JP6117379B2 - エンテロウイルス71の低温適応温度感受性株および低温適応温度感受性ウイルス株を発展させるプロセス - Google Patents
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[0001]本出願は、電子形式の配列表とともに提出されている。配列表は、2577224PCTSequenceListing.txtと題され、2013年1月11日に作成され、そしてサイズは21kbである。配列表の電子形式での情報は、その全体が本明細書に援用される。
ヒト・エンテロウイルス71(EV71)の低温適応温度感受性株を発展させるための材料および方法
[0047]細胞、ウイルスおよび低温適応プロセス:10%ウシ胎児血清(FCS)を補充したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)中の定期的な継代によって維持されたVero細胞(ATCC CCL−81)を、ウイルス培養、弱毒化、力価決定および温度感受性表現型の評価に用いた。手足口病(HFMD)を提示した患者の、それぞれ、口腔分泌物、糞便および脳幹標本からVero細胞において単離された遺伝子型C1、B3およびB4に属する3つのEV71単離体を、先に記載される技術にしたがって、1回プラーク精製した(Dougherty、1964)。プラーク精製後、Vero細胞において37℃で2回継代した後、それぞれ親野生型株と称されるウイルスストックを調製した。すべてのウイルスストックおよびそれぞれの継代株を、−80℃フリーザー中で保存した。
エンテロウイルス71の低温適応温度感受性株(EV71:TLLα、EV71:TLLαP20、EV71:TLLβ、EV71:TLLβP20およびEV71:TLLβP40)の表現型および遺伝子型特性に関する結果
[0063]低温適応株を得るために用いた元来の3つの親EV71ウイルスは、10 MOIのウイルス接種物および37.5℃のインキュベーション温度で、接種後3日以内に、Vero細胞において、完全CPEを引き起こした。同じウイルス接種物で、元来の親EV71ウイルスは、39.5℃のインキュベーション温度で5日以内に、Vero細胞において、完全CPEを引き起こした。しかし、37.5℃で培養したVero細胞の最初の2回の継代から得られるすべての3つの元来の親EV71ウイルスは、10 MOIのウイルス接種物および28℃のインキュベーション温度で、Vero細胞において、CPEを引き起こさなかった。また、28℃で10日間の培養終了時、ブラインド継代後に、CPEはまったく見られなかった。接種されたVero細胞におけるウイルス複製の非存在は、さらに、間接的免疫蛍光アッセイによる、EV71に対する商業的検出モノクローナル抗体を用いた10日培養終了時に、培養上清液における懸濁された細胞存在の陰性染色によって、さらに裏付けられた。
37℃でインキュベーションしたVero細胞を6回連続継代した後のEV71:TLLβP20の低温適応温度感受性表現型からの復帰の評価
IFA:間接的免疫蛍光アッセイ
[0068]EV71:TLLαおよびEV71:TLLβ、さらに20回継代した後のそれぞれの株(EV71:TLLαP20およびEV71:TLLβP20)および元来の親野生型の完全ゲノムを配列決定し、そして分析した。EV71:TLLαP20のヌクレオチド配列を配列番号6に示す。EV71:TLLβP20のヌクレオチド配列を配列番号7に示す。EV71:TLLα、EV71:TLLαP20および元来の親野生型の間の遺伝子各セグメントでのヌクレオチド変化の数を表2に示す。元来の親野生型、EV71:TLLβ、EV71:TLLβP20およびEV71:TLLβP40(さらなる40継代)の間のヌクレオチド変化の数を表3に示す。37℃のインキュベーション温度での6回の連続継代による温度感受性復帰研究から得られるウイルス株の完全ゲノムもまた配列決定し、そしてEV71:TLLβP20のものに比較したヌクレオチド変化の数を表4に示す。
元来の親野生型ウイルスの完全ゲノムと比較した、EV71:TLLαおよびEV71:TLLαP20のゲノムセグメント各々で生じる、ヌクレオチド(NT)および対応するアミノ酸(AA)突然変異の数
元来の親野生型ウイルスのゲノムと比較した、EV71:TLLβ、EV71:TLLβP20およびEV71:TLLβP40のゲノムセグメント各々で生じる、ヌクレオチド(NT)および対応するアミノ酸(AA)突然変異の数
EV71:TLLβP20のゲノムと比較した、温度感受性復帰研究由来のウイルス株のゲノムセグメント各々で生じる、ヌクレオチド(NT)および対応するアミノ酸(AA)突然変異の数
ヒト・エンテロウイルス71の低温適応温度感受性株(EV71:TLLβP20)のサル研究に関する結果
[0069]臨床的知見:研究したサルの臨床状態および体温測定に関する一般的な観察を1日2回、朝および夕方に行った。全体を通して、すべてのサルは、活発であり、そして正常に摂食しているとわかった。いずれのサルも、いかなるわずかな局所神経学的欠陥、例えば脚弱、振戦または異常な運動も発展させなかった。1X108 CCID50/mlの静脈内用量を投与された1匹のサル(2247M)が接種3日後に一過性の低等級の発熱(39.3℃)を示したことを除いて、こうした事例はなかった。サルが深い麻酔下で屠殺される時点まで、再体重測定に際して、体重喪失したサルはいなかった。
EV71:TLLβP20の完全ゲノムと比較した、4日および8日PIに収集した2匹のサル(2889Mおよび2890M)の血清試料中に存在するEV71のゲノムセグメント各々で生じる、ヌクレオチド(NT)および対応するアミノ酸(AA)突然変異の数
抗原として社内調製感染Vero細胞を用いた間接的免疫蛍光アッセイによって決定した際の、静脈内EV71:TLLβP20を投与した後のサルの結合抗体(IgMおよびIgG)の力価
マイクロ中和アッセイによって決定した際の、静脈内EV71:TLLβP20を投与した後の、2匹のサルの血清におけるEV71のいくつかの遺伝子型(A、B3、B4、B5、C1およびC5)に対する中和抗体の力価。
ヒト・コクサッキーウイルスA16の低温適応温度感受性株を発展させるための材料および方法
[0075]材料および方法:10%ウシ胎児血清(FCS)を補充したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)中の定期的な継代によって維持されたVero細胞(ATCC CCL−81)を、コクサッキーウイルスA16のウイルス培養、弱毒化、力価決定および温度感受性の評価に用いた。弱毒化プロセスのための親野生型コクサッキーウイルスA16(CA16)は、手足口病(HFMD)を有する患者の口腔分泌物から得られる。該ウイルスは、先に記載する技術にしたがって、1回プラーク精製された。プラーク精製後、Vero細胞において37℃で2回継代した後、それぞれ親野生型株と称されるウイルスストックを調製した。すべてのウイルスストックおよびそれぞれの継代株を、−80℃フリーザー中で保存した。
ヒト・コクサッキーウイルスA16の低温適応温度感受性株の細胞におけるウイルス特性に関する結果
[0079]インキュベーション温度を連続して低下させる100回の継代時に、低温適応CA16株は、≦5MOIのウイルス接種物および28℃のインキュベーション温度で、接種3日以内に、Vero細胞において、完全CPEを引き起こすことが可能であったが、37℃のインキュベーション温度では、完全CPEを達成するのに4日間かかった。39.5℃のインキュベーション温度では、CPEはまったく見られなかった。
[態様1] 低温適応温度感受性エンテロウイルス71株。
[態様2] EV71:TLLβP20である、態様1の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株。
[態様3] EV71:TLLαP20である、態様1の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株。
[態様4] 態様1〜3のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株を含む組成物。
[態様5] 薬学的に許容されうるキャリアーをさらに含む、態様4の組成物。
[態様6] アジュバントをさらに含む、態様4または5の組成物。
[態様7] ワクチンである、態様4〜7のいずれか一項の組成物。
[態様8] 被験体において防御免疫反応を誘発する際に使用するための、態様1〜3のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または態様4〜8のいずれか一項の組成物。
[態様9] 被験体がエンテロウイルス71関連疾患に罹患することを防止する際に使用するための、態様1〜3のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または態様4〜8のいずれか一項の組成物。
[態様10] エンテロウイルス71感染被験体において、エンテロウイルス71関連疾患の開始を遅らせるかまたはその速度を遅延させる際に使用するための、態様1〜3のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または態様4〜8のいずれか一項の組成物。
[態様11] 被験体において防御免疫反応を誘発するための薬剤製造のための、態様1〜3のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または態様4〜8のいずれか一項の組成物の使用。
[態様12] 被験体がエンテロウイルス71関連疾患に罹患することを防止するための薬剤製造のための、態様1〜3のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または態様4〜8のいずれか一項の組成物の使用。
[態様13] エンテロウイルス71感染被験体において、エンテロウイルス71関連疾患の開始を遅らせるかまたはその速度を遅延させるための薬剤製造のための、態様1〜3のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または態様4〜8のいずれか一項の組成物の使用。
[態様14] 被験体において防御免疫反応を誘発する方法であって、態様1〜3のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または態様4〜8のいずれか一項の組成物の、予防的、療法的または免疫学的に有効な量を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
[態様15] 被験体が野生型エンテロウイルス71に曝露されている、態様14の方法。
[態様16] 被験体がエンテロウイルス71関連疾患に罹患することを防止するための方法であって、態様1〜3のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または態様4〜8のいずれか一項の組成物の、予防的、療法的または免疫学的に有効な量を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
[態様17] 被験体が野生型エンテロウイルス71に曝露されている、態様16の方法。
[態様18] エンテロウイルス71感染被験体において、エンテロウイルス71関連疾患の開始を遅らせるかまたはその速度を遅延させる方法であって、態様1〜3のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または態様4〜8のいずれか一項の組成物の、予防的、療法的または免疫学的に有効な量を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
[態様19] 被験体がヒト被験体である、態様14〜18のいずれか一項の方法。
[態様20] 低温適応温度感受性エンテロウイルス71株で被験体を免疫するためのキットであって、態様1〜3のいずれか一項の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または態様4〜8のいずれか一項の組成物、薬学的に許容されうるキャリアー、およびその使用のための指示資料を含む、前記キット。
[態様21] アプリケーターをさらに含む、態様20のキット。
[態様22] 低温適応温度感受性ウイルスを産生する方法であって、以下の工程:
(i)親野生型ウイルスの参照ストックを調製し;
(ii)親野生型ウイルスの参照ストックに感染させた細胞の培養物を、より高い感染多重度(MOI)および約34℃〜約36℃、好ましくは約34℃のインキュベーション温度で5回またはそれより多い継代数分、より低いMOIの接種物および完全CPEを得るための各継代のより短いインキュベーション期間を用いて、各継代で完全細胞変性効果(CPE)が得られるまでインキュベーションし;
(iii)先の工程の結果生じたウイルスに感染させた細胞の培養物を、より高いMOIおよび先の工程よりも約1℃〜約3℃低いインキュベーション温度で5回またはそれより多い継代数分、より低いMOIの接種物および完全CPEを得るための各継代のより短いインキュベーション期間を用いて、各継代で完全細胞変性効果(CPE)が得られるまでインキュベーションし;そして
(iv)ウイルスの最適複製のために選択されるターゲット温度が達成されるまで、インキュベーション温度を増分で低下させる体系的な段階的方式で、工程(iii)を反復する;
工程を含む、前記方法。
[態様23] 約36℃〜約38℃、好ましくは約37℃の温度で、1回または2回の継代分、完全細胞変性効果(CPE)が得られるまで、野生型ウイルスに感染した細胞の培養物をインキュベーションすることによって、親野生型ウイルスの参照ストックを調製する、態様22の方法。
[態様24] ウイルスがピコルナウイルス科、好ましくはエンテロウイルス属のメンバーである、態様22または23の方法。
[態様25] ウイルスがエンテロウイルス71またはコクサッキーウイルスA16である、態様24の方法。
[態様26] ターゲット温度が約26℃〜約29℃、好ましくは約28℃である、態様22〜25のいずれかの方法。
[態様27] ウイルスが完全細胞変性効果(CPE)を得たら直ちに、ウイルスを含有する清澄化された培養上清を得て、そして細胞の連続する新鮮な新規培養フラスコのそれぞれの中に、この上清を渡すことによって、ウイルスをプロセスの各工程で継代する、態様22〜26のいずれかの方法。
[態様28] より高いMOIが20である、態様22〜27のいずれかの方法。
[態様29] 新鮮な集密(confluent)単層Vero細胞を含有する新規培養フラスコに、ウイルスが完全CPEを引き起こした後、さらに3回の継代に渡って、20のMOIのウイルスを接種する、態様28の方法。
[態様30] より低いMOIが5〜10である、態様22〜29のいずれかの方法。
[態様31] 新鮮な集密単層Vero細胞を含有する新規培養フラスコに、ウイルスが完全CPEを引き起こした後、少なくともさらに3回の継代に渡って、5〜10のMOIでウイルスを接種する、態様30の方法。
[態様32] 工程(iii)を、前記の少なくともさらに3回の継代の後、5〜10のMOIで、開始するかまたは反復する、態様31の方法。
[態様33] 完全CPEが接種後3日以内に起こる、態様27〜32のいずれか一項の方法。
[態様34] 細胞がVero細胞である、態様22〜33のいずれかの方法。
[態様35] Vero細胞を、ウシ胎児血清(FCS)を補充したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)中で培養する、態様22〜34のいずれかの方法。
[態様36] 培地に1%FCSを補充する、態様35の方法。
Claims (26)
- 寄託番号PTA−13285としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された株EV71:TLLβP20、または寄託番号PTA−13284としてアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託された株EV71:TLLαP20である、低温適応温度感受性エンテロウイルス71株。
- 請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株を含む組成物。
- 薬学的に許容されうるキャリアーをさらに含む、請求項2に記載の組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項2に記載の組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項3に記載の組成物。
- ワクチンである、請求項2に記載の組成物。
- ワクチンである、請求項3に記載の組成物。
- ワクチンである、請求項4に記載の組成物。
- ワクチンである、請求項5に記載の組成物。
- 被験体において防御免疫反応を誘発する際に使用するための、請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または請求項2〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 被験体がエンテロウイルス71関連疾患に罹患することを防止する際に使用するための、請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または請求項2〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- エンテロウイルス71感染被験体において、エンテロウイルス71関連疾患の開始を遅らせるかまたはその速度を遅延させる際に使用するための、請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または請求項2〜9のいずれか一項に記載の組成物。
- 被験体において防御免疫反応を誘発するための薬剤製造のための、請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または請求項2〜9のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 被験体がエンテロウイルス71関連疾患に罹患することを防止するための薬剤製造のための、請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または請求項2〜9のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- エンテロウイルス71感染被験体において、エンテロウイルス71関連疾患の開始を遅らせるかまたはその速度を遅延させるための薬剤製造のための、請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株、または請求項2〜9のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 被験体がヒト被験体である、請求項13〜15のいずれか1項に記載の使用。
- 低温適応温度感受性エンテロウイルス71株で被験体を免疫するためのキットであって、請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株または請求項2〜9のいずれか一項に記載の組成物、薬学的に許容されうるキャリアー、およびその使用のための指示資料、を含む、前記キット。
- さらにアプリケーターを含む、請求項17に記載のキット。
- 請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株を使用することを含む、ワクチンの製造方法。
- 配列番号6または配列番号7に示されるヌクレオチド配列からなる核酸を使用することを含む、ワクチンの製造方法。
- ワクチン開発のための、請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株の使用。
- ワクチン開発のための、配列番号6または配列番号7に示されるヌクレオチド配列からなる核酸の使用。
- ワクチン開発に使用するための請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株。
- ワクチン開発に使用するための配列番号6または配列番号7に示されるヌクレオチド配列からなる核酸。
- 請求項1に記載の低温適応温度感受性エンテロウイルス71株の使用。
- 配列番号6または配列番号7に示されるヌクレオチド配列からなる核酸の使用。
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