CN1314940A - 温度敏感和冷适应的2型人副流感病毒(hpiv－2)及基于该病毒的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及2型人副流感病毒(HPIV－2)的分离的减毒病毒株,其用于活疫苗制备。这些病毒株显示出温度敏感和冷适应表型,这对在接种的哺乳动物体内激发保护性免疫应答而不产生严重症状有用。

Description

温度敏感和冷适应的2型人副流感病毒 (HPIV-2)及基于该病毒的疫苗
发明背景
本发明涉及2型人副流感病毒(HPIV-2)的分离的减毒病毒株，其在活疫苗制备中有用。这些病毒株显示出温度敏感和冷适应表型，这对在接种的哺乳动物体内激发保护性免疫应答而不产生由野生型病毒引起的严重症状有用。
1、2、3型人副流感病毒(HPIV)是婴儿及年幼儿童的重要致病原。HPIV通常引起中耳炎、咽炎和普通感冒。通常发生这些上呼吸道感染(URI)并可伴随下呼吸道感染(LRI)，包括哮吼、肺炎和细支气管炎。年幼儿童的初次感染伴有下呼吸道疾病，并常导致住院。副流感病毒作为一个群体，是因呼吸道感染而入院的第二大最常见的原因，仅次于作为年幼儿童重要致病原的呼吸道合胞病毒。副流感病毒中唯有3型副流感病毒具备通常感染小于六月龄年幼婴儿的能力。感染该型病毒的婴儿通常有细支气管炎和肺炎；在这点上，3型副流感病毒与呼吸道合胞病毒相似。最近一些关于这些病毒感染不同方面的有关HPIV的综述已经发表(Ray和Compans,1990；Kingsbury,1991；Henrickson等人，1994)。
在美国HPIV-2感染每年爆发一次(Downham等人，1974)。该病原体高峰发病率在秋季至初冬，与HPIV-1相比其“季节”稍长。哮吼是该病毒引起的最频发的LRI，但它也可引起任何其它与HPIV-1相关的呼吸道疾病。HPIV-2感染的高峰发生率出现在一生中的第二年，大约有60％的感染发生在小于5岁的儿童中。在一项研究中有趣地观察到，与HPIV-1或3引起的LRI相比，更多女孩比男孩具有HPIV-2引起的LRI症状(Downham等人，1974)。已报道HPIV-2引起的LRI不如HPIV-1和HPIV-3引起的LRI频发。新近的报道指出地理差异或分离和检测技术的差别可能造成该病毒的过低报道(Downham等人，1974；Henrickson等人，1994)。估计在美国1991年的流行中，由于HPIV-2感染，有157000名5岁以下的儿童进入急诊室，35000名儿童入院。这次流行导致HPIV-1和2合计的直接患者医疗花费几乎2亿美元。
所有的人副流感病毒在结构、物理化学、和生物学性质上非常相似。原型HPIV病毒体由单链RNA组成，RNA负极包裹着宿主细胞来源的脂质包膜。这些多形的，或者多种形状的病毒平均直径150-250nm。典型的HPIV基因组包含大约15000个核苷酸的遗传信息(Storey等人，1984)，编码至少六个病毒蛋白质(3”-NP-P(+C)M-F-HN-L-5’)(Storey等人，1984)。另外，HPIV-1、2、和3编码额外的非结构蛋白质“C”，HPIV-2编码蛋白质“V”。这些蛋白质由P基因内的重叠读码框架产生，并可能需要的RNA编辑(Matsuoka等人，1991)。HPIV-2基因组的全部核苷酸序列尚未公布。
人副流感病毒在副粘病毒科的属内分类。该属内有五种主要的血清型：HPIV 1-4和腮腺炎病毒。HPIV的血清型根据抗原性划分为两组：(1)HPIV-1和HPIV-3，在副粘病毒属内，和(2)HPIV-2和HPIV-4，在Rubulavirus属内(Collins等人，1996)。HPIV均享有公共抗原，在感染期间常检测到可变的异型抗体水平。因此，很难确定是否异型应答是以往感染的表现，或仅仅是血清学化验中相似抗原的交叉反应。然而，在标准分析中，可利用过去的特定超免疫动物血清和更近的单克隆抗体来区分这些病毒(Sarkkinen等人，1981)。
鼻和咽粘膜是副流感病毒感染的初始部位。轻微疾病的患者可能还有局限的支气管累及。更广泛的HPIV-1和HPIV-2感染累及喉和气管上部，导致哮吼综合征。随着变浓粘液的积累及造成的肺膨胀不全(不完全的肺膨胀)和肺炎，感染也可蔓延至气管下部和支气管。与发生的感染局限于上呼吸道的年龄相近的患者相比，发生副流感病毒哮吼的婴儿和儿童的局部病毒特异IgE抗体产生得早且量大，通过对该现象的观察提示免疫应答对该病发病机制的可能作用(Welliver等人，1982)。已报道与只出现上呼吸道疾病的感染婴儿相比，在患副流感病毒细支气管炎的婴儿中针对副流感病毒抗原的细胞介导的免疫应答及副流感病毒特异的IgE抗体应答更强。在慢性支气管炎和肺气肿患者中观察到HPIV-3携带的状态延长(Gross等人，1973)。已提出健康成年人可间歇性释放感染性病毒并感染易感个体；调查者进一步提出可能发生持续感染(Parkinson等人，1980)。
仓鼠提供了公认的HPIV感染动物模型。受染动物肺部形成不因被动施用抗体而改变的可识别病理变化(Glezen和Femald,1976)。感染期间，受染的仓鼠不显示出明显的呼吸道疾病征兆及显著的体重下降。另外，如下面实施例4-6中所证明的，猴子可用作感染的动物模型。
多年来开发了多种疫苗以防止各种病毒感染动物和人。使用的疫苗主要有两种类型：死病毒和减毒活病毒。死病毒一般通过化学和物理处理灭活，但在激发持久的免疫应答方面一般不如减毒活病毒有效。一般减毒活病毒更有效，但在体内可能返祖回其毒力状态。在开发死疫苗或减毒活疫苗上的时间及花费是惊人的。
减毒活疫苗可从分离自受染动物的子代病毒直接获得。例如Straub的美国专利第3927209公开了作为病毒株从牛呼吸道分离的3型副流感疫苗。减毒活疫苗也可通过将野生型株经过适合的培养重复冷传代直至该病毒丧失最初的致病性而获得。“冷传代”是指病毒在低于其正常复制温度的条件下经历完整生命周期(感染宿主细胞、在宿主细胞中增殖、和逃离宿主细胞)的生长。例如cp45这一冷适应的温度敏感株是通过将HPIV-3野生型病毒(JS株)在降低的温度下传代45次而得到的(Belshe和Hissom,1982)。目前为用作人HPIV-3的候选疫苗，cp45这一温度敏感株正在评估中(Karron等人，1995；Hall等人，1993；Belshe等人，1992；Clement等人，1991；Crookshanks-Newman和Belshe,1996)。近来在儿童中的评估揭示cp45株高度灭活，并在激发免疫原应答中有效(Karron等人，1995；Belshe等人，1992)。尽管冷传代技术已用来生产A型和B型流感疫苗，但是还没有HPIV-2病毒成功冷传代的类似描述。
评价特定疫苗株的减毒通常谈到该株的三个表型：冷适应、温度敏感和组织培养中空斑大小或产量。冷适应(ca)涉及病毒在25℃左右降低的温度下生长的能力。温度敏感(ts)涉及这种生长是否在40℃左右受到抑制。空斑滴度是定量评估病毒生长程度的分析，通常用来评估冷适应和/或温度敏感表型之程度。确定疫苗是否减毒的其他方法包括给灵长类动物施用疫苗。例如，新的脊髓灰质炎疫苗项目在被美国食品及药物管理局(FDA)批准销售前一般在猴子中做减毒实验。
考虑到HPIV-2疾病在婴儿和年幼儿童中引起严重呼吸窘迫的倾向及最终入院治疗的必需性，能预防严重感染的疫苗倍受期望。尽管认识到需要HPIV-2疫苗已经超过二十年，尽管在二十世纪八十年代早期分离HPIV-3疫苗株就已成功，目前仍没有可用的疫苗可免疫儿童防止HPIV-2。在本申请者的发现之前HPIV-2尚不能成功地冷传代。与HPIV-3病毒相比，分离HPIV-2病毒减毒株的困难可从这两种病毒间形态学和表型上的巨大差别来解释。尽管它们在抗原性上相似，但是与HPIV-3相比，HPIV-2更难适应体外生长条件及降低的温度。
发明概述
因此，本发明的一个目的是提供可用来免疫哺乳动物(包括人)防止野生型HPIV-2感染的HPIV-2疫苗株。提供与感染野生型HPIV-2病毒株相比，感染疫苗株后产生之症状大大减轻的疫苗株是本发明进一步的目的。提供能使施用的患者产生保护性免疫应答的HPIV-2疫苗株是本发明进一步的目的。
申请者已从圣路易斯大学(Saint Louis University)命名为SLU7255的野生型HPIV-2株中培养和分离了冷适应的HPIV-2疫苗株。已经分离了几个具有期望的冷适应和温度敏感表型的减毒株。
因此，本发明涉及显示出冷适应和温度敏感表型特性的分离的HPIV-2减毒株。具有这些特性的优选分离株是命名为C3396、C3464、C3490、C3440和C3444的那些。更优选的病毒株是命名为C3464、C3490和C3440的那些。另外，本发明涉及显示出冷适应和温度敏感表型的分离的HPIV-2减毒株，它们是被命名为C3396、C3464、C3490、C3440和C3444的分离株之子代或亚克隆。
另外本发明涉及用作减毒活疫苗的疫苗组合物，它们包括上述任意HPIV-2病毒株及药学可接受的载体。这些组合物也可包括任意药学可接受的赋形剂、稀释剂、和/或佐剂。
本发明还涉及通过给哺乳动物接种本发明的减毒活病毒株，从而在哺乳动物中引起保护性免疫应答的方法。
附图简述图1：显示在说明书中描述的分离病毒株C3440和C3490谱系之冷传代图解。图2：该图显示收集自用病毒株C3490(■)、C3440(□)、C3464(◆)或野生株453库(◇)接种之仓鼠鼻洗液中的活性病毒滴度。图3：该图显示收集自用病毒株C3490(■)、C3440(□)、C3464(◆)或野生株453库(◇)接种之仓鼠支气管/肺洗液中的活性病毒滴度。
发明详述
与HPIV-3不同，经证实能成功培养及体外维持的野生型HPIV-2株很难分离。在发现能在体外培养中成功维持的野生型株之前，申请者试验了五十多株不同来源的野生型病毒。如下面公开内容中所显示的，申请者已从非温度敏感和非冷适应的野生型(wt)HPIV-2病毒株中培育了分离的温度敏感(ts)和冷适应(ca)的病毒株。如图1所示，申请者成功地改良了野生型HPIV-2株，使其在降低的温度下生长，创造了优选地适应低于30℃的毒株，更优选适应低于26℃，最优选适应低于24℃左右的毒株。然后分析这些冷适应株，以证实它们有合适的温度敏感性。申请者已发现，一部分冷适应株显示出的温度敏感性达到了防止病毒在下呼吸道中生长和增殖及伴随的HPIV-2疾病严重症状所必需之程度。这些形成的毒株能在较低的生产温度下不受限制地生长，而且在施用的患者中是减毒的，因此培育的这些毒株ca和ts联合表型使它们成为用作防止HPIV-2感染的活疫苗的极好减毒株。
尽管是利用了一个特定HPIV-2 wt株来培育下面公开的病毒株，但是相信应用申请者所示的方法，任何能以体外培养物维持的wt株均可用来形成HPIV-2的ts和ca减毒株。胎恒河猴肺(FRhL-2)细胞是疫苗研究中充分表征的细胞，因此优选其作为冷传代的宿主细胞。然而，在生产本发明的减毒病毒株中考虑了使用其它培养的哺乳动物宿主细胞。同样的，本领域技术人员可选择改良冷传代的技术，其方法是使用不同的温度或在每一温度下冷传代不同次数。然而，与下面申请者的那些描述类似，这些改良将优选保持逐步降低的温度。
2型副流感病毒(HPIV-2)的SLU7255株分离自因患哮吼和肺炎而住院的六月龄儿童(保藏存放于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号--)。尽管SLU7255最初分离自原代恒河猴肾(RMK)细胞，但是已使其适于在胎恒河猴肺(FRhL-2)细胞(一种用于疫苗研究的二倍体细胞系)中生长。适应FRhL细胞后，SLU7255以与HPIV-3的JS株类似的方式在冷的条件下(≤30℃)连续传代，以产生候选疫苗，方法在Belshe和Hissom(1982)中有描述，这里引入作为参考。wt株先于30℃传代6次，然后于28℃传代6次、于26℃传代8次、于24℃传代13次。见图1的冷传代过程图解。申请者惊奇地发现与HPIV-3不同，为成功地改造HPIV-2病毒，冷传代的温度不得不逐步降低，而HPIV-3可立即在22℃冷传代。冷适应后，在原代非洲绿猴肾(AGMK)细胞中运用标准空斑分析将巴斯德移液器穿过上层覆盖的琼脂糖挑选克隆，其方法是抽吸琼脂糖填料，并将克隆接种到含有原代AGMK细胞的组织培养管中。初次克隆筛选后，将克隆C2450和C2768在23-24℃进一步冷传代18-30次，产生分离的克隆C3464(保藏于ATCC，保藏号--)、C3440(保藏于ATCC，保藏号--)、和C3490(保藏于ATCC，保藏号--)(随后亚克隆，产生C3605)。以前没有公开过HPIV-2病毒成功冷传代。
运用红细胞吸附空斑分析比较每个克隆在32℃和39℃的滴度，来确定HPIV-2克隆是否温度敏感。当39℃的滴度与32℃的滴度相比，如果其显示滴度下降100倍以上，则认为该克隆“温度敏感”，相反，39℃的滴度与32℃的滴度相比，如果其显示下降＜100倍，则认为该克隆是野生型(wt)病毒。更优选地，克隆在39℃时滴度＜1.0pfu/ml。运用红细胞吸附筛选分析鉴定ts表型的结果表明，大多数检测的克隆显示ts表型。
将克隆在23℃和32℃的生长情况加以比较来确定其是否具有冷适应特性。见表1。每个克隆均接种到组织培养管的单层Vero细胞或原代AGMK细胞(未显示数据)中，于23℃或32℃培养。接种后于第7天和第14天(对于23℃培养的)及第7天(32℃培养的)收获每个克隆的管培养物。通过于32℃对Vero细胞进行空斑分析确定培养上清液中的病毒滴度。通过将细胞用苏木精和伊红染色5天后，观察平皿。认为于23℃的滴度在32℃的滴度的一百倍之内的克隆是冷适应的(ca)。
分析的克隆中有六个为冷适应的，然而，它们中的一个克隆C3252在两个温度下均不生长。与冷适应的克隆(C3396、C3464、t3490、C3457、V3440和C3444)形成对比，野生型的亲本对照453库23℃时在Vero细胞中不生长。
进行空斑形成效率(EOP)分析来确定每个克隆的温度阀值。在32℃、36℃、37℃、38℃和39℃分析了每一个候选疫苗在Vero细胞中形成空斑的能力。见表2。C3464、C3490、C3457、C3440和C3444显示的温度阀值为38℃，而这些克隆中的两个(C3396和C3444)其39℃与32℃的生长情况相比限制了1000倍。
以类似申请者公开的方式，从野生型HPIV-2病毒培育和分离的也显示ts和ca表型的C3396、C3464、C3490、C3457、C3440、和C3444以外的克隆也在本发明范围之内。参照本说明书中第四部分的实施例和教导，本领域中的普通技术人员将能运用常规方法从野生型HPIV-2病毒培育和分离ts和ca克隆。另外，公开的优选株亚克隆之进一步冷传代，或为在其它宿主细胞中培养而利用已建立的方法对这些株之改造，均完全在病毒学领域技术人员的普通技能之内。因此，以上优选株的亚克隆和子代也在本发明范围之内。
如下面实施例中所显示，在疫苗组合物中，本发明分离的病毒株对在哺乳动物中诱导保护性免疫应答有效。本发明中分离的HPIV-2病毒减毒株优选作为活疫苗以有效量施用，为产生期望的免疫应答，所用有效量将容许病毒的少许生长和增殖，但不会产生HPIV-2疾病症状。活疫苗中使用病毒的合适量依赖于几个因素，包括：特定的分离HPIV-2减毒株的毒力或耐力；将施用疫苗的患者年龄；将施用疫苗的患者体重和总体健康情况；和将施用疫苗的患者免疫系统是否受到损害。
本发明中分离的HPIV-2减毒株可制成疫苗组合物，用于以任意通常的途径(作为腹膜内或静脉内注射、局部应用制剂、口服施用制剂等等)给患者施用，但最优选制成喷雾或洗液，应用于上呼吸道粘膜。这种应用能协助激发局部粘膜免疫，其会提供更强的保护，防止以后野生型HPIV-2病毒感染。这些疫苗制剂包括本发明分离的减毒病毒及药学可接受的载体，例如无菌盐水。另外，疫苗制剂可包括药学可接受的赋形剂、稀释剂、和/或佐剂，在患者中它们将协助产生保护性免疫应答。可用在本发明疫苗制剂中的赋形剂包括能帮助病毒粘附粘膜及沿上呼吸道表面传播的试剂，例如树胶或淀粉。
为引起保护性免疫应答，可将本发明分离的HPIV-2减毒株以疫苗制剂施用给哺乳动物患者。接种后，患者的免疫系统将显示出致敏的免疫应答，对抗野生型HPIV-2病毒攻击，缓解HPIV-2感染和疾病之严重性。尽管本发明的疫苗株是给人类患者使用，但是在本发明范围内也考虑了给其它显示出感染HPIV-2之有害症状的哺乳动物使用。为防止更严重的常发生于幼年的感染，本发明的疫苗株优选在年纪小时给患者施用。尽管目前预期单次施用本发明的疫苗株将足够诱导引发免疫应答，对抗稍后的野生型HPIV-2病毒攻击，但是根据类似上述那些诸如剂量的因素，可能需要不止一次施用。本领域中的普通技术人员不用过多的试验即可为具体患者设计适当的剂量方案。
几个使用本发明分离的HPIV-2减毒株的实施例举例说明如下。应当知晓，这些是作为本发明之举例说明而提供的，并不意味着以任何形式限制本发明的实施方案。
实施例1
根据其表型特性，选择C3440、C3464和C3490这3个ts和ca克隆在仓鼠中评估。表3说明了这些所选克隆和这些HPIV-2候选疫苗wt亲本的ts和ca表型。将刚断奶的仓鼠深度麻醉，鼻内接种wt亲本病毒或一种候选疫苗。表4中显示了仓鼠接受的接种物的滴度。每只动物接受的接种物总量为0.1ml(0.05ml/鼻孔)，为防止交叉污染使用带有气溶胶抗性的移液器尖头之微量移液器。将仓鼠以20只为一组接种一种候选疫苗或wt亲本病毒。每组中有四只仓鼠在五个时间点(即接种后第1、2、3、4、和7天)安乐死。将十只未接种的动物安乐死(五个时间点中每个点2只)作为对照组。在收获当天切除每只动物的肺及鼻甲，并通过心脏穿刺采血。通过32℃培养五天的Vero细胞之空斑分析，检测每种组织匀浆中的病毒。用甲醛固定单层Vero细胞，并用苏木精和伊红染色使病毒空斑可见。
在刚断奶仓鼠的鼻甲和肺中wt HPIV-2亲本生长地同样良好(见图2和3)。病毒的释放期持续4天，其中第3天鼻甲的高峰滴度为5.5pfu/gm组织(在这些实施例中所有pfu/gm的值均以log10计)，第2天肺组织的平均高峰滴度为5.2pfu/gm组织。第3天至第7天自仓鼠鼻甲中释放克隆C3490(cp51)。第7天回收的C3490的平均高峰滴度为4.5pfu/gm组织。只从少数接种C3440或C3464的动物中回收到HPIV-2，这说明这些克隆的传染力最小。从接种了三种冷适应的克隆中的一种克隆之任何动物的肺中均回收不到病毒。这三种冷适应的温度敏感克隆在仓鼠中是减毒的，并可因其它体内特性而应用。
实施例2
仓鼠中评估的每种克隆也在体外检测了遗传稳定性。我们对每种克隆进行了应激试验，其方法是将每种克隆盲法连续传代，每周传代一次共持续四周，温度分别为容许温度(32℃)、中间容许温度(35℃)、和限制温度(39℃)，以此确定在不利于ts表型的选择压力下病毒是否返祖回野生型表型。表5显示了应激试验的结果。每次传代后，在32℃至39℃滴定病毒检测ts表型变化。在39℃连续传代后每种克隆仍保持其ts表型，说明它们是遗传稳定的。
除应激试验外，我们从这三种冷传代病毒的每种中挑选空斑，确定是否该病毒库内有病毒表型的混合。(表6)从474库(克隆3490)中挑选的10个亚克隆中的每一个均为明显ts，并在39℃显示出完全截断。从477库(克隆3440)中挑选的10个亚克隆中的两个在39℃显示出少许生长，但是在39℃与在32℃相比，滴度至少低100倍。所有从484库(克隆3464)中挑选的6个亚克隆均在39℃有完全截断，并保持其ts表型。这些结果表明，与有表型混合的克隆C3440形成对比，克隆3490和克隆3464均为单一表型。为获得更纯系的候选疫苗，我们从C3440中挑选亚克隆(C3605)。
实施例3
C3464(cp50)、C3490(cp51)、和C3605(cp63,C3440的亚克隆)这三个SLU7255的克隆成为最有希望的候选疫苗。在血清阴性的恒河猴中评估这三个克隆。在Vero细胞中制备每个克隆和wt病毒的病毒库。表7显示了以下实施例中所用库的滴度。
实施例4
本实验的目的是评估野生型(wt)HPIV-2感染血清阴性恒河猴的能力。本实验和后面两个实验中涉及的每只恒河猴均根据其血清抗wtHPIV-2之HAI抗体情况进行挑选。认为抗wt HPIV-2抗原之HAI抗体滴度＜1∶8的猴子适合入选。这三个实验共涉及20只恒河猴。其中十六只接受wt HPIV-2或两种ca/ts候选疫苗中的一种，其余4只动物接受安慰剂。4只猴子中的两只作为安慰剂动物参与不止一个试验。每个试验都有两只安慰剂对照动物。
在Vero细胞中制备wt HPIV-2亲本及ca/ts克隆C3490和C3605的库。C3605是分离株C3440的亚克隆。在最初两个实验中新伊比利亚半岛(New Iberia)的人员在接种时稀释了病毒，但是当确定实施例5的接种后个体≤2.0pfu/ml(而其预期为6.0pfu/ml)时，我们改变了步骤。包括ca/ts候选疫苗C3605及wt HPIV-2攻击病毒的实施例6之接种体均在圣路易斯大学制备，并以想要的剂量冰冻后船运至新伊比利亚半岛。
第0天(接种前)及鼻内和气管内接种105.5pfu病毒或安慰剂后第3、5、7、10、12、14、17、19、和21天，从每只猴子采集鼻洗液(NW)样品及支气管灌洗(BL)样品。将样品与转运载体混合后分装，在干冰/酒精浴中速冻并保存于-70℃。接种前及接种后第7、14、21、28、42、和56天从每只猴子采集血清样品。
将样品接种到重复的原代恒河猴肾组织培养管中，32℃孵育。在第5、9、和14天用豚鼠红细胞对RMK管进行红细胞吸附。用免疫荧光(IF)鉴定红细胞吸附阳性管。也通过在32℃对单层Vero细胞的空斑分析对每个样品定量。通过血凝抑制反应(HAI)检测血清样品中抗wt HPIV-2的抗体。在受体破坏酶(RDE)处理和热激活后对所有样品用相同的分析检测。
结果：从第一个实验的四只接种恒河猴中每只的NW和BL样品中回收到野生型HPIV-2。见表8。从NW和BL样品中回收到相似的HPIV-2滴度，其中第7天NW样品的平均高峰滴度≥1.73pfu/ml，第5天BL样品的平均高峰滴度≥1.53pfu/ml。接种后21天内在4只动物中的每一只均观察到抗wt HPIV-2的HAI抗体应答。安慰剂接受者既不释放病毒也无HAI抗体应答。
实施例5
本实验的目的是确定HPIV-2候选疫苗在血清阴性恒河猴中的生长、减毒、遗传学稳定性、和免疫原性。
检测C3490和C3605这两个HPIV-2 ca/ts候选疫苗。见表9A和9B。尽管它们中的两只仅释放病毒一天(95N148和95N139)，我们仍从4只接受C3490的猴子中的每一只的鼻洗液(NW)样品中分离到病毒。我们从4只接受C3605(502库)的猴子中3只的NW中分离到病毒。C3605组中一只动物95N152尽管其接种时为血清阳性(HAI滴度=32)，但有两天释放病毒。第7天从释放HPIV-2动物的NW中回收病毒之平均高峰滴度对C3490为1.5pfu/ml，对C3605为1.4pfu/ml。接种C3490或C3605ca/ts HPIV-2候选疫苗的8只猴子中没有一只从下呼吸道(也就是支气管灌洗样品)中释放病毒。从安慰剂接受者中的任何一只也未分离到HPIV-2。总的来说，在C3490组的两只动物(95N140和95N139)中HAI数值显示出极小的增加(＜4至8)，而在95N148号猴子中HAI滴度从第28天的8增加至第42天和第56天的32。然而，该猴子从第0天至21天显示的滴度为16，因此滴度从8增加至32可能并不代表抗体应答的有力事实。
在接受C3605组或安慰剂接受者中没有HAI抗体增加。分装的稀释疫苗的反向滴定结果显示，该实验的接种物太低。确定后接种物的反向滴定对C3490来说大约1.0pfu/ml，对C3605来说大约2.5pfu/ml。从该数据中，任何人都能看出疫苗株在下呼吸道是减毒的。
实施例6
本实验的目的是评估优选的减毒HPIV-2候选疫苗在血清阴性恒河猴中的功效。四只血清阴性的恒河猴接受稀释前量的C3605的气管内和鼻内接种。所有4只动物均从其NW样品中释放C3605 HPIV-2。见表10。从接受ca/ts候选疫苗的任何动物的BL中均分离不到病毒。第7天从NW样品中释放的疫苗的平均最高滴度为1.88pfu/ml。没有一只猴子显示出对C3605 HPIV-2的HAI抗体应答。安慰剂接受者既不释放病毒也无HAI抗体应答。
在最初用ca/ts克隆C3605接种后六十五天，用单个wt HPIV-2接种体攻击四只猴子中的每一只。见表11。安慰剂接受者也接受wt HPIV-2攻击病毒。从任何接种C3605的猴子中都回收不到病毒；但是，两只最初接受安慰剂然后用wt HPIV-2攻击的动物，从其NW和BL样品中均有病毒释放。接种C3605的4只猴子中有3只对wt HPIV-2攻击病毒的HAI抗体应答非常强。用wt HPIV-2攻击后至第7天有明显的≥64的HAI滴度。第四只猴子95N204在攻击后至第28天血清转换。接受安慰剂然后接受攻击病毒的动物，其HAI抗体应答上升至类似实施例4中接种wt HPIV-2的猴子之水平。也就是两只猴子在攻击后至第21天均血清转换。
为举例说明和描述，已介绍了前述本发明之描述及优选实施方案。它们并不完全也不是要把发明限制于公开的具体形式，按照上面的讲授，许多修改和变化是可能的。这些对本领域熟练技术人员显而易见的修改和变化在本发明范围之内。
表1
对wt亲本和PIV-2(SLU7255)所选克隆冷适应特性的表征
      病毒滴度(logpfu/ml)克隆#
      23℃ D7    23℃ D14    32℃ D7C3252    ＜2        ＜2         ＜2C3396    4.8        6.7         6.4C3464    3.1        5.3         6.8C3490    3.8        6.0         5.7C3457    4.0        6.4         6.2C3440    3.4        5.8         6.5C3444    3.8        5.7         5.3Pool453   ＜2        ＜2         6.1(野生型PIV-2)
表2wt亲本(453库)和PIV-2(SLU7255)所选克隆之空斑形成效率(EOP)分析克隆    cp
                     病毒滴度(pfu/mL)#       水平   32℃   36℃   37℃   38℃    39℃C3252    38    2.8    3.0    2.5    2.7     ＜2C3396    50    6.3    6.4    6.0    5.9     2.8C3464    50    6.1    5.8    5.3    4.6     ＜2C3490    63    5.2    4.9    4.5    4.4     ＜2C3457    56    5.4    5.3    4.9    5.2     ＜2C3440    47    4.8    4.9    4.6    4.5     ＜2C3444    63    5.8    5.7    5.1    5.3     2.8库453    0     7.0    7.2    7.1    7.0     6.9
表3PIV-2所选克隆的冷适应和温度敏感表型
    病毒滴度(log pfu/mL) 解释
   克隆#    cp水平     32℃     39℃   23℃D14  32℃D7 ts ca
 C3464     50     6.1     ＜2.0     5.3     6.8 是 是
 C3490     63     5.2     ＜2.0     6.0     5.7 是 是
 C3440     47     4.8     ＜2.0     5.8     6.5 是 是
 库453(wt)     0     7.0     6.9     ＜2.0     6.1 否 否
表4用于接种仓鼠的wt和ca PIV-2库的滴度
    库号     克隆号     cp水平 接种体滴度(logpfu/mL)
    474     3490     63     6.0
    477     3440     47     6.4
    484     3464     50     6.4
    453     wt     6.8
表5病毒滴度(32℃的log pfu/ml)
                 周1                         周2                                              周3                            周4
克隆     32℃   35℃   39℃    32℃   35℃   39℃     32℃   35℃   39℃     32℃   35℃   39℃
 C3464     7.5    5.2    ＜17.0    5.0    ＜16.6    4.8    2.07.5    5.7    2.9    5.6    4.4    ＜16.0    4.9    ＜16.2    5.2    ＜15.5    4.1    2.2     4.7    3.2    ＜15.4    5.1    ＜15.3    4.0    ＜13.8    3.2    2.2     5.5    4.4    ＜15.9    4.8    ＜16.3    5.5    ＜15.3    4.1    3.1
 C3490
 C3440
库453(wt)
                 周1                            周2                                             周3                          周4
克隆     32℃   35℃   39℃     32℃   35℃   39℃     32℃   35℃   39℃     32℃    35℃    39℃
 C3464     5.1    1.3    ＜15.5    2.4    ＜13.4    ＜1    ＜17.3    6.3    3.8     ＜1    ＜1    ＜1＜1    2.0    ＜1＜1    ＜1    ＜15.7    5.3    2.9     1.3    ＜1    ＜1＜1    ＜1    ＜1＜1    ＜1    ＜14.9    4.2    3.1     ＜1    ＜1    ＜14.2    1.0    ＜1＜1    ＜1    ＜16.0    4.9    4.1
 C3490
 C3440
库453(wt)
表6PIV-2亚克隆的表型亲代克隆  亚克隆   病毒滴度(log pfu/mL)
 #       #
               库#    32℃    39℃C3490     C3591    474    4.4    ＜1C3490     C3592    474    5.4    ＜1C3490     C3593    474    5.3    ＜1C3490     C3594    474    7.0    ＜1C3490     C3595    474    6.2    ＜1C3490     C3596    474    6.7    ＜1C3490     C3597    474    6.3    ＜1C3490     C3598    474    7.4    ＜1C3490     C3599    474    6.8    ＜1C3490     C3600    474    5.8    ＜1C3440     C3601    477    7.2    3.1C3440     C3602    477    6.9    ＜1C3440     C3603    477    7.3    ＜1C3440     C3604    477    6.6    ＜1C3440     C3605    477    7.3    ＜1C3440     C3606    477    6.6    ＜1C3440     C3607    477    7.1    ＜1C3440     C3608    477    7.1    ＜1C3440     C3609    477    4.7    ＜1C3440     C3610    477    6.7    4.4C3464     C3621    484    5.5    ＜1C3464     C3622    484    6.0    ＜1C3464     C3623    484    5.5    ＜1C3464     C3625    484    6.2    ＜1C3464     C3627    484    6.9    ＜1C3464     C3628    484    7.0    ＜1
      对照     491    6.4    6.2
表7用于血清阴性恒河猴接种的HPIV-2(SLU7255)之wt和减毒库的滴度库#    克隆#    冷传代水平    病毒滴度(log pfu/ml)
                          32℃            39℃499    C3464    50            5.4             2.0500    C3490    63            7.2             1.3502    C3605* 47            7.8             ＜1.0504    wt       0             6.4             6.6*C3605是C3440的亚克隆
表8来自用wt HPIV-2接种的恒河猴的样品
    分离自Vero细胞分析的HPIV-2[病毒滴毒(log pfu/ml)]     HAI滴度
恒河猴1D#库504(wt)     接种后天数(NWa)     接种后天数(BLb)     接种后天数
0 3 5 7 10 12 0 3 5 7 10 12 0 7 14 21 28 42 56
 95N002 ＜1 ≥1.5* 2.1 3.0 ＜1 ＜1 ＜1 ≥1.5* 1.6 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 16 32 64 64 64
 95N055 ＜1 ≥1.5* ＜1 ≥1.5* ＜1 ＜1 ＜1 ≥1.5* ≥1.5* 1.0* ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 8 32 32 16 16
 95N059 ＜1 ≥1.5* 1.0* ≥1.5* ＜1 ＜1 ＜1 ≥1.5* ≥1.5* ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 4 16 16 16 8
 95N060 ＜1 ≥1.5* ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ≥1.5* ≥1.5* ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 ＜4 8 8 16 16
 安慰剂
 95N003 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4
 05M--7 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4
a)NW=鼻洗液：b)BL=支气管灌洗；*=以RMK数据为根据的滴度，一个阳性管=1.0，两个HA阳性管=≥1.5
表9A收集自用C3490或C3605 HPIV-2候选疫苗接种的恒河猴样品的病毒学
和免疫学结果
恒河猴#     HAI滴度，接种后天数d NWa的HPIV-2分离物 BLb的HPIV-2分离物
0 7 14 21 28 42 56 RMK管     Vero平板    RMK管   Vero平板
库500(P1V2,C3490,cp63  天     天)     天)     天)
 95N140     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     8     8     5,7,10     5,7,10     VNI     ＜1
 95N159     4     8     8     4     8     8     8     7,14     ＜1     VNI     ＜1
 95N148     16     16     16     16     8     32     32     17     ＜1     VNI     ＜1
 95N139     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     8     4     17     ＜1     VNI     ＜1
库502 P1V2,C3605,cp47
 95N152     32     32     32     32     32     32     32     5,7     ＜1     VNI     ＜1
 95N147     4     8     8     8     8     8     8     3,5,7,10,12     10,12     VNI     ＜1
 95N145     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     3,5,7,10     5,7,10     VNI     ＜1
 95N130     ＜4     ＜4     4     4     4     4     4     VNI°     ＜1     VNI     ＜1
安慰剂
95N009     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     ＜4     VNI     ＜1     VNI     ＜1
95N163 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 VNI ＜1 VNI ＜1
表9B收集自用C3490或C3605 HPIV-2候选疫苗接种的恒河猴样品的病毒学
和免疫学结果
NW的Vero平板数据下降(仅限阳性样品)
恒河猴#     滴度(pfu/mL)，接种后天数
0 3 5 7 10 12 14 17
库500(P1V2,C3490,cp51
 95N140 ＜1 ＜1     1.8     1.8     1.9     ＜1     ＜1     ＜1
 95N159 ＜1 ＜1     ＜1     1.0*     ＜1     ＜1     1.0*     ＜1
 95N148 ＜1 ＜1     ＜1     ＜1     ＜1     ＜1     ＜1     1.0*
库502(PIV2,C3605,cp47)
95N152 ＜1 ＜1     1.0*     ≥1.5*     ＜1     ＜1     ＜1     ＜1
95N147 ＜1 1.0*     ≥1.5*     ≥1.5*     1.7     1.4     Pe     ＜1
95N145 ＜1  1.0*     2.2     2.6     1.5     ＜1     ＜1     ＜1
a)NW=鼻洗液；b)BL=支气管灌洗；c)=未分离到病毒；d)=所有时间点的血样5/21/98的HAI数据*以RMK数据为根据的滴度，一个HA阳性管=1.5，两个HA阳性
表10来自用502库或安慰剂接种的恒河猴的样品
    Vero分析的HPIV-2分离物[病毒滴度]     HAI滴度
恒河猴1D#库502(P1V2,C3605,cp47)     接种后天数(NWa)     接种后天数(BLb)     接种后天数
0 3 5 7 10 12 0 3 5 7 10 12 0 7 14 21 28 42 56
 95N024 ＜1 ＜1 1.5 1.8 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4
 95N087 ＜1 1.5* 1.0* 1.2 2.0* 1.0* ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4
 95N138 ＜1 1.5* 1.0* 2.0* 1.0(1.5*) ≥1.5 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4
 95N181 ＜1 ＜1 1.5* 2.5 2.0* ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4
安慰剂
95N006 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4
 95N009 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4
a)NW=鼻洗液；b)BL=支气管灌洗；*=以RMK数据为根据的滴度，一个阳性管=1.0，两个HA阳性管=≥1.5
表11来自用502库或安慰剂接种然后用wt HPIV-2攻击的恒河猴的样品
    Vero分析的HPIV-2分离物[病毒滴度]     HAI滴度
恒河猴1D#库502(wt)(P1V2,C3605,cp47)     接种后天数(Nwa)     接种后天数(BLb)     接种后天数
0 3 5 7 10 12 0 3 5 7 10 12 0 7 14 21 28 42 56
95N024 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 ＜4 4 8 8 4
95N087 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 64 128 128 64 64 64
95N138 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 256 512 512 256 128 128
95N181 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 256 128 128 64 32 32
安慰剂
95N006 ＜1 1.9 1.5 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 1.0* ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 ＜4 32 32 32 16
 95N009 ＜1 ≥1.5 ≥1.5 ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 1.0* ＜1 ＜1 ＜1 ＜1 ＜4 ＜4 4 8 16 16 32
a)NW=鼻洗液；b)BL=支气管灌洗；*=以RMK数据为根据的滴度，一个阳性管=1.0，两个HA阳性管=≥1.5
参考文献
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Claims (22)

1．一种分离的2型人副流感病毒减毒病毒株。
2．权利要求1的分离的减毒病毒株，其在用Vero细胞的空斑分析中显示滴度，32℃左右在哺乳动物宿主细胞中生长时其滴度比23℃左右在哺乳动物宿主细胞中生长时其滴度的100倍小，并且与39℃左右在哺乳动物宿主细胞中生长时其滴度的大约100倍相比相等或较小。
3．权利要求1的分离的减毒病毒株，其在用Vero细胞的空斑分析中显示滴度，当于39℃左右在哺乳动物宿主细胞中生长时，滴度小于或等于大约1.0pfu/ml。
4．权利要求1的分离的减毒病毒株，其选自命名为C3396、C3464、C3490、C3457、C3440、C3444的病毒株组、及任何前面提到的病毒株之亚克隆或子代。
5．权利要求1的分离的减毒病毒株，其选自命名为C3464、C3490、C3440的病毒株、及任何前面提到的病毒株之亚克隆或子代。
6．一种含有权利要求1的分离的减毒病毒株及药学可接受的载体的疫苗组合物。
7．权利要求6的疫苗组合物，其进一步包括药学可接受的赋形剂。
8．权利要求6的疫苗组合物，其进一步包括药学可接受的佐剂。
9．权利要求6的疫苗组合物，其中分离的减毒病毒株是权利要求2的病毒株。
10．权利要求9的疫苗组合物，其进一步包括药学可接受的赋形剂。
11．权利要求9的疫苗组合物，其进一步包括药学可接受的佐剂。
12．权利要求6的疫苗组合物，其中分离的减毒病毒株是权利要求4的病毒株。
13．权利要求12的疫苗组合物，其进一步包括药学可接受的赋形剂。
14．权利要求12的疫苗组合物，其进一步包括药学可接受的佐剂。
15．权利要求6的疫苗组合物，其中分离的减毒病毒株是权利要求5的病毒株。
16．权利要求15的疫苗组合物，其进一步包括药学可接受的赋形剂。
17．权利要求15的疫苗组合物，其进一步包括药学可接受的佐剂。
18．一种在哺乳动物中诱导保护性免疫应答的方法，包括给哺乳动物施用足够引起保护性免疫应答的量的权利要求1之分离的减毒病毒株。
19．权利要求18的方法，其中分离的减毒病毒株是权利要求2的病毒株。
20．权利要求18的方法，其中分离的减毒病毒株是权利要求3的病毒株。
21．权利要求18的方法，其中分离的减毒病毒株是权利要求4的病毒株。
22．权利要求18的方法，其中分离的减毒病毒株是权利要求5的病毒株。
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