CN113462656B

CN113462656B - 一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株及其应用

Info

Publication number: CN113462656B
Application number: CN202110312884.4A
Authority: CN
Inventors: 白慕群; 火文; 关文竹; 李雄雄; 王云瑾; 包红; 寇桂英; 韩平; 王名强
Original assignee: Lanzhou Institute Of Biological Products Co ltd
Current assignee: Lanzhou Institute Of Biological Products Co ltd
Priority date: 2021-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2041-03-24
Also published as: CN113462656A

Abstract

本发明提供了一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株及其应用，所述人三型副流感病毒冷适应温度敏感株为HPIV3CPW3以及包含人三型副流感病毒冷适应温度敏感株的组合物，该人三型副流感病毒株HPIV3CPW3作为三型副流感病毒减毒活疫苗候选毒株，具有剂次效应以及良好的安全性，而且对小鼠肺部HPIV‑3野毒株的感染有显著性保护效力，具有冷适应温度敏感特性的人三型副流感减毒活疫苗将能够有效预防三型副流感病毒的感染，而且该人三型副流感病毒株HPIV3CPW3具有冷适应和温度敏感特性且在小鼠的上下呼吸道也具有温度敏感的特性，这对于在接种的哺乳动物体内激发保护性免疫应答而不产生严重症状具有重要意义，可用于制备在对象中引起保护性免疫应答的药物。

Description

一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株及其应用

技术领域

本发明涉及一种三型副流感病毒，尤其涉及一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株及其应用。

背景技术

人三型副流感病毒(Human parainfluenza virus type 3，HPIV-3)是仅次于呼吸道合胞病毒、易引起婴幼儿严重支气管炎及肺炎等急性下呼吸道疾病的主要病原体。在急性呼吸道感染住院患儿中HPIV-3感染非常普遍，HPIV-3的爆发每年都会出现，主要发生在春夏两季，且流行病学研究显示5岁以下婴幼儿中有80％感染过HPIV-3。此外，HPIV-3感染还是导致老年慢性病患者和免疫力低下成年人下呼吸道疾病和死亡的重要原因，在器官移植和免疫抑制患者中，HPIV-3感染导致的死亡率在3％-47％不等，造成了很大的疾病负担。因此，HPIV-3疫苗的开发研究非常必要。

在HPIV-3疫苗研发中，灭活疫苗由于其接种后的疾病增强作用而被放弃，目前疫苗的研发主要集中在减毒活疫苗和亚单位疫苗。由美国科学家开发的减毒活疫苗有两个，一个是基于异源相关病毒的交叉保护，牛三型副流感病毒(Bovin parainfluenza virustype 3， bPIV-3)被认为是一个有希望的候选疫苗，其二期临床结果显示，bPIV-3减毒活疫苗在婴儿中具有很好的安全性和耐受性，而且可以诱导bPIV-3血清抗体应答，并对HPIV-3感染有交叉保护效力；另一个有前途的疫苗候选株是由HPIV-3病毒经过冷适应传代得到的具有温度敏感特性的HPIV-3减毒株cp45，研究显示cp45比bPIV-3具有更强的免疫原性，其二期临床结果表明，在血清HPIV-3抗体阴性婴幼儿中，cp45具有很好的安全性和耐受性，并诱导较高的中和抗体应答和保护效力。亚单位疫苗主要是由加拿大研究人员开发的哺乳动物细胞表达的HPIV-3外壳蛋白F-HN嵌合蛋白，并辅以新型佐剂，动物实验表明，此重组嵌合蛋白具有较高的免疫原性，可诱导动物的中和抗体应答并可以保护HPIV-3的感染，但亚单位疫苗的研究目前还处于实验室阶段。

迄今，还没有有效治疗HPIV-3感染的特效药物和预防性疫苗上市，因此，HPIV-3冷适应温度敏感减毒疫苗的研发具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供了一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株及其应用。

为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株，其特征在于，所述人三型副流感病毒的冷适应温度敏感株为HPIV3CPW3，保藏编号为CCTCC NO:V202113，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年1月 22日。

本发明还提供了包含上述人三型副流感病毒冷适应温度敏感株的组合物。

进一步地，所述组合物进一步包含药学上可接受载体或佐剂。

进一步地，所述组合物为具有冷适应温度敏感特性的人三型副流感疫苗。

进一步地，所述具有冷适应温度敏感特性的人三型副流感疫苗为HPIV-3减毒活疫苗。

本发明还提供了具有冷适应和温度敏感特性的人三型副流感疫苗的制备方法，包括使用上述人三型副流感病毒冷适应温度敏感株。

本发明还提供了人三型副流感病毒冷适应温度敏感株或上述包含人三型副流感病毒冷适应温度敏感株的组合物在制备用于在对象中引起保护性免疫应答的药物中的应用。

进一步地，所述保护性免疫应答保护对象抵抗人三型副流感病毒引起的疾病。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株HPIV3CPW3，该人三型副流感病毒株HPIV3CPW3作为三型副流感病毒减毒活疫苗候选毒株，鼻腔免疫接种小鼠，具有良好的安全性；可诱导小鼠显著的血清中和抗体应答，具有剂次效应；而且对小鼠肺部HPIV-3野毒株的感染有显著性保护效力。具有冷适应温度敏感特性的人三型副流感减毒活疫苗将能够有效预防三型副流感病毒的感染，而且该人三型副流感病毒株HPIV3CPW3具有冷适应和温度敏感特性且在小鼠的上下呼吸道也具有温度敏感的特性，此技术特性对在接种的哺乳动物体内激发保护性免疫应答而不产生严重症状具有重要意义。

附图说明

图1是本发明实施例1的HPIV-3阳性标本的检测结果；

图2是本发明实施例1的外源因子检测引物的阳性验证结果，其中1为鼻病毒、2为腺病毒、3为支原体、4为呼吸道合胞病毒、5为甲型H1N1流感病毒、6为甲型H2N3流感病毒、7为乙型流感病毒；

图3是本发明实施例1的HPIV3CPW3病毒株在25℃的传代结果；

图4是本发明实施例2的超速离心纯化后HPIV3CPW3病毒电镜图；

图5是本发明实施例2的超速离心纯化后HPIV3CPW3病毒的Western-blotting鉴定结果；

图6是本发明实施例5的HPIV3CPW3病毒株在特定温度细胞培养的病变；

图7是本发明实施例5的HPIV3CPW3病毒和其亲本野毒株LZ1501W3在WI-38细胞上的温度敏感检测结果；

图8是本发明实施例5的HPIV3CPW3病毒和其亲本野毒株LZ1501W3在小鼠上下呼吸道的冷适应温度敏感特性鉴定结果；

图9是本发明实施例6的HPIV3CPW3病毒免疫接种后小鼠血清HPIV-3中和抗体噬斑减少实验图；其中1-9孔是系列稀释的实验组血清与HPIV3LZ1728C19病毒中和后的蚀斑图，10-12为阴性对照组血清20倍稀释后与HPIV3LZ1728C19病毒中和后的蚀斑图；

图10是本发明实施例7的HPIV3CPW3病毒3剂免疫接种小鼠后在小鼠上下呼吸道的增殖结果；

图11是本发明实施例7的HPIV3CPW3病毒免疫接种小鼠的安全性评价结果；

图12是本发明实施例7的HPIV3CPW3病毒免疫接种后小鼠血清HPIV-3中和抗体应答结果；

图13是本发明实施例7的HPIV3CPW3病毒免疫接种对小鼠肺部HPIV-3感染的保护效力评价结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

本发明提供了一种冷适应温度敏感特性的人三型副流感病毒株HPIV3CPW3，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:V202113，保藏日期为2021年1月22日。

实施例1人三型副流感病毒的冷适应温度敏感株的筛选

1.1HPIV-3阳性临床标本的筛选

筛选材料：甘肃省妇幼保健医院下呼吸道感染住院患儿下呼吸道分泌物标本，-80℃冻存；

筛选方法：将病毒筛选材料室温融化，然后于12000rpm下涡旋震荡2min；震荡结束后将涡旋液吸入1.5ml离心管中，12000rpm下离心20min；将离心后的上清液用针式滤器(0.22μm)除菌过滤后，接种至生长有WI-38(人胚肺成纤维细胞)的6孔板中，37℃孵育2小时；吸去上清，加入3ml含有10ug/ml支原体去除剂Plasmocin(Invivogen，ant-mpt) 的DMEM培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养7天，孔对孔连续传代10次后进行 RT-PCR检测；取HPIV-3呈阳性的培养孔，用qRT-PCR进行病毒滴度测定；结果发现，一份标本的滴度达到了3.2x10⁷拷贝/ml，将该HPIV-3阳性病毒标本命名为LZ1501标本如图1，用于后续噬斑克隆。

1.2HPIV-3阳性培养物的噬斑克隆纯化

将10次连续传代培养的LZ1501阳性培养上清液进行10倍系列稀释，稀释倍数从10^-1至10^-8倍；然后分别接种至生长有WI-38细胞的6孔板上，10^-3至10^-8每个稀释度接种1孔，每孔接种1ml，接种完成后在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养2小时，弃上清液，每孔加入DMEM配制的0.8％低熔点琼脂糖(Sigma，A9045)3ml，室温凝固后，倒置于 37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养4天；再加入含有中性红的DMEM配制的1％低熔点琼脂糖1ml，室温凝固，倒置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24小时；在WI-38细胞的高稀释度孔中挑取蚀斑，接种于24孔板同种细胞上，并于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养7天；qRT-PCR检测HPIV-3阳性克隆培养物，然后挑取12个HPIV-3阳性初始克隆，每一个HPIV-3阳性初始克隆连续克隆5次，克隆所用液体中均加入10ug/ml支原体去除剂 Plasmocin(Invivogen,ant-mpt)；最后挑选12个来源于不同HPIV-3阳性初始克隆的高滴度HPIV-3克隆毒株进行外源因子检测，12个克隆毒株分别命名为LZ1501W1～ LZ1501W12。

1.3外源因子的检测

用巢式RT-PCR方法测定LZ1501高滴度克隆纯化毒株(LZ1501W1～LZ1501W12)中的鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H2N3流感病毒和乙型流感病毒，用巢式PCR方法检测上述LZ1501高滴度克隆纯化毒株中的支原体；检测引物由兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室自行设计，由宝生物工程(大连)有限公司合成；引物序列信息见表1，并通过阳性培养物验证(图2)。

表1外源因子的检测引物序列

结果发现，所有LZ1501高滴度克隆纯化毒株，检测的7种外源因子(鼻病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型H1N1流感病毒、甲型H2N3流感病毒和乙型流感病毒，支原体)均为阴性。

1.4HPIV-3冷适应温度敏感株的筛选

采用诱变剂加逐步降温法筛选，具体步骤为：将上述克隆纯化去除外源因子的12个LZ1501高滴度克隆纯化毒株，分别接种于12个T25 WI-38细胞培养瓶，每瓶按10ug/ml 浓度加入5-氟尿嘧啶，瓶对瓶1：100传代培养，培养温度从35℃开始，降温幅度2℃，即35℃、33℃、31℃、29℃、27℃、25℃，每个温度传代培养10代；结果从35℃～27℃的50代冷适应传代培养中病毒的平均滴度下降了1个lg值；继续在25℃传35代，开始所有克隆培养孔病毒滴度显著下降，最高下降4个lg值；继续传代，如图3所示，随着 25℃传代次数的增加，有2个克隆株的滴度经过降低之后缓慢升高最终在25℃传代30代后病毒滴度达10⁶拷贝数/ml，将其中一个毒株命名为HPIV3CPW3。

实施例2 HPIV3CPW3病毒培养液的制备和纯化及病毒外壳蛋白的鉴定

2.1HPIV3CPW3病毒培养液的制备

将HPIV3CPW3病毒株以0.01MOI接种WI-38细胞，在25℃、5％CO₂培养箱中培养 7天，收集培养上清液，qRT-PCR检测病毒滴度，4℃保存。

2.2超速离心法纯化HPIV3CPW3病毒

将步骤2.1制备的HPIV3CPW3病毒培养液在8000rpm、4℃下离心30min，沉淀细胞碎片，收集上清液；取30ml上清加入到50ml专用离心管中，用8cm长针头从底部轻轻推入15ml50％的蔗糖(操作中注意保持界面清晰)，然后放入超速离心机(可选用日立cp70mx 超速离心机)内，在4℃、35000rpm下，超速离心4小时，弃上清液；用无菌TNE Buffer (三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液)重悬沉淀，测定病毒蛋白浓度，电镜观察病毒形态，如图4所示，在电镜下可观察到150nm左右的病毒颗粒；以上结果表明，HPIV3CPW3 病毒能够大量制备，且纯化后的病毒颗粒清晰明显，即HPIV3CPW3病毒容易纯化获取。

2.3Western-Blot(蛋白质免疫印迹)技术鉴定HPIV3CPW3病毒外壳HN蛋白和F蛋白

将超速离心纯化的HPIV3CPW3病毒蛋白首先进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶按照标准程序(SambrookJ，Fritsch EF，ManiatisT 1989)进行Western-blotting 分析；

其中，特异性抗体为兰州生物制品研究所有限责任公司第二研究室自行制备的兔抗重组HPIV-3的HN蛋白和兔抗重组F蛋白多克隆抗体，按一定稀释度稀释后使用；二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体(购自Sigma公司)，按标示浓度使用；显色用Lumi-Light Western Blotting Substract(用于蛋白质印迹的化学发光过氧化物酶底物，购自Roche1，型号：20152000010)，使用GE Healthcare凝胶成像系统成像。

结果如图5所示，其中印迹HN为HPIV3CPW3病毒HN蛋白与兔抗重组HN多克隆抗体的反应条带，印迹F0为HPIV3CPW3病毒F0蛋白与兔抗重组F蛋白多克隆抗体的反应条带，印迹F1为HPIV3CPW3病毒F1蛋白与兔抗重组F蛋白多克隆抗体的反应条带；由此可见，步骤2.2的超离心纯化病毒与HPIV-3重组HN蛋白抗体、HPIV-3重组F蛋白抗体在预期的分子量处出现了特异性反应条带，说明HPIV3CPW3毒株具有HPIV-3病毒的HN蛋白和F蛋白。

实施例3 HPIV3CPW3的全基因序列的测定和遗传特点分析

采用二代测序法测定HPIV3CPW3的全基因序列，具体过程由上海伯杰医疗科技有限公司完成。测序结果表明：HPIV3CPW3的全基因序列含有15462个核苷酸，通过核苷酸序列分析可知，HPIV3CPW3与GenBank上HPIV-3分离株MH678682.1的同源性为99.87％，HPIV3CPW3株基因核苷酸序列符合副黏病毒科基因组“6碱基原则”，按照5’-NP (111-1658)-PP/C(1784-3592)-M(3753-4814)-F(5072-6691)-HN(6806-8524)-L (8571-15347)-3’的顺序编码6种蛋白，基因结构与已知序列HPIV-3分离株相同。说明 HPIV3CPW3病毒株是三型副流感病毒。

实施例4 HPIV3CPW3病毒在细胞培养中的冷适应和温度敏感特性鉴定

将HPIV3CPW3和其亲本野毒株LZ1501W3分别接种于铺满WI-38细胞的T25细胞培养瓶中，各设三瓶，每个病毒的三瓶分别于25℃、37℃和40℃培养7天，按照6.5qRT-PCR 测定每瓶病毒培养液的滴度，并观察病变；

如图6所示，与LZ1501W3相比，HPIV3CPW3在37℃和40℃的病变显著减轻，而在 25℃的病变显著增强；

病毒滴度检测显示(图7)，25℃培养的病毒滴度提高了3.59lg值，说明HPIV3CPW3具有了冷适应的特点，同时在40℃培养的病毒滴度降低了4.86lg值，37℃培养的病毒滴度下降了2.55lg值，说明HPIV3CPW3具有了温度敏感的特性。

实施例5 HPIV3CPW3在小鼠模型上的温度敏感特性的鉴定

将2周龄、体重为13.5g～14.5g的Balb/C小鼠，随机分为两组，每组21只，所有小鼠均腹腔注射5％水合氯醛麻醉，100ul/只；待小鼠失去行动力后，一组小鼠鼻腔接种HPIV3CPW3病毒培养液(滴度2.1x10⁶拷贝/ml)，20ul/只；另一组小鼠鼻腔接种HPIV3CPW3毒株的野生亲本毒株LZ1501W3病毒培养液(滴度5.2x10⁸拷贝/ml)，20ul/只；然后参照步骤6.4-6.5方法，于接种后第3天采用qRT-PCR检测小鼠肺组织和鼻洗液中HPIV-3病毒滴度：

结果如图8所示，LZ1501W3和HPIV3CPW3在肺组织的病毒滴度分别为7.67lg和5.58lg，显著下降了2.09lg；LZ1501W3和HPIV3CPW3在小鼠鼻腔洗液中滴度则从4.27lg 上升到4.78，增加了0.51lg。以上结果表明，HPIV3CPW3在Balb/C小鼠的上下呼吸道也具有温度敏感的特性。

实施例6 HPIV-3减毒活疫苗HPIV3CPW3的制备、免疫程序和检测方法

6.1HPIV-3减毒活疫苗的制备

HPIV3CPW3病毒培养液以0.01MOI接种WI-38细胞25℃5％CO2培养箱培养7天，qRT-PCR测定病毒滴度为2.1x10⁶拷贝/ml，8000g离心40分钟，收集离心上清，作为疫苗免疫接种小鼠。

6.2HPIV3CPW3免疫小鼠的免疫程序和剂量

将2周龄、体重为13.5g～14.5g的Balb/C小鼠随机分为11组，每组21只，所有小鼠均腹腔注射5％水合氯醛麻醉，100ul/只，待小鼠失去行动力；

实验组(HPIV3CPW3组)：1-3实验组的小鼠，鼻腔接种步骤6.1制备的HPIV-3减毒活疫苗(HPIV3CPW3病毒培养液，滴度2.1x10⁶拷贝/ml)，20ul/只，共接种1剂；4-6 实验组，鼻腔接种HPIV-3减毒活疫苗，20ul/只，共接种2剂，每剂间隔28天；7-9实验组，鼻腔接种HPIV-3减毒活疫苗，20ul/只，共接种3剂，每剂间隔28天。

阳性对照组(LZ1501W3组)：与实验组相比，其区别在于，对第10组的麻醉小鼠鼻腔接种HPIV3CPW3病毒的野生亲本病毒株LZ1501W3病毒培养液(滴度5.2x10⁸拷贝/ml)，与实验组分开饲养，只接种一剂；

阴性对照组：与实验组相比，其区别在于，对第11组的麻醉小鼠接种20ul高糖DMEM液体培养基，与实验组分开饲养，不做任何处理；

6.3HPIV3CPW3感染小鼠上下呼吸道组织的收取

实验组：分别在每一剂接种后第3天、第40天各取一组小鼠(对第1-3实验组，取三组中在1剂接种后第3天、第40天的一组HPIV3CPW3感染小鼠；对第4-6实验组，取三组中在2剂接种后第3天、第40天一组小鼠；对第7-9实验组，取三组中在3剂接种后第 3天、第40天的一组CPW3感染小鼠)；对各组HPIV3CPW3感染小鼠眼球取500ul全血， 37℃静置2小时，4℃过夜后5000g离心10分钟，分离血清，用于中和抗体滴度的测定；然后拉颈处死感染小鼠，用100ul高糖DMEM液体培养基冲洗小鼠鼻腔，取50ul冲洗液提取RNA，用于qRT-PCR检测小鼠鼻腔冲洗液中HPIV-3病毒滴度；用75％乙醇浸泡2 分钟消毒小鼠，无菌解刨感染小鼠胸腔，取出肺脏，称取10mg，用1ml玻璃匀浆器磨碎，提取RNA，用于qRT-PCR检测小鼠肺脏组织中HPIV-3病毒滴度。

6.4HPIV3CPW3感染小鼠上下呼吸道组织RNA的提取

采用Rneasy Mini Kit(50)(QIAGEN，74104)分别进行小鼠鼻洗液RNA及肺组织RNA提取，具体操作如下：小鼠鼻洗液RNA的提取：取小鼠鼻洗液50ul，加入110ul灭菌PBS，再向其中加入150ul buffer RLT，3ulβ-ME，彻底混匀；加入300ul 70％乙醇(DEPC水配制)，混匀；将混合物加入RNA纯化柱，12000rpm离心1min，弃管中液体；加入700uL buffer RW1，12000rpm离心1min，弃管中液体；加入500uL buffer RPE，12000rpm离心 1min，弃管中液体；加入500uL buffer RPE，再洗一次，弃管中液体；12000rpm离心2min，空柱；换新离心管，每柱加入20uL DEPC水，12000rpm离心1min；纯化RNA置冰浴或 -80℃备用。

小鼠肺组织RNA的提取：小鼠肺组织10mg，向其中加入800ul buffer RLT(10ul β-ME/1ml RLT溶液)，用研磨棒将组织破碎,12000rpm离心10min，取300ul上清液到一新的EP管中，加入300ul 70％乙醇(DEPC水配制)，混匀；将混合物加入RNA纯化柱， 12000rpm离心1min，弃管中液体；加入700uL buffer RW1，12000rpm离心1min，弃管中液体；加入500uLbuffer RPE，12000rpm离心1min，弃管中液体；加入500uL buffer RPE，再洗一次，弃管中液体；12000rpm离心2min，空柱；换新离心管，每柱加入20uL DEPC 水，12000rpm离心1min；纯化RNA置冰浴或-80℃备用。

6.5小鼠上下呼吸道HPIV-3病毒滴度的检测

采用qRT-PCR方法检测HPIV3CPW3感染小鼠上下呼吸道HPIV-3病毒滴度，包括以下步骤：

6.5.1HPIV-3病毒滴度检测用qRT-PCR方法的引物和探针设计

引物和探针位于HPIV-3HN片段内，由本实验室自行设计和验证，序列见表2；

表2 HPIV-3滴度检测用Q-RT-PCR方法的引物和探针序列

6.5.2、qRT-PCR检测用HNRNA标准品的制备

采用体外转录法，具体步骤如下：

6.5.2.1HPIV-3HN基因的克隆

采用RT-PCR法克隆HPIV-3HN基因：参照6.4的方法提取HPIV-3病毒RNA，用SuperScript III One Step RT-PCR system with platinum Taq High Fidelity(Invitrogen, 12574-035)，引物对 HNS(ATGGAATACTGGAAGCACACC)/HNA(AACTGCAGCTTTTTGGAAT)进行HPIV3 HN基因的扩增；

反应体系：2x reaction buffer 25ul,RNA 5ul,HNS(10pmol/ul)1ul,HNA(10pmol/ul)1ul, SuperScript III RT/Taq En 1ul,DEPC H₂O 17ul；

反应程序：48℃30分钟；94℃2分钟；94℃40秒，55℃1分钟，68℃2分钟，重复 30次；68℃8分钟；

RT-PCR产物凝胶电泳，切出目的条带，按照试剂盒所示方法，用QIAquick GelExtraction Kit纯化HN DNA。测序结果，与GenBank上HPIV-3HN基因的序列同源性为99.81％，表明成功克隆得到HPIV-3HN基因。

6.5.2.2HPIV-3HNRNA标准品的制备

采用T7 RNA polymerase试剂盒(购自Takara公司，D2540)制备标准品，具体操作为：以6.5.2.1得到的HPIV-3HN基因为模板，用HNT7S和HNT7A引物(见表3)，扩增5’端带有T7RNA聚合酶起始位点，3’端带有Poly(A)15的HPIV-3HN基因片段；片段切胶纯化后，作为体外转录模板，用T7 RNA polymerase试剂盒体外转录得到HPIV-3HN 的RNA；体外转录HPIV-3HNRNA经纯化后，测定纯度和浓度，10x系列稀释后作为 qRT-PCR检测方法的标准品，测定标准曲线。

表3 HPIV-3HN RNA体外转录引物序列

6.5.3HPIV-3病毒滴度检测体系及程序

采用One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)(Takara,CodeNo. DRR064A)进行HPIV-3病毒滴度检测，具体操作如下：

采用3.7x10⁰-3.7x10⁷拷贝/ml的体外转录HPIV-3HN RNA进行Taqman探针Real-Time RT-PCR，建立标准曲线；

反应体系为：2xone step RT-PCR buffer III 10ul，Takara Ex TaqHS(5U/ul)0.4ul，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4ul，HNReaLS(10pmol/ul)0.6ul，HNReaLA(10pmol/ul)0.6ul， Probe(10pmol/ul)0.2ul，ROX Reference Dye(50x)0.4ul，Tatol RNA2ul，RNase free H20 5.4ul，总体积20ul；

扩增程序为：1、反转录，42℃，5分钟，95℃10秒；2、PCR扩增，95℃5秒，57℃ 34秒，40个循环；以上扩增反应在7500real-time PCR system(Applied Biosystem)上进行。

6.6HPIV3CPW3免疫小鼠血清HPIV-3中和抗体的检测

采用蚀斑减少试验检测免疫小鼠血清HPIV-3中和抗体滴度，具体操作如下：

6.6.1噬斑检测用病毒HPIV3LZ1728C19工作稀释度的确定

将HPIV-3野毒株HPIV3LZ1728C19以5×系列稀释，接种24孔板MA104细胞，置于 37℃、5％CO₂培养箱中培养2小时后，吸出上清液，加入1％低熔点琼脂糖3ml，室温凝固后倒置于37℃、5％CO₂培养箱培养72小时，然后加入含有中性红的1％低熔点琼脂糖 1ml，室温凝固后于37℃、5％CO₂培养箱过夜，观察出斑，以80％细胞出现蚀斑的病毒稀释度，作为病毒的工作稀释度；

6.6.2待检血清的稀释与病毒的中和

待检血清(HPIV3CPW3免疫小鼠血清)10倍稀释，0.22μM针式滤器除菌过滤，再2×系列稀释，与等体积工作稀释度稀释的HPIV3LZ1728C19病毒混合，37℃下结合2小时；将血清中和后的病毒接种于24孔板MA104细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养2小时，然后吸出上清液，加入1％低熔点琼脂糖1ml，室温凝固后，倒置于37℃、5％CO₂培养箱培养72小时，加入含有中性红的1％低熔点琼脂糖1ml，室温凝固后于37℃、5％CO₂培养箱中过夜，观察出斑(实验组)；

6.6.3阴性对照

20x稀释阴性对照组血清与等体积工作稀释度稀释的HPIV3LZ1728C19病毒混合，其余步骤同6.6.2；

6.6.4结果判定：与阴性对照组的蚀斑数相比，能使蚀斑数降低50％的血清稀释度确定为中和抗体滴度(图9)。

实施例7 HPIV3CPW3免疫接种小鼠安全性、免疫原性和HPIV-3保护效力的评价

7.1HPIV3CPW3感染小鼠上下呼吸道的增殖

实验组：以实施例6的步骤6.2中实验组小鼠为研究对象，在每剂接种后第3天，参照步骤6.3和6.4的方法，提取小鼠鼻洗液和肺组织RNA，参照步骤6.5的方法，用qRT-PCR 方法检测免疫小鼠HPIV3CPW3病毒负载量；

阴性对照组：与实验组相比，其区别在于，每只麻醉小鼠接种20ul高糖DMEM液体培养基，与实验组分开饲养，不做任何处理；

结果如图10所示，与阴性对照组相比，每剂接种后HPIV3CPW3均可以在小鼠的上下呼吸道显著增殖；而且一剂免疫后3天，HPIV3CPW3在小鼠肺部的病毒负载量提高了 2.7lg值，在鼻腔的病毒负载3.1lg值；以上结果表明，HPIV3CPW3病毒株能够感染小鼠，在小鼠的上下呼吸道增殖

7.2HPIV3CPW3免疫接种小鼠的安全性评价

以实施例6的步骤6.2中实验组小鼠为研究对象，连续30日测量实验组中第1组、阳性对照组和阴性对照组的小鼠体重及体温；

结果如图11所示，免疫小鼠在30天内的体重曲线和阴性对照组基本重合，无差异；免疫接种后30天内小鼠体温在正常范围内波动，说明HPIV3CPW3对小鼠的安全性良好。

7.3HPIV3CPW3免疫接种小鼠血清中和抗体应答评价

实验组：以实施例6的步骤6.2中实验组小鼠为研究对象，在每一剂接种后第40天取一组HPIV3CPW3感染小鼠，用实施例6的步骤6.6的蚀斑减少中和试验检测HPIV3CPW3 诱导小鼠产生中和抗体的能力；

阴性对照组(步骤6.2中的第11组)：与实验组相比，其区别在于，每只麻醉小鼠接种20ul高糖DMEM液体培养基，与实验组分开饲养，不做任何处理；

结果如图12所示，与阴性对照组相比，2剂免疫后小鼠中抗体几何平均滴度升高了103倍，3剂免疫后小鼠中抗体几何平均滴度提高了1386倍；说明HPIV3CPW3免疫接种小鼠可诱导显著的血清HPIV-3特异性中和抗体应答，具有剂次效应。

7.4HPIV3CPW3免疫接种对小鼠肺部HPIV-3感染保护效力的评价

实验组：以实施例6的步骤6.2中实验组小鼠为研究对象，在每一剂接种后第40天取一组HPIV3CPW3感染小鼠，用于HPIV-3感染攻毒实验，具体为：用HPIV-3野毒株HPIV3LZ1728C19(8.5x10⁸拷贝/ml)鼻腔攻毒感染HPIV3CPW3免疫小鼠，20ul/鼠，攻击后第三天参照步骤6.3-6.4收集样本并提取RNA，按照步骤6.5用qRT-PCR方法检测样本中HPIV-3病毒滴度；

阴性对照组(步骤6.2中的第11组)：与实验组相比，其区别在于，对第11组的每只麻醉小鼠接种20ul DMEM液体培养基，与实验组分开饲养，不做任何处理；

结果如图13，HPIV3LZ1728C19攻毒实验显示，与阴性对照组相比，2剂接种后小鼠肺部HPIV3LZ1729C19病毒负载量显著降低了0.81lg值(p<0.05)，3剂免疫接种后小鼠肺部病毒负载下降了1.85lg值(p<0.005)，说明HPIV3CPW3免疫接种对小鼠肺部HPIV-3 野毒株HPIV3LZ1728C19的感染有显著性保护效力。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 兰州生物制品研究所有限责任公司

<120> 一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株及其应用

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcacttct gtttccccgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaacacgga cacccaaagt 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtagacctg gcagatgagg c 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acattcaggg gccggagga 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cattgccggt ttcattgaag g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atccagaaac tgattgcccc c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtttccaat ttccttggca tt 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaattgtaca tttggggggt tc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagatctgct gcttgtcctg tg 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acctatatgt tcaagcatca ggg 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttgtcattg ggaatgcttc c 21

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtagtaaca tccaatgcag atcg 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aggcaatctg cttcaccaat ta 22

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttacatccgg gtgctttcct ata 23

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaggatttg agtctccata gagg 24

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgatcccctc ggtagtgaag t 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tccgacttca tgaggacgaa t 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctcgcctggg tagtacattc g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgtcatccct tccttcctcc 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atgaccaagg actggttcct g 21

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

actacaatat tggctaccag ggc 23

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgggatccac ctcaaaagtc a 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cataaagaag ggtgggctcg t 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcagaaaacc gtgacctatc 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

acacctaaca agaagcccag 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ctgctgatcc acaggttaag 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

actgtggtgc ttctcttctg 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atggaatact ggaagcacac c 21

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aactgcagct ttttggaat 19

Claims

1.一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株，其特征在于，所述人三型副流感病毒的冷适应温度敏感株为HPIV3CPW3，保藏编号为CCTCC NO:V202113，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年1月22日。

2.包含权利要求1所述的人三型副流感病毒冷适应温度敏感株的组合物。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述组合物进一步包含药学上可接受载体或佐剂。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述组合物为具有冷适应温度敏感特性的人三型副流感疫苗。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于：所述具有冷适应温度敏感特性的人三型副流感疫苗为HPIV-3减毒活疫苗。

6.具有冷适应和温度敏感特性的人三型副流感疫苗的制备方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的人三型副流感病毒冷适应温度敏感株。

7.权利要求1所述人三型副流感病毒冷适应温度敏感株或权利要求2-5任一项所述组合物在制备用于在对象中引起保护性免疫应答的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述保护性免疫应答保护对象抵抗人三型副流感病毒引起的疾病。