플락 크기, 숙주범위제한 및 PIV의 면역원성 에피토페의 변화로 이루어지는 군에서 선택된 표현형 변화를 특정하는 뉴클레오타이드 삽입, 재배열, 결실, 또는 치환에 의해서 변형된 것인, 면역원성 조성물.
- 제 125 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 ts 또는 비ts 약독화 변이중에서 선택된 다수의 변이를 포함하여 약독화된, 감염성, 키메릭 PIV입자를 형성하는, 면역원성 조성물.
- 제 118 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 하나의 JS cp45의 변이를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제 118 항에 있어서, 상기 재조합 PIV게놈 또는 안티게놈이 다수의 JS cp45의 변이를 포함하는 면역원성 조성물.서열 목록(1) 일반 정보:(i) 출원인:(A) 명칭: 미합중국(B) 거리명: 박스 오티티(C) 도시명: 베데스다(D) 주명: 매릴랜드(E) 국가명: 미합중국(F) 우편번호 (ZIP): 20892(G) 전화번호:(H) 팩스번호:(I) 텔렉스번호:(ii) 발명의 명칭: 클로닝된 뉴클레오티드 서열로부터약독화된 파라인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법(iii) 서열의 수: 74개(iv) 컴퓨터 판독 형태:(A) 매체 종류: 플로피 디스크(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.25(v) 본건 출원 데이타:(A) 출원 번호: WO(B) 출원일자: 1998년 5월 22일(C) 분류기호:(vi) 우선권 주장 데이타:(A) 출원 번호: US 60/059,385(B) 출원 일자: 1997년 9월 19일(vi) 우선권 주장 데이타:(A) 출원 번호: US 60/047,575(B) 출원 일자: 1997년 5월 23일(vii) 대리인/사무소 정보:(A) 성명: 킹, 제프리 제이.(B) 등록 번호: 38,515(C) 참조 번호/관리 번호: 17634-000320PC(viii) 원격 통신 정보:(A) 전화 번호: 206-467-9600(B) 팩스 번호: 415-576-0300(2) 서열 1의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 15669 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 1:GCTGGGTACC GGGCCCGTCG ACGCGTATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA 60GACCCGTTTA GAGGCCCCAA GGGGTTATGC TACTGCAGGC TCTCCCTTAG CCATCCGAGT 120GGACGTGCGT CCTCCTTCGG ATGCCCAGGT CGGACCGCGA GGAGGTGGAG ATGCCATGCC 180GACCCACCAA ACAAGAGAAG AAACTTGTCT GGGAATATAA ATTTAACTTT AAATTAACTT 240AGGATTAAAG ACATTGACTA GAAGGTCAAG AAAAGGGAAC TCTATAATTT CAAAAATGTT 300GAGCCTATTT GATACATTTA ATGCACGTAG GCAAGAAAAC ATAACAAAAT CAGCCGGTGG 360AGCTATCATT CCTGGACAGA AAAATACTGT CTCTATATTC GCCCTTGGAC CGACAATAAC 420TGATGATAAT GAGAAAATGA CATTAGCTCT TCTATTTCTA TCTCATTCAC TAGATAATGA 480GAAACAACAT GCACAAAGGG CAGGGTTCTT GGTGTCTTTA TTGTCAATGG CTTATGCCAA 540TCCAGAGCTC TACCTAACAA CAAATGGAAG TAATGCAGAT GTCAAGTATG TCATATACAT 600GATTGAGAAA GATCTAAAAC GGCAAAAGTA TGGAGGATTT GTGGTTAAGA CGAGAGAGAT 660GATATATGAA AAGACAACTG ATTGGATATT TGGAAGTGAC CTGGATTATG ATCAGGAAAC 720TATGTTGCAG AACGGCAGGA ACAATTCAAC AATTGAAGAC CTTGTCCACA CATTTGGGTA 780TCCATCATGT TTAGGAGCTC TTATAATACA GATCTGGATA GTTCTGGTCA AAGCTATCAC 840TAGTATCTCA GGGTTAAGAA AAGGCTTTTT CACCCGATTG GAAGCTTTCA GACAAGATGG 900AACAGTGCAG GCAGGGCTGG TATTGAGCGG TGACACAGTG GATCAGATTG GGTCAATCAT 960GCGGTCTCAA CAGAGCTTGG TAACTCTTAT GGTTGAAACA TTAATAACAA TGAATACCAG 1020CAGAAATGAC CTCACAACCA TAGAAAAGAA TATACAAATT GTTGGCAACT ACATAAGAGA 1080TGCAGGTCTC GCTTCATTCT TCAATACAAT CAGATATGGA ATTGAGACCA GAATGGCAGC 1140TTTGACTCTA TCCACTCTCA GACCAGATAT CAATAGATTA AAAGCTTTGA TGGAACTGTA 1200TTTATCAAAG GGACCACGCG CTCCTTTCAT CTGTATCCTC AGAGATCCTA TACATGGTGA 1260GTTCGCACCA GGCAACTATC CTGCCATATG GAGCTATGCA ATGGGGGTGG CAGTTGTACA 1320AAATAGAGCC ATGCAACAGT ATGTGACGGG AAGATCATAT CTAGACATTG ATATGTTCCA 1380GCTAGGACAA GCAGTAGCAC GTGATGCCGA AGCTCAAATG AGCTCAACAC TGGAAGATGA 1440ACTTGGAGTG ACACACGAAT CTAAAGAAAG CTTGAAGAGA CATATAAGGA ACATAAACAG 1500TTCAGAGACA TCTTTCCACA AACCGACAGG TGGATCAGCC ATAGAGATGG CAATAGATGA 1560AGAGCCAGAA CAATTCGAAC ATAGAGCAGA TCAAGAACAA AATGGAGAAC CTCAATCATC 1620CATAATTCAA TATGCCTGGG CAGAAGGAAA TAGAAGCGAT GATCAGACTG AGCAAGCTAC 1680AGAATCTGAC AATATCAAGA CCGAACAACA AAACATCAGA GACAGACTAA ACAAGAGACT 1740CAACGACAAG AAGAAACAAA GCAGTCAACC ACCCACTAAT CCCACAAACA GAACAAACCA 1800GGACGAAATA GATGATCTGT TTAACGCATT TGGAAGCAAC TAATCGAATC AACATTTTAA 1860TCTAAATCAA TAATAAATAA GAAAAACTTA GGATTAAAGA ATCCTATCAT ACCGGAATAT 1920AGGGTGGTAA ATTTAGAGTC TGCTTGAAAC TCAATCAATA GAGAGTTGAT GGAAAGCGAT 1980GCTAAAAACT ATCAAATCAT GGATTCTTGG GAAGAGGAAT CAAGAGATAA ATCAACTAAT 2040ATCTCCTCGG CCCTCAACAT CATTGAATTC ATACTCAGCA CCGACCCCCA AGAAGACTTA 2100TCGGAAAACG ACACAATCAA CACAAGAACC CAGCAACTCA GTGCCACCAT CTGTCAACCA 2160GAAATCAAAC CAACAGAAAC AAGTGAGAAA GATAGTGGAT CAACTGACAA AAATAGACAG 2220TCTGGGTCAT CACACGAATG TACAACAGAA GCAAAAGATA GAAATATTGA TCAGGAAACT 2280GTACAGAGAG GACCTGGGAG AAGAAGCAGC TCAGATAGTA GAGCTGAGAC TGTGGTCTCT 2340GGAGGAATCC CCAGAAGCAT CACAGATTCT AAAAATGGAA CCCAAAACAC GGAGGATATT 2400GATCTCAATG AAATTAGAAA GATGGATAAG GACTCTATTG AGGGGAAAAT GCGACAATCT 2460GCAAATGTTC CAAGCGAGAT ATCAGGAAGT GATGACATAT TTACAACAGA ACAAAGTAGA 2520AACAGTGATC ATGGAAGAAG CCTGGAATCT ATCAGTACAC CTGATACAAG ATCAATAAGT 2580GTTGTTACTG CTGCAACACC AGATGATGAA GAAGAAATAC TAATGAAAAA TAGTAGGACA 2640AAGAAAAGTT CTTCAACACA TCAAGAAGAT GACAAAAGAA TTAAAAAAGG GGGAAAAGGG 2700AAAGACTGGT TTAAGAAATC AAAAGATACC GACAACCAGA TACCAACATC AGACTACAGA 2760TCCACATCAA AAGGGCAGAA GAAAATCTCA AAGACAACAA CCACCAACAC CGACACAAAG 2820GGGCAAACAG AAATACAGAC AGAATCATCA GAAACACAAT CCTCATCATG GAATCTCATC 2880ATCGACAACA ACACCGACCG GAACGAACAG ACAAGCACAA CTCCTCCAAC AACAACTTCC 2940AGATCAACTT ATACAAAAGA ATCGATCCGA ACAAACTCTG AATCCAAACC CAAGACACAA 3000AAGACAAATG GAAAGGAAAG GAAGGATACA GAAGAGAGCA ATCGATTTAC AGAGAGGGCA 3060ATTACTCTAT TGCAGAATCT TGGTGTAATT CAATCCACAT CAAAACTAGA TTTATATCAA 3120GACAAACGAG TTGTATGTGT AGCAAATGTA CTAAACAATG TAGATACTGC ATCAAAGATA 3180GATTTCCTGG CAGGATTAGT CATAGGGGTT TCAATGGACA ACGACACAAA ATTAACACAG 3240ATACAAAATG AAATGCTAAA CCTCAAAGCA GATCTAAAGA AAATGGACGA ATCACATAGA 3300AGATTGATAG AAAATCAAAG AGAACAACTG TCATTGATCA CGTCACTAAT TTCAAATCTC 3360AAAATTATGA CTGAGAGAGG AGGAAAGAAA GACCAAAATG AATCCAATGA GAGAGTATCC 3420ATGATCAAAA CAAAATTGAA AGAAGAAAAG ATCAAGAAGA CCAGGTTTGA CCCACTTATG 3480GAGGCACAAG GCATTGACAA GAATATACCC GATCTATATC GACATGCAGG AGATACACTA 3540GAGAACGATG TACAAGTTAA ATCAGAGATA TTAAGTTCAT ACAATGAGTC AAATGCAACA 3600AGACTAATAC CCAAAAAAGT GAGCAGTACA ATGAGATCAC TAGTTGCAGT CATCAACAAC 3660AGCAATCTCT CACAAAGCAC AAAACAATCA TACATAAACG AACTCAAACG TTGCAAAAAT 3720GATGAAGAAG TATCTGAATT AATGGACATG TTCAATGAAG ATGTCAACAA TTGCCAATGA 3780TCCAACAAAG AAACGACACC GAACAAACAG ACAAGAAACA ACAGTAGATC AAAACCTGTC 3840AACACACACA AAATCAAGCA GAATGAAACA ACAGATATCA ATCAATATAC AAATAAGAAA 3900AACTTAGGAT TAAAGAATAA ATTAATCCTT GTCCAAAATG AGTATAACTA ACTCTGCAAT 3960ATACACATTC CCAGAATCAT CATTCTCTGA AAATGGTCAT ATAGAACCAT TACCACTCAA 4020AGTCAATGAA CAGAGGAAAG CAGTACCCCA CATTAGAGTT GCCAAGATCG GAAATCCACC 4080AAAACACGGA TCCCGGTATT TAGATGTCTT CTTACTCGGC TTCTTCGAGA TGGAACGAAT 4140CAAAGACAAA TACGGGAGTG TGAATGATCT CGACAGTGAC CCGAGTTACA AAGTTTGTGG 4200CTCTGGATCA TTACCAATCG GATTGGCTAA GTACACTGGG AATGACCAGG AATTGTTACA 4260AGCCGCAACC AAACTGGATA TAGAAGTGAG AAGAACAGTC AAAGCGAAAG AGATGGTTGT 4320TTACACGGTA CAAAATATAA AACCAGAACT GTACCCATGG TCCAATAGAC TAAGAAAAGG 4380AATGCTGTTC GATGCCAACA AAGTTGCTCT TGCTCCTCAA TGTCTTCCAC TAGATAGGAG 4440CATAAAATTT AGAGTAATCT TCGTGAATTG TACGGCAATT GGATCAATAA CCTTGTTCAA 4500AATTCCTAAG TCAATGGCAT CACTATCTCT ACCCAACACA ATATCAATCA ATCTGCAGGT 4560ACACATAAAA ACAGGGGTTC AGACTGATTC TAAAGGGATA GTTCAAATTT TGGATGAGAA 4620AGGCGAAAAA TCACTGAATT TCATGGTCCA TCTCGGATTG ATCAAAAGAA AAGTAGGCAG 4680AATGTACTCT GTTGAATACT GTAAACAGAA AATCGAGAAA ATGAGATTGA TATTTTCTTT 4740AGGACTAGTT GGAGGAATCA GTCTTCATGT CAATGCAACT GGGTCCATAT CAAAAACACT 4800AGCAAGTCAG CTGGTATTCA AAAGAGAGAT TTGTTATCCT TTAATGGATC TAAATCCGCA 4860TCTCAATCTA GTTATCTGGG CTTCATCAGT AGAGATTACA AGAGTGGATG CAATTTTCCA 4920ACCTTCTTTA CCTGGCGAGT TCAGATACTA TCCTAATATT ATTGCAAAAG GAGTTGGGAA 4980AATCAAACAA TGGAACTAGT AATCTCTATT TTAGTCCGGA CGTATCTATT AAGCCGAAGC 5040AAATAAAGGA TAATCAAAAA CTTAGGACAA AAGAGGTCAA TACCAACAAC TATTAGCAGT 5100CACACTCGCA AGAATAAGAG AGAAGGGACC AAAAAAGTCA AATAGGAGAA ATCAAAACAA 5160AAGGTACAGA ACACCAGAAC AACAAAATCA AAACATCCAA CTCACTCAAA ACAAAAATTC 5220CAAAAGAGAC CGGCAACACA ACAAGCACTG AACACAATGC CAACTTCAAT ACTGCTAATT 5280ATTACAACCA TGATCATGGC ATCTTTCTGC CAAATAGATA TCACAAAACT ACAGCACGTA 5340GGTGTATTGG TCAACAGTCC CAAAGGGATG AAGATATCAC AAAACTTTGA AACAAGATAT 5400CTAATTTTGA GCCTCATACC AAAAATAGAA GACTCTAACT CTTGTGGTGA CCAACAGATC 5460AAGCAATACA AGAAGTTATT GGATAGACTG ATCATCCCTT TATATGATGG ATTAAGATTA 5520CAGAAAGATG TGATAGTAAC CAATCAAGAA TCCAATGAAA ACACTGATCC CAGAACAAAA 5580CGATTCTTTG GAGGGGTAAT TGGAACCATT GCTCTGGGAG TAGCAACCTC AGCACAAATT 5640ACAGCGGCAG TTGCTCTGGT TGAAGCCAAG CAGGCAAGAT CAGACATCGA AAAACTCAAA 5700GAAGCAATTA GGGACACAAA CAAAGCAGTG CAGTCAGTTC AGAGCTCCAT AGGAAATTTA 5760ATAGTAGCAA TTAAATCAGT CCAGGATTAT GTTAACAAAG AAATCGTGCC ATCGATTGCG 5820AGGCTAGGTT GTGAAGCAGC AGGACTTCAA TTAGGAATTG CATTAACACA GCATTACTCA 5880GAATTAACAA ACATATTTGG TGATAACATA GGATCGTTAC AAGAAAAAGG AATAAAATTA 5940CAAGGTATAG CATCATTATA CCGCACAAAT ATCACAGAAA TATTCACAAC ATCAACAGTT 6000GATAAATATG ATATCTATGA TCTGTTATTT ACAGAATCAA TAAAGGTGAG AGTTATAGAT 6060GTTGACTTGA ATGATTACTC AATCACCCTC CAAGTCAGAC TCCCTTTATT AACTAGGCTG 6120CTGAACACTC AGATCTACAA AGTAGATTCC ATATCATATA ACATCCAAAA CAGAGAATGG 6180TATATCCCTC TTCCCAGCCA TATCATGACG AAAGGGGCAT TTCTAGGTGG AGCAGACGTC 6240AAAGAATGTA TAGAAGCATT CAGCAGCTAT ATATGCCCTT CTGATCCAGG ATTTGTATTA 6300AACCATGAAA TAGAGAGCTG CTTATCAGGA AACATATCCC AATGTCCAAG AACAACGGTC 6360ACATCAGACA TTGTTCCAAG ATATGCATTT GTCAATGGAG GAGTGGTTGC AAACTGTATA 6420ACAACCACCT GTACATGCAA CGGAATTGGT AATAGAATCA ATCAACCACC TGATCAAGGA 6480GTAAAAATTA TAACACATAA AGAATGTAGT ACAATAGGTA TCAACGGAAT GCTGTTCAAT 6540ACAAATAAAG AAGGAACTCT TGCATTCTAT ACACCAAATG ATATAACACT AAACAATTCT 6600GTTGCACTTG ATCCAATTGA CATATCAATC GAGCTCAACA AGGCCAAATC AGATCTAGAA 6660GAATCAAAAG AATGGATAAG AAGGTCAAAT CAAAAACTAG ATTCTATTGG AAATTGGCAT 6720CAATCTAGCA CTACAATCAT AATTATTTTG ATAATGATCA TTATATTGTT TATAATTAAT 6780ATAACGATAA TTACAATTGC AATTAAGTAT TACAGAATTC AAAAGAGAAA TCGAGTGGAT 6840CAAAATGACA AGCCATATGT ACTAACAAAC AAATAACATA TCTACAGATC ATTAGATATT 6900AAAATTATAA AAAACTTAGG AGTAAAGTTA CGCAATCCAA CTCTACTCAT ATAATTGAGG 6960AAGGACCCAA TAGACAAATC CAAATTCGAG ATGGAATACT GGAAGCATAC CAATCACGGA 7020AAGGATGCTG GTAATGAGCT GGAGACGTCT ATGGCTACTC ATGGCAACAA GCTCACTAAT 7080AAGATAATAT ACATATTATG GACAATAATC CTGGTGTTAT TATCAATAGT CTTCATCATA 7140GTGCTAATTA ATTCCATCAA AAGTGAAAAG GCCCACGAAT CATTGCTGCA AGACATAAAT 7200AATGAGTTTA TGGAAATTAC AGAAAAGATC CAAATGGCAT CGGATAATAC CAATGATCTA 7260ATACAGTCAG GAGTGAATAC AAGGCTTCTT ACAATTCAGA GTCATGTCCA GAATTACATA 7320CCAATATCAT TGACACAACA GATGTCAGAT CTTAGGAAAT TCATTAGTGA AATTACAATT 7380AGAAATGATA ATCAAGAAGT GCTGCCACAA AGAATAACAC ATGATGTAGG TATAAAACCT 7440TTAAATCCAG ATGATTTTTG GAGATGCACG TCTGGTCTTC CATCTTTAAT GAAAACTCCA 7500AAAATAAGGT TAATGCCAGG GCCGGGATTA TTAGCTATGC CAACGACTGT TGATGGCTGT 7560GTTAGAACTC CGTCTTTAGT TATAAATGAT CTGATTTATG CTTATACCTC AAATCTAATT 7620ACTCGAGGTT GTCAGGATAT AGGAAAATCA TATCAAGTCT TACAGATAGG GATAATAACT 7680GTAAACTCAG ACTTGGTACC TGACTTAAAT CCTAGGATCT CTCATACCTT TAACATAAAT 7740GACAATAGGA AGTCATGTTC TCTAGCACTC CTAAATATAG ATGTATATCA ACTGTGTTCA 7800ACTCCCAAAG TTGATGAAAG ATCAGATTAT GCATCATCAG GCATAGAAGA TATTGTACTT 7860GATATTGTCA ATTATGATGG TTCAATCTCA ACAACAAGAT TTAAGAATAA TAACATAAGC 7920TTTGATCAAC CATATGCTGC ACTATACCCA TCTGTTGGAC CAGGGATATA CTACAAAGGC 7980AAAATAATAT TTCTCGGGTA TGGAGGTCTT GAACATCCAA TAAATGAGAA TGTAATCTGC 8040AACACAACTG GGTGCCCCGG GAAAACACAG AGAGACTGTA ATCAAGCATC TCATAGTACT 8100TGGTTTTCAG ATAGGAGGAT GGTCAACTCC ATCATTGTTG TTGACAAAGG CTTAAACTCA 8160ATTCCAAAAT TGAAAGTATG GACGATATCT ATGCGACAAA ATTACTGGGG GTCAGAAGGA 8220AGGTTACTTC TACTAGGTAA CAAGATCTAT ATATATACAA GATCTACAAG TTGGCATAGC 8280AAGTTACAAT TAGGAATAAT TGATATTACT GATTACAGTG ATATAAGGAT AAAATGGACA 8340TGGCATAATG TGCTATCAAG ACCAGGAAAC AATGAATGTC CATGGGGACA TTCATGTCCA 8400GATGGATGTA TAACAGGAGT ATATACTGAT GCATATCCAC TCAATCCCAC AGGGAGCATT 8460GTGTCATCTG TCATATTAGA CTCACAAAAA TCGAGAGTGA ACCCAGTCAT AACTTACTCA 8520ACAGCAACCG AAAGAGTAAA CGAGCTGGCC ATCCTAAACA GAACACTCTC AGCTGGATAT 8580ACAACAACAA GCTGCATTAC ACACTATAAC AAAGGATATT GTTTTCATAT AGTAGAAATA 8640AATCATAAAA GCTTAAACAC ATTTCAACCC ATGTTGTTCA AAACAGAGAT TCCAAAAAGC 8700TGCAGTTAAT CATAATTAAC CATAATATGC ATCAATCTAT CTATAATACA AGTATATGAT 8760AAGTAATCAG CAATCAGACA ATAGACAAAA GGGAAATATA AAAAACTTAG GAGCAAAGCG 8820TGCTCGGGAA ATGGACACTG AATCTAACAA TGGCACTGTA TCTGACATAC TCTATCCTGA 8880GTGTCACCTT AACTCTCCTA TCGTTAAAGG TAAAATAGCA CAATTACACA CTATTATGAG 8940TCTACCTCAG CCTTATGATA TGGATGACGA CTCAATACTA GTTATCACTA GACAGAAAAT 9000AAAACTTAAT AAATTGGATA AAAGACAACG ATCTATTAGA AGATTAAAAT TAATATTAAC 9060TGAAAAAGTG AATGACTTAG GAAAATACAC ATTTATCAGA TATCCAGAAA TGTCAAAAGA 9120AATGTTCAAA TTATATATAC CTGGTATTAA CAGTAAAGTG ACTGAATTAT TACTTAAAGC 9180AGATAGAACA TATAGTCAAA TGACTGATGG ATTAAGAGAT CTATGGATTA ATGTGCTATC 9240AAAATTAGCC TCAAAAAATG ATGGAAGCAA TTATGATCTT AATGAAGAAA TTAATAATAT 9300ATCGAAAGTT CACACAACCT ATAAATCAGA TAAATGGTAT AATCCATTCA AAACATGGTT 9360TACTATCAAG TATGATATGA GAAGATTACA AAAAGCTCGA AATGAGATCA CTTTTAATGT 9420TGGGAAGGAT TATAACTTGT TAGAAGACCA GAAGAATTTC TTATTGATAC ATCCAGAATT 9480GGTTTTGATA TTAGATAAAC AAAACTATAA TGGTTATCTA ATTACTCCTG AATTAGTATT 9540GATGTATTGT GACGTAGTCG AAGGCCGATG GAATATAAGT GCATGTGCTA AGTTAGATCC 9600AAAATTACAA TCTATGTATC AGAAAGGTAA TAACCTGTGG GAAGTGATAG ATAAATTGTT 9660TCCAATTATG GGAGAAAAGA CATTTGATGT GATATCGTTA TTAGAACCAC TTGCATTATC 9720CTTAATTCAA ACTCATGATC CTGTTAAACA ACTAAGAGGA GCTTTTTTAA ATCATGTGTT 9780ATCCGAGATG GAATTAATAT TTGAATCTAG AGAATCGATT AAGGAATTTC TGAGTGTAGA 9840TTACATTGAT AAAATTTTAG ATATATTTAA TAAGTCTACA ATAGATGAAA TAGCAGAGAT 9900TTTCTCTTTT TTTAGAACAT TTGGGCATCC TCCATTAGAA GCTAGTATTG CAGCAGAAAA 9960GGTTAGAAAA TATATGTATA TTGGAAAACA ATTAAAATTT GACACTATTA ATAAATGTCA 10020TGCTATCTTC TGTACAATAA TAATTAACGG ATATAGAGAG AGGCATGGTG GACAGTGGCC 10080TCCTGTGACA TTACCTGATC ATGCACACGA ATTCATCATA AATGCTTACG GTTCAAACTC 10140TGCGATATCA TATGAAAATG CTGTTGATTA TTACCAGAGC TTTATAGGAA TAAAATTCAA 10200TAAATTCATA GAGCCTCAGT TAGATGAGGA TTTGACAATT TATATGAAAG ATAAAGCATT 10260ATCTCCAAAA AAATCAAATT GGGACACAGT TTATCCTGCA TCTAATTTAC TGTACCGTAC 10320TAACGCATCC AACGAATCAC GAAGATTAGT TGAAGTATTT ATAGCAGATA GTAAATTTGA 10380TCCTCATCAG ATATTGGATT ATGTAGAATC TGGGGACTGG TTAGATGATC CAGAATTTAA 10440TATTTCTTAT AGTCTTAAAG AAAAAGAGAT CAAACAGGAA GGTAGACTCT TTGCAAAAAT 10500GACATACAAA ATGAGAGCTA CACAAGTTTT ATCAGAGACC CTACTTGCAA ATAACATAGG 10560AAAATTCTTT CAAGAAAATG GGATGGTGAA GGGAGAGATT GAATTACTTA AGAGATTAAC 10620AACCATATCA ATATCAGGAG TTCCACGGTA TAATGAAGTG TACAATAATT CTAAAAGCCA 10680TACAGATGAC CTTAAAACCT ACAATAAAAT AAGTAATCTT AATTTGTCTT CTAATCAGAA 10740ATCAAAGAAA TTTGAATTCA AGTCAACGGA TATCTACAAT GATGGATACG AGACTGTGAG 10800CTGTTTCCTA ACAACAGATC TCAAAAAATA CTGTCTTAAT TGGAGATATG AATCAACAGC 10860TCTATTTGGA GAAACTTGCA ACCAAATATT TGGATTAAAT AAATTGTTTA ATTGGTTACA 10920CCCTCGTCTT GAAGGAAGTA CAATCTATGT AGGTGATCCT TACTGTCCTC CATCAGATAA 10980AGAACATATA TCATTAGAGG ATCACCCTGA TTCTGGTTTT TACGTTCATA ACCCAAGAGG 11040GGGTATAGAA GGATTTTGTC AAAAATTATG GACACTCATA TCTATAAGTG CAATACATCT 11100AGCAGCTGTT AGAATAGGCG TGAGGGTGAC TGCAATGGTT CAAGGAGACA ATCAAGCTAT 11160AGCTGTAACC ACAAGAGTAC CCAACAATTA TGACTACAGA GTTAAGAAGG AGATAGTTTA 11220TAAAGATGTA GTGAGATTTT TTGATTCATT AAGAGAAGTG ATGGATGATC TAGGTCATGA 11280ACTTAAATTA AATGAAACGA TTATAAGTAG CAAGATGTTC ATATATAGCA AAAGAATCTA 11340TTATGATGGG AGAATTCTTC CTCAAGCTCT AAAAGCATTA TCTAGATGTG TCTTCTGGTC 11400AGAGACAGTA ATAGACGAAA CAAGATCAGC ATCTTCAAAT TTGGCAACAT CATTTGCAAA 11460AGCAATTGAG AATGGTTATT CACCTGTTCT AGGATATGCA TGCTCAATTT TTAAGAATAT 11520TCAACAACTA TATATTGCCC TTGGGATGAA TATCAATCCA ACTATAACAC AGAATATCAG 11580AGATCAGTAT TTTAGGAATC CAAATTGGAT GCAATATGCC TCTTTAATAC CTGCTAGTGT 11640TGGGGGATTC AATTACATGG CCATGTCAAG ATGTTTTGTA AGGAATATTG GTGATCCATC 11700AGTTGCCGCA TTGGCTGATA TTAAAAGATT TATTAAGGCG AATCTATTAG ACCGAAGTGT 11760TCTTTATAGG ATTATGAATC AAGAACCAGG TGAGTCATCT TTTTTGGACT GGGCTTCAGA 11820TCCATATTCA TGCAATTTAC CACAATCTCA AAATATAACC ACCATGATAA AAAATATAAC 11880AGCAAGGAAT GTATTACAAG ATTCACCAAA TCCATTATTA TCTGGATTAT TCACAAATAC 11940AATGATAGAA GAAGATGAAG AATTAGCTGA GTTCCTGATG GACAGGAAGG TAATTCTCCC 12000TAGAGTTGCA CATGATATTC TAGATAATTC TCTCACAGGA ATTAGAAATG CCATAGCTGG 12060AATGTTAGAT ACGACAAAAT CACTAATTCG GGTTGGCATA AATAGAGGAG GACTGACATA 12120TAGTTTGTTG AGGAAAATCA GTAATTACGA TCTAGTACAA TATGAAACAC TAAGTAGGAC 12180TTTGCGACTA ATTGTAAGTG ATAAAATCAA GTATGAAGAT ATGTGTTCGG TAGACCTTGC 12240CATAGCATTG CGACAAAAGA TGTGGATTCA TTTATCAGGA GGAAGGATGA TAAGTGGACT 12300TGAAACGCCT GACCCATTAG AATTACTATC TGGGGTAGTA ATAACAGGAT CAGAACATTG 12360TAAAATATGT TATTCTTCAG ATGGCACAAA CCCATATACT TGGATGTATT TACCCGGTAA 12420TATCAAAATA GGATCAGCAG AAACAGGTAT ATCGTCATTA AGAGTTCCTT ATTTTGGATC 12480AGTCACTGAT GAAAGATCTG AAGCACAATT AGGATATATC AAGAATCTTA GTAAACCTGC 12540AAAAGCCGCA ATAAGAATAG CAATGATATA TACATGGGCA TTTGGTAATG ATGAGATATC 12600TTGGATGGAA GCCTCACAGA TAGCACAAAC ACGTGCAAAT TTTACACTAG ATAGTCTCAA 12660AATTTTAACA CCGGTAGCTA CATCAACAAA TTTATCACAC AGATTAAAGG ATACTGCAAC 12720TCAGATGAAA TTCTCCAGTA CATCATTGAT CAGAGTCAGC AGATTCATAA CAATGTCCAA 12780TGATAACATG TCTATCAAAG AAGCTAATGA AACCAAAGAT ACTAATCTTA TTTATCAACA 12840AATAATGTTA ACAGGATTAA GTGTTTTCGA ATATTTATTT AGATTAAAAG AAACCACAGG 12900ACACAACCCT ATAGTTATGC ATCTGCACAT AGAAGATGAG TGTTGTATTA AAGAAAGTTT 12960TAATGATGAA CATATTAATC CAGAGTCTAC ATTAGAATTA ATTCGATATC CTGAAAGTAA 13020TGAATTTATT TATGATAAAG ACCCACTCAA AGATGTGGAC TTATCAAAAC TTATGGTTAT 13080TAAAGACCAT TCTTACACAA TTGATATGAA TTATTGGGAT GATACTGACA TCATACATGC 13140AATTTCAATA TGTACTGCAA TTACAATAGC AGATACTATG TCACAATTAG ATCGAGATAA 13200TTTAAAAGAG ATAATAGTTA TTGCAAATGA TGATGATATT AATAGCTTAA TCACTGAATT 13260TTTGACTCTT GACATACTTG TATTTCTCAA GACATTTGGT GGATTATTAG TAAATCAATT 13320TGCATACACT CTTTATAGTC TAAAAATAGA AGGTAGGGAT CTCATTTGGG ATTATATAAT 13380GAGAACACTG AGAGATACTT CCCATTCAAT ATTAAAAGTA TTATCTAATG CATTATCTCA 13440TCCTAAAGTA TTCAAGAGGT TCTGGGATTG TGGAGTTTTA AACCCTATTT ATGGTCCTAA 13500TACTGCTAGT CAAGACCAGA TAAAACTTGC CCTATCTATA TGTGAATATT CACTAGATCT 13560ATTTATGAGA GAATGGTTGA ATGGTGTATC ACTTGAAATA TACATTTGTG ACAGCGATAT 13620GGAAGTTGCA AATGATAGGA AACAAGCCTT TATTTCTAGA CACCTTTCAT TTGTTTGTTG 13680TTTAGCAGAA ATTGCATCTT TCGGACCTAA CCTGTTAAAC TTAACATACT TGGAGAGACT 13740TGATCTATTG AAACAATATC TTGAATTAAA TATTAAAGAA GACCCTACTC TTAAATATGT 13800ACAAATATCT GGATTATTAA TTAAATCGTT CCCATCAACT GTAACATACG TAAGAAAGAC 13860TGCAATCAAA TATCTAAGGA TTCGCGGTAT TAGTCCACCT GAGGTAATTG ATGATTGGGA 13920TCCGGTAGAA GATGAAAATA TGCTGGATAA CATTGTCAAA ACTATAAATG ATAACTGTAA 13980TAAAGATAAT AAAGGGAATA AAATTAACAA TTTCTGGGGA CTAGCACTTA AGAACTATCA 14040AGTCCTTAAA ATCAGATCTA TAACAAGTGA TTCTGATGAT AATGATAGAC TAGATGCTAA 14100TACAAGTGGT TTGACACTTC CTCAAGGAGG GAATTATCTA TCGCATCAAT TGAGATTATT 14160CGGAATCAAC AGCACTAGTT GTCTGAAAGC TCTTGAGTTA TCACAAATTT TAATGAAGGA 14220AGTCAATAAA GACAAGGACA GGCTCTTCCT GGGAGAAGGA GCAGGAGCTA TGCTAGCATG 14280TTATGATGCC ACATTAGGAC CTGCAGTTAA TTATTATAAT TCAGGTTTGA ATATAACAGA 14340TGTAATTGGT CAACGAGAAT TGAAAATATT TCCTTCAGAG GTATCATTAG TAGGTAAAAA 14400ATTAGGAAAT GTGACACAGA TTCTTAACAG GGTAAAAGTA CTGTTCAATG GGAATCCTAA 14460TTCAACATGG ATAGGAAATA TGGAATGTGA GAGCTTAATA TGGAGTGAAT TAAATGATAA 14520GTCCATTGGA TTAGTACATT GTGATATGGA AGGAGCTATC GGTAAATCAG AAGAAACTGT 14580TCTACATGAA CATTATAGTG TTATAAGAAT TACATACTTG ATTGGGGATG ATGATGTTGT 14640TTTAGTTTCC AAAATTATAC CTACAATCAC TCCGAATTGG TCTAGAATAC TTTATCTATA 14700TAAATTATAT TGGAAAGATG TAAGTATAAT ATCACTCAAA ACTTCTAATC CTGCATCAAC 14760AGAATTATAT CTAATTTCGA AAGATGCATA TTGTACTATA ATGGAACCTA GTGAAATTGT 14820TTTATCAAAA CTTAAAAGAT TGTCACTCTT GGAAGAAAAT AATCTATTAA AATGGATCAT 14880TTTATCAAAG AAGAGGAATA ATGAATGGTT ACATCATGAA ATCAAAGAAG GAGAAAGAGA 14940TTATGGAATC ATGAGACCAT ATCATATGGC ACTACAAATC TTTGGATTTC AAATCAATTT 15000AAATCATCTG GCGAAAGAAT TTTTATCAAC CCCAGATCTG ACTAATATCA ACAATATAAT 15060CCAAAGTTTT CAGCGAACAA TAAAGGATGT TTTATTTGAA TGGATTAATA TAACTCATGA 15120TGATAAGAGA CATAAATTAG GCGGAAGATA TAACATATTC CCACTGAAAA ATAAGGGAAA 15180GTTAAGACTG CTATCGAGAA GACTAGTATT AAGTTGGATT TCATTATCAT TATCGACTCG 15240ATTACTTACA GGTCGCTTTC CTGATGAAAA ATTTGAACAT AGAGCACAGA CTGGATATGT 15300ATCATTAGCT GATACTGATT TAGAATCATT AAAGTTATTG TCGAAAAACA TCATTAAGAA 15360TTACAGAGAG TGTATAGGAT CAATATCATA TTGGTTTCTA ACCAAAGAAG TTAAAATACT 15420TATGAAATTG ATCGGTGGTG CTAAATTATT AGGAATTCCC AGACAATATA AAGAACCCGA 15480AGACCAGTTA TTAGAAAACT ACAATCAACA TGATGAATTT GATATCGATT AAAACATAAA 15540TACAATGAAG ATATATCCTA ACCTTTATCT TTAAGCCTAG GAATAGACAA AAAGTAAGAA 15600AAACATGTAA TATATATATA CCAAACAGAG TTCTTCTCTT GTTTGGTTAT AGTGAGTCGT 15660ATTACAATC 15669(2) 서열 2의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 31 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 2:AATACGACTC ACTATAACCA AACAAGAGAA C 31(2) 서열 3의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 24 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 3:CCAAGTACTA TGAGATGCTT CATT 24(2) 서열 4의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 31 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 4:CCCTATAATT TCAACATGTT GAGCCTATTT G 31(2) 서열 5의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 31 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 5:GATTAAAATG TTGGTCGACT TAGTTGCTTC C 31(2) 서열 6의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 38 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 6:CCATAGAGAG TCCATGGAAA GCGACGCTAA AAACTATC 38(2) 서열 7의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 37 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 7:CGGTGTCGTT TCTTTGTCGA CTCATTGGCA ATTGTTG 37(2) 서열 8의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 42 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 8:GCAAAGCGTG CCCGGGCCAT GGACACTGAA TCTAACAATG GC 42(2) 서열 9의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 28 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 9:GAAATTCCTT AATCGATTCT CTAGATTC 28(2) 서열 10의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 30 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 특성: 서열 10:CCCATCAACT GTAACATACG TAAGAAAGAC 30(2) 서열 11의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 29 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 11:GGTTAGGATA TGTCGACATT GTATTTATG 29(2) 서열 12의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 43 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 12:GGGGTTATGC TACTGCAGGC TTTTTTTCTC CCTTAGCCAT CCG 43(2) 서열 13의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 35 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 13:CTCCATTCTA GANTTATAAA AATTATAGAG TTCCC 35(2) 서열 14의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 15660 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 14:TAATACGACT CACTATAACC AAACAAGAGA AGAAACTTGT CTGGGAATAT AAATTTAACT 60TTAAATTAAC TTAGGATTAA AGACATTGAC TAGAAGGTCA AGAAAAGGGA ACTCTATAAT 120TTCAAAAATG TTGAGCCTAT TTGATACATT TAATGCACGT AGGCAAGAAA ACATAACAAA 180ATCAGCCGGT GGAGCTATCA TTCCTGGACA GAAAAATACT GTCTCTATAT TCGCCCTTGG 240ACCGACAATA ACTGATGATA ATGAGAAAAT GACATTAGCT CTTCTATTTC TATCTCATTC 300ACTAGATAAT GAGAAACAAC ATGCACAAAG GGCAGGGTTC TTGGTGTCTT TATTGTCAAT 360GGCTTATGCC AATCCAGAGC TCTACCTAAC AACAAATGGA AGTAATGCAG ATGTCAAGTA 420TGTCATATAC ATGATTGAGA AAGATCTAAA ACGGCAAAAG TATGGAGGAT TTGTGGTTAA 480GACGAGAGAG ATGATATATG AAAAGACAAC TGATTGGATA TTTGGAAGTG ACCTGGATTA 540TGATCAGGAA ACTATGTTGC AGAACGGCAG GAACAATTCA ACAATTGAAG ACCTTGTCCA 600CACATTTGGG TATCCATCAT GTTTAGGAGC TCTTATAATA CAGATCTGGA TAGTTCTGGT 660CAAAGCTATC ACTAGTATCT CAGGGTTAAG AAAAGGCTTT TTCACCCGAT TGGAAGCTTT 720CAGACAAGAT GGAACAGTGC AGGCAGGGCT GGTATTGAGC GGTGACACAG TGGATCAGAT 780TGGGTCAATC ATGCGGTCTC AACAGAGCTT GGTAACTCTT ATGGTTGAAA CATTAATAAC 840AATGAATACC AGCAGAAATG ACCTCACAAC CATAGAAAAG AATATACAAA TTGTTGGCAA 900CTACATAAGA GATGCAGGTC TCGCTTCATT CTTCAATACA ATCAGATATG GAATTGAGAC 960CAGAATGGCA GCTTTGACTC TATCCACTCT CAGACCAGAT ATCAATAGAT TAAAAGCTTT 1020GATGGAACTG TATTTATCAA AGGGACCACG CGCTCCTTTC ATCTGTATCC TCAGAGATCC 1080TATACATGGT GAGTTCGCAC CAGGCAACTA TCCTGCCATA TGGAGCTATG CAATGGGGGT 1140GGCAGTTGTA CAAAATAGAG CCATGCAACA GTATGTGACG GGAAGATCAT ATCTAGACAT 1200TGATATGTTC CAGCTAGGAC AAGCAGTAGC ACGTGATGCC GAAGCTCAAA TGAGCTCAAC 1260ACTGGAAGAT GAACTTGGAG TGACACACGA ATCTAAAGAA AGCTTGAAGA GACATATAAG 1320GAACATAAAC AGTTCAGAGA CATCTTTCCA CAAACCGACA GGTGGATCAG CCATAGAGAT 1380GGCAATAGAT GAAGAGCCAG AACAATTCGA ACATAGAGCA GATCAAGAAC AAAATGGAGA 1440ACCTCAATCA TCCATAATTC AATATGCCTG GGCAGAAGGA AATAGAAGCG ATGATCAGAC 1500TGAGCAAGCT ACAGAATCTG ACAATATCAA GACCGAACAA CAAAACATCA GAGACAGACT 1560AAACAAGAGA CTCAACGACA AGAAGAAACA AAGCAGTCAA CCACCCACTA ATCCCACAAA 1620CAGAACAAAC CAGGACGAAA TAGATGATCT GTTTAACGCA TTTGGAAGCA ACTAATCGAA 1680TCAACATTTT AATCTAAATC AATAATAAAT AAGAAAAACT TAGGATTAAA GAATCCTATC 1740ATACCGGAAT ATAGGGTGGT AAATTTAGAG TCTGCTTGAA ACTCAATCAA TAGAGAGTTG 1800ATGGAAAGCG ATGCTAAAAA CTATCAAATC ATGGATTCTT GGGAAGAGGA ATCAAGAGAT 1860AAATCAACTA ATATCTCCTC GGCCCTCAAC ATCATTGAAT TCATACTCAG CACCGACCCC 1920CAAGAAGACT TATCGGAAAA CGACACAATC AACACAAGAA CCCAGCAACT CAGTGCCACC 1980ATCTGTCAAC CAGAAATCAA ACCAACAGAA ACAAGTGAGA AAGATAGTGG ATCAACTGAC 2040AAAAATAGAC AGTCTGGGTC ATCACACGAA TGTACAACAG AAGCAAAAGA TAGAAATATT 2100GATCAGGAAA CTGTACAGAG AGGACCTGGG AGAAGAAGCA GCTCAGATAG TAGAGCTGAG 2160ACTGTGGTCT CTGGAGGAAT CCCCAGAAGC ATCACAGATT CTAAAAATGG AACCCAAAAC 2220ACGGAGGATA TTGATCTCAA TGAAATTAGA AAGATGGATA AGGACTCTAT TGAGGGGAAA 2280ATGCGACAAT CTGCAAATGT TCCAAGCGAG ATATCAGGAA GTGATGACAT ATTTACAACA 2340GAACAAAGTA GAAACAGTGA TCATGGAAGA AGCCTGGAAT CTATCAGTAC ACCTGATACA 2400AGATCAATAA GTGTTGTTAC TGCTGCAACA CCAGATGATG AAGAAGAAAT ACTAATGAAA 2460AATAGTAGGA CAAAGAAAAG TTCTTCAACA CATCAAGAAG ATGACAAAAG AATTAAAAAA 2520GGGGGAAAAG GGAAAGACTG GTTTAAGAAA TCAAAAGATA CCGACAACCA GATACCAACA 2580TCAGACTACA GATCCACATC AAAAGGGCAG AAGAAAATCT CAAAGACAAC AACCACCAAC 2640ACCGACACAA AGGGGCAAAC AGAAATACAG ACAGAATCAT CAGAAACACA ATCCTCATCA 2700TGGAATCTCA TCATCGACAA CAACACCGAC CGGAACGAAC AGACAAGCAC AACTCCTCCA 2760ACAACAACTT CCAGATCAAC TTATACAAAA GAATCGATCC GAACAAACTC TGAATCCAAA 2820CCCAAGACAC AAAAGACAAA TGGAAAGGAA AGGAAGGATA CAGAAGAGAG CAATCGATTT 2880ACAGAGAGGG CAATTACTCT ATTGCAGAAT CTTGGTGTAA TTCAATCCAC ATCAAAACTA 2940GATTTATATC AAGACAAACG AGTTGTATGT GTAGCAAATG TACTAAACAA TGTAGATACT 3000GCATCAAAGA TAGATTTCCT GGCAGGATTA GTCATAGGGG TTTCAATGGA CAACGACACA 3060AAATTAACAC AGATACAAAA TGAAATGCTA AACCTCAAAG CAGATCTAAA GAAAATGGAC 3120GAATCACATA GAAGATTGAT AGAAAATCAA AGAGAACAAC TGTCATTGAT CACGTCACTA 3180ATTTCAAATC TCAAAATTAT GACTGAGAGA GGAGGAAAGA AAGACCAAAA TGAATCCAAT 3240GAGAGAGTAT CCATGATCAA AACAAAATTG AAAGAAGAAA AGATCAAGAA GACCAGGTTT 3300GACCCACTTA TGGAGGCACA AGGCATTGAC AAGAATATAC CCGATCTATA TCGACATGCA 3360GGAGATACAC TAGAGAACGA TGTACAAGTT AAATCAGAGA TATTAAGTTC ATACAATGAG 3420TCAAATGCAA CAAGACTAAT ACCCAAAAAA GTGAGCAGTA CAATGAGATC ACTAGTTGCA 3480GTCATCAACA ACAGCAATCT CTCACAAAGC ACAAAACAAT CATACATAAA CGAACTCAAA 3540CGTTGCAAAA ATGATGAAGA AGTATCTGAA TTAATGGACA TGTTCAATGA AGATGTCAAC 3600AATTGCCAAT GATCCAACAA AGAAACGACA CCGAACAAAC AGACAAGAAA CAACAGTAGA 3660TCAAAACCTG TCAACACACA CAAAATCAAG CAGAATGAAA CAACAGATAT CAATCAATAT 3720ACAAATAAGA AAAACTTAGG ATTAAAGAAT AAATTAATCC TTGTCCAAAA TGAGTATAAC 3780TAACTCTGCA ATATACACAT TCCCAGAATC ATCATTCTCT GAAAATGGTC ATATAGAACC 3840ATTACCACTC AAAGTCAATG AACAGAGGAA AGCAGTACCC CACATTAGAG TTGCCAAGAT 3900CGGAAATCCA CCAAAACACG GATCCCGGTA TTTAGATGTC TTCTTACTCG GCTTCTTCGA 3960GATGGAACGA ATCAAAGACA AATACGGGAG TGTGAATGAT CTCGACAGTG ACCCGAGTTA 4020CAAAGTTTGT GGCTCTGGAT CATTACCAAT CGGATTGGCT AAGTACACTG GGAATGACCA 4080GGAATTGTTA CAAGCCGCAA CCAAACTGGA TATAGAAGTG AGAAGAACAG TCAAAGCGAA 4140AGAGATGGTT GTTTACACGG TACAAAATAT AAAACCAGAA CTGTACCCAT GGTCCAATAG 4200ACTAAGAAAA GGAATGCTGT TCGATGCCAA CAAAGTTGCT CTTGCTCCTC AATGTCTTCC 4260ACTAGATAGG AGCATAAAAT TTAGAGTAAT CTTCGTGAAT TGTACGGCAA TTGGATCAAT 4320AACCTTGTTC AAAATTCCTA AGTCAATGGC ATCACTATCT CTACCCAACA CAATATCAAT 4380CAATCTGCAG GTACACATAA AAACAGGGGT TCAGACTGAT TCTAAAGGGA TAGTTCAAAT 4440TTTGGATGAG AAAGGCGAAA AATCACTGAA TTTCATGGTC CATCTCGGAT TGATCAAAAG 4500AAAAGTAGGC AGAATGTACT CTGTTGAATA CTGTAAACAG AAAATCGAGA AAATGAGATT 4560GATATTTTCT TTAGGACTAG TTGGAGGAAT CAGTCTTCAT GTCAATGCAA CTGGGTCCAT 4620ATCAAAAACA CTAGCAAGTC AGCTGGTATT CAAAAGAGAG ATTTGTTATC CTTTAATGGA 4680TCTAAATCCG CATCTCAATC TAGTTATCTG GGCTTCATCA GTAGAGATTA CAAGAGTGGA 4740TGCAATTTTC CAACCTTCTT TACCTGGCGA GTTCAGATAC TATCCTAATA TTATTGCAAA 4800AGGAGTTGGG AAAATCAAAC AATGGAACTA GTAATCTCTA TTTTAGTCCG GACGTATCTA 4860TTAAGCCGAA GCAAATAAAG GATAATCAAA AACTTAGGAC AAAAGAGGTC AATACCAACA 4920ACTATTAGCA GTCACACTCG CAAGAATAAG AGAGAAGGGA CCAAAAAAGT CAAATAGGAG 4980AAATCAAAAC AAAAGGTACA GAACACCAGA ACAACAAAAT CAAAACATCC AACTCACTCA 5040AAACAAAAAT TCCAAAAGAG ACCGGCAACA CAACAAGCAC TGAACACAAT GCCAACTTCA 5100ATACTGCTAA TTATTACAAC CATGATCATG GCATCTTTCT GCCAAATAGA TATCACAAAA 5160CTACAGCACG TAGGTGTATT GGTCAACAGT CCCAAAGGGA TGAAGATATC ACAAAACTTT 5220GAAACAAGAT ATCTAATTTT GAGCCTCATA CCAAAAATAG AAGACTCTAA CTCTTGTGGT 5280GACCAACAGA TCAAGCAATA CAAGAAGTTA TTGGATAGAC TGATCATCCC TTTATATGAT 5340GGATTAAGAT TACAGAAAGA TGTGATAGTA ACCAATCAAG AATCCAATGA AAACACTGAT 5400CCCAGAACAA AACGATTCTT TGGAGGGGTA ATTGGAACCA TTGCTCTGGG AGTAGCAACC 5460TCAGCACAAA TTACAGCGGC AGTTGCTCTG GTTGAAGCCA AGCAGGCAAG ATCAGACATC 5520GAAAAACTCA AAGAAGCAAT TAGGGACACA AACAAAGCAG TGCAGTCAGT TCAGAGCTCC 5580ATAGGAAATT TAATAGTAGC AATTAAATCA GTCCAGGATT ATGTTAACAA AGAAATCGTG 5640CCATCGATTG CGAGGCTAGG TTGTGAAGCA GCAGGACTTC AATTAGGAAT TGCATTAACA 5700CAGCATTACT CAGAATTAAC AAACATATTT GGTGATAACA TAGGATCGTT ACAAGAAAAA 5760GGAATAAAAT TACAAGGTAT AGCATCATTA TACCGCACAA ATATCACAGA AATATTCACA 5820ACATCAACAG TTGATAAATA TGATATCTAT GATCTGTTAT TTACAGAATC AATAAAGGTG 5880AGAGTTATAG ATGTTGACTT GAATGATTAC TCAATCACCC TCCAAGTCAG ACTCCCTTTA 5940TTAACTAGGC TGCTGAACAC TCAGATCTAC AAAGTAGATT CCATATCATA TAACATCCAA 6000AACAGAGAAT GGTATATCCC TCTTCCCAGC CATATCATGA CGAAAGGGGC ATTTCTAGGT 6060GGAGCAGACG TCAAAGAATG TATAGAAGCA TTCAGCAGCT ATATATGCCC TTCTGATCCA 6120GGATTTGTAT TAAACCATGA AATAGAGAGC TGCTTATCAG GAAACATATC CCAATGTCCA 6180AGAACAACGG TCACATCAGA CATTGTTCCA AGATATGCAT TTGTCAATGG AGGAGTGGTT 6240GCAAACTGTA TAACAACCAC CTGTACATGC AACGGAATTG GTAATAGAAT CAATCAACCA 6300CCTGATCAAG GAGTAAAAAT TATAACACAT AAAGAATGTA GTACAATAGG TATCAACGGA 6360ATGCTGTTCA ATACAAATAA AGAAGGAACT CTTGCATTCT ATACACCAAA TGATATAACA 6420CTAAACAATT CTGTTGCACT TGATCCAATT GACATATCAA TCGAGCTCAA CAAGGCCAAA 6480TCAGATCTAG AAGAATCAAA AGAATGGATA AGAAGGTCAA ATCAAAAACT AGATTCTATT 6540GGAAATTGGC ATCAATCTAG CACTACAATC ATAATTATTT TGATAATGAT CATTATATTG 6600TTTATAATTA ATATAACGAT AATTACAATT GCAATTAAGT ATTACAGAAT TCAAAAGAGA 6660AATCGAGTGG ATCAAAATGA CAAGCCATAT GTACTAACAA ACAAATAACA TATCTACAGA 6720TCATTAGATA TTAAAATTAT AAAAAACTTA GGAGTAAAGT TACGCAATCC AACTCTACTC 6780ATATAATTGA GGAAGGACCC AATAGACAAA TCCAAATTCG AGATGGAATA CTGGAAGCAT 6840ACCAATCACG GAAAGGATGC TGGTAATGAG CTGGAGACGT CTATGGCTAC TCATGGCAAC 6900AAGCTCACTA ATAAGATAAT ATACATATTA TGGACAATAA TCCTGGTGTT ATTATCAATA 6960GTCTTCATCA TAGTGCTAAT TAATTCCATC AAAAGTGAAA AGGCCCACGA ATCATTGCTG 7020CAAGACATAA ATAATGAGTT TATGGAAATT ACAGAAAAGA TCCAAATGGC ATCGGATAAT 7080ACCAATGATC TAATACAGTC AGGAGTGAAT ACAAGGCTTC TTACAATTCA GAGTCATGTC 7140CAGAATTACA TACCAATATC ATTGACACAA CAGATGTCAG ATCTTAGGAA ATTCATTAGT 7200GAAATTACAA TTAGAAATGA TAATCAAGAA GTGCTGCCAC AAAGAATAAC ACATGATGTA 7260GGTATAAAAC CTTTAAATCC AGATGATTTT TGGAGATGCA CGTCTGGTCT TCCATCTTTA 7320ATGAAAACTC CAAAAATAAG GTTAATGCCA GGGCCGGGAT TATTAGCTAT GCCAACGACT 7380GTTGATGGCT GTGTTAGAAC TCCGTCTTTA GTTATAAATG ATCTGATTTA TGCTTATACC 7440TCAAATCTAA TTACTCGAGG TTGTCAGGAT ATAGGAAAAT CATATCAAGT CTTACAGATA 7500GGGATAATAA CTGTAAACTC AGACTTGGTA CCTGACTTAA ATCCTAGGAT CTCTCATACC 7560TTTAACATAA ATGACAATAG GAAGTCATGT TCTCTAGCAC TCCTAAATAT AGATGTATAT 7620CAACTGTGTT CAACTCCCAA AGTTGATGAA AGATCAGATT ATGCATCATC AGGCATAGAA 7680GATATTGTAC TTGATATTGT CAATTATGAT GGTTCAATCT CAACAACAAG ATTTAAGAAT 7740AATAACATAA GCTTTGATCA ACCATATGCT GCACTATACC CATCTGTTGG ACCAGGGATA 7800TACTACAAAG GCAAAATAAT ATTTCTCGGG TATGGAGGTC TTGAACATCC AATAAATGAG 7860AATGTAATCT GCAACACAAC TGGGTGCCCC GGGAAAACAC AGAGAGACTG TAATCAAGCA 7920TCTCATAGTA CTTGGTTTTC AGATAGGAGG ATGGTCAACT CCATCATTGT TGTTGACAAA 7980GGCTTAAACT CAATTCCAAA ATTGAAAGTA TGGACGATAT CTATGCGACA AAATTACTGG 8040GGGTCAGAAG GAAGGTTACT TCTACTAGGT AACAAGATCT ATATATATAC AAGATCTACA 8100AGTTGGCATA GCAAGTTACA ATTAGGAATA ATTGATATTA CTGATTACAG TGATATAAGG 8160ATAAAATGGA CATGGCATAA TGTGCTATCA AGACCAGGAA ACAATGAATG TCCATGGGGA 8220CATTCATGTC CAGATGGATG TATAACAGGA GTATATACTG ATGCATATCC ACTCAATCCC 8280ACAGGGAGCA TTGTGTCATC TGTCATATTA GACTCACAAA AATCGAGAGT GAACCCAGTC 8340ATAACTTACT CAACAGCAAC CGAAAGAGTA AACGAGCTGG CCATCCTAAA CAGAACACTC 8400TCAGCTGGAT ATACAACAAC AAGCTGCATT ACACACTATA ACAAAGGATA TTGTTTTCAT 8460ATAGTAGAAA TAAATCATAA AAGCTTAAAC ACATTTCAAC CCATGTTGTT CAAAACAGAG 8520ATTCCAAAAA GCTGCAGTTA ATCATAATTA ACCATAATAT GCATCAATCT ATCTATAATA 8580CAAGTATATG ATAAGTAATC AGCAATCAGA CAATAGACAA AAGGGAAATA TAAAAAACTT 8640AGGAGCAAAG CGTGCTCGGG AAATGGACAC TGAATCTAAC AATGGCACTG TATCTGACAT 8700ACTCTATCCT GAGTGTCACC TTAACTCTCC TATCGTTAAA GGTAAAATAG CACAATTACA 8760CACTATTATG AGTCTACCTC AGCCTTATGA TATGGATGAC GACTCAATAC TAGTTATCAC 8820TAGACAGAAA ATAAAACTTA ATAAATTGGA TAAAAGACAA CGATCTATTA GAAGATTAAA 8880ATTAATATTA ACTGAAAAAG TGAATGACTT AGGAAAATAC ACATTTATCA GATATCCAGA 8940AATGTCAAAA GAAATGTTCA AATTATATAT ACCTGGTATT AACAGTAAAG TGACTGAATT 9000ATTACTTAAA GCAGATAGAA CATATAGTCA AATGACTGAT GGATTAAGAG ATCTATGGAT 9060TAATGTGCTA TCAAAATTAG CCTCAAAAAA TGATGGAAGC AATTATGATC TTAATGAAGA 9120AATTAATAAT ATATCGAAAG TTCACACAAC CTATAAATCA GATAAATGGT ATAATCCATT 9180CAAAACATGG TTTACTATCA AGTATGATAT GAGAAGATTA CAAAAAGCTC GAAATGAGAT 9240CACTTTTAAT GTTGGGAAGG ATTATAACTT GTTAGAAGAC CAGAAGAATT TCTTATTGAT 9300ACATCCAGAA TTGGTTTTGA TATTAGATAA ACAAAACTAT AATGGTTATC TAATTACTCC 9360TGAATTAGTA TTGATGTATT GTGACGTAGT CGAAGGCCGA TGGAATATAA GTGCATGTGC 9420TAAGTTAGAT CCAAAATTAC AATCTATGTA TCAGAAAGGT AATAACCTGT GGGAAGTGAT 9480AGATAAATTG TTTCCAATTA TGGGAGAAAA GACATTTGAT GTGATATCGT TATTAGAACC 9540ACTTGCATTA TCCTTAATTC AAACTCATGA TCCTGTTAAA CAACTAAGAG GAGCTTTTTT 9600AAATCATGTG TTATCCGAGA TGGAATTAAT ATTTGAATCT AGAGAATCGA TTAAGGAATT 9660TCTGAGTGTA GATTACATTG ATAAAATTTT AGATATATTT AATAAGTCTA CAATAGATGA 9720AATAGCAGAG ATTTTCTCTT TTTTTAGAAC ATTTGGGCAT CCTCCATTAG AAGCTAGTAT 9780TGCAGCAGAA AAGGTTAGAA AATATATGTA TATTGGAAAA CAATTAAAAT TTGACACTAT 9840TAATAAATGT CATGCTATCT TCTGTACAAT AATAATTAAC GGATATAGAG AGAGGCATGG 9900TGGACAGTGG CCTCCTGTGA CATTACCTGA TCATGCACAC GAATTCATCA TAAATGCTTA 9960CGGTTCAAAC TCTGCGATAT CATATGAAAA TGCTGTTGAT TATTACCAGA GCTTTATAGG 10020AATAAAATTC AATAAATTCA TAGAGCCTCA GTTAGATGAG GATTTGACAA TTTATATGAA 10080AGATAAAGCA TTATCTCCAA AAAAATCAAA TTGGGACACA GTTTATCCTG CATCTAATTT 10140ACTGTACCGT ACTAACGCAT CCAACGAATC ACGAAGATTA GTTGAAGTAT TTATAGCAGA 10200TAGTAAATTT GATCCTCATC AGATATTGGA TTATGTAGAA TCTGGGGACT GGTTAGATGA 10260TCCAGAATTT AATATTTCTT ATAGTCTTAA AGAAAAAGAG ATCAAACAGG AAGGTAGACT 10320CTTTGCAAAA ATGACATACA AAATGAGAGC TACACAAGTT TTATCAGAGA CCCTACTTGC 10380AAATAACATA GGAAAATTCT TTCAAGAAAA TGGGATGGTG AAGGGAGAGA TTGAATTACT 10440TAAGAGATTA ACAACCATAT CAATATCAGG AGTTCCACGG TATAATGAAG TGTACAATAA 10500TTCTAAAAGC CATACAGATG ACCTTAAAAC CTACAATAAA ATAAGTAATC TTAATTTGTC 10560TTCTAATCAG AAATCAAAGA AATTTGAATT CAAGTCAACG GATATCTACA ATGATGGATA 10620CGAGACTGTG AGCTGTTTCC TAACAACAGA TCTCAAAAAA TACTGTCTTA ATTGGAGATA 10680TGAATCAACA GCTCTATTTG GAGAAACTTG CAACCAAATA TTTGGATTAA ATAAATTGTT 10740TAATTGGTTA CACCCTCGTC TTGAAGGAAG TACAATCTAT GTAGGTGATC CTTACTGTCC 10800TCCATCAGAT AAAGAACATA TATCATTAGA GGATCACCCT GATTCTGGTT TTTACGTTCA 10860TAACCCAAGA GGGGGTATAG AAGGATTTTG TCAAAAATTA TGGACACTCA TATCTATAAG 10920TGCAATACAT CTAGCAGCTG TTAGAATAGG CGTGAGGGTG ACTGCAATGG TTCAAGGAGA 10980CAATCAAGCT ATAGCTGTAA CCACAAGAGT ACCCAACAAT TATGACTACA GAGTTAAGAA 11040GGAGATAGTT TATAAAGATG TAGTGAGATT TTTTGATTCA TTAAGAGAAG TGATGGATGA 11100TCTAGGTCAT GAACTTAAAT TAAATGAAAC GATTATAAGT AGCAAGATGT TCATATATAG 11160CAAAAGAATC TATTATGATG GGAGAATTCT TCCTCAAGCT CTAAAAGCAT TATCTAGATG 11220TGTCTTCTGG TCAGAGACAG TAATAGACGA AACAAGATCA GCATCTTCAA ATTTGGCAAC 11280ATCATTTGCA AAAGCAATTG AGAATGGTTA TTCACCTGTT CTAGGATATG CATGCTCAAT 11340TTTTAAGAAT ATTCAACAAC TATATATTGC CCTTGGGATG AATATCAATC CAACTATAAC 11400ACAGAATATC AGAGATCAGT ATTTTAGGAA TCCAAATTGG ATGCAATATG CCTCTTTAAT 11460ACCTGCTAGT GTTGGGGGAT TCAATTACAT GGCCATGTCA AGATGTTTTG TAAGGAATAT 11520TGGTGATCCA TCAGTTGCCG CATTGGCTGA TATTAAAAGA TTTATTAAGG CGAATCTATT 11580AGACCGAAGT GTTCTTTATA GGATTATGAA TCAAGAACCA GGTGAGTCAT CTTTTTTGGA 11640CTGGGCTTCA GATCCATATT CATGCAATTT ACCACAATCT CAAAATATAA CCACCATGAT 11700AAAAAATATA ACAGCAAGGA ATGTATTACA AGATTCACCA AATCCATTAT TATCTGGATT 11760ATTCACAAAT ACAATGATAG AAGAAGATGA AGAATTAGCT GAGTTCCTGA TGGACAGGAA 11820GGTAATTCTC CCTAGAGTTG CACATGATAT TCTAGATAAT TCTCTCACAG GAATTAGAAA 11880TGCCATAGCT GGAATGTTAG ATACGACAAA ATCACTAATT CGGGTTGGCA TAAATAGAGG 11940AGGACTGACA TATAGTTTGT TGAGGAAAAT CAGTAATTAC GATCTAGTAC AATATGAAAC 12000ACTAAGTAGG ACTTTGCGAC TAATTGTAAG TGATAAAATC AAGTATGAAG ATATGTGTTC 12060GGTAGACCTT GCCATAGCAT TGCGACAAAA GATGTGGATT CATTTATCAG GAGGAAGGAT 12120GATAAGTGGA CTTGAAACGC CTGACCCATT AGAATTACTA TCTGGGGTAG TAATAACAGG 12180ATCAGAACAT TGTAAAATAT GTTATTCTTC AGATGGCACA AACCCATATA CTTGGATGTA 12240TTTACCCGGT AATATCAAAA TAGGATCAGC AGAAACAGGT ATATCGTCAT TAAGAGTTCC 12300TTATTTTGGA TCAGTCACTG ATGAAAGATC TGAAGCACAA TTAGGATATA TCAAGAATCT 12360TAGTAAACCT GCAAAAGCCG CAATAAGAAT AGCAATGATA TATACATGGG CATTTGGTAA 12420TGATGAGATA TCTTGGATGG AAGCCTCACA GATAGCACAA ACACGTGCAA ATTTTACACT 12480AGATAGTCTC AAAATTTTAA CACCGGTAGC TACATCAACA AATTTATCAC ACAGATTAAA 12540GGATACTGCA ACTCAGATGA AATTCTCCAG TACATCATTG ATCAGAGTCA GCAGATTCAT 12600AACAATGTCC AATGATAACA TGTCTATCAA AGAAGCTAAT GAAACCAAAG ATACTAATCT 12660TATTTATCAA CAAATAATGT TAACAGGATT AAGTGTTTTC GAATATTTAT TTAGATTAAA 12720AGAAACCACA GGACACAACC CTATAGTTAT GCATCTGCAC ATAGAAGATG AGTGTTGTAT 12780TAAAGAAAGT TTTAATGATG AACATATTAA TCCAGAGTCT ACATTAGAAT TAATTCGATA 12840TCCTGAAAGT AATGAATTTA TTTATGATAA AGACCCACTC AAAGATGTGG ACTTATCAAA 12900ACTTATGGTT ATTAAAGACC ATTCTTACAC AATTGATATG AATTATTGGG ATGATACTGA 12960CATCATACAT GCAATTTCAA TATGTACTGC AATTACAATA GCAGATACTA TGTCACAATT 13020AGATCGAGAT AATTTAAAAG AGATAATAGT TATTGCAAAT GATGATGATA TTAATAGCTT 13080AATCACTGAA TTTTTGACTC TTGACATACT TGTATTTCTC AAGACATTTG GTGGATTATT 13140AGTAAATCAA TTTGCATACA CTCTTTATAG TCTAAAAATA GAAGGTAGGG ATCTCATTTG 13200GGATTATATA ATGAGAACAC TGAGAGATAC TTCCCATTCA ATATTAAAAG TATTATCTAA 13260TGCATTATCT CATCCTAAAG TATTCAAGAG GTTCTGGGAT TGTGGAGTTT TAAACCCTAT 13320TTATGGTCCT AATACTGCTA GTCAAGACCA GATAAAACTT GCCCTATCTA TATGTGAATA 13380TTCACTAGAT CTATTTATGA GAGAATGGTT GAATGGTGTA TCACTTGAAA TATACATTTG 13440TGACAGCGAT ATGGAAGTTG CAAATGATAG GAAACAAGCC TTTATTTCTA GACACCTTTC 13500ATTTGTTTGT TGTTTAGCAG AAATTGCATC TTTCGGACCT AACCTGTTAA ACTTAACATA 13560CTTGGAGAGA CTTGATCTAT TGAAACAATA TCTTGAATTA AATATTAAAG AAGACCCTAC 13620TCTTAAATAT GTACAAATAT CTGGATTATT AATTAAATCG TTCCCATCAA CTGTAACATA 13680CGTAAGAAAG ACTGCAATCA AATATCTAAG GATTCGCGGT ATTAGTCCAC CTGAGGTAAT 13740TGATGATTGG GATCCGGTAG AAGATGAAAA TATGCTGGAT AACATTGTCA AAACTATAAA 13800TGATAACTGT AATAAAGATA ATAAAGGGAA TAAAATTAAC AATTTCTGGG GACTAGCACT 13860TAAGAACTAT CAAGTCCTTA AAATCAGATC TATAACAAGT GATTCTGATG ATAATGATAG 13920ACTAGATGCT AATACAAGTG GTTTGACACT TCCTCAAGGA GGGAATTATC TATCGCATCA 13980ATTGAGATTA TTCGGAATCA ACAGCACTAG TTGTCTGAAA GCTCTTGAGT TATCACAAAT 14040TTTAATGAAG GAAGTCAATA AAGACAAGGA CAGGCTCTTC CTGGGAGAAG GAGCAGGAGC 14100TATGCTAGCA TGTTATGATG CCACATTAGG ACCTGCAGTT AATTATTATA ATTCAGGTTT 14160GAATATAACA GATGTAATTG GTCAACGAGA ATTGAAAATA TTTCCTTCAG AGGTATCATT 14220AGTAGGTAAA AAATTAGGAA ATGTGACACA GATTCTTAAC AGGGTAAAAG TACTGTTCAA 14280TGGGAATCCT AATTCAACAT GGATAGGAAA TATGGAATGT GAGAGCTTAA TATGGAGTGA 14340ATTAAATGAT AAGTCCATTG GATTAGTACA TTGTGATATG GAAGGAGCTA TCGGTAAATC 14400AGAAGAAACT GTTCTACATG AACATTATAG TGTTATAAGA ATTACATACT TGATTGGGGA 14460TGATGATGTT GTTTTAGTTT CCAAAATTAT ACCTACAATC ACTCCGAATT GGTCTAGAAT 14520ACTTTATCTA TATAAATTAT ATTGGAAAGA TGTAAGTATA ATATCACTCA AAACTTCTAA 14580TCCTGCATCA ACAGAATTAT ATCTAATTTC GAAAGATGCA TATTGTACTA TAATGGAACC 14640TAGTGAAATT GTTTTATCAA AACTTAAAAG ATTGTCACTC TTGGAAGAAA ATAATCTATT 14700AAAATGGATC ATTTTATCAA AGAAGAGGAA TAATGAATGG TTACATCATG AAATCAAAGA 14760AGGAGAAAGA GATTATGGAA TCATGAGACC ATATCATATG GCACTACAAA TCTTTGGATT 14820TCAAATCAAT TTAAATCATC TGGCGAAAGA ATTTTTATCA ACCCCAGATC TGACTAATAT 14880CAACAATATA ATCCAAAGTT TTCAGCGAAC AATAAAGGAT GTTTTATTTG AATGGATTAA 14940TATAACTCAT GATGATAAGA GACATAAATT AGGCGGAAGA TATAACATAT TCCCACTGAA 15000AAATAAGGGA AAGTTAAGAC TGCTATCGAG AAGACTAGTA TTAAGTTGGA TTTCATTATC 15060ATTATCGACT CGATTACTTA CAGGTCGCTT TCCTGATGAA AAATTTGAAC ATAGAGCACA 15120GACTGGATAT GTATCATTAG CTGATACTGA TTTAGAATCA TTAAAGTTAT TGTCGAAAAA 15180CATCATTAAG AATTACAGAG AGTGTATAGG ATCAATATCA TATTGGTTTC TAACCAAAGA 15240AGTTAAAATA CTTATGAAAT TGATCGGTGG TGCTAAATTA TTAGGAATTC CCAGACAATA 15300TAAAGAACCC GAAGACCAGT TATTAGAAAA CTACAATCAA CATGATGAAT TTGATATCGA 15360TTAAAACATA AATACAATGA AGATATATCC TAACCTTTAT CTTTAAGCCT AGGAATAGAC 15420AAAAAGTAAG AAAAACATGT AATATATATA TACCAAACAG AGTTCTTCTC TTGTTTGGTG 15480GGTCGGCATG GCATCTCCAC CTCCTCGCGG TCCGGACCTG GGCATCCGAA GGAGGACGCA 15540CGTCCACTCG GATGGCTAAG GGAGAGCCTG CAGTAGCATA ACCCCTTGGG GCCTCTAAAC 15600GGGTCTTGAG GGGTTTTTTG CTGAAAGGAG GAACTATATA CGCGTCGACG GGCCCCGCGC 15660(2) 서열 15의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 15666 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 15:TAATACGACT CACTATAGGA CCAAACAAGA GAAGAAACTT GTCTGGGAAT ATAAATTTAA 60CTTTAAATTA ACTTAGGATT AAAGACATTG ACTAGAAGGT CAAGAAAAGG GAACTCTATA 120ATTTCAAAAA TGTTGAGCCT ATTTGATACA TTTAATGCAC GTAGGCAAGA AAACATAACA 180AAATCAGCCG GTGGAGCTAT CATTCCTGGA CAGAAAAATA CTGTCTCTAT ATTCGCCCTT 240GGACCGACAA TAACTGATGA TAATGAGAAA ATGACATTAG CTCTTCTATT TCTATCTCAT 300TCACTAGATA ATGAGAAACA ACATGCACAA AGGGCAGGGT TCTTGGTGTC TTTATTGTCA 360ATGGCTTATG CCAATCCAGA GCTCTACCTA ACAACAAATG GAAGTAATGC AGATGTCAAG 420TATGTCATAT ACATGATTGA GAAAGATCTA AAACGGCAAA AGTATGGAGG ATTTGTGGTT 480AAGACGAGAG AGATGATATA TGAAAAGACA ACTGATTGGA TATTTGGAAG TGACCTGGAT 540TATGATCAGG AAACTATGTT GCAGAACGGC AGGAACAATT CAACAATTGA AGACCTTGTC 600CACACATTTG GGTATCCATC ATGTTTAGGA GCTCTTATAA TACAGATCTG GATAGTTCTG 660GTCAAAGCTA TCACTAGTAT CTCAGGGTTA AGAAAAGGCT TTTTCACCCG ATTGGAAGCT 720TTCAGACAAG ATGGAACAGT GCAGGCAGGG CTGGTATTGA GCGGTGACAC AGTGGATCAG 780ATTGGGTCAA TCATGCGGTC TCAACAGAGC TTGGTAACTC TTATGGTTGA AACATTAATA 840ACAATGAATA CCAGCAGAAA TGACCTCACA ACCATAGAAA AGAATATACA AATTGTTGGC 900AACTACATAA GAGATGCAGG TCTCGCTTCA TTCTTCAATA CAATCAGATA TGGAATTGAG 960ACCAGAATGG CAGCTTTGAC TCTATCCACT CTCAGACCAG ATATCAATAG ATTAAAAGCT 1020TTGATGGAAC TGTATTTATC AAAGGGACCA CGCGCTCCTT TCATCTGTAT CCTCAGAGAT 1080CCTATACATG GTGAGTTCGC ACCAGGCAAC TATCCTGCCA TATGGAGCTA TGCAATGGGG 1140GTGGCAGTTG TACAAAATAG AGCCATGCAA CAGTATGTGA CGGGAAGATC ATATCTAGAC 1200ATTGATATGT TCCAGCTAGG ACAAGCAGTA GCACGTGATG CCGAAGCTCA AATGAGCTCA 1260ACACTGGAAG ATGAACTTGG AGTGACACAC GAATCTAAAG AAAGCTTGAA GAGACATATA 1320AGGAACATAA ACAGTTCAGA GACATCTTTC CACAAACCGA CAGGTGGATC AGCCATAGAG 1380ATGGCAATAG ATGAAGAGCC AGAACAATTC GAACATAGAG CAGATCAAGA ACAAAATGGA 1440GAACCTCAAT CATCCATAAT TCAATATGCC TGGGCAGAAG GAAATAGAAG CGATGATCAG 1500ACTGAGCAAG CTACAGAATC TGACAATATC AAGACCGAAC AACAAAACAT CAGAGACAGA 1560CTAAACAAGA GACTCAACGA CAAGAAGAAA CAAAGCAGTC AACCACCCAC TAATCCCACA 1620AACAGAACAA ACCAGGACGA AATAGATGAT CTGTTTAACG CATTTGGAAG CAACTAATCG 1680AATCAACATT TTAATCTAAA TCAATAATAA ATAAGAAAAA CTTAGGATTA AAGAATCCTA 1740TCATACCGGA ATATAGGGTG GTAAATTTAG AGTCTGCTTG AAACTCAATC AATAGAGAGT 1800TGATGGAAAG CGATGCTAAA AACTATCAAA TCATGGATTC TTGGGAAGAG GAATCAAGAG 1860ATAAATCAAC TAATATCTCC TCGGCCCTCA ACATCATTGA ATTCATACTC AGCACCGACC 1920CCCAAGAAGA CTTATCGGAA AACGACACAA TCAACACAAG AACCCAGCAA CTCAGTGCCA 1980CCATCTGTCA ACCAGAAATC AAACCAACAG AAACAAGTGA GAAAGATAGT GGATCAACTG 2040ACAAAAATAG ACAGTCTGGG TCATCACACG AATGTACAAC AGAAGCAAAA GATAGAAATA 2100TTGATCAGGA AACTGTACAG AGAGGACCTG GGAGAAGAAG CAGCTCAGAT AGTAGAGCTG 2160AGACTGTGGT CTCTGGAGGA ATCCCCAGAA GCATCACAGA TTCTAAAAAT GGAACCCAAA 2220ACACGGAGGA TATTGATCTC AATGAAATTA GAAAGATGGA TAAGGACTCT ATTGAGGGGA 2280AAATGCGACA ATCTGCAAAT GTTCCAAGCG AGATATCAGG AAGTGATGAC ATATTTACAA 2340CAGAACAAAG TAGAAACAGT GATCATGGAA GAAGCCTGGA ATCTATCAGT ACACCTGATA 2400CAAGATCAAT AAGTGTTGTT ACTGCTGCAA CACCAGATGA TGAAGAAGAA ATACTAATGA 2460AAAATAGTAG GACAAAGAAA AGTTCTTCAA CACATCAAGA AGATGACAAA AGAATTAAAA 2520AAGGGGGAAA AGGGAAAGAC TGGTTTAAGA AATCAAAAGA TACCGACAAC CAGATACCAA 2580CATCAGACTA CAGATCCACA TCAAAAGGGC AGAAGAAAAT CTCAAAGACA ACAACCACCA 2640ACACCGACAC AAAGGGGCAA ACAGAAATAC AGACAGAATC ATCAGAAACA CAATCCTCAT 2700CATGGAATCT CATCATCGAC AACAACACCG ACCGGAACGA ACAGACAAGC ACAACTCCTC 2760CAACAACAAC TTCCAGATCA ACTTATACAA AAGAATCGAT CCGAACAAAC TCTGAATCCA 2820AACCCAAGAC ACAAAAGACA AATGGAAAGG AAAGGAAGGA TACAGAAGAG AGCAATCGAT 2880TTACAGAGAG GGCAATTACT CTATTGCAGA ATCTTGGTGT AATTCAATCC ACATCAAAAC 2940TAGATTTATA TCAAGACAAA CGAGTTGTAT GTGTAGCAAA TGTACTAAAC AATGTAGATA 3000CTGCATCAAA GATAGATTTC CTGGCAGGAT TAGTCATAGG GGTTTCAATG GACAACGACA 3060CAAAATTAAC ACAGATACAA AATGAAATGC TAAACCTCAA AGCAGATCTA AAGAAAATGG 3120ACGAATCACA TAGAAGATTG ATAGAAAATC AAAGAGAACA ACTGTCATTG ATCACGTCAC 3180TAATTTCAAA TCTCAAAATT ATGACTGAGA GAGGAGGAAA GAAAGACCAA AATGAATCCA 3240ATGAGAGAGT ATCCATGATC AAAACAAAAT TGAAAGAAGA AAAGATCAAG AAGACCAGGT 3300TTGACCCACT TATGGAGGCACAAGGCATTG ACAAGAATAT ACCCGATCTA TATCGACATG 3360CAGGAGATAC ACTAGAGAAC GATGTACAAG TTAAATCAGA GATATTAAGT TCATACAATG 3420AGTCAAATGC AACAAGACTA ATACCCAAAA AAGTGAGCAG TACAATGAGA TCACTAGTTG 3480CAGTCATCAA CAACAGCAAT CTCTCACAAA GCACAAAACA ATCATACATA AACGAACTCA 3540AACGTTGCAA AAATGATGAA GAAGTATCTG AATTAATGGA CATGTTCAAT GAAGATGTCA 3600ACAATTGCCA ATGATCCAAC AAAGAAACGA CACCGAACAA ACAGACAAGA AACAACAGTA 3660GATCAAAACC TGTCAACACA CACAAAATCA AGCAGAATGA AACAACAGAT ATCAATCAAT 3720ATACAAATAA GAAAAACTTA GGATTAAAGA ATAAATTAAT CCTTGTCCAA AATGAGTATA 3780ACTAACTCTG CAATATACAC ATTCCCAGAA TCATCATTCT CTGAAAATGG TCATATAGAA 3840CCATTACCAC TCAAAGTCAA TGAACAGAGG AAAGCAGTAC CCCACATTAG AGTTGCCAAG 3900ATCGGAAATC CACCAAAACA CGGATCCCGG TATTTAGATG TCTTCTTACT CGGCTTCTTC 3960GAGATGGAAC GAATCAAAGA CAAATACGGG AGTGTGAATG ATCTCGACAG TGACCCGAGT 4020TACAAAGTTT GTGGCTCTGG ATCATTACCA ATCGGATTGG CTAAGTACAC TGGGAATGAC 4080CAGGAATTGT TACAAGCCGC AACCAAACTG GATATAGAAG TGAGAAGAAC AGTCAAAGCG 4140AAAGAGATGG TTGTTTACAC GGTACAAAAT ATAAAACCAG AACTGTACCC ATGGTCCAAT 4200AGACTAAGAA AAGGAATGCT GTTCGATGCC AACAAAGTTG CTCTTGCTCC TCAATGTCTT 4260CCACTAGATA GGAGCATAAA ATTTAGAGTA ATCTTCGTGA ATTGTACGGC AATTGGATCA 4320ATAACCTTGT TCAAAATTCC TAAGTCAATG GCATCACTAT CTCTACCCAA CACAATATCA 4380ATCAATCTGC AGGTACACAT AAAAACAGGG GTTCAGACTG ATTCTAAAGG GATAGTTCAA 4440ATTTTGGATG AGAAAGGCGA AAAATCACTG AATTTCATGG TCCATCTCGG ATTGATCAAA 4500AGAAAAGTAG GCAGAATGTA CTCTGTTGAA TACTGTAAAC AGAAAATCGA GAAAATGAGA 4560TTGATATTTT CTTTAGGACT AGTTGGAGGA ATCAGTCTTC ATGTCAATGC AACTGGGTCC 4620ATATCAAAAA CACTAGCAAG TCAGCTGGTA TTCAAAAGAG AGATTTGTTA TCCTTTAATG 4680GATCTAAATC CGCATCTCAA TCTAGTTATC TGGGCTTCAT CAGTAGAGAT TACAAGAGTG 4740GATGCAATTT TCCAACCTTC TTTACCTGGC GAGTTCAGAT ACTATCCTAA TATTATTGCA 4800AAAGGAGTTG GGAAAATCAA ACAATGGAAC TAGTAATCTC TATTTTAGTC CGGACGTATC 4860TATTAAGCCG AAGCAAATAA AGGATAATCA AAAACTTAGG ACAAAAGAGG TCAATACCAA 4920CAACTATTAG CAGTCACACT CGCAAGAATA AGAGAGAAGG GACCAAAAAA GTCAAATAGG 4980AGAAATCAAA ACAAAAGGTA CAGAACACCA GAACAACAAA ATCAAAACAT CCAACTCACT 5040CAAAACAAAA ATTCCAAAAG AGACCGGCAA CACAACAAGC ACTGAACACA ATGCCAACTT 5100CAATACTGCT AATTATTACA ACCATGATCA TGGCATCTTT CTGCCAAATA GATATCACAA 5160AACTACAGCA CGTAGGTGTA TTGGTCAACA GTCCCAAAGG GATGAAGATA TCACAAAACT 5220TTGAAACAAG ATATCTAATT TTGAGCCTCA TACCAAAAAT AGAAGACTCT AACTCTTGTG 5280GTGACCAACA GATCAAGCAA TACAAGAAGT TATTGGATAG ACTGATCATC CCTTTATATG 5340ATGGATTAAG ATTACAGAAA GATGTGATAG TAACCAATCA AGAATCCAAT GAAAACACTG 5400ATCCCAGAAC AAAACGATTC TTTGGAGGGG TAATTGGAAC CATTGCTCTG GGAGTAGCAA 5460CCTCAGCACA AATTACAGCG GCAGTTGCTC TGGTTGAAGC CAAGCAGGCA AGATCAGACA 5520TCGAAAAACT CAAAGAAGCA ATTAGGGACA CAAACAAAGC AGTGCAGTCA GTTCAGAGCT 5580CCATAGGAAA TTTAATAGTA GCAATTAAAT CAGTCCAGGA TTATGTTAAC AAAGAAATCG 5640TGCCATCGAT TGCGAGGCTA GGTTGTGAAG CAGCAGGACT TCAATTAGGA ATTGCATTAA 5700CACAGCATTA CTCAGAATTA ACAAACATAT TTGGTGATAA CATAGGATCG TTACAAGAAA 5760AAGGAATAAA ATTACAAGGT ATAGCATCAT TATACCGCAC AAATATCACA GAAATATTCA 5820CAACATCAAC AGTTGATAAA TATGATATCT ATGATCTGTT ATTTACAGAA TCAATAAAGG 5880TGAGAGTTAT AGATGTTGAC TTGAATGATT ACTCAATCAC CCTCCAAGTC AGACTCCCTT 5940TATTAACTAG GCTGCTGAAC ACTCAGATCT ACAAAGTAGA TTCCATATCA TATAACATCC 6000AAAACAGAGA ATGGTATATC CCTCTTCCCA GCCATATCAT GACGAAAGGG GCATTTCTAG 6060GTGGAGCAGA CGTCAAAGAA TGTATAGAAG CATTCAGCAG CTATATATGC CCTTCTGATC 6120CAGGATTTGT ATTAAACCAT GAAATAGAGA GCTGCTTATC AGGAAACATA TCCCAATGTC 6180CAAGAACAAC GGTCACATCA GACATTGTTC CAAGATATGC ATTTGTCAAT GGAGGAGTGG 6240TTGCAAACTG TATAACAACC ACCTGTACAT GCAACGGAAT TGGTAATAGA ATCAATCAAC 6300CACCTGATCA AGGAGTAAAA ATTATAACAC ATAAAGAATG TAGTACAATA GGTATCAACG 6360GAATGCTGTT CAATACAAAT AAAGAAGGAA CTCTTGCATT CTATACACCA AATGATATAA 6420CACTAAACAA TTCTGTTGCA CTTGATCCAA TTGACATATC AATCGAGCTC AACAAGGCCA 6480AATCAGATCT AGAAGAATCA AAAGAATGGA TAAGAAGGTC AAATCAAAAA CTAGATTCTA 6540TTGGAAATTG GCATCAATCT AGCACTACAA TCATAATTAT TTTGATAATG ATCATTATAT 6600TGTTTATAAT TAATATAACG ATAATTACAA TTGCAATTAA GTATTACAGA ATTCAAAAGA 6660GAAATCGAGT GGATCAAAAT GACAAGCCAT ATGTACTAAC AAACAAATAA CATATCTACA 6720GATCATTAGA TATTAAAATT ATAAAAAACT TAGGAGTAAA GTTACGCAAT CCAACTCTAC 6780TCATATAATT GAGGAAGGAC CCAATAGACA AATCCAAATT CGAGATGGAA TACTGGAAGC 6840ATACCAATCA CGGAAAGGAT GCTGGTAATG AGCTGGAGAC GTCTATGGCT ACTCATGGCA 6900ACAAGCTCAC TAATAAGATA ATATACATAT TATGGACAAT AATCCTGGTG TTATTATCAA 6960TAGTCTTCAT CATAGTGCTA ATTAATTCCA TCAAAAGTGA AAAGGCCCAC GAATCATTGC 7020TGCAAGACAT AAATAATGAG TTTATGGAAA TTACAGAAAA GATCCAAATG GCATCGGATA 7080ATACCAATGA TCTAATACAG TCAGGAGTGA ATACAAGGCT TCTTACAATT CAGAGTCATG 7140TCCAGAATTA CATACCAATA TCATTGACAC AACAGATGTC AGATCTTAGG AAATTCATTA 7200GTGAAATTAC AATTAGAAAT GATAATCAAG AAGTGCTGCC ACAAAGAATA ACACATGATG 7260TAGGTATAAA ACCTTTAAAT CCAGATGATT TTTGGAGATG CACGTCTGGT CTTCCATCTT 7320TAATGAAAAC TCCAAAAATA AGGTTAATGC CAGGGCCGGG ATTATTAGCT ATGCCAACGA 7380CTGTTGATGG CTGTGTTAGA ACTCCGTCTT TAGTTATAAA TGATCTGATT TATGCTTATA 7440CCTCAAATCT AATTACTCGA GGTTGTCAGG ATATAGGAAA ATCATATCAA GTCTTACAGA 7500TAGGGATAAT AACTGTAAAC TCAGACTTGG TACCTGACTT AAATCCTAGG ATCTCTCATA 7560CCTTTAACAT AAATGACAAT AGGAAGTCAT GTTCTCTAGC ACTCCTAAAT ATAGATGTAT 7620ATCAACTGTG TTCAACTCCC AAAGTTGATG AAAGATCAGA TTATGCATCA TCAGGCATAG 7680AAGATATTGT ACTTGATATT GTCAATTATG ATGGTTCAAT CTCAACAACA AGATTTAAGA 7740ATAATAACAT AAGCTTTGAT CAACCATATG CTGCACTATA CCCATCTGTT GGACCAGGGA 7800TATACTACAA AGGCAAAATA ATATTTCTCG GGTATGGAGG TCTTGAACAT CCAATAAATG 7860AGAATGTAAT CTGCAACACA ACTGGGTGCC CCGGGAAAAC ACAGAGAGAC TGTAATCAAG 7920CATCTCATAG TACTTGGTTT TCAGATAGGA GGATGGTCAA CTCCATCATT GTTGTTGACA 7980AAGGCTTAAA CTCAATTCCA AAATTGAAAG TATGGACGAT ATCTATGCGA CAAAATTACT 8040GGGGGTCAGA AGGAAGGTTA CTTCTACTAG GTAACAAGAT CTATATATAT ACAAGATCTA 8100CAAGTTGGCA TAGCAAGTTA CAATTAGGAA TAATTGATAT TACTGATTAC AGTGATATAA 8160GGATAAAATG GACATGGCAT AATGTGCTAT CAAGACCAGG AAACAATGAA TGTCCATGGG 8220GACATTCATG TCCAGATGGA TGTATAACAG GAGTATATAC TGATGCATAT CCACTCAATC 8280CCACAGGGAG CATTGTGTCA TCTGTCATAT TAGACTCACA AAAATCGAGA GTGAACCCAG 8340TCATAACTTA CTCAACAGCA ACCGAAAGAG TAAACGAGCT GGCCATCCTA AACAGAACAC 8400TCTCAGCTGG ATATACAACA ACAAGCTGCA TTACACACTA TAACAAAGGA TATTGTTTTC 8460ATATAGTAGA AATAAATCAT AAAAGCTTAA ACACATTTCA ACCCATGTTG TTCAAAACAG 8520AGATTCCAAA AAGCTGCAGT TAATCATAAT TAACCATAAT ATGCATCAAT CTATCTATAA 8580TACAAGTATA TGATAAGTAA TCAGCAATCA GACAATAGAC AAAAGGGAAA TATAAAAAAC 8640TTAGGAGCAA AGCGTGCTCG GGAAATGGAC ACTGAATCTA ACAATGGCAC TGTATCTGAC 8700ATACTCTATC CTGAGTGTCA CCTTAACTCT CCTATCGTTA AAGGTAAAAT AGCACAATTA 8760CACACTATTA TGAGTCTACC TCAGCCTTAT GATATGGATG ACGACTCAAT ACTAGTTATC 8820ACTAGACAGA AAATAAAACT TAATAAATTG GATAAAAGAC AACGATCTAT TAGAAGATTA 8880AAATTAATAT TAACTGAAAA AGTGAATGAC TTAGGAAAAT ACACATTTAT CAGATATCCA 8940GAAATGTCAA AAGAAATGTT CAAATTATAT ATACCTGGTA TTAACAGTAA AGTGACTGAA 9000TTATTACTTA AAGCAGATAG AACATATAGT CAAATGACTG ATGGATTAAG AGATCTATGG 9060ATTAATGTGC TATCAAAATT AGCCTCAAAA AATGATGGAA GCAATTATGA TCTTAATGAA 9120GAAATTAATA ATATATCGAA AGTTCACACA ACCTATAAAT CAGATAAATG GTATAATCCA 9180TTCAAAACAT GGTTTACTAT CAAGTATGAT ATGAGAAGAT TACAAAAAGC TCGAAATGAG 9240ATCACTTTTA ATGTTGGGAA GGATTATAAC TTGTTAGAAG ACCAGAAGAA TTTCTTATTG 9300ATACATCCAG AATTGGTTTT GATATTAGAT AAACAAAACT ATAATGGTTA TCTAATTACT 9360CCTGAATTAG TATTGATGTA TTGTGACGTA GTCGAAGGCC GATGGAATAT AAGTGCATGT 9420GCTAAGTTAG ATCCAAAATT ACAATCTATG TATCAGAAAG GTAATAACCT GTGGGAAGTG 9480ATAGATAAAT TGTTTCCAAT TATGGGAGAA AAGACATTTG ATGTGATATC GTTATTAGAA 9540CCACTTGCAT TATCCTTAAT TCAAACTCAT GATCCTGTTA AACAACTAAG AGGAGCTTTT 9600TTAAATCATG TGTTATCCGA GATGGAATTA ATATTTGAAT CTAGAGAATC GATTAAGGAA 9660TTTCTGAGTG TAGATTACAT TGATAAAATT TTAGATATAT TTAATAAGTC TACAATAGAT 9720GAAATAGCAG AGATTTTCTC TTTTTTTAGA ACATTTGGGC ATCCTCCATT AGAAGCTAGT 9780ATTGCAGCAG AAAAGGTTAG AAAATATATG TATATTGGAA AACAATTAAA ATTTGACACT 9840ATTAATAAAT GTCATGCTAT CTTCTGTACA ATAATAATTA ACGGATATAG AGAGAGGCAT 9900GGTGGACAGT GGCCTCCTGT GACATTACCT GATCATGCAC ACGAATTCAT CATAAATGCT 9960TACGGTTCAA ACTCTGCGAT ATCATATGAA AATGCTGTTG ATTATTACCA GAGCTTTATA 10020GGAATAAAAT TCAATAAATT CATAGAGCCT CAGTTAGATG AGGATTTGAC AATTTATATG 10080AAAGATAAAG CATTATCTCC AAAAAAATCA AATTGGGACA CAGTTTATCC TGCATCTAAT 10140TTACTGTACC GTACTAACGC ATCCAACGAA TCACGAAGAT TAGTTGAAGT ATTTATAGCA 10200GATAGTAAAT TTGATCCTCA TCAGATATTG GATTATGTAG AATCTGGGGA CTGGTTAGAT 10260GATCCAGAAT TTAATATTTC TTATAGTCTT AAAGAAAAAG AGATCAAACA GGAAGGTAGA 10320CTCTTTGCAA AAATGACATA CAAAATGAGA GCTACACAAG TTTTATCAGA GACCCTACTT 10380GCAAATAACA TAGGAAAATT CTTTCAAGAA AATGGGATGG TGAAGGGAGA GATTGAATTA 10440CTTAAGAGAT TAACAACCAT ATCAATATCA GGAGTTCCAC GGTATAATGA AGTGTACAAT 10500AATTCTAAAA GCCATACAGA TGACCTTAAA ACCTACAATA AAATAAGTAA TCTTAATTTG 10560TCTTCTAATC AGAAATCAAA GAAATTTGAA TTCAAGTCAA CGGATATCTA CAATGATGGA 10620TACGAGACTG TGAGCTGTTT CCTAACAACA GATCTCAAAA AATACTGTCT TAATTGGAGA 10680TATGAATCAA CAGCTCTATT TGGAGAAACT TGCAACCAAA TATTTGGATT AAATAAATTG 10740TTTAATTGGT TACACCCTCG TCTTGAAGGA AGTACAATCT ATGTAGGTGA TCCTTACTGT 10800CCTCCATCAG ATAAAGAACA TATATCATTA GAGGATCACC CTGATTCTGG TTTTTACGTT 10860CATAACCCAA GAGGGGGTAT AGAAGGATTT TGTCAAAAAT TATGGACACT CATATCTATA 10920AGTGCAATAC ATCTAGCAGC TGTTAGAATA GGCGTGAGGG TGACTGCAAT GGTTCAAGGA 10980GACAATCAAG CTATAGCTGT AACCACAAGA GTACCCAACA ATTATGACTA CAGAGTTAAG 11040AAGGAGATAG TTTATAAAGA TGTAGTGAGA TTTTTTGATT CATTAAGAGA AGTGATGGAT 11100GATCTAGGTC ATGAACTTAA ATTAAATGAA ACGATTATAA GTAGCAAGAT GTTCATATAT 11160AGCAAAAGAA TCTATTATGA TGGGAGAATT CTTCCTCAAG CTCTAAAAGC ATTATCTAGA 11220TGTGTCTTCT GGTCAGAGAC AGTAATAGAC GAAACAAGAT CAGCATCTTC AAATTTGGCA 11280ACATCATTTG CAAAAGCAAT TGAGAATGGT TATTCACCTG TTCTAGGATA TGCATGCTCA 11340ATTTTTAAGA ATATTCAACA ACTATATATT GCCCTTGGGA TGAATATCAA TCCAACTATA 11400ACACAGAATA TCAGAGATCA GTATTTTAGG AATCCAAATT GGATGCAATA TGCCTCTTTA 11460ATACCTGCTA GTGTTGGGGG ATTCAATTAC ATGGCCATGT CAAGATGTTT TGTAAGGAAT 11520ATTGGTGATC CATCAGTTGC CGCATTGGCT GATATTAAAA GATTTATTAA GGCGAATCTA 11580TTAGACCGAA GTGTTCTTTA TAGGATTATG AATCAAGAAC CAGGTGAGTC ATCTTTTTTG 11640GACTGGGCTT CAGATCCATA TTCATGCAAT TTACCACAAT CTCAAAATAT AACCACCATG 11700ATAAAAAATA TAACAGCAAG GAATGTATTA CAAGATTCAC CAAATCCATT ATTATCTGGA 11760TTATTCACAA ATACAATGAT AGAAGAAGAT GAAGAATTAG CTGAGTTCCT GATGGACAGG 11820AAGGTAATTC TCCCTAGAGT TGCACATGAT ATTCTAGATA ATTCTCTCAC AGGAATTAGA 11880AATGCCATAG CTGGAATGTT AGATACGACA AAATCACTAA TTCGGGTTGG CATAAATAGA 11940GGAGGACTGA CATATAGTTT GTTGAGGAAA ATCAGTAATT ACGATCTAGT ACAATATGAA 12000ACACTAAGTA GGACTTTGCG ACTAATTGTA AGTGATAAAA TCAAGTATGA AGATATGTGT 12060TCGGTAGACC TTGCCATAGC ATTGCGACAA AAGATGTGGA TTCATTTATC AGGAGGAAGG 12120ATGATAAGTG GACTTGAAAC GCCTGACCCA TTAGAATTAC TATCTGGGGT AGTAATAACA 12180GGATCAGAAC ATTGTAAAAT ATGTTATTCT TCAGATGGCA CAAACCCATA TACTTGGATG 12240TATTTACCCG GTAATATCAA AATAGGATCA GCAGAAACAG GTATATCGTC ATTAAGAGTT 12300CCTTATTTTG GATCAGTCAC TGATGAAAGA TCTGAAGCAC AATTAGGATA TATCAAGAAT 12360CTTAGTAAAC CTGCAAAAGC CGCAATAAGA ATAGCAATGA TATATACATG GGCATTTGGT 12420AATGATGAGA TATCTTGGAT GGAAGCCTCA CAGATAGCAC AAACACGTGC AAATTTTACA 12480CTAGATAGTC TCAAAATTTT AACACCGGTA GCTACATCAA CAAATTTATC ACACAGATTA 12540AAGGATACTG CAACTCAGAT GAAATTCTCC AGTACATCAT TGATCAGAGT CAGCAGATTC 12600ATAACAATGT CCAATGATAA CATGTCTATC AAAGAAGCTA ATGAAACCAA AGATACTAAT 12660CTTATTTATC AACAAATAAT GTTAACAGGA TTAAGTGTTT TCGAATATTT ATTTAGATTA 12720AAAGAAACCA CAGGACACAA CCCTATAGTT ATGCATCTGC ACATAGAAGA TGAGTGTTGT 12780ATTAAAGAAA GTTTTAATGA TGAACATATT AATCCAGAGT CTACATTAGA ATTAATTCGA 12840TATCCTGAAA GTAATGAATT TATTTATGAT AAAGACCCAC TCAAAGATGT GGACTTATCA 12900AAACTTATGG TTATTAAAGA CCATTCTTAC ACAATTGATA TGAATTATTG GGATGATACT 12960GACATCATAC ATGCAATTTC AATATGTACT GCAATTACAA TAGCAGATAC TATGTCACAA 13020TTAGATCGAG ATAATTTAAA AGAGATAATA GTTATTGCAA ATGATGATGA TATTAATAGC 13080TTAATCACTG AATTTTTGAC TCTTGACATA CTTGTATTTC TCAAGACATT TGGTGGATTA 13140TTAGTAAATC AATTTGCATA CACTCTTTAT AGTCTAAAAA TAGAAGGTAG GGATCTCATT 13200TGGGATTATA TAATGAGAAC ACTGAGAGAT ACTTCCCATT CAATATTAAA AGTATTATCT 13260AATGCATTAT CTCATCCTAA AGTATTCAAG AGGTTCTGGG ATTGTGGAGT TTTAAACCCT 13320ATTTATGGTC CTAATACTGC TAGTCAAGAC CAGATAAAAC TTGCCCTATC TATATGTGAA 13380TATTCACTAG ATCTATTTAT GAGAGAATGG TTGAATGGTG TATCACTTGA AATATACATT 13440TGTGACAGCG ATATGGAAGT TGCAAATGAT AGGAAACAAG CCTTTATTTC TAGACACCTT 13500TCATTTGTTT GTTGTTTAGC AGAAATTGCA TCTTTCGGAC CTAACCTGTT AAACTTAACA 13560TACTTGGAGA GACTTGATCT ATTGAAACAA TATCTTGAAT TAAATATTAA AGAAGACCCT 13620ACTCTTAAAT ATGTACAAAT ATCTGGATTA TTAATTAAAT CGTTCCCATC AACTGTAACA 13680TACGTAAGAA AGACTGCAAT CAAATATCTA AGGATTCGCG GTATTAGTCC ACCTGAGGTA 13740ATTGATGATT GGGATCCGGT AGAAGATGAA AATATGCTGG ATAACATTGT CAAAACTATA 13800AATGATAACT GTAATAAAGA TAATAAAGGG AATAAAATTA ACAATTTCTG GGGACTAGCA 13860CTTAAGAACT ATCAAGTCCT TAAAATCAGA TCTATAACAA GTGATTCTGA TGATAATGAT 13920AGACTAGATG CTAATACAAG TGGTTTGACA CTTCCTCAAG GAGGGAATTA TCTATCGCAT 13980CAATTGAGAT TATTCGGAAT CAACAGCACT AGTTGTCTGA AAGCTCTTGA GTTATCACAA 14040ATTTTAATGA AGGAAGTCAA TAAAGACAAG GACAGGCTCT TCCTGGGAGA AGGAGCAGGA 14100GCTATGCTAG CATGTTATGA TGCCACATTA GGACCTGCAG TTAATTATTA TAATTCAGGT 14160TTGAATATAA CAGATGTAAT TGGTCAACGA GAATTGAAAA TATTTCCTTC AGAGGTATCA 14220TTAGTAGGTA AAAAATTAGG AAATGTGACA CAGATTCTTA ACAGGGTAAA AGTACTGTTC 14280AATGGGAATC CTAATTCAAC ATGGATAGGA AATATGGAAT GTGAGAGCTT AATATGGAGT 14340GAATTAAATG ATAAGTCCAT TGGATTAGTA CATTGTGATA TGGAAGGAGC TATCGGTAAA 14400TCAGAAGAAA CTGTTCTACA TGAACATTAT AGTGTTATAA GAATTACATA CTTGATTGGG 14460GATGATGATG TTGTTTTAGT TTCCAAAATT ATACCTACAA TCACTCCGAA TTGGTCTAGA 14520ATACTTTATC TATATAAATT ATATTGGAAA GATGTAAGTA TAATATCACT CAAAACTTCT 14580AATCCTGCAT CAACAGAATT ATATCTAATT TCGAAAGATG CATATTGTAC TATAATGGAA 14640CCTAGTGAAA TTGTTTTATC AAAACTTAAA AGATTGTCAC TCTTGGAAGA AAATAATCTA 14700TTAAAATGGA TCATTTTATC AAAGAAGAGG AATAATGAAT GGTTACATCA TGAAATCAAA 14760GAAGGAGAAA GAGATTATGG AATCATGAGA CCATATCATA TGGCACTACA AATCTTTGGA 14820TTTCAAATCA ATTTAAATCA TCTGGCGAAA GAATTTTTAT CAACCCCAGA TCTGACTAAT 14880ATCAACAATA TAATCCAAAG TTTTCAGCGA ACAATAAAGG ATGTTTTATT TGAATGGATT 14940AATATAACTC ATGATGATAA GAGACATAAA TTAGGCGGAA GATATAACAT ATTCCCACTG 15000AAAAATAAGG GAAAGTTAAG ACTGCTATCG AGAAGACTAG TATTAAGTTG GATTTCATTA 15060TCATTATCGA CTCGATTACT TACAGGTCGC TTTCCTGATG AAAAATTTGA ACATAGAGCA 15120CAGACTGGAT ATGTATCATT AGCTGATACT GATTTAGAAT CATTAAAGTT ATTGTCGAAA 15180AACATCATTA AGAATTACAG AGAGTGTATA GGATCAATAT CATATTGGTT TCTAACCAAA 15240GAAGTTAAAA TACTTATGAA ATTGATCGGT GGTGCTAAAT TATTAGGAAT TCCCAGACAA 15300TATAAAGAAC CCGAAGACCA GTTATTAGAA AACTACAATC AACATGATGA ATTTGATATC 15360GATTAAAACA TAAATACAAT GAAGATATAT CCTAACCTTT ATCTTTAAGC CTAGGAATAG 15420ACAAAAAGTA AGAAAAACAT GTAATATATA TATACCAAAC AGAGTTCTTC TCTTGTTTGG 15480TGGGTCGGCA TGGCATCTCC ACCTCCTCGC GGTCCGGACC TGGGCATCCG AAGGAGGACG 15540CACGTCCACT CGGATGGCTA AGGGAGAGCC TGCAGTAGCA TAACCCCTTG GGGCCTCTAA 15600ACGGGTCTTG AGGGGTTTTT TGCTGAAAGG AGGAACTATA TACGCGTCGA CGGGCCCCGC 15660GCTCAC 15666(2) 서열 16의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 28 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 16:GGATTTGCGC GCAATTTAAA TCATCTGG 28(2) 서열 17의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 70 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 17:CCCAGGTCGG ACCGCGAGGA GGTGGAGATG CCATGCCAGC CCACCAAAAC AAGAGAAGAA 60CTCTGTTTGG 70(2) 서열 18의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 45 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 18:GGCCCGTCGA CGCGTAATAC GACTCACTAT AGGACCAAAC AAGAG 45(2) 서열 19의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 16 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 19:CGGCATCACG TGCTAC 16(2) 서열 20의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 6843 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 20:ATGTTGAGCC TATTTGATAC ATTTAATGCA CGTAGGCAAG AAAACATAAC AAAATCAGCC 60GGTGGAGCTA TCATTCCTGG ACAGAAAAAT ACTGTCTCTA TATTCGCCCT TGGACCGACA 120ATAACTGATG ATAATGAGAA AATGACATTA GCTCTTCTAT TTCTATCTCA TTCACTAGAT 180AATGAGAAAC AACATGCACA AAGGGCAGGG TTCTTGGTGT CTTTATTGTC AATGGCTTAT 240GCCAATCCAG AGCTCTACCT AACAACAAAT GGAAGTAATG CAGATGTCAA GTATGTCATA 300TACATGATTG AGAAAGATCT AAAACGGCAA AAGTATGGAG GATTTGTGGT TAAGACGAGA 360GAGATGATAT ATGAAAAGAC AACTGATTGG ATATTTGGAA GTGACCTGGA TTATGATCAG 420GAAACTATGT TGCAGAACGG CAGGAACAAT TCAACAATTG AAGACCTTGT CCACACATTT 480GGGTATCCAT CATGTTTAGG AGCTCTTATA ATACAGATCT GGATAGTTCT GGTCAAAGCT 540ATCACTAGTA TCTCAGGGTT AAGAAAAGGC TTTTTCACCC GATTGGAAGC TTTCAGACAA 600GATGGAACAG TGCAGGCAGG GCTGGTATTG AGCGGTGACA CAGTGGATCA GATTGGGTCA 660ATCATGCGGT CTCAACAGAG CTTGGTAACT CTTATGGTTG AAACATTAAT AACAATGAAT 720ACCAGCAGAA ATGACCTCAC AACCATAGAA AAGAATATAC AAATTGTTGG CAACTACATA 780AGAGATGCAG GTCTCGCTTC ATTCTTCAAT ACAATCAGAT ATGGAATTGA GACCAGAATG 840GCAGCTTTGA CTCTATCCAC TCTCAGACCA GATATCAATA GATTAAAAGC TTTGATGGAA 900CTGTATTTAT CAAAGGGACC ACGCGCTCCT TTCATCTGTA TCCTCAGAGA TCCTATACAT 960GGTGAGTTCG CACCAGGCAA CTATCCTGCC ATATGGAGCT ATGCAATGGG GGTGGCAGTT 1020GTACAAAATA GAGCCATGCA ACAGTATGTG ACGGGAAGAT CATATCTAGA CATTGATATG 1080TTCCAGCTAG GACAAGCAGT AGCACGTGAT GCCGAAGCTC AAATGAGCTC AACACTGGAA 1140GATGAACTTG GAGTGACACA CGAATCTAAA GAAAGCTTGA AGAGACATAT AAGGAACATA 1200AACAGTTCAG AGACATCTTT CCACAAACCG ACAGGTGGAT CAGCCATAGA GATGGCAATA 1260GATGAAGAGC CAGAACAATT CGAACATAGA GCAGATCAAG AACAAAATGG AGAACCTCAA 1320TCATCCATAA TTCAATATGC CTGGGCAGAA GGAAATAGAA GCGATGATCA GACTGAGCAA 1380GCTACAGAAT CTGACAATAT CAAGACCGAA CAACAAAACA TCAGAGACAG ACTAAACAAG 1440AGACTCAACG ACAAGAAGAA ACAAAGCAGT CAACCACCCA CTAATCCCAC AAACAGAACA 1500AACCAGGACG AAATAGATGA TCTGTTTAAC GCATTTGGAA GCAACTAAGT CGACGATCCG 1560GCTGCTAACA AAGCCCGAAA GGAAGCTGAG TTGGCTGCTG CCACCGCTGA GCAATAACTA 1620GCATAACCCC TTGGGGCCTC TAAACGGGTC TTGAGGGGTT TTTTGCTGAA AGGAGGAACT 1680ATATCCGGAT CGAGATCAAT TCTGTGAGCG TATGGCAAAC GAAGGAAAAA TAGTTATAGT 1740AGCCGCACTC GATGGGACAT TTCAACGTAA ACCGTTTAAT AATATTTTGA ATCTTATTCC 1800ATTATCTGAA ATGGTGGTAA AACTAACTGC TGTGTGTATG AAATGCTTTA AGGAGGCTTC 1860CTTTTCTAAA CGATTGGGTG AGGAAACCGA GATAGAAATA ATAGGAGGTA ATGATATGTA 1920TCAATCGGTG TGTAGAAAGT GTTACATCGA CTCATAATAT TATATTTTTT ATCTAAAAAA 1980CTAAAAATAA ACATTGATTA AATTTTAATA TAATACTTAA AAATGGATGT TGTGTCGTTA 2040GATAAACCGT TTATGTATTT TGAGGAAATT GATAATGAGT TAGATTACGA ACCAGAAAGT 2100GCAAATGAGG TCGCAAAAAA ACTGCCGTAT CAAGGACAGT TAAAACTATT ACTAGGAGAA 2160TTATTTTTTC TTAGTAAGTT ACAGCGACAC GGTATATTAG ATGGTGCCAC CGTAGTGTAT 2220ATAGGATCTG CTCCCGGTAC ACATATACGT TATTTGAGAG ATCATTTCTA TAATTTAGGA 2280GTGATCATCA AATGGATGCT AATTGACGGC CGCCATCATG ATCCTATTTT AAATGGATTG 2340CGTGATGTGA CTCTAGTGAC TCGGTTCGTT GATGAGGAAT ATCTACGATC CATCAAAAAA 2400CAACTGCATC CTTCTAAGAT TATTTTAATT TCTGATGTGA GATCCAAACG AGGAGGAAAT 2460GAACCTAGTA CGGCGGATTT ACTAAGTAAT TACGCTCTAC AAAATGTCAT GATTAGTATT 2520TTAAACCCCG TGGCGTCTAG TCTTAAATGG AGATGCCCGT TTCCAGATCA ATGGATCAAG 2580GACTTTTATA TCCCACACGG TAATAAAATG TTACAACCTT TTGCTCCTTC ATATTCAGGG 2640CCGTCGTTTT ACAACGTCGT GACTGGGAAA ACCCTGGCGT TACCCAACTT AATCGCCTTG 2700CAGCACATCC CCCTTTCGCC AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA GGCCCGCACC GATCGCCCTT 2760CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGCGCGACGC GCCCTGTAGC GGCGCATTAA 2820GCGCGGCGGG TGTGGTGGTT ACGCGCAGCG TGACCGCTAC ACTTGCCAGC GCCCTAGCGC 2880CCGCTCCTTT CGCTTTCTTC CCTTCCTTTC TCGCCACGTT CGCCGGCTTT CCCCGTCAAG 2940CTCTAAATCG GGGGCTCCCT TTAGGGTTCC GATTTAGTGC TTTACGGCAC CTCGACCCCA 3000AAAAACTTGA TTAGGGTGAT GGTTCACGTA GTGGGCCATC GCCCTGATAG ACGGTTTTTC 3060GCCCTTTGAC GTTGGAGTCC ACGTTCTTTA ATAGTGGACT CTTGTTCCAA ACTGGAACAA 3120CACTCAACCC TATCTCGGTC TATTCTTTTG ATTTATAAGG GATTTTGCCG ATTTCGGCCT 3180ATTGGTTAAA AAATGAGCTG ATTTAACAAA AATTTAACGC GAATTTTAAC AAAATATTAA 3240CGTTTACAAT TTCCCAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG CGCGGAACCC CTATTTGTTT 3300ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA CAATAACCCT GATAAATGCT 3360TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTATGAG TATTCAACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC 3420CTTTTTTGCG GCATTTTGCC TTCCTGTTTT TGCTCACCCA GAAACGCTGG TGAAAGTAAA 3480AGATGCTGAA GATCAGTTGG GTGCACGAGT GGGTTACATC GAACTGGATC TCAACAGCGG 3540TAAGATCCTT GAGAGTTTTC GCCCCGAAGA ACGTTTTCCA ATGATGAGCA CTTTTAAAGT 3600TCTGCTATGT GGCGCGGTAT TATCCCGTAT TGACGCCGGG CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG 3660CATACACTAT TCTCAGAATG ACTTGGTTGA GTACTCACCA GTCACAGAAA AGCATCTTAC 3720GGATGGCATG ACAGTAAGAG AATTATGCAG TGCTGCCATA ACCATGAGTG ATAACACTGC 3780GGCCAACTTA CTTCTGACAA CGATCGGAGG ACCGAAGGAG CTAACCGCTT TTTTGCACAA 3840CATGGGGGAT CATGTAACTC GCCTTGATCG TTGGGAACCG GAGCTGAATG AAGCCATACC 3900AAACGACGAG CGTGACACCA CGATGCCTGT AGCAATGGCA ACAACGTTGC GCAAACTATT 3960AACTGGCGAA CTACTTACTC TAGCTTCCCG GCAACAATTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA 4020TAAAGTTGCA GGACCACTTC TGCGCTCGGC CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCTGATAA 4080ATCTGGAGCC GGTGAGCGTG GGTCTCGCGG TATCATTGCA GCACTGGGGC CAGATGGTAA 4140GCCCTCCCGT ATCGTAGTTA TCTACACGAC GGGGAGTCAG GCAACTATGG ATGAACGAAA 4200TAGACAGATC GCTGAGATAG GTGCCTCACT GATTAAGCAT TGGTAACTGT CAGACCAAGT 4260TTACTCATAT ATACTTTAGA TTGATTTAAA ACTTCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT 4320GAAGATCCTT TTTGATAATC TCATGACCAA AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG 4380AGCGTCAGAC CCCGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT 4440AATCTGCTGC TTGCAAACAA AAAAACCACC GCTACCAGCG GTGGTTTGTT TGCCGGATCA 4500AGAGCTACCA ACTCTTTTTC CGAAGGTAAC TGGCTTCAGC AGAGCGCAGA TACCAAATAC 4560TGTCCTTCTA GTGTAGCCGT AGTTAGGCCA CCACTTCAAG AACTCTGTAG CACCGCCTAC 4620ATACCTCGCT CTGCTAATCC TGTTACCAGT GGCTGCTGCC AGTGGCGATA AGTCGTGTCT 4680TACCGGGTTG GACTCAAGAC GATAGTTACC GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG 4740GGGTTCGTGC ACACAGCCCA GCTTGGAGCG AACGACCTAC ACCGAACTGA GATACCTACA 4800GCGTGAGCTA TGAGAAAGCG CCACGCTTCC CGAAGGGAGA AAGGCGGACA GGTATCCGGT 4860AAGCGGCAGG GTCGGAACAG GAGAGCGCAC GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA 4920TCTTTATAGT CCTGTCGGGT TTCGCCACCT CTGACTTGAG CGTCGATTTT TGTGATGCTC 4980GTCAGGGGGG CGGAGCCTAT GGAAAAACGC CAGCAACGCG GCCTTTTTAC GGTTCCTGGC 5040CTTTTGCTGG CCTTTTGCTC ACATGTTCTT TCCTGCGTTA TCCCCTGATT CTGTGGATAA 5100CCGTATTACC GCCTTTGAGT GAGCTGATAC CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGAGCGCAG 5160CGAGTCAGTG AGCGAGGAAG CGGAAGAGCG CCCAATACGC AAACCGCCTC TCCCCGCGCG 5220TTGGCCGATT CATTAATGCA GCTGGCACGA CAGGTTTCCC GACTGGAAAG CGGGCAGTGA 5280GCGCAACGCA ATTAATGTGA GTTAGCTCAC TCATTAGGCA CCCCAGGCTT TACACTTTAT 5340GCTTCCGGCT CGTATGTTGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGAAACAG 5400CTATGACCAT GATTACGCCA AGCTTTTGCG ATCAATAAAT GGATCACAAC CAGTATCTCT 5460TAACGATGTT CTTCGCAGAT GATGATTCAT TTTTTAAGTA TTTGGCTAGT CAAGATGATG 5520AATCTTCATT ATCTGATATA TTGCAAATCA CTCAATATCT AGACTTTCTG TTATTATTAT 5580TGATCCAATC AAAAAATAAA TTAGAAGCCG TGGGTCATTG TTATGAATCT CTTTCAGAGG 5640AATACAGACA ATTGACAAAA TTCACAGACT TTCAAGATTT TAAAAAACTG TTTAACAAGG 5700TCCCTATTGT TACAGATGGA AGGGTCAAAC TTAATAAAGG ATATTTGTTC GACTTTGTGA 5760TTAGTTTGAT GCGATTCAAA AAAGAATCCT CTCTAGCTAC CACCGCAATA GATCCTGTTA 5820GATACATAGA TCCTCGTCGC AATATCGCAT TTTCTAACGT GATGGATATA TTAAAGTCGA 5880ATAAAGTGAA CAATAATTAA TTCTTTATTG TCATCATGAA CGGCGGACAT ATTCAGTTGA 5940TAATCGGCCC CATGTTTTCA GGTAAAAGTA CAGAATTAAT TAGACGAGTT AGACGTTATC 6000AAATAGCTCA ATATAAATGC GTGACTATAA AATATTCTAA CGATAATAGA TACGGAACGG 6060GACTATGGAC GCATGATAAG AATAATTTTG AAGCATTGGA AGCAACTAAA CTATGTGATG 6120TCTTGGAATC AATTACAGAT TTCTCCGTGA TAGGTATCGA TGAAGGACAG TTCTTTCCAG 6180ACATTGTTGA ATTGATCTCG ATCCCGCGAA ATTAATACGA CTCACTATAG GGAGACCACA 6240ACGGTTTCCC TCTAGCGGGA TCAATTCCGC CCCTCTCCCT CCCCCCCCCC TAACGTTACT 6300GGCCGAAGCC GCTTGGAATA AGGCCGGTGT GCGTTTGTCT ATATGTTATT TTCCACCATA 6360TTGCCGTCTT TTGGCAATGT GAGGGCCCGG AAACCTGGCC CTGTCTTCTT GACGAGCATT 6420CCTAGGGGTC TTTCCCCTCT CGCCAAAGGA ATGCAAGGTC TGTTGAATGT CGTGAAGGAA 6480GCAGTTCCTC TGGAAGCTTC TTGAAGACAA ACAACGTCTG TAGCGACCCT TTGCAGGCAG 6540CGGAACCCCC CACCTGGCGA CAGGTGCCTC TGCGGCCAAA AGCCACGTGT ATAAGATACA 6600CCTGCAAAGG CGGCACAACC CCAGTGCCAC GTTGTGAGTT GGATAGTTGT GGAAAGAGTC 6660AAATGGCTCT CCTCAAGCGT ATTCAACAAG GGGCTGAAGG ATGCCCAGAA GGTACCCCAT 6720TGTATGGGAT CTGATCTGGG GCCTCGGTGC ACATGCTTTA CATGTGTTTA GTCGAGGTTA 6780AAAAACGTCT AGGCCCCCCG AACCACGGGG ACGTGGTTTT CCTTTGAAAA ACACGATAAT 6840ACC 6843(2) 서열 21의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 7107 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 21:ATGGAAAGCG ACGCTAAAAA CTATCAAATC ATGGATTCTT GGGAAGAGGA ATCAAGAGAT 60AAATCAACTA ATATCTCCTC GGCCCTCAAC ATCATTGAAT TCATACTCAG CACCGACCCC 120CAAGAAGACT TATCGGAAAA CGACACAATC AACACAAGAA CCCAGCAACT CAGTGCCACC 180ATCTGTCAAC CAGAAATCAA ACCAACAGAA ACAAGTGAGA AAGATAGTGG ATCAACTGAC 240AAAAATAGAC AGTCCGGGTC ATCACACGAA TGTACAACAG AAGCAAAAGA TAGAAATATT 300GATCAGGAAA CTGTACAGAG AGGACCTGGG AGAAGAAGCA GCTCAGATAG TAGAGCTGAG 360ACTGTGGTCT CTGGAGGAAT CCCCAGAAGC ATCACAGATT CTAAAAATGG AACCCAAAAC 420ACGGAGGATA TTGATCTCAA TGAAATTAGA AAGATGGATA AGGACTCTAT TGAGGGGAAA 480ATGCGACAAT CTGCAAATGT TCCAAGCGAG ATATCAGGAA GTGATGACAT ATTTACAACA 540GAACAAAGTA GAAACAGTGA TCATGGAAGA AGCCTGGAAT CTATCAGTAC ACCTGATACA 600AGATCAATAA GTGTTGTTAC TGCTGCAACA CCAGATGATG AAGAAGAAAT ACTAATGAAA 660AATAGTAGGA CAAAGAAAAG TTCTTCAACA CATCAAGAAG ATGACAAAAG AATTAAAAAA 720GGGGGAAAAG GGAAAGACTG GTTTAAGAAA TCAAAAGATA CCGACAACCA GATACCAACA 780TCAGACTACA GATCCACATC AAAAGGGCAG AAGAAAATCT CAAAGACAAC AACCACCAAC 840ACCGACACAA AGGGGCAAAC AGAAATACAG ACAGAATCAT CAGAAACACA ATCCTCATCA 900TGGAATCTCA TCATCGACAA CAACACCGAC CGGAACGAAC AGACAAGCAC AACTCCTCCA 960ACAACAACTT CCAGATCAAC TTATACAAAA GAATCGATCC GAACAAACTC TGAATCCAAA 1020CCCAAGACAC AAAAGACAAA TGGAAAGGAA AGGAAGGATA CAGAAGAGAG CAATCGATTT 1080ACAGAGAGGG CAATTACTCT ATTGCAGAAT CTTGGTGTAA TTCAATCCAC ATCAAAACTA 1140GATTTATATC AAGACAAACG AGTTGTATGT GTAGCAAATG TACTAAACAA TGTAGATACT 1200GCATCAAAGA TAGATTTCCT GGCAGGATTA GTCATAGGGG TTTCAATGGA CAACGACACA 1260AAATTAACAC AGATACAAAA TGAAATGCTA AACCTCAAAG CAGATCTAAA GAAAATGGAC 1320GAATCACATA GAAGATTGAT AGAAAATCAA AGAGAACAAC TGTCATTGAT CACGTCACTA 1380ATTTCAAATC TCAAAATTAT GACTGAGAGA GGAGGAAAGA AAGACCAAAA TGAATCCAAT 1440GAGAGAGTAT CCATGATCAA AACAAAATTG AAAGAAGAAA AGATCAAGAA GACCAGGTTT 1500GACCCACTTA TGGAGGCACA AGGCATTGAC AAGAATATAC CCGATCTATA TCGACATGCA 1560GGAGATACAC TAGAGAACGA TGTACAAGTT AAATCAGAGA TATTAAGTTC ATACAATGAG 1620TCAAATGCAA CAAGACTAAT ACCCAAAAAA GTGAGCAGTA CAATGAGATC ACTAGTTGCA 1680GTCATCAACA ACAGCAATCT CTCACAAAGC ACAAAACAAT CATACATAAA CGAACTCAAA 1740CGTTGCAAAA ATGATGAAGA AGTATCTGAA TTAATGGACA TGTTCAATGA AGATGTCAAC 1800AATTGCCAAT GAGTCGACGA TCCGGCTGCT AACAAAGCCC GAAAGGAAGC TGAGTTGGCT 1860GCTGCCACCG CTGAGCAATA ACTAGCATAA CCCCTTGGGG CCTCTAAACG GGTCTTGAGG 1920GGTTTTTTGC TGAAAGGAGG AACTATATCC GGATCGAGAT CAATTCTGTG AGCGTATGGC 1980AAACGAAGGA AAAATAGTTA TAGTAGCCGC ACTCGATGGG ACATTTCAAC GTAAACCGTT 2040TAATAATATT TTGAATCTTA TTCCATTATC TGAAATGGTG GTAAAACTAA CTGCTGTGTG 2100TATGAAATGC TTTAAGGAGG CTTCCTTTTC TAAACGATTG GGTGAGGAAA CCGAGATAGA 2160AATAATAGGA GGTAATGATA TGTATCAATC GGTGTGTAGA AAGTGTTACA TCGACTCATA 2220ATATTATATT TTTTATCTAA AAAACTAAAA ATAAACATTG ATTAAATTTT AATATAATAC 2280TTAAAAATGG ATGTTGTGTC GTTAGATAAA CCGTTTATGT ATTTTGAGGA AATTGATAAT 2340GAGTTAGATT ACGAACCAGA AAGTGCAAAT GAGGTCGCAA AAAAACTGCC GTATCAAGGA 2400CAGTTAAAAC TATTACTAGG AGAATTATTT TTTCTTAGTA AGTTACAGCG ACACGGTATA 2460TTAGATGGTG CCACCGTAGT GTATATAGGA TCTGCTCCCG GTACACATAT ACGTTATTTG 2520AGAGATCATT TCTATAATTT AGGAGTGATC ATCAAATGGA TGCTAATTGA CGGCCGCCAT 2580CATGATCCTA TTTTAAATGG ATTGCGTGAT GTGACTCTAG TGACTCGGTT CGTTGATGAG 2640GAATATCTAC GATCCATCAA AAAACAACTG CATCCTTCTA AGATTATTTT AATTTCTGAT 2700GTGAGATCCA AACGAGGAGG AAATGAACCT AGTACGGCGG ATTTACTAAG TAATTACGCT 2760CTACAAAATG TCATGATTAG TATTTTAAAC CCCGTGGCGT CTAGTCTTAA ATGGAGATGC 2820CCGTTTCCAG ATCAATGGAT CAAGGACTTT TATATCCCAC ACGGTAATAA AATGTTACAA 2880CCTTTTGCTC CTTCATATTC AGGGCCGTCG TTTTACAACG TCGTGACTGG GAAAACCCTG 2940GCGTTACCCA ACTTAATCGC CTTGCAGCAC ATCCCCCTTT CGCCAGCTGG CGTAATAGCG 3000AAGAGGCCCG CACCGATCGC CCTTCCCAAC AGTTGCGCAG CCTGAATGGC GAATGGCGCG 3060ACGCGCCCTG TAGCGGCGCA TTAAGCGCGG CGGGTGTGGT GGTTACGCGC AGCGTGACCG 3120CTACACTTGC CAGCGCCCTA GCGCCCGCTC CTTTCGCTTT CTTCCCTTCC TTTCTCGCCA 3180CGTTCGCCGG CTTTCCCCGT CAAGCTCTAA ATCGGGGGCT CCCTTTAGGG TTCCGATTTA 3240GTGCTTTACG GCACCTCGAC CCCAAAAAAC TTGATTAGGG TGATGGTTCA CGTAGTGGGC 3300CATCGCCCTG ATAGACGGTT TTTCGCCCTT TGACGTTGGA GTCCACGTTC TTTAATAGTG 3360GACTCTTGTT CCAAACTGGA ACAACACTCA ACCCTATCTC GGTCTATTCT TTTGATTTAT 3420AAGGGATTTT GCCGATTTCG GCCTATTGGT TAAAAAATGA GCTGATTTAA CAAAAATTTA 3480ACGCGAATTT TAACAAAATA TTAACGTTTA CAATTTCCCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA 3540TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT 3600GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA 3660ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA 3720CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA 3780CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG AAGAACGTTT 3840TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC 3900CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC 3960ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC 4020CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA 4080GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA 4140ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT 4200GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA 4260ATTAATAGAC TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC 4320GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT 4380TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA GTTATCTACA CGACGGGGAG 4440TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA 4500GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA 4560TTTTTAATTT AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC 4620TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC 4680TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC 4740AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT 4800CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT 4860CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC 4920TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA 4980GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC 5040CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG 5100GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA 5160GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT 5220TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA 5280CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC 5340GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG 5400CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT 5460ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC ACGACAGGTT 5520TCCCGACTGG AAAGCGGGCA GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC TCACTCATTA 5580GGCACCCCAG GCTTTACACT TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA TTGTGAGCGG 5640ATAACAATTT CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATGATTAC GCCAAGCTTT TGCGATCAAT 5700AAATGGATCA CAACCAGTAT CTCTTAACGA TGTTCTTCGC AGATGATGAT TCATTTTTTA 5760AGTATTTGGC TAGTCAAGAT GATGAATCTT CATTATCTGA TATATTGCAA ATCACTCAAT 5820ATCTAGACTT TCTGTTATTA TTATTGATCC AATCAAAAAA TAAATTAGAA GCCGTGGGTC 5880ATTGTTATGA ATCTCTTTCA GAGGAATACA GACAATTGAC AAAATTCACA GACTTTCAAG 5940ATTTTAAAAA ACTGTTTAAC AAGGTCCCTA TTGTTACAGA TGGAAGGGTC AAACTTAATA 6000AAGGATATTT GTTCGACTTT GTGATTAGTT TGATGCGATT CAAAAAAGAA TCCTCTCTAG 6060CTACCACCGC AATAGATCCT GTTAGATACA TAGATCCTCG TCGCAATATC GCATTTTCTA 6120ACGTGATGGA TATATTAAAG TCGAATAAAG TGAACAATAA TTAATTCTTT ATTGTCATCA 6180TGAACGGCGG ACATATTCAG TTGATAATCG GCCCCATGTT TTCAGGTAAA AGTACAGAAT 6240TAATTAGACG AGTTAGACGT TATCAAATAG CTCAATATAA ATGCGTGACT ATAAAATATT 6300CTAACGATAA TAGATACGGA ACGGGACTAT GGACGCATGA TAAGAATAAT TTTGAAGCAT 6360TGGAAGCAAC TAAACTATGT GATGTCTTGG AATCAATTAC AGATTTCTCC GTGATAGGTA 6420TCGATGAAGG ACAGTTCTTT CCAGACATTG TTGAATTGAT CTCGATCCCG CGAAATTAAT 6480ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACAACGGTT TCCCTCTAGC GGGATCAATT CCGCCCCTCT 6540CCCTCCCCCC CCCCTAACGT TACTGGCCGA AGCCGCTTGG AATAAGGCCG GTGTGCGTTT 6600GTCTATATGT TATTTTCCAC CATATTGCCG TCTTTTGGCA ATGTGAGGGC CCGGAAACCT 6660GGCCCTGTCT TCTTGACGAG CATTCCTAGG GGTCTTTCCC CTCTCGCCAA AGGAATGCAA 6720GGTCTGTTGA ATGTCGTGAA GGAAGCAGTT CCTCTGGAAG CTTCTTGAAG ACAAACAACG 6780TCTGTAGCGA CCCTTTGCAG GCAGCGGAAC CCCCCACCTG GCGACAGGTG CCTCTGCGGC 6840CAAAAGCCAC GTGTATAAGA TACACCTGCA AAGGCGGCAC AACCCCAGTG CCACGTTGTG 6900AGTTGGATAG TTGTGGAAAG AGTCAAATGG CTCTCCTCAA GCGTATTCAA CAAGGGGCTG 6960AAGGATGCCC AGAAGGTACC CCATTGTATG GGATCTGATC TGGGGCCTCG GTGCACATGC 7020TTTACATGTG TTTAGTCGAG GTTAAAAAAC GTCTAGGCCC CCCGAACCAC GGGGACGTGG 7080TTTTCCTTTG AAAAACACGA TAATACC 7107(2) 서열 22의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12011 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 22:ATGGACACTG AATCTAACAA TGGCACTGTA TCTGACATAC TCTATCCTGA GTGTCACCTT 60AACTCTCCTA TCGTTAAAGG TAAAATAGCA CAATTACACA CTATTATGAG TCTACCTCAG 120CCTTATGATA TGGATGACGA CTCAATACTA GTTATCACTA GACAGAAAAT AAAACTTAAT 180AAATTGGATA AAAGACAACG ATCTATTAGA AGATTAAAAT TAATATTAAC TGAAAAAGTG 240AATGACTTAG GAAAATACAC ATTTATCAGA TATCCAGAAA TGTCAAAAGA AATGTTCAAA 300TTATATATAC CTGGTATTAA CAGTAAAGTG ACTGAATTAT TACTTAAAGC AGATAGAACA 360TATAGTCAAA TGACTGATGG ATTAAGAGAT CTATGGATTA ATGTGCTATC AAAATTAGCC 420TCAAAAAATG ATGGAAGCAA TTATGATCTT AATGAAGAAA TTAATAATAT ATCGAAAGTT 480CACACAACCT ATAAATCAGA TAAATGGTAT AATCCATTCA AAACATGGTT TACTATCAAG 540TATGATATGA GAAGATTACA AAAAGCTCGA AATGAGATCA CTTTTAATGT TGGGAAGGAT 600TATAACTTGT TAGAAGACCA GAAGAATTTC TTATTGATAC ATCCAGAATT GGTTTTGATA 660TTAGATAAAC AAAACTATAA TGGTTATCTA ATTACTCCTG AATTAGTATT GATGTATTGT 720GACGTAGTCG AAGGCCGATG GAATATAAGT GCATGTGCTA AGTTAGATCC AAAATTACAA 780TCTATGTATC AGAAAGGTAA TAACCTGTGG GAAGTGATAG ATAAATTGTT TCCAATTATG 840GGAGAAAAGA CATTTGATGT GATATCGTTA TTAGAACCAC TTGCATTATC CTTAATTCAA 900ACTCATGATC CTGTTAAACA ACTAAGAGGA GCTTTTTTAA ATCATGTGTT ATCCGAGATG 960GAATTAATAT TTGAATCTAG AGAATCGATT AAGGAATTTC TGAGTGTAGA TTACATTGAT 1020AAAATTTTAG ATATATTTAA TAAGTCTACA ATAGATGAAA TAGCAGAGAT TTTCTCTTTT 1080TTTAGAACAT TTGGGCATCC TCCATTAGAA GCTAGTATTG CAGCAGAAAA GGTTAGAAAA 1140TATATGTATA TTGGAAAACA ATTAAAATTT GACACTATTA ATAAATGTCA TGCTATCTTC 1200TGTACAATAA TAATTAACGG ATATAGAGAG AGGCATGGTG GACAGTGGCC TCCTGTGACA 1260TTACCTGATC ATGCACACGA ATTCATCATA AATGCTTACG GTTCAAACTC TGCGATATCA 1320TATGAAAATG CTGTTGATTA TTACCAGAGC TTTATAGGAA TAAAATTCAA TAAATTCATA 1380GAGCCTCAGT TAGATGAGGA TTTGACAATT TATATGAAAG ATAAAGCATT ATCTCCAAAA 1440AAATCAAATT GGGACACAGT TTATCCTGCA TCTAATTTAC TGTACCGTAC TAACGCATCC 1500AACGAATCAC GAAGATTAGT TGAAGTATTT ATAGCAGATA GTAAATTTGA TCCTCATCAG 1560ATATTGGATT ATGTAGAATC TGGGGACTGG TTAGATGATC CAGAATTTAA TATTTCTTAT 1620AGTCTTAAAG AAAAAGAGAT CAAACAGGAA GGTAGACTCT TTGCAAAAAT GACATACAAA 1680ATGAGAGCTA CACAAGTTTT ATCAGAGACA CTACTTGCAA ATAACATAGG AAAATTCTTT 1740CAAGAAAATG GGATGGTGAA GGGAGAGATT GAATTACTTA AGAGATTAAC AACCATATCA 1800ATATCAGGAG TTCCACGGTA TAATGAAGTG TACAATAATT CTAAAAGCCA TACAGATGAC 1860CTTAAAACCT ACAATAAAAT AAGTAATCTT AATTTGTCTT CTAATCAGAA ATCAAAGAAA 1920TTTGAATTCA AGTCAACGGA TATCTACAAT GATGGATACG AGACTGTGAG CTGTTTCCTA 1980ACAACAGATC TCAAAAAATA CTGTCTTAAT TGGAGATATG AATCAACAGC TCTATTTGGA 2040GAAACTTGCA ACCAAATATT TGGATTAAAT AAATTGTTTA ATTGGTTACA CCCTCGTCTT 2100GAAGGAAGTA CAATCTATGT AGGTGATCCT TACTGTCCTC CATCAGATAA AGAACATATA 2160TCATTAGAGG ATCACCCTGA TTCTGGTTTT TACGTTCATA ACCCAAGAGG GGGTATAGAA 2220GGATTTTGTC AAAAATTATG GACACTCATA TCTATAAGTG CAATACATCT AGCAGCTGTT 2280AGAATAGGCG TGAGGGTGAC TGCAATGGTT CAAGGAGACA ATCAAGCTAT AGCTGTAACC 2340ACAAGAGTAC CCAACAATTA TGACTACAGA GTTAAGAAGG AGATAGTTTA TAAAGATGTA 2400GTGAGATTTT TTGATTCATT AAGAGAAGTG ATGGATGATC TAGGTCATGA ACTTAAATTA 2460AATGAAACGA TTATAAGTAG CAAGATGTTC ATATATAGCA AAAGAATCTA TTATGATGGG 2520AGAATTCTTC CTCAAGCTCT AAAAGCATTA TCTAGATGTG TCTTCTGGTC AGAGACAGTA 2580ATAGACGAAA CAAGATCAGC ATCTTCAAAT TTGGCAACAT CATTTGCAAA AGCAATTGAG 2640AATGGTTATT CACCTGTTCT AGGATATGCA TGCTCAATTT TTAAGAACAT TCAACAACTA 2700TATATTGCCC TTGGGATGAA TATCAATCCA ACTATAACAC AGAATATCAG AGATCAGTAT 2760TTTAGGAATC CAAATTGGAT GCAATATGCC TCTTTAATAC CTGCTAGTGT TGGGGGATTC 2820AATTACATGG CCATGTCAAG ATGTTTTGTA AGGAATATTG GTGATCCATC AGTTGCCGCA 2880TTGGCTGATA TTAAAAGATT TATTAAGGCG AATCTATTAG ACCGAAGTGT TCTTTATAGG 2940ATTATGAATC AAGAACCAGG TGAGTCATCT TTTTTGGACT GGGCTTCAGA TCCATATTCA 3000TGCAATTTAC CACAATCTCA AAATATAACC ACCATGATAA AAAATATAAC AGCAAGGAAT 3060GTATTACAAG ATTCACCAAA TCCATTATTA TCTGGATTAT TCACAAATAC AATGATAGAA 3120GAAGATGAAG AATTAGCTGA GTTCCTGATG GACAGGAAGG TAATTCTCCC TAGAGTTGCA 3180CATGATATTC TAGATAATTC TCTCACAGGA ATTAGAAATG CCATAGCTGG AATGTTAGAT 3240ACGACAAAAT CACTAATTCG GGTTGGCATA AATAGAGGAG GACTGACATA TAGTTTGTTG 3300AGGAAAATCA GTAATTACGA TCTAGTACAA TATGAAACAC TAAGTAGGAC TTTGCGACTA 3360ATTGTAAGTG ATAAAATCAA GTATGAAGAT ATGTGTTCGG TAGACCTTGC CATAGCATTG 3420CGACAAAAGA TGTGGATTCA TTTATCAGGA GGAAGGATGA TAAGTGGACT TGAAACGCCT 3480GACCCATTAG AATTACTATC TGGGGTAGTA ATAACAGGAT CAGAACATTG TAAAATATGT 3540TATTCTTCAG ATGGCACAAA CCCATATACT TGGATGTATT TACCCGGTAA TATCAAAATA 3600GGATCAGCAG AAACAGGTAT ATCGTCATTA AGAGTTCCTT ATTTTGGATC AGTCACTGAT 3660GAAAGATCTG AAGCACAATT AGGATATATC AAGAATCTTA GTAAACCTGC AAAAGCCGCA 3720ATAAGAATAG CAATGATATA TACATGGGCA TTTGGTAATG ATGAGATATC TTGGATGGAA 3780GCCTCACAGA TAGCACAAAC ACGTGCAAAT TTTACACTAG ATAGTCTCAA AATTTTAACA 3840CCGGTAGCTA CATCAACAAA TTTATCACAC AGATTAAAGG ATACTGCAAC TCAGATGAAA 3900TTCTCCAGTA CATCATTGAT CAGAGTCAGC AGATTCATAA CAATGTCCAA TGATAACATG 3960TCTATCAAAG AAGCTAATGA AACCAAAGAT ACTAATCTTA TTTATCAACA AATAATGTTA 4020ACAGGATTAA GTGTTTTCGA ATATTTATTT AGATTAAAAG AAACCACAGG ACACAACCCT 4080ATAGTTATGC ATCTGCACAT AGAAGATGAG TGTTGTATTA AAGAAAGTTT TAATGATGAA 4140CATATTAATC CAGAGTCTAC ATTAGAATTA ATTCGATATC CTGAAAGTAA TGAATTTATT 4200TATGATAAAG ACCCACTCAA AGATGTGGAC TTATCAAAAC TTATGGTTAT TAAAGACCAT 4260TCTTACACAA TTGATATGAA TTATTGGGAT GATACTGACA TCATACATGC AATTTCAATA 4320TGTACTGCAA TTACAATAGC AGATACTATG TCACAATTAG ATCGAGATAA TTTAAAAGAG 4380ATAATAGTTA TTGCAAATGA TGATGATATT AATAGCTTAA TCACTGAATT TTTGACTCTT 4440GACATACTTG TATTTCTCAA GACATTTGGT GGATTATTAG TAAATCAATT TGCATACACT 4500CTTTATAGTC TAAAAATAGA AGGTAGGGAT CTCATTTGGG ATTATATAAT GAGAACACTG 4560AGAGATACTT CCCATTCAAT ATTAAAAGTA TTATCTAATG CATTATCTCA TCCTAAAGTA 4620TTCAAGAGGT TCTGGGATTG TGGAGTTTTA AACCCTATTT ATGGTCCTAA TACTGCTAGT 4680CAAGACCAGA TAAAACTTGC CCTATCTATA TGTGAATATT CACTAGATCT ATTTATGAGA 4740GAATGGTTGA ATGGTGTATC ACTTGAAATA TACATTTGTG ACAGCGATAT GGAAGTTGCA 4800AATGATAGGA AACAAGCCTT TATTTCTAGA CACCTTTCAT TTGTTTGTTG TTTAGCAGAA 4860ATTGCATCTT TCGGACCTAA CCTGTTAAAC TTAACATACT TGGAGAGACT TGATCTATTG 4920AAACAATATC TTGAATTAAA TATTAAAGAA GACCCTACTC TTAAATATGT ACAAATATCT 4980GGATTATTAA TTAAATCGTT CCCATCAACT GTAACATACG TAAGAAAGAC TGCAATCAAA 5040TATCTAAGGA TTCGCGGTAT TAGTCCACCT GAGGTAATTG ATGATTGGGA TCCGGTAGAA 5100GATGAAAATA TGCTGGATAA CATTGTCAAA ACTATAAATG ATAACTGTAA TAAAGATAAT 5160AAAGGGAATA AAATTAACAA TTTCTGGGGA CTAGCACTTA AGAACTATCA AGTCCTTAAA 5220ATCAGATCTA TAACAAGTGA TTCTGATGAT AATGATAGAC TAGATGCTAA TACAAGTGGT 5280TTGACACTTC CTCAAGGAGG GAATTATCTA TCGCATCAAT TGAGATTATT CGGAATCAAC 5340AGCACTAGTT GTCTGAAAGC TCTTGAGTTA TCACAAATTT TAATGAAGGA AGTCAATAAA 5400GACAAGGACA GGCTCTTCCT GGGAGAAGGA GCAGGAGCTA TGCTAGCATG TTATGATGCC 5460ACATTAGGAC CTGCAGTTAA TTATTATAAT TCAGGTTTGA ATATAACAGA TGTAATTGGT 5520CAACGAGAAT TGAAAATATT TCCTTCAGAG GTATCATTAG TAGGTAAAAA ATTAGGAAAT 5580GTGACACAGA TTCTTAACAG GGTAAAAGTA CTGTTCAATG GGAATCCTAA TTCAACATGG 5640ATAGGAAATA TGGAATGTGA GAGCTTAATA TGGAGTGAAT TAAATGATAA GTCCATTGGA 5700TTAGTACATT GTGATATGGA AGGAGCTATC GGTAAATCAG AAGAAACTGT TCTACATGAA 5760CATTATAGTG TTATAAGAAT TACATACTTG ATTGGGGATG ATGATGTTGT TTTAGTTTCC 5820AAAATTATAC CTACAATCAC TCCGAATTGG TCTAGAATAC TTTATCTATA TAAATTATAT 5880TGGAAAGATG TAAGTATAAT ATCACTCAAA ACTTCTAATC CTGCATCAAC AGAATTATAT 5940CTAATTTCGA AAGATGCATA TTGTACTATA ATGGAACCTA GTGAAATTGT TTTATCAAAA 6000CTTAAAAGAT TGTCACTCTT GGAAGAAAAT AATCTATTAA AATGGATCAT TTTATCAAAG 6060AAGAGGAATA ATGAATGGTT ACATCATGAA ATCAAAGAAG GAGAAAGAGA TTATGGAATC 6120ATGAGACCAT ATCATATGGC ACTACAAATC TTTGGATTTC AAATCAATTT AAATCATCTG 6180GCGAAAGAAT TTTTATCAAC CCCAGATCTG ACTAATATCA ACAATATAAT CCAAAGTTTT 6240CAGCGAACAA TAAAGGATGT TTTATTTGAA TGGATTAATA TAACTCATGA TGATAAGAGA 6300CATAAATTAG GCGGAAGATA TAACATATTC CCACTGAAAA ATAAGGGAAA GTTAAGACTG 6360CTATCGAGAA GACTAGTATT AAGTTGGATT TCATTATCAT TATCGACTCG ATTACTTACA 6420GGTCGCTTTC CTGATGAAAA ATTTGAACAT AGAGCACAGA CTGGATATGT ATCATTAGCT 6480GATACTGATT TAGAATCATT AAAGTTATTG TCGAAAAACA TCATTAAGAA TTACAGAGAG 6540TGTATAGGAT CAATATCATA TTGGTTTCTA ACCAAAGAAG TTAAAATACT TATGAAATTG 6600ATTGGTGGTG CTAAATTATT AGGAATTCCC AGACAATATA AAGAACCCGA AGACCAGTTA 6660TTAGAAAACT ACAATCAACA TGATGAATTT GATATCGATT AAAACATAAA TACAATGTCG 6720ACGATCCGGC TGCTAACAAA GCCCGAAAGG AAGCTGAGTT GGCTGCTGCC ACCGCTGAGC 6780AATAACTAGC ATAACCCCTT GGGGCCTCTA AACGGGTCTT GAGGGGTTTT TTGCTGAAAG 6840GAGGAACTAT ATCCGGATCG AGATCAATTC TGTGAGCGTA TGGCAAACGA AGGAAAAATA 6900GTTATAGTAG CCGCACTCGA TGGGACATTT CAACGTAAAC CGTTTAATAA TATTTTGAAT 6960CTTATTCCAT TATCTGAAAT GGTGGTAAAA CTAACTGCTG TGTGTATGAA ATGCTTTAAG 7020GAGGCTTCCT TTTCTAAACG ATTGGGTGAG GAAACCGAGA TAGAAATAAT AGGAGGTAAT 7080GATATGTATC AATCGGTGTG TAGAAAGTGT TACATCGACT CATAATATTA TATTTTTTAT 7140CTAAAAAACT AAAAATAAAC ATTGATTAAA TTTTAATATA ATACTTAAAA ATGGATGTTG 7200TGTCGTTAGA TAAACCGTTT ATGTATTTTG AGGAAATTGA TAATGAGTTA GATTACGAAC 7260CAGAAAGTGC AAATGAGGTC GCAAAAAAAC TGCCGTATCA AGGACAGTTA AAACTATTAC 7320TAGGAGAATT ATTTTTTCTT AGTAAGTTAC AGCGACACGG TATATTAGAT GGTGCCACCG 7380TAGTGTATAT AGGATCTGCT CCCGGTACAC ATATACGTTA TTTGAGAGAT CATTTCTATA 7440ATTTAGGAGT GATCATCAAA TGGATGCTAA TTGACGGCCG CCATCATGAT CCTATTTTAA 7500ATGGATTGCG TGATGTGACT CTAGTGACTC GGTTCGTTGA TGAGGAATAT CTACGATCCA 7560TCAAAAAACA ACTGCATCCT TCTAAGATTA TTTTAATTTC TGATGTGAGA TCCAAACGAG 7620GAGGAAATGA ACCTAGTACG GCGGATTTAC TAAGTAATTA CGCTCTACAA AATGTCATGA 7680TTAGTATTTT AAACCCCGTG GCGTCTAGTC TTAAATGGAG ATGCCCGTTT CCAGATCAAT 7740GGATCAAGGA CTTTTATATC CCACACGGTA ATAAAATGTT ACAACCTTTT GCTCCTTCAT 7800ATTCAGGGCC GTCGTTTTAC AACGTCGTGA CTGGGAAAAC CCTGGCGTTA CCCAACTTAA 7860TCGCCTTGCA GCACATCCCC CTTTCGCCAG CTGGCGTAAT AGCGAAGAGG CCCGCACCGA 7920TCGCCCTTCC CAACAGTTGC GCAGCCTGAA TGGCGAATGG CGCGACGCGC CCTGTAGCGG 7980CGCATTAAGC GCGGCGGGTG TGGTGGTTAC GCGCAGCGTG ACCGCTACAC TTGCCAGCGC 8040CCTAGCGCCC GCTCCTTTCG CTTTCTTCCC TTCCTTTCTC GCCACGTTCG CCGGCTTTCC 8100CCGTCAAGCT CTAAATCGGG GGCTCCCTTT AGGGTTCCGA TTTAGTGCTT TACGGCACCT 8160CGACCCCAAA AAACTTGATT AGGGTGATGG TTCACGTAGT GGGCCATCGC CCTGATAGAC 8220GGTTTTTCGC CCTTTGACGT TGGAGTCCAC GTTCTTTAAT AGTGGACTCT TGTTCCAAAC 8280TGGAACAACA CTCAACCCTA TCTCGGTCTA TTCTTTTGAT TTATAAGGGA TTTTGCCGAT 8340TTCGGCCTAT TGGTTAAAAA ATGAGCTGAT TTAACAAAAA TTTAACGCGA ATTTTAACAA 8400AATATTAACG TTTACAATTT CCCAGGTGGC ACTTTTCGGG GAAATGTGCG CGGAACCCCT 8460ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT ATGTATCCGC TCATGAGACA ATAACCCTGA 8520TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG AGTATGAGTA TTCAACATTT CCGTGTCGCC 8580CTTATTCCCT TTTTTGCGGC ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG CTCACCCAGA AACGCTGGTG 8640AAAGTAAAAG ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG GTTACATCGA ACTGGATCTC 8700AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT GATGAGCACT 8760TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTATTG ACGCCGGGCA AGAGCAACTC 8820GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAG 8880CATCTTACGG ATGGCATGAC AGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAAC CATGAGTGAT 8940AACACTGCGG CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC CGAAGGAGCT AACCGCTTTT 9000TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT GGGAACCGGA GCTGAATGAA 9060GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ATGCCTGTAG CAATGGCAAC AACGTTGCGC 9120AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG 9180GAGGCGGATA AAGTTGCAGG ACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG CTGGTTTATT 9240GCTGATAAAT CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA TCATTGCAGC ACTGGGGCCA 9300GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG GGAGTCAGGC AACTATGGAT 9360GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA TTAAGCATTG GTAACTGTCA 9420GACCAAGTTT ACTCATATAT ACTTTAGATT GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG 9480ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACG TGAGTTTTCG 9540TTCCACTGAG CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT 9600CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA AAACCACCGC TACCAGCGGT GGTTTGTTTG 9660CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG GCTTCAGCAG AGCGCAGATA 9720CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA 9780CCGCCTACAT ACCTCGCTCT GCTAATCCTG TTACCAGTGG CTGCTGCCAG TGGCGATAAG 9840TCGTGTCTTA CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC 9900TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA CGACCTACAC CGAACTGAGA 9960TACCTACAGC GTGAGCTATG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG AAGGGAGAAA GGCGGACAGG 10020TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA GAGCGCACGA GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC 10080GCCTGGTATC TTTATAGTCC TGTCGGGTTT CGCCACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTTG 10140TGATGCTCGT CAGGGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA GCAACGCGGC CTTTTTACGG 10200TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC ATGTTCTTTC CTGCGTTATC CCCTGATTCT 10260GTGGATAACC GTATTACCGC CTTTGAGTGA GCTGATACCG CTCGCCGCAG CCGAACGACC 10320GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG GAAGAGCGCC CAATACGCAA ACCGCCTCTC 10380CCCGCGCGTT GGCCGATTCA TTAATGCAGC TGGCACGACA GGTTTCCCGA CTGGAAAGCG 10440GGCAGTGAGC GCAACGCAAT TAATGTGAGT TAGCTCACTC ATTAGGCACC CCAGGCTTTA 10500CACTTTATGC TTCCGGCTCG TATGTTGTGT GGAATTGTGA GCGGATAACA ATTTCACACA 10560GGAAACAGCT ATGACCATGA TTACGCCAAG CTTTTGCGAT CAATAAATGG ATCACAACCA 10620GTATCTCTTA ACGATGTTCT TCGCAGATGA TGATTCATTT TTTAAGTATT TGGCTAGTCA 10680AGATGATGAA TCTTCATTAT CTGATATATT GCAAATCACT CAATATCTAG ACTTTCTGTT 10740ATTATTATTG ATCCAATCAA AAAATAAATT AGAAGCCGTG GGTCATTGTT ATGAATCTCT 10800TTCAGAGGAA TACAGACAAT TGACAAAATT CACAGACTTT CAAGATTTTA AAAAACTGTT 10860TAACAAGGTC CCTATTGTTA CAGATGGAAG GGTCAAACTT AATAAAGGAT ATTTGTTCGA 10920CTTTGTGATT AGTTTGATGC GATTCAAAAA AGAATCCTCT CTAGCTACCA CCGCAATAGA 10980TCCTGTTAGA TACATAGATC CTCGTCGCAA TATCGCATTT TCTAACGTGA TGGATATATT 11040AAAGTCGAAT AAAGTGAACA ATAATTAATT CTTTATTGTC ATCATGAACG GCGGACATAT 11100TCAGTTGATA ATCGGCCCCA TGTTTTCAGG TAAAAGTACA GAATTAATTA GACGAGTTAG 11160ACGTTATCAA ATAGCTCAAT ATAAATGCGT GACTATAAAA TATTCTAACG ATAATAGATA 11220CGGAACGGGA CTATGGACGC ATGATAAGAA TAATTTTGAA GCATTGGAAG CAACTAAACT 11280ATGTGATGTC TTGGAATCAA TTACAGATTT CTCCGTGATA GGTATCGATG AAGGACAGTT 11340CTTTCCAGAC ATTGTTGAAT TGATCTCGAT CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG 11400AGACCACAAC GGTTTCCCTC TAGCGGGATC AATTCCGCCC CTCTCCCTCC CCCCCCCCTA 11460ACGTTACTGG CCGAAGCCGC TTGGAATAAG GCCGGTGTGC GTTTGTCTAT ATGTTATTTT 11520CCACCATATT GCCGTCTTTT GGCAATGTGA GGGCCCGGAA ACCTGGCCCT GTCTTCTTGA 11580CGAGCATTCC TAGGGGTCTT TCCCCTCTCG CCAAAGGAAT GCAAGGTCTG TTGAATGTCG 11640TGAAGGAAGC AGTTCCTCTG GAAGCTTCTT GAAGACAAAC AACGTCTGTA GCGACCCTTT 11700GCAGGCAGCG GAACCCCCCA CCTGGCGACA GGTGCCTCTG CGGCCAAAAG CCACGTGTAT 11760AAGATACACC TGCAAAGGCG GCACAACCCC AGTGCCACGT TGTGAGTTGG ATAGTTGTGG 11820AAAGAGTCAA ATGGCTCTCC TCAAGCGTAT TCAACAAGGG GCTGAAGGAT GCCCAGAAGG 11880TACCCCATTG TATGGGATCT GATCTGGGGC CTCGGTGCAC ATGCTTTACA TGTGTTTAGT 11940CGAGGTTAAA AAACGTCTAG GCCCCCCGAA CCACGGGGAC GTGGTTTTCC TTTGAAAAAC 12000ACGATAATAC C 12011(2) 서열 23의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 15 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 23:GATCGATGCT AGCCC 15(2) 서열 24의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 15 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 24:GATCGGGCTA GCATC 15(2) 서열 25의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 25:TTACATGGCC AT 12(2) 서열 26의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 26:TCACATGGCG AT 12(2) 서열 27의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 27:TTTGGACTGG GC 12(2) 서열 28의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 28:TTTTGATTGG GC 12(2) 서열 29의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 14 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 29:TGGTCCTAAT ACTG 14(2) 서열 30의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 14 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 30:TGGGCCTAAT ATCG 14(2) 서열 31의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 30 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 31:GCATTATCTA GATGTGTCTT CTGGTCAGAG 30(2) 서열 32의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 30 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 32:CCTGAATTAT AATAATTAAC TGCAGGTCCT 30(2) 서열 33의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 26 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 33:GGGAAAGAAT CCAGAGACAA GAACGG 26(2) 서열 34의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 26 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 34:GGTGAAGTTG TGGATCCATT TGATTG 26(2) 서열 35의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 24 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 35:CAACCTGTAA GGTACCAGCA TCCG 24(2) 서열 36의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 27 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 36:GATATGGTGT TAGGCCTTGA TCTGTTC 27(2) 서열 37의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 29 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 37:CGCCATGGAA AAATCAGAGA TCCTCTTCT 29(2) 서열 38의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 31 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 38:CTGGATCCTA ATTGGAGTTG TTACCCATGT A 31(2) 서열 39의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 23 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 39:AACCATGGCT GAAAAAGGGA AAA 23(2) 서열 40의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 33 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 40:GGTGAAGCTT AAGATGTGAT TTTACATATT TTA 33(2) 서열 41의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 35 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 41:AAATAGGATC CCTACAGATC ATTAGATATT AAAAT 35(2) 서열 42의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 24 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 42:CGCCATGGTG TTCAGTGCTT GTTG 24(2) 서열 43의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 31 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 43:CCACAAGCTT AATTAACCAT AATATGCATC A 31(2) 서열 44의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 29 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 44:TTCCATGGAT TTGGATTTGT CTATTGGGT 29(2) 서열 45의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 15462 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 45:ACCAAACAAG AGAAGAAACT TGCTTGGTAA TATAAATTTA ACTTAAAATT AACTTAGGAT 60TTAAGACATT GACTAGAAGG TCAAGAAAAG GGAACTCTAT AATTTCAAAA ATGTTGAGCC 120TATTTGATAC ATTTAATGCA CGTAGGCAAG AAAACATAAC AAAATCAGCC GGTGGAGCTA 180TCATTCCTGG ACAGAAAAAT ACTGTCTCTA TATTCGCCCT TGGACCGACA ATAACTGATG 240ATAATGAGAA AATGACATTA GCTCTTCTAT TTCTATCTCA TTCACTAGAT AATGAGAAAC 300AACATGCACA AAGGGCAGGG TTCTTGGTGT CTTTATTGTC AATGGCTTAT GCCAATCCAG 360AGCTCTACCT AACAACAAAT GGAAGTAATG CAGATGCCAA GTATGTCATA TACATGATTG 420AGAAAGATCT AAAACGGCAA AAGTATGGAG GATTTGTGGT TAAGACGAGA GAGATGATAT 480ATGAAAAGAC AACTGATTGG ATATTTGGAA GTGACCTGGA TTATGATCAG GAAACTATGT 540TGCAGAACGG CAGGAACAAT TCAACAATTG AAGACCTTGT CCACACATTT GGGTATCCAT 600CATGTTTAGG AGCTCTTATA ATACAGATCT GGATAGTTCT GGTCAAAGCT ATCACTAGTA 660TCTCAGGGTT AAGAAAAGGC TTTTTCACCC GATTGGAAGC TTTCAGACAA GATGGAACAG 720TGCAGGCAGG GCTGGTATTG AGCGGTGACA CAGTGGATCA GATTGGGTCA ATCATGCGGT 780CTCAACAGAG CTTGGTAACT CTTATGGTTG AAACATTAAT AACAATGAAT ACCAGCAGAA 840ATGACCTCAC AACCATAGAA AAGAATATAC AAATTGTTGG CAACTACATA AGAGATGCAG 900GTCTCGCTTC ATTCTTCAAT ACAATCAGAT ATGGAATTGA GACCAGAATG GCAGCTTTGA 960CTCTATCCAC TCTCAGACCA GATATCAATA GATTAAAAGC TTTGATGGAA CTGTATTTAT 1020CAAAGGGACC ACGCGCTCCT TTCATCTGTA TCCTCAGAGA TCCTATACAT GGTGAGTTCG 1080CACCAGGCAA CTATCCTGCC ATATGGAGCT ATGCAATGGG GGTGGCAGTT GTACAAAATA 1140GAGCCATGCA ACAGTATGTG ACGGGAAGAT CATATCTAGA CATTGATATG TTCCAGCTAG 1200GACAAGCAGT AGCACGTGAT GCCGAAGCTC AAATGAGCTC AACACTGGAA GATGAACTTG 1260GAGTGACACA CGAAGCTAAA GAAAGCTTGA AGAGACATAT AAGGAACATA AACAGTTCAG 1320AGACATCTTT CCACAAACCG ACAGGTGGAT CAGCCATAGA GATGGCAATA GATGAAGAGC 1380CAGAACAATT CGAACATAGA GCAGATCAAG AACAAAATGG AGAACCTCAA TCATCCATAA 1440TTCAATATGC CTGGGCAGAA GGAAATAGAA GCGATGATCA GACTGAGCAA GCTACAGAAT 1500CTGACAATAT CAAGACCGAA CAACAAAACA TCAGAGACAG ACTAAACAAG AGACTCAACG 1560ACAAGAAGAA ACAAAGCAGT CAACCACCCA CTAATCCCAC AAACAGAACA AACCAGGACG 1620AAATAGATGA TCTGTTTAAC GCATTTGGAA GCAACTAATC GAATCAACAT TTTAATCTAA 1680ATCAATAATA AATAAGAAAA ACTTAGGATT AAAGAATCCT ATCATACCGG AATATAGGGT 1740GGTAAATTTA GAGTCTGCTT GAAACTCAAT CAATAGAGAG TTGATGGAAA GCGATGCTAA 1800AAACTATCAA ATCATGGATT CTTGGGAAGA GGAATCAAGA GATAAATCAA CTAATATCTC 1860CTCGGCCCTC AACATCATTG AATTCATACT CAGCACCGAC CCCCAAGAAG ACTTATCGGA 1920AAACGACACA ATCAACACAA GAACCCAGCA ACTCAGTGCC ACCATCTGTC AACCAGAAAT 1980CAAACCAACA GAAACAAGTG AGAAAGATAG TGGATCAACT GACAAAAATA GACAGTCTGG 2040GTCATCACAC GAATGTACAA CAGAAGCAAA AGATAGAAAC ATTGATCAGG AAACTGTACA 2100GAGAGGACCT GGGAGAAGAA GCAGCTCAGA TAGTAGAGCT GAGACTGTGG TCTCTGGAGG 2160AATCCCCAGA AGCATCACAG ATTCTAAAAA TGGAACCCAA AACACGGAGG ATATTGATCT 2220CAATGAAATT AGAAAGATGG ATAAGGACTC TATTGAGGGG AAAATGCGAC AATCTGCAAA 2280TGTTCCAAGC GAGATATCAG GAAGTGATGA CATATTTACA ACAGAACAAA GTAGAAACAG 2340TGATCATGGA AGAAGCCTGG AATCTATCAG TACACCTGAT ACAAGATCAA TAAGTGTTGT 2400TACTGCTGCA ACACCAGATG ATGAAGAAGA AATACTAATG AAAAATAGTA GGACAAAGAA 2460AAGTTCTTCA ACACATCAAG AAGATGACAA AAGAATTAAA AAAGGGGGAA AAGGGAAAGA 2520CTGGTTTAAG AAATCAAAAG ATACCGACAA CCAGATACCA ACATCAGACT ACAGATCCAC 2580ATCAAAAGGG CAGAAGAAAA TCTCAAAGAC AACAACCACC AACACCGACA CAAAGGGGCA 2640AACAGAAATA CAGACAGAAT CATCAGAAAC ACAATCCTCA TCATGGAATC TCATCATCGA 2700CAACAACACC GACCGGAACG AACAGACAAG CACAACTCCT CCAACAACAA CTTCCAGATC 2760AACTTATACA AAAGAATCGA TCCGAACAAA CTCTGAATCC AAACCCAAGA CACAAAAGAC 2820AAATGGAAAG GAAAGGAAGG ATACAGAAGA GAGCAATCGA TTTACAGAGA GGGCAATTAC 2880TCTATTGCAG AATCTTGGTG TAATTCAATC CACATCAAAA CTAGATTTAT ATCAAGACAA 2940ACGAGTTGTA TGTGTAGCAA ATGTACTAAA CAATGTAGAT ACTGCATCAA AGATAGATTT 3000CCTGGCAGGA TTAGTCATAG GGGTTTCAAT GGACAACGAC ACAAAATTAA CACAGATACA 3060AAATGAAATG CTAAACCTCA AAGCAGATCT AAAGAAAATG GACGAATCAC ATAGAAGATT 3120GATAGAAAAT CAAAGAGAAC AACTGTCATT GATCACGTCA CTAATTTCAA ATCTCAAAAT 3180TATGACTGAG AGAGGAGGAA AGAAAGACCA AAATGAATCC AATGAGAGAG TATCCATGAT 3240CAAAACAAAA TTGAAAGAAG AAAAGATCAA GAAGACCAGG TTTGACCCAC TTATGGAGGC 3300ACAAGGCATT GACAAGAATA TACCCGATCT ATATCGACAT GCAGGAGATA CACTAGAGAA 3360CGATGTACAA GTTAAATCAG AGATATTAAG TTCATACAAT GAGTCAAATG CAACAAGACT 3420AATACCCAAA AAAGTGAGCA GTACAATGAG ATCACTAGTT GCAGTCATCA ACAACAGCAA 3480TCTCTCACAA AGCACAAAAC AATCATACAT AAACGAACTC AAACGTTGCA AAAATGATGA 3540AGAAGTATCT GAATTAATGG ACATGTTCAA TGAAGATGTC AACAATTGCC AATGATCCAA 3600CAAAGAAACG ACACCGAACA AACAGACAAG AAACAACAGT AGATCAAAAC CTGTCAACAC 3660ACACAAAATC AAGCAGAATG AAACAACAGA TATCAATCAA TATACAAATA AGAAAAACTT 3720AGGATTAAAG AATAAATTAA TCCTTGTCCA AAATGAGTAT AACTAACTCT GCAATATACA 3780CATTCCCAGA ATCATCATTC TCTGAAAATG GTCATATAGA ACCATTACCA CTCAAAGTCA 3840ATGAACAGAG GAAAGCAGTA CCCCACATTA GAGTTGCCAA GATCGGAAAT CCACCAAAAC 3900ACGGATCCCG GTATTTAGAT GTCTTCTTAC TCGGCTTCTT CGAGATGGAA CGAATCAAAG 3960ACAAATACGG GAGTGTGAAT GATCTCGACA GTGACCCGAG TTACAAAGTT TGTGGCTCTG 4020GATCATTACC AATCGGATTG GCTAAGTACA CTGGGAATGA CCAGGAATTG TTACAAGCCG 4080CAACCAAACT GGATATAGAA GTGAGAAGAA CAGTCAAAGC GAAAGAGATG GTTGTTTACA 4140CGGTACAAAA TATAAAACCA GAACTGTACC CATGGTCCAA TAGACTAAGA AAAGGAATGC 4200TGTTCGATGC CAACAAAGTT GCTCTTGCTC CTCAATGTCT TCCACTAGAT AGGAGCATAA 4260AATTTAGAGT AATCTTCGTG AATTGTACGG CAATTGGATC AATAACCTTG TTCAAAATTC 4320CTAAGTCAAT GGCATCACTA TCGTTAACCA ACACAATATC AATCAATCTG CAGGTACACA 4380TAAAAACAGG GGTTCAGACT GATTCTAAAG GGATAGTTCA AATTTTGGAT GAGAAAGGCG 4440AAAAATCACT GAATTTCATG GTCCATCTCG GATTGATCAA AAGAAAAGTA GGCAGAATGT 4500ACTCTGTTGA ATACTGTAAA CAGAAAATCG AGAAAATGAG ATTGATATTT TCTTTAGGAC 4560TAGTTGGAGG AATCAGTCTT CATGTCAATG CAACTGGGTC CATATCAAAA ACACTAGCAA 4620GTCAGCTGGT ATTCAAAAGA GAGATTTGTT ATCCTTTAAT GGATCTAAAT CCGCATCTCA 4680ATCTAGTTAT CTGGGCTTCA TCAGTAGAGA TTACAAGAGT GGATGCAATT TTCCAACCTT 4740CTTTACCTGG CGAGTTCAGA TACTATCCTA ATATTATTGC AAAAGGAGTT GGGAAAATCA 4800AACAATGGAA CTAGTAATCT CTATTTTAGT CCGGACGTAT CTATTAAGCC GAAGCAAATA 4860AAGGATAATC AAAAACTTAG GACAAAAGAG GTCAATACCA ACAACTATTA GCAGTCACAC 4920TCGCAAGAAT AAGAGAGAAG GGACCAAAAA AGTCAAATAG GAGAAATCAA AACAAAAGGT 4980ACAGAACACC AGAACAACAA AATCAAAACA TCCAACTCAC TCAAAACAAA AATTCCAAAA 5040GAGACCGGCA ACACAACAAG CACTGAACAC AATGCCAACT TCAATACTGC TAATTATTAC 5100AACCATGATC ATGGCATCTT TCTGCCAAAT AGATATCACA AAACTACAGC ACGTAGGTGT 5160ATTGGTCAAC AGTCCCAAAG GGATGAAGAT ATCACAAAAC TTTGAAACAA GATATCTAAT 5220TTTGAGCCTC ATACCAAAAA TAGAAGACTC TAACTCTTGT GGTGACCAAC AGATCAAGCA 5280ATACAAGAAG TTATTGGATA GACTGATCAT CCCTTTATAT GATGGATTAA GATTACAGAA 5340AGATGTGATA GTAACCAATC AAGAATCCAA TGAAAACACT GATCCCAGAA CAAAACGATT 5400CTTTGGAGGG GTAATTGGAA CCATTGCTCT GGGAGTAGCA ACCTCAGCAC AAATTACAGC 5460GGCAGTTGCT CTGGTTGAAG CCAAGCAGGC AAGATCAGAC ATCGAAAAAC TCAAAGAAGC 5520AATTAGGGAC ACAAACAAAG CAGTGCAGTC AGTTCAGAGC TCCATAGGAA ATTTAATAGT 5580AGCAATTAAA TCAGTCCAGG ATTATGTTAA CAAAGAAATC GTGCCATCGA TTGCGAGGCT 5640AGGTTGTGAA GCAGCAGGAC TTCAATTAGG AATTGCATTA ACACAGCATT ACTCAGAATT 5700AACAAACATA TTTGGTGATA ACATAGGATC GTTACAAGAA AAAGGAATAA AATTACAAGG 5760TATAGCATCA TTATACCGCA CAAATATCAC AGAAATATTC ACAACATCAA CAGTTGATAA 5820ATATGATATC TATGATCTGT TATTTACAGA ATCAATAAAG GTGAGAGTTA TAGATGTTGA 5880CTTGAATGAT TACTCAATCA CCCTCCAAGT CAGACTCCCT TTATTAACTA GGCTGCTGAA 5940CACTCAGATC TACAAAGTAG ATTCCATATC ATATAACATC CAAAACAGAG AATGGTATAT 6000CCCTCTTCCC AGCCATATCA TGACGAAAGG GGCATTTCTA GGTGGAGCAG ACGTCAAAGA 6060ATGTATAGAA GCATTCAGCA GCTATATATG CCCTTCTGAT CCAGGATTTG TATTAAACCA 6120TGAAATAGAG AGCTGCTTAT CAGGAAACAT ATCCCAATGT CCAAGAACAA CGGTCACATC 6180AGACATTGTT CCAAGATATG CATTTGTCAA TGGAGGAGTG GTTGCAAACT GTATAACAAC 6240CACCTGTACA TGCAACGGAA TTGGTAATAG AATCAATCAA CCACCTGATC AAGGAGTAAA 6300AATTATAACA CATAAAGAAT GTAGTACTGT GGGTATCAAC GGAATGCTGT TCAATACAAA 6360TAAAGAAGGA ACTCTTGCAT TCTATACACC AAATGATATA ACACTAAACA ATTCTGTTAC 6420ACTGGATCCA ATTGACATAT CAATCGAGCT CAACAAGGCC AAATCAGATC TAGAAGAATC 6480AAAAGAATGG ATAAGAAGGT CAAATCAAAA ACTAGATTCT ATTGGAAATT GGCATCAATC 6540TAGCACTACA ATCATAATTA TTTTGATAAT GATCATTATA TTGTTTATAA TTAATATAAC 6600GATAATTACA ATTGCAATTA AGTATTACAG AATTCAAAAG AGAAATCGAG TGGATCAAAA 6660TGACAAGCCA TATGTACTAA CAAACAAATA ACATATCTAC AGATCATTAG ATATTAAAAT 6720TATAAAAAAC TTAGGAGTAA AGTTACGCAA TCCAACTCTA CTCATATAAT TGAGGAAGGA 6780CCCAATAGAC AAATCCAAAT TCGAGATGGA ATACTGGAAG CATACCAATC ACGGAAAGGA 6840TGCTGGTAAT GAGCTGGAGA CGTCTATGGC TACTCATGGC AACAAGCTCA CTAATAAGAT 6900AATATACATA TTATGGACAA TAATCCTGGT GTTATTATCA ATAGTCTTCA TCATAGTGCT 6960AATTAATTCC ATCAAAAGTG AAAAGGCCCA CGAATCATTG CTGCAAGACA TAAATAATGA 7020GTTTATGGAA ATTACAGAAA AGATCCAAAT GGCATCGGAT AATACCAATG ATCTAATACA 7080GTCAGGAGTG AATACAAGGC TTCTTACAAT TCAGAGTCAT GTCCAGAATT ACATACCAAT 7140ATCATTGACA CAACAGATGT CAGATCTTAG GAAATTCATT AGTGAAATTA CAATTAGAAA 7200TGATAATCAA GAAGTGCTGC CACAAAGAAT AACACATGAT GTAGGTATAA AACCTTTAAA 7260TCCAGATGAT TTTTGGAGAT GCACGTCTGG TCTTCCATCT TTAATGAAAA CTCCAAAAAT 7320AAGGTTAATG CCAGGGCCGG GATTATTAGC TATGCCAACG ACTGTTGATG GCTGTGTTAG 7380AACTCCGTCT TTAGTTATAA ATGATCTGAT TTATGCTTAT ACCTCAAATC TAATTACTCG 7440AGGTTGTCAG GATATAGGAA AATCATATCA AGTCTTACAG ATAGGGATAA TAACTGTAAA 7500CTCAGACTTG GTACCTGACT TAAATCCTAG GATCTCTCAT ACCTTTAACA TAAATGACAA 7560TAGGAAGTCA TGTTCTCTAG CACTCCTAAA TATAGATGTA TATCAACTGT GTTCAACTCC 7620CAAAGTTGAT GAAAGATCAG ATTATGCATC ATCAGGCATA GAAGATATTG TACTTGATAT 7680TGTCAATTAT GATGGTTCAA TCTCAACAAC AAGATTTAAG AATAATAACA TAAGCTTTGA 7740TCAACCATAT GCTGCACTAT ACCCATCTGT TGGACCAGGG ATATACTACA AAGGCAAAAT 7800AATATTTCTC GGGTATGGAG GTCTTGAACA TCCAATAAAT GAGAATGTAA TCTGCAACAC 7860AACTGGGTGC CCCGGGAAAA CACAGAGAGA CTGTAATCAA GCATCTCATA GTACTTGGTT 7920TTCAGATAGG AGGATGGTCA ACTCCATCAT TGTGGCTGAC AAAGGCTTAA ACTCAATTCC 7980AAAATTGAAA GTATGGACGA TATCTATGCG ACAAAATTAC TGGGGGTCAG AAGGAAGGTT 8040ACTTCTACTA GGTAACAAGA TCTATATATA TACAAGATCT ACAAGTTGGC ATAGCAAGTT 8100ACAATTAGGA ATAATTGATA TTACTGATTA CAGTGATATA AGGATAAAAT GGACATGGCA 8160TAATGTGCTA TCAAGACCAG GAAACAATGA ATGTCCATGG GGACATTCAT GTCCAGATGG 8220ATGTATAACA GGAGTATATA CTGATGCATA TCCACTCAAT CCCACAGGGA GCATTGTGTC 8280ATCTGTCATA TTAGACTCAC AAAAATCGAG AGTGAACCCA GTCATAACTT ACTCAACAGC 8340AACCGAAAGA GTAAACGAGC TGGCCATCCT AAACAGAACA CTCTCAGCTG GATATACAAC 8400AACAAGCTGC ATTACACACT ATAACAAAGG ATATTGTTTT CATATAGTAG AAATAAATCA 8460TAAAAGCTTA AACACATTTC AACCCATGTT GTTCAAAACA GAGATTCCAA AAAGCTGCAG 8520TTAATCATAA TTAACCATAA TATGCATCAA TCTATCTATA ATACAAGTAT ATGATAAGTA 8580ATCAGCAATC AGACAATAGA CAAAAGGGAA ATATAAAAAA CTTAGGAGCA AAGCGTGCTC 8640GGGAAATGGA CACTGAATCT AACAATGGCA CTGTATCTGA CATACTCTAT CCTGAGTGTC 8700ACCTTAACTC TCCTATCGTT AAAGGTAAAA TAGCACAATT ACACACTATT ATGAGTCTAC 8760CTCAGCCTTA TGATATGGAT GACGACTCAA TACTAGTTAT CACTAGACAG AAAATAAAAC 8820TTAATAAATT GGATAAAAGA CAACGATCTA TTAGAAGATT AAAATTAATA TTAACTGAAA 8880AAGTGAATGA CTTAGGAAAA TACACATTTA TCAGATATCC AGAAATGTCA AAAGAAATGT 8940TCAAATTATA TATACCTGGT ATTAACAGTA AAGTGACTGA ATTATTACTT AAAGCAGATA 9000GAACATATAG TCAAATGACT GATGGATTAA GAGATCTATG GATTAATGTG CTATCAAAAT 9060TAGCCTCAAA AAATGATGGA AGCAATTATG ATCTTAATGA AGAAATTAAT AATATATCGA 9120AAGTTCACAC AACCTATAAA TCAGATAAAT GGTATAATCC ATTCAAAACA TGGTTTACTA 9180TCAAGTATGA TATGAGAAGA TTACAAAAAG CTCGAAATGA GATCACTTTT AATGTTGGGA 9240AGGATTATAA CTTGTTAGAA GACCAGAAGA ATTTCTTATT GATACATCCA GAATTGGTTT 9300TGATATTAGA TAAACAAAAC TATAATGGTT ATCTAATTAC TCCTGAATTA GTATTGATGT 9360ATTGTGACGT AGTCGAAGGC CGATGGAATA TAAGTGCATG TGCTAAGTTA GATCCAAAAT 9420TACAATCTAT GTATCAGAAA GGTAATAACC TGTGGGAAGT GATAGATAAA TTGTTTCCAA 9480TTATGGGAGA AAAGACATTT GATGTGATAT CGTTATTAGA ACCACTTGCA TTATCCTTAA 9540TTCAAACTCA TGATCCTGTT AAACAACTAA GAGGAGCTTT TTTAAATCAT GTGTTATCCG 9600AGATGGAATT AATATTTGAA TCTAGAGAAT CGATTAAGGA ATTTCTGAGT GTAGATTACA 9660TTGATAAAAT TTTAGATATA TTTAATAAGT CTACAATAGA TGAAATAGCA GAGATTTTCT 9720CTTTTTTTAG AACATTTGGG CATCCTCCAT TAGAAGCTAG TATTGCAGCA GAAAAGGTTA 9780GAAAATATAT GTATATTGGA AAACAATTAA AATTTGACAC TATTAATAAA TGTCATGCTA 9840TCTTCTGTAC AATAATAATT AACGGATATA GAGAGAGGCA TGGTGGACAG TGGCCTCCTG 9900TGACATTACC TGATCATGCA CACGAATTCA TCATAAATGC TTACGGTTCA AACTCTGCGA 9960TATCATATGA AAATGCTGTT GATTATTACC AGAGCTTTAT AGGAATAAAA TTCAATAAAT 10020TCATAGAGCC TCAGTTAGAT GAGGATTTGA CAATTTATAT GAAAGATAAA GCATTATCTC 10080CAAAAAAATC AAATTGGGAC ACAGTTTATC CTGCATCTAA TTTACTGTAC CGTACTAACG 10140CATCCAACGA ATCACGAAGA TTAGTTGAAG TATTTATAGC AGATAGTAAA TTTGATCCTC 10200ATCAGATATT GGATTATGTA GAATCTGGGG ACTGGTTAGA TGATCCAGAA TTTAATATTT 10260CTTATAGTCT TAAAGAAAAA GAGATCAAAC AGGAAGGTAG ACTCTTTGCA AAAATGACAT 10320ACAAAATGAG AGCTACACAA GTTTTATCAG AGACCCTACT TGCAAATAAC ATAGGAAAAT 10380TCTTTCAAGA AAATGGGATG GTGAAGGGAG AGATTGAATT ACTTAAGAGA TTAACAACCA 10440TATCAATATC AGGAGTTCCA CGGTATAATG AAGTGTACAA TAATTCTAAA AGCCATACAG 10500ATGACCTTAA AACCTACAAT AAAATAAGTA ATCTTAATTT GTCTTCTAAT CAGAAATCAA 10560AGAAATTTGA ATTCAAGTCA ACGGATATCT ACAATGATGG ATACGAGACT GTGAGCTGTT 10620TCCTAACAAC AGATCTCAAA AAATACTGTC TTAATTGGAG ATATGAATCA ACAGCTCTAT 10680TTGGAGAAAC TTGCAACCAA ATATTTGGAT TAAATAAATT GTTTAATTGG TTACACCCTC 10740GTCTTGAAGG AAGTACAATC TATGTAGGTG ATCCTTACTG TCCTCCATCA GATAAAGAAC 10800ATATATCATT AGAGGATCAC CCTGATTCTG GTTTTTACGT TCATAACCCA AGAGGGGGTA 10860TAGAAGGATT TTGTCAAAAA TTATGGACAC TCATATCTAT AAGTGCAATA CATCTAGCAG 10920CTGTTAGAAT AGGCGTGAGG GTGACTGCAA TGGTTCAAGG AGACAATCAA GCTATAGCTG 10980TAACCACAAG AGTACCCAAC AATTATGACT ACAGAGTTAA GAAGGAGATA GTTTATAAAG 11040ATGTAGTGAG ATTTTTTGAT TCATTAAGAG AAGTGATGGA TGATCTAGGT CATGAACTTA 11100AATTAAATGA AACGATTATA AGTAGCAAGA TGTTCATATA TAGCAAAAGA ATCTATTATG 11160ATGGGAGAAT TCTTCCTCAA GCTCTAAAAG CATTATCTAG ATGTGTCTTC TGGTCAGAGA 11220CAGTAATAGA CGAAACAAGA TCAGCATCTT CAAATTTGGC AACATCATTT GCAAAAGCAA 11280TTGAGAATGG TTATTCACCT GTTCTAGGAT ATGCATGCTC AATTTTTAAG AATATTCAAC 11340AACTATATAT TGCCCTTGGG ATGAATATCA ATCCAACTAT AACACAGAAT ATCAGAGATC 11400AGTATTTTAG GAATCCAAAT TGGATGCAAT ATGCCTCTTT AATACCTGCT AGTGTTGGGG 11460GATTCAATCA CATGGCGATG TCAAGATGTT TTGTAAGGAA TATTGGTGAT CCATCAGTTG 11520CCGCATTGGC TGATATTAAA AGATTTATTA AGGCGAATCT ATTAGACCGA AGTGTTCTTT 11580ATAGGATTAT GAATCAAGAA CCAGGTGAGT CATCTTTTTT TGATTGGGCT TCAGATCCAT 11640ATTCATGCAA TTTACCACAA TCTCAAAATA TAACCACCAT GATAAAAAAT ATAACAGCAA 11700GGAATGTATT ACAAGATTCA CCAAATCCAT TATTATCTGG ATTATTCACA AATACAATGA 11760TAGAAGAAGA TGAAGAATTA GCTGAGTTCC TGATGGACAG GAAGGTAATT CTCCCTAGAG 11820TTGCACATGA TATTCTAGAT AATTCTCTCA CAGGAATTAG AAATGCCATA GCTGGAATGT 11880TAGATACGAC AAAATCACTA ATTCGGGTTG GCATAAATAG AGGAGGACTG ACATATAGTT 11940TGTTGAGGAA AATCAGTAAT TACGATCTAG TACAATATGA AACACTAAGT AGGACTTTGC 12000GACTAATTGT AAGTGATAAA ATCAAGTATG AAGATATGTG TTCGGTAGAC CTTGCCATAG 12060CATTGCGACA AAAGATGTGG ATTCATTTAT CAGGAGGAAG GATGATAAGT GGACTTGAAA 12120CGCCTGACCC ATTAGAATTA CTATCTGGGG TAGTAATAAC AGGATCAGAA CATTGTAAAA 12180TATGTTATTC TTCAGATGGC ACAAACCCAT ATACTTGGAT GTATTTACCC GGTAATATCA 12240AAATAGGATC AGCAGAAACA GGTATATCGT CATTAAGAGT TCCTTATTTT GGATCAGTCA 12300CTGATGAAAG ATCTGAAGCA CAATTAGGAT ATATCAAGAA TCTTAGTAAA CCTGCAAAAG 12360CCGCAATAAG AATAGCAATG ATATATACAT GGGCATTTGG TAATGATGAG ATATCTTGGA 12420TGGAAGCCTC ACAGATAGCA CAAACACGTG CAAATTTTAC ACTAGATAGT CTCAAAATTT 12480TAACACCGGT AGCTACATCA ACAAATTTAT CACACAGATT AAAGGATACT GCAACTCAGA 12540TGAAATTCTC CAGTACATCA TTGATCAGAG TCAGCAGATT CATAACAATG TCCAATGATA 12600ACATGTCTAT CAAAGAAGCT AATGAAACCA AAGATACTAA TCTTATTTAT CAACAAATAA 12660TGTTAACAGG ATTAAGTGTT TTCGAATATT TATTTAGATT AAAAGAAACC ACAGGACACA 12720ACCCTATAGT TATGCATCTG CACATAGAAG ATGAGTGTTG TATTAAAGAA AGTTTTAATG 12780ATGAACATAT TAATCCAGAG TCTACATTAG AATTAATTCG ATATCCTGAA AGTAATGAAT 12840TTATTTATGA TAAAGACCCA CTCAAAGATG TGGACTTATC AAAACTTATG GTTATTAAAG 12900ACCATTCTTA CACAATTGAT ATGAATTATT GGGATGATAC TGACATCATA CATGCAATTT 12960CAATATGTAC TGCAATTACA ATAGCAGATA CTATGTCACA ATTAGATCGA GATAATTTAA 13020AAGAGATAAT AGTTATTGCA AATGATGATG ATATTAATAG CTTAATCACT GAATTTTTGA 13080CTCTTGACAT ACTTGTATTT CTCAAGACAT TTGGTGGATT ATTAGTAAAT CAATTTGCAT 13140ACACTCTTTA TAGTCTAAAA ATAGAAGGTA GGGATCTCAT TTGGGATTAT ATAATGAGAA 13200CACTGAGAGA TACTTCCCAT TCAATATTAA AAGTATTATC TAATGCATTA TCTCATCCTA 13260AAGTATTCAA GAGGTTCTGG GATTGTGGAG TTTTAAACCC TATTTATGGG CCTAATATCG 13320CTAGTCAAGA CCAGATAAAA CTTGCCCTAT CTATATGTGA ATATTCACTA GATCTATTTA 13380TGAGAGAATG GTTGAATGGT GTATCACTTG AAATATACAT TTGTGACAGC GATATGGAAG 13440TTGCAAATGA TAGGAAACAA GCCTTTATTT CTAGACACCT TTCATTTGTT TGTTGTTTAG 13500CAGAAATTGC ATCTTTCGGA CCTAACCTGT TAAACTTAAC ATACTTGGAG AGACTTGATC 13560TATTGAAACA ATATCTTGAA TTAAATATTA AAGAAGACCC TACTCTTAAA TATGTACAAA 13620TATCTGGATT ATTAATTAAA TCGTTCCCAT CAACTGTAAC ATACGTAAGA AAGACTGCAA 13680TCAAATATCT AAGGATTCGC GGTATTAGTC CACCTGAGGT AATTGATGAT TGGGATCCGG 13740TAGAAGATGA AAATATGCTG GATAACATTG TCAAAACTAT AAATGATAAC TGTAATAAAG 13800ATAATAAAGG GAATAAAATT AACAATTTCT GGGGACTAGC ACTTAAGAAC TATCAAGTCC 13860TTAAAATCAG ATCTATAACA AGTGATTCTG ATGATAATGA TAGACTAGAT GCTAATACAA 13920GTGGTTTGAC ACTTCCTCAA GGAGGGAATT ATCTATCGCA TCAATTGAGA TTATTCGGAA 13980TCAACAGCAC TAGTTGTCTG AAAGCTCTTG AGTTATCACA AATTTTAATG AAGGAAGTCA 14040ATAAAGACAA GGACAGGCTC TTCCTGGGAG AAGGAGCAGG AGCTATGCTA GCATGTTATG 14100ATGCCACATT AGGACCTGCA GTTAATTATT ATAATTCAGG TTTGAATATA ACAGATGTAA 14160TTGGTCAACG AGAATTGAAA ATATTTCCTT CAGAGGTATC ATTAGTAGGT AAAAAATTAG 14220GAAATGTGAC ACAGATTCTT AACAGGGTAA AAGTACTGTT CAATGGGAAT CCTAATTCAA 14280CATGGATAGG AAATATGGAA TGTGAGAGCT TAATATGGAG TGAATTAAAT GATAAGTCCA 14340TTGGATTAGT ACATTGTGAT ATGGAAGGAG CTATCGGTAA ATCAGAAGAA ACTGTTCTAC 14400ATGAACATTA TAGTGTTATA AGAATTACAT ACTTGATTGG GGATGATGAT GTTGTTTTAG 14460TTTCCAAAAT TATACCTACA ATCACTCCGA ATTGGTCTAG AATACTTTAT CTATATAAAT 14520TATATTGGAA AGATGTAAGT ATAATATCAC TCAAAACTTC TAATCCTGCA TCAACAGAAT 14580TATATCTAAT TTCGAAAGAT GCATATTGTA CTATAATGGA ACCTAGTGAA ATTGTTTTAT 14640CAAAACTTAA AAGATTGTCA CTCTTGGAAG AAAATAATCT ATTAAAATGG ATCATTTTAT 14700CAAAGAAGAG GAATAATGAA TGGTTACATC ATGAAATCAA AGAAGGAGAA AGAGATTATG 14760GAATCATGAG ACCATATCAT ATGGCACTAC AAATCTTTGG ATTTCAAATC AATTTAAATC 14820ATCTGGCGAA AGAATTTTTA TCAACCCCAG ATCTGACTAA TATCAACAAT ATAATCCAAA 14880GTTTTCAGCG AACAATAAAG GATGTTTTAT TTGAATGGAT TAATATAACT CATGATGATA 14940AGAGACATAA ATTAGGCGGA AGATATAACA TATTCCCACT GAAAAATAAG GGAAAGTTAA 15000GACTGCTATC GAGAAGACTA GTATTAAGTT GGATTTCATT ATCATTATCG ACTCGATTAC 15060TTACAGGTCG CTTTCCTGAT GAAAAATTTG AACATAGAGC ACAGACTGGA TATGTATCAT 15120TAGCTGATAC TGATTTAGAA TCATTAAAGT TATTGTCGAA AAACATCATT AAGAATTACA 15180GAGAGTGTAT AGGATCAATA TCATATTGGT TTCTAACCAA AGAAGTTAAA ATACTTATGA 15240AATTGATCGG TGGTGCTAAA TTATTAGGAA TTCCCAGACA ATATAAAGAA CCCGAAGACC 15300AGTTATTAGA AAACTACAAT CAACATGATG AATTTGATAT CGATTAAAAC ATAAATACAA 15360TGAAGATATA TCCTAACCTT TATCTTTAAG CCTAGGAATA GACAAAAAGT AAGAAAAACA 15420TGTAATATAT ATATACCAAA CAGAGTTCTT CTCTTGTTTG GT 15462(2) 서열 46의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 46:TTGTCTGGGA AT 12(2) 서열 47의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 47:TTGCCTGGGA AT 12(2) 서열 48의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 48:TTGTTTGGGA AT 12(2) 서열 49의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 49:TTGTCTGGTA AT 12(2) 서열 50의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 50:AACTTTAAAT TA 12(2) 서열 51의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 51:AACTTAAAAT TA 12(2) 서열 52의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 52:TTAAAGACAT TG 12(2) 서열 53의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 53:TTTAAGACAT TG 12(2) 서열 54의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 54:GCAGATGTCA AG 12(2) 서열 55의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 55:GCAGATGCCA AG 12(2) 서열 56의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 56:CGAATCTAAA GA 12(2) 서열 57의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 57:CGAAGCTAAA GA 12(2) 서열 58의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 58:GAAATATTGA TC 12(2) 서열 59의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 59:GAAACATTGA TC 12(2) 서열 60의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 60:TCTCTACCCA AC 12(2) 서열 61의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 61:TCGTTAACCA AC 12(2) 서열 62의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 62:AGTACAATAG GT 12(2) 서열 63의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 63:AGTACTGTGG GT 12(2) 서열 64의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 64:GCACTTGATC CA 12(2) 서열 65의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 65:ACACTGGATC CA 12(2) 서열 66의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 19 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 66:CCATCATTGT TGTTGACAA 19(2) 서열 67의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 19 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 67:CCATCATTGT GGCTGACAA 19(2) 서열 68의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 11 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 68:TTACATGGCC A 11(2) 서열 69의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 11 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 69:TCACATGGCG A 11(2) 서열 70의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 70:TTTGGACTGG GC 12(2) 서열 71의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 71:TTTTGATTGG GC 12(2) 서열 72의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 72:GGTCCTAATA CT 12(2) 서열 73의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 12 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 73:GGGCCTAATA TC 12(2) 서열 74의 정보:(i) 서열 특성:(A) 길이: 38 염기쌍(B) 종류: 핵산(C) 가닥: 단일(D) 형태: 선형(ii) 분자 종류: cDNA(xi) 서열 설명: 서열 74CCATAGAGAG TCCATGGAAA GCGACGCTAA AAACTATC 38
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US4757597P | 1997-05-23 | 1997-05-23 | |
US5938597P | 1997-09-19 | 1997-09-19 | |
US60/059,385 | 1997-09-19 | ||
US60/047,575 | 1997-09-19 | ||
PCT/US1998/010551 WO1998053078A1 (en) | 1997-05-23 | 1998-05-22 | Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20010012893A true KR20010012893A (ko) | 2001-02-26 |
KR100702523B1 KR100702523B1 (ko) | 2007-04-04 |
Family
ID=26725195
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1019997010859A KR100702523B1 (ko) | 1997-05-23 | 1998-05-22 | 클로닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된파라인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0994949B1 (ko) |
JP (2) | JP4237268B2 (ko) |
KR (1) | KR100702523B1 (ko) |
CN (1) | CN1250725C (ko) |
AT (1) | ATE501259T1 (ko) |
AU (1) | AU7797798A (ko) |
BR (1) | BR9809456B1 (ko) |
CA (1) | CA2291216A1 (ko) |
DE (1) | DE69842165D1 (ko) |
WO (1) | WO1998053078A1 (ko) |
Families Citing this family (99)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7465574B2 (en) | 1994-09-30 | 2008-12-16 | Medimmune, Llc | Recombinant RSV virus expression systems and vaccines |
US7485440B2 (en) | 1995-09-27 | 2009-02-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of M2 ORF2 |
BR9710363A (pt) | 1996-07-15 | 2000-01-11 | Us Gov Health & Human Serv | "vìrus sincicial respirátorio recombinante infeccioso isolado, partìcula do mesmo, processos para estimular o sistema imunológico de um indivìduo para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório e para produzir uma partìcula de vìrus sincicial respiratório recombinante, vacina para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório recombinante composição e ceta de vìrus sincicial respiratório recombinante" |
US6699476B1 (en) | 1996-07-15 | 2004-03-02 | Peter L. Collins | Production of recombinant respiratory syncytial viruses expressing immune modulatory molecules |
US20030082209A1 (en) | 2000-07-05 | 2003-05-01 | Skiadopoulos Mario H. | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines |
US7951383B2 (en) | 1997-05-23 | 2011-05-31 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Attenuated parainfluenza virus (PIV) vaccines |
US7201907B1 (en) | 1997-05-23 | 2007-04-10 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus(PIV) vaccines |
US6410023B1 (en) | 1997-05-23 | 2002-06-25 | United States Of America | Recombinant parainfluenza virus vaccines attenuated by deletion or ablation of a non-essential gene |
US7250171B1 (en) | 1997-05-23 | 2007-07-31 | United States Of America As Represented By The Dept. Of Health & Human Services | Construction and use of recombinant parainfluenza viruses expressing a chimeric glycoprotein |
US7192593B2 (en) | 1997-05-23 | 2007-03-20 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of recombinant parainfluenza viruses (PIVs) as vectors to protect against infection and disease caused by PIV and other human pathogens |
US7632508B2 (en) | 1997-05-23 | 2009-12-15 | The United States Of America | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines |
US7314631B1 (en) | 1997-05-23 | 2008-01-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Use of recombinant live-attenuated parainfluenza virus (PIV) as a vector to protect against disease caused by PIV and respiratory syncytial virus (RSV) |
US6830748B1 (en) | 1997-09-26 | 2004-12-14 | Medimmune Vaccines, Inc. | Recombinant RSV virus expression systems and vaccines |
ATE384126T1 (de) | 1998-06-12 | 2008-02-15 | Sinai School Medicine | Interferon induzierende genetisch veränderte attenuierte viren |
DK1085904T3 (da) | 1998-06-12 | 2013-02-25 | Sinai School Medicine | Svækkede minusstreng-vira med ændret interferon-antagonist-aktivitet til anvendelse som vacciner og lægemidler |
US6146642A (en) | 1998-09-14 | 2000-11-14 | Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York | Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines |
US6544785B1 (en) | 1998-09-14 | 2003-04-08 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses |
US8715940B2 (en) | 1999-04-06 | 2014-05-06 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of making recombinant influenza virus |
MXPA01010320A (es) | 1999-04-13 | 2003-09-15 | Us Health | Produccion de vacunas con virus sincitial respiratorio quimerico atenuado a partir de secuencias nucleotidas clonadas. |
EP1287152B1 (en) | 1999-07-09 | 2008-12-31 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES | Human-bovine chimeric respiratory syncytial virus vaccines |
CA2378661A1 (en) | 1999-07-09 | 2001-01-18 | Alexander C. Schmidt | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (piv) vaccines |
US7820182B2 (en) | 1999-07-09 | 2010-10-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Production of attenuated, human-bovine chimeric respiratory syncytial viruses for use in immunogenic compositions |
JP4795597B2 (ja) * | 1999-12-10 | 2011-10-19 | アメリカ合衆国 | パラインフルエンザウィルス(piv)及びヒトの病原体により引き起こされる感染及び疾病を保護するためへの組換えpivのベクターとしての使用 |
US6764685B1 (en) * | 2000-03-21 | 2004-07-20 | Medimmune Vaccines, Inc. | Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines |
US6635416B2 (en) | 2000-04-10 | 2003-10-21 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents |
DE60124098T2 (de) | 2000-06-23 | 2007-04-05 | Wyeth Holdings Corp. | Modifiziertes Morbillivirus V Proteine |
WO2002002605A2 (en) * | 2000-07-05 | 2002-01-10 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (piv) vaccines |
US8715922B2 (en) | 2001-01-19 | 2014-05-06 | ViroNovative | Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals |
KR100964413B1 (ko) | 2001-01-19 | 2010-06-15 | 비로노바티브 비.브이. | 감응성 포유류에서 호흡계 질환을 유발하는 바이러스 |
EP1456398B1 (en) * | 2001-11-21 | 2011-05-11 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Recovery of recombinant human parainfluenza virus type 1 (hpivi) from cdna |
EP2327418A1 (en) | 2002-02-21 | 2011-06-01 | MedImmune, LLC | Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from other viruses |
US8012736B2 (en) | 2002-04-26 | 2011-09-06 | Medimmune, Llc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
US7465456B2 (en) | 2002-04-26 | 2008-12-16 | Medimmune, Llc | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
WO2004027037A2 (en) | 2002-09-18 | 2004-04-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | RECOVERY OF RECOMBINANT HUMAN PARAINFLUENZA VIRUS TYPE 2 (HPIV2) FROM cDNA AND USE OF RECOMBINANT HPIV2 IN IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AND AS VECTORS TO ELICIT IMMUNE RESPONSES AGAINST PIV AND OTHER HUMAN PATHOGENS |
US7704491B2 (en) | 2003-02-28 | 2010-04-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant human metapneumovirus and its use |
EP2494986A1 (en) | 2003-04-25 | 2012-09-05 | MedImmune Vaccines, Inc. | Metapneumovirus strains and their use in vaccine formulations and as vectors for expression of antigenic sequences and methods for propagating virus |
US8475806B2 (en) | 2003-05-28 | 2013-07-02 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines and gene therapy |
MXPA05013141A (es) | 2003-06-09 | 2006-03-17 | Wyeth Corp | Metodo mejorado para la recuperacion de arn virus de cadena negativa, no segmentados, a partir de adnc. |
WO2005018539A2 (en) | 2003-06-16 | 2005-03-03 | Medimmune Vaccines, Inc. | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
EP1697521B1 (en) | 2003-12-23 | 2010-06-02 | MedImmune, LLC | Multi plasmid system for the production of influenza virus |
ES2393492T3 (es) | 2004-05-25 | 2012-12-21 | Medimmune, Llc | Variantes de hemaglutinina y neuraminidasa de influenza |
WO2006083286A2 (en) | 2004-06-01 | 2006-08-10 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Genetically engineered swine influenza virus and uses thereof |
EP1814990A2 (en) | 2004-11-19 | 2007-08-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Recombinant influenza vectors with tandem transcription units |
US7572620B2 (en) | 2005-01-11 | 2009-08-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | H3 equine influenza A virus |
EP1855713B1 (en) | 2005-02-15 | 2016-04-27 | Mount Sinai School of Medicine | Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof |
WO2006098901A2 (en) | 2005-03-08 | 2006-09-21 | Medimmune Vaccines, Inc. | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
EP1917352A4 (en) | 2005-06-21 | 2009-03-25 | Medimmune Vaccines Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EXPRESSING HETEROLOGOUS PROTEASE |
US7790434B2 (en) | 2005-06-21 | 2010-09-07 | Medimmune, Llc | Methods and compositions for expressing negative-sense viral RNA in canine cells |
EA016217B1 (ru) | 2005-12-02 | 2012-03-30 | Маунт Синай Скул Оф Медсин | Химерные вирусы, представляющие неприродные поверхностные белки, и их применение |
JP4905649B2 (ja) * | 2006-03-08 | 2012-03-28 | 国立大学法人 長崎大学 | 魚用ワクチン、その製造方法、および魚類感染症の予防方法 |
CA2647985C (en) | 2006-03-31 | 2014-12-30 | Warf-Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines |
JP5491173B2 (ja) | 2006-04-19 | 2014-05-14 | メディミューン,エルエルシー | イヌ細胞中でマイナス鎖ウイルスrnaを発現させるための方法および組成物 |
EP2049662A4 (en) | 2006-07-21 | 2009-12-30 | Medimmune Llc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR INCREASING REPLICATION CAPACITY OF A FLU VIRUS |
CN104278014A (zh) | 2006-08-09 | 2015-01-14 | 米迪缪尼有限公司 | 流感血凝素和神经氨酸酶变体 |
JP5666905B2 (ja) | 2007-06-18 | 2015-02-12 | メディミューン,エルエルシー | ヘマグルチニンポリペプチド中に変化を有するインフルエンザbウイルス |
WO2008156778A2 (en) | 2007-06-18 | 2008-12-24 | Tokiko Watanabe | Influenza m2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines |
CA2730408A1 (en) | 2008-07-11 | 2010-01-14 | Chin-Fen Yang | Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants |
EP2393921B1 (en) | 2009-02-05 | 2015-07-15 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof |
BRPI1008549A2 (pt) | 2009-02-12 | 2016-03-15 | Medimmune Llc | variantes de neuraminidase e hemaglutinina de influenza |
EP3009145A1 (en) | 2009-03-30 | 2016-04-20 | Mount Sinai School of Medicine of New York University | Influenza virus vaccines and uses thereof |
WO2011014504A1 (en) | 2009-07-27 | 2011-02-03 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Recombinant influenza virus vectors and uses thereof |
JP5845180B2 (ja) | 2009-07-30 | 2016-01-20 | モウント シナイ スクール オフ メディシネ | インフルエンザウイルス及びそれらの使用 |
JP2013507990A (ja) | 2009-10-26 | 2013-03-07 | ダブリュエーアールエフ−ウィスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーション | ベロ細胞において増強された複製を有する高力価の組換えインフルエンザウイルス |
US10130697B2 (en) | 2010-03-23 | 2018-11-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses |
CN102939103A (zh) | 2010-03-30 | 2013-02-20 | 西奈山医学院 | 流感病毒疫苗及其应用 |
EP2576581A4 (en) * | 2010-06-06 | 2015-04-15 | Sinai School Medicine | RECOMBINANT RNA VIRUSES AND USES THEREOF |
EP2758075B1 (en) | 2011-09-20 | 2023-05-03 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
AU2013362935B2 (en) | 2012-12-18 | 2018-10-04 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus vaccines and uses thereof |
CA2900713A1 (en) | 2013-02-08 | 2014-08-14 | Steffen Mueller | Attenuation of human respiratory syncytial virus by genome scale codon-pair deoptimization |
JP6596411B2 (ja) | 2013-03-14 | 2019-10-23 | アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ | ニューカッスル病ウイルス及びその使用 |
WO2014159960A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof |
EP3022296B1 (en) | 2013-07-15 | 2022-12-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses with enhanced replication in mdck or vero cells or eggs |
KR102407019B1 (ko) | 2014-02-27 | 2022-06-08 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | 암의 치료를 위한 결합 방법 |
US10053671B2 (en) | 2014-06-20 | 2018-08-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
JP2018504412A (ja) | 2015-01-23 | 2018-02-15 | アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ | インフルエンザウイルスワクチン接種レジメン |
US10029005B2 (en) | 2015-02-26 | 2018-07-24 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Bivalent swine influenza virus vaccine |
US10633422B2 (en) | 2015-06-01 | 2020-04-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA |
US9890363B2 (en) | 2015-07-06 | 2018-02-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
US10548966B2 (en) | 2015-08-20 | 2020-02-04 | University Of Rochester | Single-cycle virus for the development of canine influenza vaccines |
WO2017031401A2 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | University Of Rochester | Ns1 truncated virus for the development of canine influenza vaccines |
WO2017031404A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | University Of Rochester | Live-attenuated vaccine having mutations in viral polymerase for the treatment and prevention of canine influenza virus |
US11197925B2 (en) | 2016-02-19 | 2021-12-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza B virus replication for vaccine development |
MX2018014955A (es) | 2016-06-03 | 2019-05-13 | Univ Rochester | Vacunas atenuadas vivas del virus de la influenza equina. |
CA3023143A1 (en) | 2016-06-15 | 2017-12-21 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof |
EP3515930A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-31 | The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Vaccine candidates for human respiratory syncytial virus (rsv) having attenuated phenotypes |
JP2017038622A (ja) * | 2016-11-21 | 2017-02-23 | ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション | H3型ウマa型インフルエンザウイルス |
CA3058652A1 (en) | 2017-04-07 | 2018-10-11 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof |
JOP20190256A1 (ar) | 2017-05-12 | 2019-10-28 | Icahn School Med Mount Sinai | فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها |
CN110996998A (zh) * | 2017-05-29 | 2020-04-10 | 美利坚合众国- 由健康及人类服务部部长代表 | 表达rsv g的重组嵌合牛/人副流感病毒3及其用途 |
AR114410A1 (es) | 2018-02-27 | 2020-09-02 | Univ Rochester | Vacuna multivalente contra influenza viva atenuada para prevenir y controlar el virus influenza equino (vie) en caballos |
US11166996B2 (en) | 2018-12-12 | 2021-11-09 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Anellovirus compositions and methods of use |
WO2020167432A2 (en) | 2019-01-23 | 2020-08-20 | Yoshihiro Kawaoka | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
WO2020163804A1 (en) | 2019-02-08 | 2020-08-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Humanized cell line |
CA3130781A1 (en) | 2019-02-27 | 2020-09-03 | University Of Rochester | Multivalent live-attenuated influenza vaccine for prevention and control of equine influenza virus (eiv) in horses |
US11390649B2 (en) | 2019-05-01 | 2022-07-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
WO2021041624A2 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Yoshihiro Kawaoka | Recombinant influenza viruses with stabilized ha for replication in eggs |
CN110628724B (zh) * | 2019-09-25 | 2023-04-14 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 一种三型副流感病毒野毒株及其应用 |
CN116348594A (zh) | 2020-05-13 | 2023-06-27 | 美国卫生和人力服务部 | 携带一个或多个p基因突变的rsv疫苗 |
CN113462656B (zh) * | 2021-03-24 | 2022-09-30 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株及其应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU7007491A (en) * | 1990-02-02 | 1991-08-08 | Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern | Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses |
ES2210273T5 (es) * | 1994-07-18 | 2010-03-29 | Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. | Virus con arn de cadena negativa no segmentado recombinante infeccioso. |
JPH11513372A (ja) * | 1995-09-22 | 1999-11-16 | コノート ラボラトリーズ リミテッド | パラインフルエンザウイルスの糖タンパクおよびワクチン |
US5869036A (en) * | 1995-12-08 | 1999-02-09 | St. Louis University | Live attenuated vaccines based on CP45 HPIV-3 strain and method to ensure attenuation in such vaccine |
-
1998
- 1998-05-22 DE DE69842165T patent/DE69842165D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-22 BR BRPI9809456-4A patent/BR9809456B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-05-22 KR KR1019997010859A patent/KR100702523B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-05-22 WO PCT/US1998/010551 patent/WO1998053078A1/en active IP Right Grant
- 1998-05-22 CA CA002291216A patent/CA2291216A1/en not_active Abandoned
- 1998-05-22 EP EP98926055A patent/EP0994949B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-22 AU AU77977/98A patent/AU7797798A/en not_active Abandoned
- 1998-05-22 CN CNB988068869A patent/CN1250725C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-22 JP JP55070498A patent/JP4237268B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-22 AT AT98926055T patent/ATE501259T1/de not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-08-05 JP JP2008202335A patent/JP4384244B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2008307055A (ja) | 2008-12-25 |
CN1250725C (zh) | 2006-04-12 |
BR9809456A (pt) | 2000-06-13 |
EP0994949A1 (en) | 2000-04-26 |
DE69842165D1 (de) | 2011-04-21 |
EP0994949B1 (en) | 2011-03-09 |
CA2291216A1 (en) | 1998-11-26 |
BR9809456B1 (pt) | 2011-06-28 |
JP4384244B2 (ja) | 2009-12-16 |
KR100702523B1 (ko) | 2007-04-04 |
CN1306575A (zh) | 2001-08-01 |
AU7797798A (en) | 1998-12-11 |
WO1998053078A1 (en) | 1998-11-26 |
JP2002502241A (ja) | 2002-01-22 |
JP4237268B2 (ja) | 2009-03-11 |
ATE501259T1 (de) | 2011-03-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1250725C (zh) | 从克隆的核苷酸序列制备减毒副流感病毒疫苗的方法 | |
US6146642A (en) | Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines | |
WO1998013501A2 (en) | 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for attenuation in viruses of the order designated mononegavirales | |
KR20030032971A (ko) | 변형된 모빌리바이러스 v 단백질 | |
CN113322264B (zh) | 具有沉默突变的重组rsv、其相关疫苗和方法 | |
CN113293145A (zh) | 一种麻疹病毒活载体新冠疫苗 | |
US7208161B1 (en) | Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences | |
KR20180085730A (ko) | 키메라 rsv, 면역원성 조성물, 및 사용 방법 | |
CN112739359A (zh) | Apmv及其用于治疗癌症的用途 | |
KR102567994B1 (ko) | 재조합 rsv 생백신주 및 이의 제조 방법 | |
CN110996998A (zh) | 表达rsv g的重组嵌合牛/人副流感病毒3及其用途 | |
KR20210005090A (ko) | 키메라 벡터 | |
AU2002300291B2 (en) | Production Of Attenuated Parainfluenza Virus Vaccines From Cloned Nucleotide Sequences | |
KR20230038205A (ko) | 키메라 rsv 및 코로나바이러스 단백질, 면역원성 조성물, 및 사용 방법 | |
US9434768B2 (en) | Viruses lacking epithelial cell receptor entry | |
KR20180085803A (ko) | 약독화 표현형의 범위를 제공하는 m2-2 orf 변이를 가지는 재조합 호흡기 세포융합 바이러스 균주 | |
JP2002507408A (ja) | 麻疹ウイルスもしくはヒト呼吸合胞体ウイルスサブグループbの弱毒化の原因である突然変異 | |
CN113382748A (zh) | 用于制备和使用病毒样颗粒(vlp)的组合物和方法 | |
KR20230021115A (ko) | 생 약독화된 호흡기 세포융합 바이러스 (live attenuated respiratory syncytial virus) | |
AU783189B2 (en) | Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines | |
Randhawa | Molecular characterisation of the pneumonia virus of mice glycoprotein genes | |
JPH04502902A (ja) | 魚の出血性敗血症ウィルスの組換え型ポリペプチド | |
Hudacek | Tupaia paramyxovirus replication and vector applications | |
AU8933001A (en) | 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for attenuation in viruses of the order designated mononegavirales |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20110311 Year of fee payment: 5 |
|
LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |