CN104918636A

CN104918636A - 肠病毒71的冷适应型温度敏感株及开发冷适应型温度敏感性病毒株的方法

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Publication number: CN104918636A
Application number: CN201380070773.0A
Authority: CN
Inventors: K·B·蔡
Original assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2033-01-18
Also published as: CN104918636B; SG11201505468VA; HK1213474A1; JP2016511634A; WO2014112945A1; JP6117379B2; MY185184A; TWI705140B; TW201522642A

Abstract

本发明涉及冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株，特别涉及冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株EV71:TLLβP20和EV71:TLLαP20。本发明还涉及开发冷适应温度敏感病毒株的方法。

Description

肠病毒71的冷适应型温度敏感株及开发冷适应型温度敏感性病毒株的方法

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发明背景

本发明涉及冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株，特别涉及冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株EV71：TLLβP20和EV71：TLLαP20。本发明还涉及开发冷适应型温度敏感性病毒株、特别是RNA病毒株的方法。

本文用于描述本发明背景或者提供关于实践的额外细节的出版物及其它材料引入本文并且为方便起见集合在参考文献中。

手足口病(HFMD)是由一组基本上属于肠病毒A物种(enterovirus speciesA)的人肠病毒导致的。在这些病毒中，肠病毒71(EV71)和柯萨奇病毒A16(CA16)负责导致90％以上的HFMD病。除了导致HFMD之外，已知EV71导致产生死亡的严重神经疾病，特别是在幼儿中。

人肠病毒71(EV71)是小的无包膜病毒，大小约30nm，具有大约7450个核苷酸的单链正RNA基因组。该病毒分类为小RNA病毒科(Picornaviridae)肠病毒属(Enterovirus)的人肠病毒A物种(Alexander et al.，1994；Melnick，1996)。基于其主要衣壳蛋白(VP1)基因的系统发生分析，EV71分为3个主要基因群(命名为A、B和C)，基因群B和C进一步分为基因亚群B1-B5及C1-C5(Bible et al.，2008)。EV71与一组临床疾病相关，包括主要在婴儿和幼儿中的手足口病(HFMD)、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样麻痹(Alexander et al.，1994；Melnick，1996)。该病毒首先从美国加利福尼亚的一名患有无菌性脑膜炎的儿童中分离，随后被鉴定为肠病毒属的新血清型(Schmidt et al.，1974)。在其最初分离后几年中，在世界各个部分均报道了这个病毒导致的具有并发症的HFMD的爆发(Blomberg et al.，1974；Kennett et al.，1974；Deibel et al.，1975；Hagiwara et al.，1978)。

近年来，在发生神经毒性EV71流行性和零星爆发后，EV71感染已成为全世界特别是亚太地区主要的公共健康负担和关注点。EV71的神经毒性在1975年保加利亚爆发期间首先获得显著的全球关注，该次爆发导致705例脊髓灰质炎样疾病，其中44例死亡(Chumakov et al.，1979；Shindarov et al.，1979)。1978年在匈牙利发生类似性质的爆发，导致许多脊髓灰质炎样疾病病例及47例死亡(Nagy et al.，1982)。随后，在纽约、香港、澳大利亚和费城报道了一些与EV71相关的较温和的CNS疾病的流行(Chomnaitree et al.，1958；Samuda etal.，1987；Gilbert et al.，1988；Hayward et al.，1989)。在日本发生了两起EV71流行，大部分病例的特征是HFMD及CNS疾病的低发生率(Tagaya et al.，1981；Ishimaru et al.，1980；Hagiwara et al.，1983)。在1997年，在马来西亚出现由于高神经毒性EV71导致的HFMD大爆发，导致48例死亡。更大的爆发在1998年发生在台湾，有超过100000例HFMD，405例严重感染，78例由于急性脑干脑脊髓炎伴神经性心衰和肺水肿而导致的死亡(Lum et al.，1998a；Lum et al.，1998b；Chang et al.，1998；Yan et al.，200；Liu et al.，2000；Wang et al.，2000)。在2008年中国大陆记录了488955例HFMD病例，其中126例死亡(Chinese Center，2008)。据报道2009年HFMD病例数增至1155525例，死亡353例(Yang et al.，2011)。2010年，该国经历了最大爆发，有超过170万HFMD病例，27000例患者具有严重神经学并发症，905例死亡。在所有3次爆发中，几乎所有具有神经学并发症和死亡的严重病例均由EV71所致(Zeng et al.，2012)。

目前，病毒毒力的分子决定簇及EV71感染的发病机制仍未完全了解。没有任何抗病毒药被批准用于临床治疗严重感染及相关神经学并发症，也没有任何疫苗可供用于控制和预防复发性爆发。在控制和预防策略方面，特别用于发展中国家的成本可取的疫苗的开发是顶级优先和最紧急的。处于研究和开发中的各种类型的抗EV71疫苗看起来在啮齿类或猴中引起免疫应答(Wu etal.，2001；Arita et al.，2005；Chiu et al.，2006；Arita et al.，2007；Tung et al.，2007；Chung et al.，2008；Chen et al.，2008；Ong et al.，2010；Chen et al.，2011；Lee andChang，2010；Xhang et al.，2010.尽管基于VP1衣壳的病毒样颗粒疫苗和亚单位肽疫苗是值得进一步研究和开发的可行的潜在疫苗策略，但是基于失活的可注射Salk及减毒的口服活Sabin脊髓灰质炎病毒疫苗在控制和接近根除野生型脊髓灰质炎感染中的过去非常大量的开发和应用经验，可注射的失活和口服减毒EV71疫苗是最有前景的候选者(Zhang et al.，2010)。

目前，市场上没有疫苗能保护儿童抗EV71所致感染及手足口病。基于最近信息，中国2个中心、新加坡1个中心及台湾1个中心在开发可注射失活EV71疫苗(新闻报道及个人通讯)。日本东京的国家传染病研究所的肠病毒部门由Dr H.Shimizu领导从1980年代已对EV71在猴子中的发病机制及温度敏感性EV71株作为潜在的候选口服减毒活疫苗进行了深入研究(Arita et al.，2005；Arita et al.，2007)。在其猴子研究中EV71温度敏感株的所有潜在疫苗候选物在静脉内接种后仍能导致CNS的神经侵袭和组织病理学损害，尽管与野生型病毒相比程度较低。

减毒活疫苗代表首次成功的接种方法之一，始自18世纪，当时英国医生Edward Jenner开始用牛痘病毒接种儿童以抵抗致命疾病天花。减毒活疫苗使用活病毒或微生物，它们已被弱化从而不能致病，但是诱导保护性免疫应答。传统的、经典的及遗传学方法已在某种程度上成功减毒病毒和微生物用作减毒活疫苗^44-48。传统方法使用天然发生的在人类中无毒力的相关生物，如使用牛痘病毒或痘苗病毒。经典方法涉及在减毒条件下毒性病毒或微生物的生长循环，例如在组织培养或苛性液体培养基中。遗传学方法使用分子生物技术操作基因组以降低它们的毒力(Huygelen，1997；Robinson，2008；Coleman et al.，2008；Lauring et al.，2010；Kenney et al.，2011)。在获得作为减毒标记的温度敏感性表型病毒的经典方法中，野生型病毒是经噬斑测定技术而噬斑选择的，其是在低温保温的合适细胞中培养病毒。选择的病毒株随后在靶向的低保温温度重复传代(Hagiwara et al.，1982；Hashimoto and Hagiwara，1983；Richmanand Murphy，1997)。

希望的是开发能用于治疗病毒疾病的病毒株，其在特异性体外细胞培养条件中保持表型和遗传稳定性，并且在静脉内接种后在猴子中不显示神经毒性。还希望的是开发病毒、包括RNA病毒的冷适应型温度敏感性病毒株，其在细胞培养中系列传代后衍生。

发明概述

因此，在一个方面，本发明提供了冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株。在一个实施方案中，所述冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株是本文描述的EV71：TLLβP20。在另一个实施方案中，所述冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株是本文描述的EV71：TLLαP20。

本发明的肠病毒71毒株通过用温度敏感性作为表型标记减毒肠病毒71的方法制备。所述方法是体外实验室方法，改变病毒的生物学生长特征以适应在低于30℃的保温温度的最佳复制。以下详细描述的适应方法如下进行，即以系统性逐步方式渐进降低培养病毒的保温温度，直至达到选择用于病毒最佳复制的靶向温度。

在第二个方面，本发明提供了包含本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的组合物。在一个实施方案中，组合物包含有效量的本文描述的病毒株。在另一个实施方案中，所述组合物包含一或多种生理学或药物学可接受的载体。在进一步的实施方案中，所述组合物是疫苗。含有本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的疫苗使用本领域技术人员公知的技术制备。通过使用本领域技术人员公知的技术将疫苗给予对象如人类对象，这种疫苗用于提供抗亲本病毒株的免疫性。

在第三个方面，本发明提供了在对象如人类对象中引起保护性免疫应答的方法，其包括给予对象预防或治疗或免疫学有效量的本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株。在一个实施方案中，保护性免疫应答保护对象抗肠病毒71导致的疾病。在一个实施方案中，所述疾病是手足口病。在另一个实施方案中，所述疾病是无菌性脑膜炎。在一另外的实施方案中，所述疾病是脑炎。在进一步的实施方案中，所述疾病是脊髓灰质炎样麻痹。在一个实施方案中，本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株作为疫苗给予。在一另外的实施方案中，对象已暴露于野生型肠病毒71。在另一个实施方案中，给予本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株预防对象如人类对象被肠病毒71相关疾病累及。在一另外的实施方案中，对象已暴露于野生型肠病毒71。在进一步的实施方案中，给予本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株延迟了病毒感染的对象如人类对象中肠病毒71相关疾病的发作或减缓了所述疾病的进展速度。

在第四个方面，本发明提供了用温度敏感性作为表型标记减毒病毒的方法。根据这个方面，所述方法开发了冷适应型温度敏感性病毒株。本发明方法是体外实验室方法，以改变病毒生物学生长特征以适应在30℃以下的保温温度的最佳复制。适应方法如下进行，即以系统性逐步方式渐进降低培养病毒的保温温度，直至达到选择用于病毒的最佳复制的靶向温度。因此，根据本发明，所述方法包括下述步骤：(i)制备亲本野生型病毒参考原种(referencestock)，(ii)保温用亲本野生型病毒参考原种以较高感染复数(MOI)感染的细胞培养物，保温温度大约34℃至大约36℃，优选大约34℃，保温5代或更多代，直至每一代获得完全细胞病变效应(CPE)，其中使用较低MOI接种物和较短保温时间使每一代获得完全CPE，(iii)保温用前一步骤所得的病毒以较高MOI感染的细胞培养物，保温温度比前一步骤低大约1℃至大约3℃，保温5代或更多代，直至每一代获得完全细胞病变效应(CPE)，其中使用较低MOI接种物和较短保温时间使每一代获得完全CPE，及(iv)以系统性逐步渐进降低保温温度的方式而重复步骤(iii)，直至达到选择用于病毒的最佳复制的靶向温度。在一个实施方案中，靶向温度是大约26℃至大约29℃，优选大约28℃。在一个实施方案中，渐进降低保温温度是降低大约1℃至大约2℃的温度。

在一个实施方案中，亲本野生型病毒参考原种是通过在大约36℃至大约38℃、优选大约37℃的温度保温用野生型病毒感染的细胞培养物一代或两代直至获得完全细胞病变效应(CPE)而制备。含有产生的病毒的培养物上清等份置于小瓶中或者其它合适储存装置中。这个培养物上清用作亲本野生型病毒参考原种。参考亲本野生型病毒用于后续减毒过程。在另一个实施方案中，亲本野生型病毒参考原种等份储存在合适温度，如-80℃。

在一个实施方案中，病毒是任何病毒。在另一个实施方案中，病毒是RNA病毒。在一另外的实施方案中，RNA病毒是正链RNA病毒。在进一步的实施方案中，病毒是小RNA病毒科成员。在另一个实施方案中，病毒是肠病毒属成员。在一个实施方案中，病毒是肠病毒71(EV71)。在另一个实施方案中，病毒是柯萨奇病毒A16(CA16)。本发明方法可用于产生任何这些病毒的冷适应型温度敏感性病毒株，包括但不限于EV71和CA16的冷适应型温度敏感株。

在一个实施方案中，被病毒感染的细胞是任何允许病毒生长的细胞。在一优选的实施方案中，细胞是Vero细胞(ATCC CCL-81)。在一个实施方案中，细胞通过在适合细胞生长的培养基中定期传代而保持。在其中细胞是Vero细胞的实施方案中，Vero细胞在补加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM)中保持。在一个实施方案中，在补加1％FCS的DMEM中保持的Vero细胞用于生产亲本野生型病毒、病毒培养物、减毒、滴定和评估温度敏感性表型。在另一个实施方案中，DMEM补加1％FCS，用于使病毒株适应在相继降低的保温温度中复制。

本发明还涉及通过本文描述的方法产生的冷适应型温度敏感性病毒株。通过本文描述的方法产生的冷适应型温度敏感性病毒可用于使用本领域技术人员熟知的技术生产疫苗。这种疫苗可用于通过用本领域技术人员熟知的技术给予对象疫苗而提供抗亲代病毒株的免疫性。

附图简述

图1a示出衍生自给予静脉内剂量的肠病毒71(EV71：TLLβP20)后第4天的猴血液的外周血单核细胞(箭头)，其用特异于该病毒的商业单克隆抗体经间接免疫荧光测定染色阳性。

图1b示出GelRed染色的电泳琼脂糖凝胶的照片，其示出衍生自免疫后第4天的猴子(2202F，2891F)的组织的使用特异于肠病毒71检测的寡核苷酸引物对一步RT-PCR扩增产物。RT-PCR扩增产物的预期大小是427bp。两个凝胶中的泳道如下。凝胶1：泳道1：100bp DNA梯；泳道2：2202F-心脏；泳道3：2202F-脾；泳道4：2202F-淋巴结；泳道5：2202F-肾；泳道6：2202F-肝；泳道7：2891F-心脏；泳道8：2891F-脾；泳道9：2891F-淋巴结；泳道10：2891F-肾；泳道11：2891F-肝；泳道12：2202F-脑干(脑桥)；泳道13：2202F-脑干(延髓)；泳道14：2202F-皮质(脑回)；泳道15：2202F-脊髓(颈椎)；泳道16：2202F-脊髓(腰椎)；泳道17：2202F-脊髓(胸椎)；泳道18：2891F-脑干(延髓)；泳道19：2891F-脑干(脑桥)；泳道20：2891F-皮质(左小脑)。凝胶2：泳道21：100bp DNA梯；泳道22：2891F-皮质(右小脑)；泳道23：2891F-脊髓(颈椎)；泳道24：2891F-脊髓(腰椎)；泳道25：2891F-脊髓(胸椎)；泳道26：无模板对照；泳道27：100bp DNA梯。

发明详述

本发明涉及冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株，特别涉及冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株EV71：TLLβP20和EV71：TLLαP20。本发明还涉及开发冷适应型温度敏感性病毒株特别是RNA病毒株的方法。

因此，在一个方面，本发明提供了冷适应型温度敏感性毒株。在一个实施方案中，所述冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株是本文所述的EV71：TLLβP20。在另一个实施方案中，所述冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株是本文所述的EV71：TLLαP20。EV71：TLLβP20于2012年10月25日根据布达佩斯条约保藏在位于10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110，USA的美国典型培养物保藏中心，保藏号是PTA-13285。EV71：TLLαP20于2012年10月25日根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为PTA-13284。

本发明的肠病毒71毒株是通过用温度敏感性作为表型标记减毒肠病毒71的方法而制备的。所述方法是体外实验室方法，改变病毒的生物学生长特征以适应在低于30℃的保温温度的最佳复制。所述适应方法如下进行，以系统性逐步方式渐进降低培养病毒的保温温度，直至达到选择用于病毒的最佳复制的靶向温度。如本文所述，(i)制备亲本野生型病毒参考原种，(ii)保温用亲本野生型病毒参考原种以较高感染复数(MOI)感染的细胞培养物，保温温度为大约34℃，保温5代或更多代，直至每一代获得完全细胞病变效应(CPE)，其中使用较低MOI接种物和较短保温时间使每一代获得完全CPE，(iii)保温用前一步骤所得病毒以较高MOI感染的细胞培养物，保温温度比前一步骤低大约1℃至大约3℃，保温5代或更多代，直至每一代获得完全细胞病变效应(CPE)，其中使用较低MOI接种物和较短保温时间使每一代获得完全CPE，及(iv)以系统性逐步渐进降低保温温度的方式而重复步骤(iii)，直至达到选择用于病毒的最佳复制的靶向温度。在一个实施方案中，靶向温度是大约26℃至大约29℃，优选大约28℃。

在一个实施方案中，亲本野生型病毒参考原种是通过在大约36℃至大约38℃、优选大约37℃的温度保温用野生型病毒感染的细胞培养物一代或两代，直至获得完全细胞病变效应(CPE)而制备。含有产生的病毒的培养物上清等份置于小瓶中或者其它合适储存装置中。这个培养物上清用作亲本野生型病毒参考原种。参考亲本野生型病毒用于后续减毒过程。在另一个实施方案中，亲本野生型病毒参考原种等份储存在合适温度，如-80℃。

在一个实施方案中，被病毒感染的细胞是任何允许病毒生长的细胞。在一个优选的实施方案中，细胞是Vero细胞(ATCC CCL-81)。在一个实施方案中，细胞通过在适合细胞生长的培养基中定期传代而保持。在其中细胞是Vero细胞的实施方案中，Vero细胞在补加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM)中保持。在一个实施方案中，在补加1％FCS的DMEM中保持的Vero细胞用于生产亲本野生型病毒、病毒培养物、减毒、滴定和评估温度敏感性表型。在另一个实施方案中，DMEM补加1％FCS，用于使病毒株适应在相继降低的保温温度中复制。

在一个实施方案中，通过在病毒获得完全细胞病变效应(CPE)后立即获得含有病毒的澄清培养物上清并且将所述上清传递到每个相继新鲜的细胞例如Vero细胞的新培养瓶中而使病毒在方法的每一步骤中传代。在另一个实施方案中，含有病毒的培养物上清在每次相继变化到较低保温温度开始时以20的较高感染复数(MOI)传代。在观察到其能在接种后3天内在Vero细胞中导致完全CPE之后，含有新鲜铺满的单层Vero细胞的新培养瓶用相同MOI的病毒接种再传代至少3个代次，之后降低至5-10的较低MOI。一旦注意到其能够在用5-10的较低MOI接种后3天内导致完全CPE，则减毒过程在5-10MOI接种再传代至少3次后进入到下一阶段相继较低的保温温度。每次传代所需天数取决于病毒在每阶段渐进降低的保温温度适应的速度。本领域技术人员容易知道何时达到完全CPE。制备本发明的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的方法的进一步细节如下所述。

应理解本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株当用于在对象中引起保护性免疫应答或者防止对象被病毒相关疾病累及或者延迟病毒相关疾病的发作或减缓病毒相关疾病进展速度时，以组合物形式给予对象，所述组合物另外包含一或多种生理学或药物学可接受载体。药物学可接受载体是本领域技术人员熟知的，包括但不限于如下一或多种：0.01M-0.1M、优选0.05M磷酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或0.9％盐水。这种载体还包括水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液、盐水和缓冲介质。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注射有机酯如油酸乙酯。肠胃外运载体包括氯化钠溶液、Ringer右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化Ringer’s和不挥发性油。静脉内运载体包括液体和营养补剂、电解质补剂如基于Ringer右旋糖的那些，等等。固体组合物可以包括非毒性固体载体例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素或纤维素衍生物、碳酸钠和碳酸镁。为在气溶胶中给予，例如用于肺部和/或鼻内输送，药物或组合物优选用非毒性表面活性剂如C6-C22脂肪酸的酯或部分酯或天然甘油酯和推进剂配制。可以包括额外的载体如卵磷脂以促进鼻内输送。药物学可接受载体可以进一步包含少量辅助性物质如湿润剂或乳化剂、防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂和螯合剂，其促进活性成分的贮藏寿命和/或有效性。本发明组合物可以如本领域熟知的配制以在给予对象后提供活性成分的快速、缓慢或延迟释放。

在第三个方面，本发明提供了在对象如人类对象中引起保护性免疫应答的方法，包括给予对象预防或治疗或免疫学有效量的本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株。因此，本发明还提供了冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或者包含冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的组合物用于在对象中引起保护性免疫应答。本发明还提供了冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或者包含冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的组合物在制备用于在对象中引起保护性免疫应答的药物中的应用。在一个实施方案中，所述保护性免疫应答保护对象抗肠病毒71导致的疾病。在一个实施方案中，所述疾病是手足口病。在另一个实施方案中，所述疾病是无菌性脑膜炎。在另一个实施方案中，所述疾病是脑炎。在进一步的实施方案中，所述疾病是脊髓灰质炎样麻痹。在一个实施方案中，本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株作为疫苗给予。在另一个实施方案中，对象已暴露于野生型肠病毒71。“暴露”于肠病毒71是指与肠病毒71接触，由此可能导致感染。在另一个实施方案中，给予本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株预防对象如人类对象免于肠病毒71相关疾病累及。因此，本发明还提供了冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或者包含冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的组合物用于预防对象如人类对象免于肠病毒71相关疾病累及。本发明还提供了冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或者包含冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的组合物在制备用于预防对象如人类对象免于肠病毒71相关疾病累及的药物中的应用。在另一个实施方案中，对象已暴露于野生型肠病毒71。在进一步的实施方案中，给予本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株在病毒感染对象如人类对象中延迟肠病毒71相关疾病的发作或者减缓所述疾病进展速度。因此，本发明还提供了冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或者包含冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的组合物用于在病毒感染对象如人类对象中延迟肠病毒71相关疾病的发作或者减缓所述疾病进展速度。本发明还提供了冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或者包含冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的组合物在制备用于在病毒感染对象如人类对象中延迟肠病毒71相关疾病的发作或者减缓所述疾病进展速度的药物中的应用。

如本文所用，“给予”是指用本领域技术人员已知的各种方法和输送系统进行输送。给予可以例如在腹膜内、脑内、静脉内、口服、经粘膜、皮下、经皮、真皮内、肌肉内、局部、肠胃外、经植入物、鞘内、淋巴内、病灶内、心包、或硬膜进行。药物或组合物也可以在气溶胶中给予，例如用于肺部和/或鼻内输送。给予可以进行例如一次、多次和/或一或多个延长时间。

在对象中引起保护性免疫应答可以通过例如给予对象初始剂量疫苗，随后合适时间后后续给予一或多次疫苗而实现。给予疫苗之间的合适时间间隔可以由本领域技术人员容易地确定，通常是几周至几个月。但是，本发明不限于任何特定的给药方法、途径或频率。

“预防有效剂量”或者“免疫学有效剂量”是任何这样的疫苗量，当给予易于病毒感染或易于受累于病毒相关疾病的对象时，在对象中诱导免疫应答保护对象免于被病毒感染或者免于疾病累及。“保护”对象是指至少2倍、优选至少10倍降低对象被病毒感染的可能性，或者减少对象中疾病发作的可能性。例如，如果对象有1％几率被病毒感染，则对象被病毒感染的可能性2倍降低将导致对象有0.5％几率被病毒感染。更优选地，“预防有效剂量”在对象中诱导完全防止对象被病毒感染或者完全防止对象中疾病发作的免疫应答。

任何本发明的免疫和治疗方法的一些实施方案可以进一步包括给予对象至少一种佐剂。“佐剂”是指适合增强抗原免疫原性和加强对象中的免疫应答的任何物质。本领域技术人员熟知许多适用于基于蛋白质和核酸的疫苗的佐剂，包括颗粒佐剂，及组合佐剂与抗原的方法。适用于蛋白质免疫的佐剂包括但不限于铝、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、铝佐剂、基于皂苷的佐剂，如QuilA和QS-21等。

本发明还涉及用温度敏感性作为表型标记减毒病毒的方法。根据这个方面，所述方法开发了冷适应型温度敏感性病毒株。本发明方法是体外实验室方法，改变病毒生物学生长特征以适应在30℃以下的保温温度的最佳复制。适应方法如下进行，以系统性逐步方式渐进降低培养病毒的保温温度，直至达到选择用于病毒的最佳复制的靶向温度。

因此，根据本发明，所述方法包括下述步骤：(i)制备亲本野生型病毒参考原种，(ii)保温用亲本野生型病毒参考原种以较高感染复数(MOI)感染的细胞培养物，保温温度为大约34℃至大约36℃，优选大约34℃，保温5代或更多代，直至每一代获得完全细胞病变效应(CPE)，其中使用较低MOI接种物和较短保温时间使每一代获得完全CPE，(iii)保温用前一步骤所得的病毒以较高MOI感染的细胞培养物，保温温度比前一步骤低大约1℃至大约3℃，保温5代或更多代，直至每一代获得完全细胞病变效应(CPE)，其中使用较低MOI接种物和较短保温时间使每一代获得完全CPE，及(iv)以系统性逐步渐进降低保温温度的方式重复步骤(iii)，直至达到选择用于病毒的最佳复制的靶向温度。在一个实施方案中，靶向温度是大约26℃至大约29℃，优选大约28℃。在一个实施方案中，渐进降低保温温度是降低大约1℃至大约2℃的温度。

在一个实施方案中，亲代野生型病毒参考原种通过在大约36℃至大约38℃、优选大约37℃的温度保温用野生型病毒感染的细胞培养物一或两代直至获得完全细胞病变效应(CPE)而制备。含有产生的病毒的培养物上清等份置于小瓶或其它合适储存装置中。这个培养物上清用作亲代野生型病毒参考原种。参考亲代野生型病毒用于后续减毒过程。在另一个实施方案中，亲代野生型病毒参考原种在合适温度如-80℃储存。

在一个实施方案中，通过在病毒获得完全细胞病变效应(CPE)后立即获得含有病毒的澄清培养物上清并且将所述上清传递到每个相继新鲜的细胞例如Vero细胞的新培养瓶中而使病毒在方法的每一步骤中传代。在另一个实施方案中，含有病毒的培养物上清在每次相继变化到较低保温温度开始时以20的较高感染复数(MOI)传代。在观察到其能在接种后3天内在Vero细胞中导致完全CPE之后，含有新鲜铺满的单层Vero细胞的新培养瓶用相同MOI的病毒接种再传代至少3个代次，之后降低至5-10的较低MOI。一旦注意到其能够在用5-10的较低MOI接种后3天内导致完全CPE，则减毒过程在5-10MOI接种再传代至少3次后进行到下一阶段相继较低的保温温度。每次传代所需天数取决于病毒在每阶段渐进降低的保温温度适应的速度。本领域技术人员容易知道何时达到完全CPE。

在一个实施方案中，病毒是任何病毒。在另一个实施方案中，病毒是RNA病毒。在另一个实施方案中，RNA病毒是正链RNA病毒。在进一步的实施方案中，病毒是小RNA病毒科成员。在另一个实施方案中，病毒是肠病毒属成员。在一个实施方案中，病毒是肠病毒71(EV71)。在另一个实施方案中，病毒是柯萨奇病毒A16(CA16)。本发明方法可用于产生任何这些病毒的冷适应型温度敏感性病毒株，包括但不限于EV71和CA16的冷适应型温度敏感性毒株。

在一个实施方案中，被病毒感染的细胞是允许病毒生长的任何细胞。在一个优选的实施方案中，细胞是Vero细胞(ATCC CCL-81)。在一个实施方案中，细胞通过在适合细胞生长的培养基中定期传代而保持。在其中细胞是Vero细胞的实施方案中，Vero细胞在补加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM)中培养。在一个实施方案中，保持在补加1％FCS的DMEM中的Vero细胞用于产生亲代野生型病毒、病毒培养物、减毒、滴定和评估温度敏感性表型。在另一个实施方案中，DMEM补加1％FCS，用于适应病毒株在相继降低的保温温度中复制。

本发明方法适用于产生小RNA病毒科和肠病毒属的冷适应型温度敏感性病毒。实用性已通过产生EV71(TLLα)和EV71(TLLβ)的冷适应型温度敏感性毒株而在本文证实，所述毒株是通过在渐进降低的保温温度下在细胞培养物中系列传代而衍生。EV71(TLLβ)毒株保留在特异性体外细胞培养条件中的表型和遗传稳定性，并且在静脉内接种后在猴中不显示神经毒性。实用性也通过产生冷适应型温度敏感性CA16而在本文证实，其是通过在渐进降低的保温温度下在细胞培养物中系列传代而衍生。

本发明还提供了用于用本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株免疫对象的试剂盒。所述试剂盒包含本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株、药物学可接受载体、施用器和使用说明材料。本发明包括本领域技术人员已知的其它试剂盒实施方案。说明可以提供用于指导本文描述的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的给药的任何信息。

除非另有说明，本发明的实践采用常规化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学技术，其属于本领域范畴。参见例如，Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning(ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)；Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，3rdEd.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Greenand Sambrook，2012，Molecular Cloning，4th Ed.(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)；Ausubel et al.，1992，Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley&Sons，including periodic updates)；Glover，1985，DNA Cloning(IRL Press，Oxford)；Russell，1984，Molecular biology of plants：alaboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.)；Anand，Techniques for the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Guthrie and Fink，Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology(Academic Press，New York，1991)；Harlow and Lane，1988，Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；CultureOfAnimal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，Essential Immunology，6th Edition，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988；Fire et al.，RNA InterferenceTechnology：From Basic Science to Drug Development，Cambridge UniversityPress，Cambridge，2005；Schepers，RNA Interference in Practice，Wiley-VCH，2005；Engelke，RNA Interference(RNAi)：The Nuts&Bolts of siRNA Technology，DNA Press，2003；Gott，RNA Interference，Editing，and Modification：Methodsand Protocols(Methods in Molecular Biology)，Human Press，Totowa，NJ，2004；Sohail，Gene Silencing by RNA Interference：Technology and Application，CRC，2004.

实施例

本发明参考如下实施例进行描述，所述实施例是为举例目的提供而非以任何方式限制本发明。使用了本领域熟知的标准技术或以下特别描述的技术。

实施例1

开发人类肠病毒71(EV71)的冷适应型温度敏感株的材料和方法

细胞、病毒及冷适应方法：通过在补加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM)中定期传代而维持的Vero细胞(ATCC CCL-81)用于病毒培养、减毒、滴定和评估温度敏感性表型。3个EV71分离株属于基因型C1、B3和B4，在Vero细胞中分离自呈现手足口病(HFMD)的患者的口腔分泌物、粪便和脑干样本，根据先前描述的技术(Dougherty，1964)进行一次噬斑纯化。噬斑纯化之后，在Vero细胞中在37℃传代两次后制备命名为相应亲本野生型毒株的病毒原种。所有病毒原种和相应传代毒株均保存在-80℃冰箱中。

使用在含有1％FCS的DMEM中的幼龄新鲜铺满的单层Vero细胞使病毒株适应在相继更低的保温温度中复制，从最初的低保温温度34℃开始。在获得完全细胞病变效应(CPE)后立即将含有病毒的澄清培养物上清传递到每个相继的新鲜Vero细胞的新培养瓶中。含有病毒的培养物上清在每个相继变化为更低保温温度开始时以20的较高感染复数(MOI)而传代。在注意到其能够在接种后3天内在Vero细胞中导致完全CPE后，含有新鲜铺满的单层Vero细胞的新培养瓶用相同MOI病毒接种再传代3个代次，随后降低到5-10的较低MOI。一旦注意到其能够在5-10的较低MOI接种后3天内导致完全CPE，在再传代至少3次后，减毒过程然后继续进行到下一个较低保温温度。在本实施例中，用于开发肠病毒71的冷适应型温度敏感株的相继渐进降低的保温温度是34℃、32℃、30℃、29℃和28℃。

病毒滴定：根据世界卫生组织的Polio Laboratory Manual 2004所述方法稍作修改通过在Vero细胞中的微滴定测定确定病毒效价，根据Reed andMuench(1938)的方法，病毒效价计算为每毫升50％细胞培养物感染剂量(CCID₅₀)。简言之，在用等体积氯仿处理分散病毒聚集物之后，在含有1％FCS的DMEM中制备澄清病毒上清的10倍系列稀释液。在96孔平底组织培养平板中的Vero细胞单层(10⁴个细胞/孔)用100μl系列稀释的每种病毒原种接种并且在5％CO₂环境中在每种相应的保温温度保温5天，之后观察CPE的存在。

温度敏感性测定：使用两种方法评估病毒株在Vero细胞中在28℃、37℃和39.5℃的保温温度的生长特性。第一种方法评估病毒株在感染细胞中导致完全CPE所需的天数(复制动力学)，第二种方法评估病毒株在每种具体测试的温度下保温的细胞中的效价。简言之，在第一种方法中，3个含有类似年龄的铺满的单层Vero细胞的T-25组织培养瓶的生长培养基用维持培养基(具有1％FCS的DMEM)置换。在每个瓶中的培养基然后通过置于各自温箱1小时而平衡至待测的具体温度，随后以感染复数(MOI)为10的剂量接种病毒株。如果在10天培养结束时未观测到CPE，则上清传递到新的单层Vero细胞培养瓶中，再类似保温10天。如果在第2次传代后未观测到CPE，则其记为无病毒复制。在第二种方法中，密度为10⁴个细胞/100μl的Vero细胞悬液接种到3个96孔细胞培养平板的每个孔中，在37℃于5％CO_2.环境中保温。保温10个小时后，每个细胞培养平板然后通过置于各自温箱1小时而平衡至待测的具体温度。每个孔中的细胞随后用100μl的10倍系列稀释的病毒株接种，然后转移到各自温度的温箱中保温5天，之后观察CPE的存在。

遗传稳定性及温度敏感性测定：为评估在特定培养环境和细胞类型中培养的病毒株的遗传稳定性，所述病毒株在以5MOI病毒接种物接种和28℃保温温度保温的细胞培养物中进一步传代20次。在20次传代结束时，通过如上所述在28℃、37℃和39.5℃的保温温度培养而评估病毒株的温度敏感性表型特征。随后测序它们各自基因组的完整核苷酸序列，并针对它们各自的亲代野生型病毒的完整基因组进行分析。

温度敏感性逆转测定在稳定的冷适应型温度敏感性病毒株上进行。选择的毒株在5％CO₂环境中于37℃温度保温的单层Vero细胞中传代5次。在每个代次，使用10MOI的病毒接种物。通过如上所述温度敏感性测定的类似方法，在28℃、37℃和39.5℃的保温温度在Vero细胞中评估在每个代次衍生的病毒株的生长特征。在37℃培养温度的每个相继代次的病毒株的完整基因组被测序和分析。

RNA提取、RT-PCR及测序：用市售病毒RNA提取试剂盒(Qiagen，Germany)从完全CPE的感染细胞的培养液体中提取病毒基因组RNA。用Superscript II RNA聚合酶(Invitrogen，USA)使用EV71特异性引物进行第一链合成，用GoTaq Green PCR mix(Promega，USA)用18个简并引物对进行后续PCR。用BigDye Terminator测序试剂盒(Applied Biosystems，USA)测序产生的片段。通过将5’-虫草菌素阻断的接头DT88(5′-GAA GAG AAG GTG GAA ATGGCG TTT TTG G-虫草菌素-3′；SEQ ID NO：1)与EV71 cDNA的5’末端用标准T4 DNA连接酶(Fermentas，USA)连接而进行5’RACE以确定5’-UTR病毒序列，之后用DT88-互补引物(5′-CCA AAA CGC CAT TTC CAC CTT CTC TTC 3′；SEQ ID NO：2)和EV71特异性引物(5’-ATT CAG GGG CCG GAG GAC TAC-3’；SEQ ID NO：3)进行标准PCR。还用寡dT引物(Li et al.，2005)进行了3’-RACE以确定3’-UTR病毒序列。

分子克隆及质粒纯化：将具有不明确序列的片段克隆进pZero-2质粒(Invitrogen，USA)中并转化进TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen，USA)。用市售Plasmid Miniprep Kit(Qiagen，Germany)从来自每个转化体的至少10个菌落中提取含有克隆的EV71片段的质粒，随后确定克隆片段的序列。

用European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS；http：//mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py？#forms：：merger)(Rice et al.2000)合并所获得的片段序列。用程序BioEdit Sequence Alignment Editor v.7.0.9.0(Hall，1997)将合并的序列与EV71毒株3799-SIN-98(GenBank登录号DQ341354.1)的参考序列进行比对。

猴研究：选择的EV71冷适应型温度敏感性毒株(EV71：TLLβP20)的安全性和免疫原性的猴研究外包给基于新加坡Animal Facility of DUKE-NUS的研究人员。使用7只无结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和猴免疫缺陷病毒的食蟹猴(Macaca fascicularis)研究稳定的冷适应型温度敏感性EV71：TLLβP20的安全性和免疫原性，其中有3只雌性(2202F，2207F，2891F)和4只雄性(0791M，2247M，2889M，2890M)，平均体重为3.23Kg(范围为2.44至4.11，SD＝0.7)。所有7只猴预先筛选不存在抗EV71的结合(间接免疫荧光)和中和抗体。所述研究和所有动物程序均经新加坡DUKE-NUS的生物安全性委员会和动物操作和伦理委员会批准。病毒接种和观测、动物照顾和验尸均根据委员会指南进行。

在用氯胺酮轻度麻醉下，将1ml病毒接种物静脉内接种进右隐静脉。3只猴(2889M，0791M和2891F)给予每只猴10⁷CCID₅₀的EV71：TLLβP20的静脉剂量，另外3只猴(2890M，2202F和2247M)各给予10⁸CCID₅₀，第7只猴用作阴性对照。每日观察猴子两次的临床疾病特别是神经学表现，通过内置温度传感器记录它们的体温。每日收集每只猴的粪便，储存在-80℃冰箱用于稍后分离病毒。在接种后(PI)第4天，在深度麻醉下处死2只猴，各来自不同病毒接种剂量。在尸体解剖时，收集中枢神经系统(CNS)的各个部分、非神经组织和血液用于组织病理学和病毒学分析。在PI第8天，处死另一组类似2只猴，在尸体解剖时收集相同类型的组织和血液用于组织病理学和病毒学研究。在收集血样进行抗EV71抗体评估后在PI第14天给予剩余2只猴各自等价的加强剂量的EV71：TLLβP20。在接受加强剂量后使它们睡眠16天，在尸体解剖时收集CNS组织用于组织病理学研究。

组织学和免疫组织化学：CNS组织样本(大脑、小脑、基底神经节、脑干和脊髓)和非神经组织(淋巴结、脾、肝、肾、肺和心脏)在10％福尔马林于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中固定，在固定后包埋在石蜡中。脊髓分别在颈部水平切片10次，在胸部8次及在腰部水平10次。在除去石蜡及再水合过程后，6μm厚度的石蜡切片用苏木精和曙红(H&E)染色及用勒克司坚牢蓝/甲酚紫染色(Kluver-Barrera法)。

抗原检测及从猴分离病毒：血样收集在普通试管和肝素化试管中。用Ficoll-Paque^TM PLUS(GE Healthcare，Sweden)从肝素化血液中收集外周血单个核细胞(PBMC)。在用无菌PBS洗涤2次后，PBMC悬液等份接种到Teflon包被的玻片的孔上，用于使用商业检测单克隆抗体(Cat.No.3360，LightDiagnostics，USA)经间接免疫荧光测定检测EV71抗原。通过将PBMC悬液接种进含有单层Vero细胞的24孔细胞培养平板的孔中进行病毒分离。在每个血清样本上的病毒分离是通过将50μl和100μl血清接种到含有单层Vero细胞的24孔培养平板的相应孔中而进行。猴组织用两次交换无菌PBS轻轻洗涤，在II类生物安全柜中用研钵和研杵研磨而匀浆。在DMEM中制备的组织匀浆(10％，w/v)在1000g离心10分钟而澄清。澄清的上清通过0.22微米注射器滤器过滤，通过接种100μl和200μl滤液而进行病毒分离。在PBS中制备10％粪便悬液并在1000g离心10分钟而澄清。在通过0.22微米注射器滤器过滤后，通过接种100μl和200μl粪便滤液而进行病毒分离。在猴样品上的所有病毒分离工作均一式二份进行，一组是在28℃保温的接种细胞培养物，另一组是在37℃保温。

分子检测及完整基因组测序：使用商业病毒RNA提取和纯化试剂盒(Qiagen，Germany)从血清、PBMC和澄清的组织匀浆中提取病毒基因组RNA。在从组织提取后，使用商业一步RT-PCR试剂盒(Qiagen，Germany)和扩增所有EV71基因型的VP1基因的近端三分之一的共有寡核苷酸引物对(有义：5’-CACCCTTGTGATACCATGGATCAG-3’(SEQ ID NO：4)；反义：5’-GTGAATTAAGAACRCAYCGTGTYT-3’(SEQ ID NO：5))进行EV71特异性病毒RNA的分子扩增和检测。使用基于EV71：TLLβ的完整基因组序列的18对序列特异性引物对扩增和测序在PI第4天和第8天获得的2只猴的血清中存在的EV71的完整基因组。将通过直接测序不产生良好序列读取的任何PCR扩增片段克隆进pZero-2(Invitrogen，USA)并转化进TOP10大肠杆菌中。从每个转化体选择至少10个菌落，在携带插入序列的纯化质粒上进行测序。

血清结合及中和抗体测定：在接近完全CPE时收获用基因型B3的EV71感染的Vero细胞，并用无菌PBS洗5次。最后一次洗涤后，将感染细胞的悬液与洗涤的未感染的Vero细胞悬液以大约4个感染细胞比1个未感染细胞的比率混合。将10微升的含有250个细胞的混合细胞悬液小心放置在12孔Teflon包被玻片的每个孔上，并在热平板上干燥。干燥的玻片在冷丙酮中固定10分钟，用作内部抗原以通过间接免疫荧光测定从1∶10IgM和1∶20IgG的最初稀释度开始测定EV71结合抗体。在抗EV71 IgM效价测定中，在用无菌PBS进行系列2倍稀释之前，猴血清用合适浓度的蛋白A(Invitrogen，USA)处理以去除IgG。

根据世界卫生组织的Polio Laboratory Manual 2004所述方法稍作修改通过用Vero细胞的微中和测定确定猴的中和抗体效价。用于中和的每种EV71基因型的浓度是100CCID₅₀/100μl。用96孔平底培养平板进行病毒中和测定。从1：10稀释度开始以100μl DMEM(1％FCS)体积一式二份制备每种血清样品的系列2倍稀释液。向每孔稀释血清中加入等体积(100μl)的含有100CCID₅₀EV71的在DMEM(1％FCS)中的病毒工作原种并在37℃保温2小时。保温后，向每孔中加入100μl含有250个细胞的在DMEM(10％FCS)中的Vero细胞悬液。小心密封96孔培养平板并在5％CO₂环境中于37℃保温。每日读取平板共8天，以检测每孔中影响Vero细胞的CPE的存在。每个血清样品的中和抗体的效价通过具有不显示CPE的最高稀释度的孔而确定。

实施例2

肠病毒71的冷适应型温度敏感性毒株(EV71：TLLα，EV71：TLLαP20，EV71：TLLβ，EV71：TLLβP20和EV71：TLLβP40)的表型和基因型特征结果

用于衍生冷适应型毒株的3个原始亲代EV71病毒在以10MOI病毒接种物接种及在37.5℃保温后3天之内导致Vero细胞的完全CPE。以相同病毒接种物，原始亲代EV71病毒在39.5℃保温温度5天之内导致Vero细胞中的完全CPE。但是，衍生自在37.5℃培养的Vero细胞中前两个代次的所有3个原始亲代EV71病毒在10MOI病毒接种物和28℃保温温度不导致Vero细胞中的CPE。在28℃10天培养结束时的盲传代后也未观察到CPE。在接种的Vero细胞中病毒复制的不存在进一步通过用抗EV71的商业检测单克隆抗体经间接免疫荧光测定在10天结束时在培养物上清液中悬浮细胞存在的染色阴性而支持。

在相继更低保温温度中超过90代之后，所有三个传代的EV71毒株在≤5MOI的病毒接种物接种及28℃保温温度3天内能导致Vero细胞中的完全CPE。病毒株进一步在28℃保温温度传代直至第100代。在第100代，衍生自从患者的口腔液体、脑干组织和粪便样本分离的原始EV71的病毒株分别命名为EV71：TLL、EV71：TLLα和EV71：TLLβ。在温度敏感性测定中，所有3个冷适应型毒株在28℃保温温度用10MOI病毒接种物在2天内导致Vero细胞中完全CPE，但是在37℃保温温度需要4天达到完全CPE。在39.5℃保温温度，在10天培养后所有3个毒株均未观察到CPE。但是，在盲传代(blindpassage)进在39.5℃保温的Vero细胞新鲜瓶中之后，EV71：TLL在培养的第10天给出2+CPE。EV71：TLLα和EV71：TLLβ甚至在两次进一步盲传代进在39.5℃保温的新鲜Vero细胞瓶中之后也未观察到CPE。在各自10天培养结束时，从用EV71：TLLα或EV71：TLLβ接种的培养上清包括那些衍生自盲传代的培养上清收获的悬浮细胞均未给出用EV71检测单克隆抗体的阳性免疫荧光染色。大约1％的收获自用EV71：TLL接种的培养上清的悬浮细胞给出阳性染色，尽管在10天培养后未观察到CPE。

使用28℃和37℃的保温温度测定3个冷适应型毒株的病毒复制效价，测定重复至少4次。当滴定的培养物分别在28℃和37℃保温时，EV71：TLL的效价分别是1X10⁸CCID₅₀/ml和2-3X10⁷CCID₅₀/ml。在28℃保温温度，EV71：TLLα给出病毒效价是1X10⁸CCID₅₀/ml，在37℃效价是1-2X10^5.5-6CCID₅₀/ml。在28℃保温温度EV71：TLLβ效价是2-5X10⁸CCID₅₀/ml，在37℃效价是1X10⁷CCID₅₀/ml。

EV71：TLLα和EV71：TLLβ的冷适应型的稳定性通过将两个病毒株在28℃保温温度和10MOI病毒接种物在Vero细胞中20次额外传代而评估。在额外20次传代后，EV71：TLLα在PI 2天内导致在28℃保温的细胞中的完全CPE，但是甚至在2次盲传代后在37℃保温的细胞中不导致CPE。其保持在28℃保温温度达到病毒效价为1X10⁸CCID₅₀/ml的能力。EV71：TLLβ在额外20次传代后在28℃和37℃保温温度的生长动力学和病毒效价方面保持相同冷适应型表型。EV71：TLLβ的冷适应型的稳定性通过进一步在相同培养条件下再传代20次(从第100代起40次额外传代)而评估，发现其保持类似的冷适应型温度敏感性表型。

从冷适应型温度敏感性表型的逆转评估通过在各个完全CPE的在37℃保温的Vero细胞中6次依次传代病毒而在EV71：TLLβP20上进行。表1示出衍生自在37℃保温的每个相应培养物的病毒在28℃、37℃和39.5℃保温温度的生长动力学和病毒效价方面的生长特征。在37℃保温的细胞中3次相继传代后，病毒保持在39.5℃保温温度在Vero细胞中不能产生活感染性颗粒(缺乏阳性免疫荧光染色细胞)及在第6次重复传代在39.5℃保温温度不能导致细胞培养物中的完全CPE。

表1

6次相继传代在37℃保温的Vero细胞后EV71：TLLβP20的冷适应型温度敏感性表型逆转的评估

每一传代病毒的生长特征和效价在28℃、37℃和39.5℃保温温度在Vero细胞中培养或滴定。

P1：传代1

IFA：间接免疫荧光测定

EV71：TLLα和EV71：TLLβ、它们各自的额外20代之后的毒株(EV71：TLLαP20和EV71：TLLβP20)及原始亲代野生型的完整基因组被测序和分析。EV71：TLLαP20的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。EV71：TLLβP20的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。表2示出EV71：TLLα、EV71：TLLαP20和原始亲代野生型之间其基因每个区段的核苷酸变化数目。表3示出原始亲代野生型、EV71：TLLβ、EV71：TLLβP20和EV71：TLLβP40(额外40次传代)之间核苷酸变化数目。衍生自通过在37℃保温温度6次相继传代而温度敏感性逆转研究的病毒株的完整基因组也被测序，相对于EV71：TLLβP20的核苷酸变化数目示于表4。

表2

与其原始亲代野生型病毒的完整基因组相比在EV71：TLLα和EV71：TLLαP20的每个基因组区段中发生的核苷酸(NT)和相应氨基酸(AA)突变的数目

表3

与其原始亲代野生型病毒的基因组相比在EV71：TLLβ、EV71：TLLβP20和EV71：TLLβP40的每个基因组区段中发生的核苷酸(NT)和相应氨基酸(AA)突变的数目

实施例3

人类肠病毒71的冷适应型温度敏感株(EV71：TLLβP20)的猴研究结果

临床发现：每天早晚两次进行研究的猴子的临床状态的一般观察和体温测量。所有猴子被记录为活动的并且正常喂食。没有猴子产生任何敏感的局灶性神经学缺陷如肢体无力、震颤或运动异常。只有被给予1X10⁸CCID₅₀/ml静脉内剂量的一只猴子(2247M)在接种后第3天产生低烧(39.3℃)。在深度麻醉下处死猴子时重新称重无一猴子体重减轻。

尸体解剖及组织学发现：尸体解剖时所有猴子均未观察到大体死后损害。在收集用于组织病理学检查的所有猴组织中未发现异常组织学发现。

病毒学研究：使用在28℃和37℃保温温度的Vero细胞在猴子血清、PBMC、粪便样品和所有尸体解剖组织上进行病毒分离。尽管在培养10天后盲传代，从任何猴子样品均未分离出病毒。对于血清、PBMC样品和经RT-PCR测试EV71阳性的那些组织匀浆在Vero细胞中进行一次额外盲传代。尽管未分离到病毒，经间接免疫荧光测定(图1a)用商业单克隆抗体在衍生自PI第4天收集的两只猴子2891F(接受1X10⁷CCID₅₀EV71：TLLβP20)和2890M(接受1X10⁸CCID₅₀EV71：TLLβP20)的肝素化血液的几个PBMC中检测到EV71抗原。在收获自PI第8天采集的猴子的肝素化血液的PBMC中未检测到病毒抗原。

通过RT-PCR在PI第4天和第8天收集的所有猴子的血清样品中检测到EV71特异性基因组序列。在非神经元组织中，EV71基因组序列仅在2只猴子(2202F和2891F)的脾匀浆中检测到(图1b)。在任何神经元组织匀浆中均未检测到EV71基因组序列。提取和完整测序存在于在PI第4天和第8天收集的两只猴子(2889M和2890M)的血清样品中的EV71：TLLβP20基因组。表5示出与EV71：TLLβP20的基因组相比在血清中存在的病毒株的每个基因组区段中发生的核苷酸(NT)和相应氨基酸(AA)突变或逆转数目。

表5：与EV71：TLLβP20的完整基因组相比在PI第4天和第8天收集的两只猴(2889M和2890M)的血清样品中存在的EV71的每个基因组区段中发生的核苷酸(NT)和相应氨基酸(AA)突变的数目

猴体液免疫应答：使用内部制备的感染的Vero细胞作为抗原经间接免疫荧光测定进行被给予静脉内EV71：TLLβP20的猴血清中的结合抗体(IgM和IgG)存在的测定。表6示出在给予等价静脉内加强剂量之前在PI第14天及在PI第30天(加强后16天)收集的两只剩余猴子(2889M和2890M)的血液中存在的抗EV71IgM和IgG的效价。

表6：用内部制备的感染的Vero细胞作为抗原通过间接免疫荧光测定确定的给予静脉内EV71：TLLβP20之后的猴的结合抗体(IgM和IgG)效价

用微中和测定确定在PI第14天和第30天收集的两只猴子(2889M和2890M)的血清样品中抗EV71基因型A(BrCr)、B3、B4、B5、C1和C5的中和抗体效价。表7示出抗每种EV71基因型的猴血清的中和抗体的各自效价。

表7：通过微中和测定确定的在给予静脉内EV71：TLLβP20之后在两只猴血清中存在的抗一些EV71基因型(A，B3，B4，B5，C1和C5)的中和抗体的效价

实施例4

用于开发人类柯萨奇病毒A16的冷适应型温度敏感株的材料和方法

材料和方法：通过在补加10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM)中定期传代而维持的Vero细胞(ATCC CCL-81)用于柯萨奇病毒A16的病毒培养、减毒、滴定和评估温度敏感性表型。用于减毒过程的亲本野生型柯萨奇病毒A16(CA16)衍生自具有手足口病(HFMD)的患者的口腔分泌物。根据先前描述的技术进行一次病毒噬斑纯化。噬斑纯化之后，在Vero细胞中在37℃传代两次后制备命名为相应亲本野生型毒株的病毒原种。所有病毒原种和相应传代毒株均保存在-80℃冰箱中。

使用在含有1％FCS的DMEM中的幼龄新鲜铺满的单层Vero细胞使原始野生型CA16适应在相继更低的保温温度中复制，从最初的低保温温度34℃开始。在完全细胞病变效应(CPE)后将病毒传代到每个相继的新Vero细胞培养瓶中。病毒在变化为相继更低保温温度时以20的较高感染复数(MOI)传代，在注意到其能够在接种后3天内导致完全CPE后，再传代至少3个代次后，降低到5-10的较低MOI。在注意到其能够在5-10MOI接种后3天内导致完全CPE，在再传代至少3次后，进行到下一个相继较低保温温度。每一相继传代的培养物上清储存在-80℃冰箱中用于稍后分析。

病毒滴定：根据世界卫生组织的Polio Laboratory Manual 2004所述方法稍作修改通过在Vero细胞中的微滴定测定确定病毒效价，根据Reed&Munch(1938)的方法，病毒效价计算为每毫升50％细胞培养物感染剂量(CCID₅₀)。简言之，在用等体积氯仿处理分散病毒聚集物之后，在含有1％FCS的DMEM中制备澄清病毒上清的10倍系列稀释液。在96孔平底组织培养平板中的Vero细胞单层(10⁴个细胞/孔)用100μl系列稀释的每种病毒原种接种，并且在5％CO₂环境中在每种相应的保温温度保温5天，之后观察CPE的存在。

温度敏感性测定：使用两种方法评估冷适应型病毒株在Vero细胞中在28℃、37℃和39.5℃的保温温度的生长特性。第一种方法评估病毒株在感染细胞中导致完全CPE所需的天数(复制动力学)，第二种方法评估病毒株在每种具体测试的温度下保温的细胞中的效价。简言之，在第一种方法中，3个含有类似年龄的铺满的单层Vero细胞的T-25组织培养瓶的生长培养基用维持培养基(具有1％FCS的DMEM)置换。在每个瓶中的培养基然后通过置于各自温箱1小时而平衡至待测的具体温度，随后以感染复数(MOI)为10的剂量接种病毒株。如果在10天培养结束时未观测到CPE，则上清传递到新的单层Vero细胞培养瓶中，再类似保温10天。如果在第2次传代后未观测到CPE，则其记为无病毒复制。在第二种方法中，密度为10⁴个细胞/100μl的Vero细胞悬液接种到3个96孔细胞培养平板的每个孔中，在37℃于5％CO_2.环境中保温。保温10个小时后，每个细胞培养平板然后通过置于各自温箱1小时而平衡至待测的具体温度。每个孔中的细胞随后用100μl的10倍系列稀释的病毒株接种，然后转移到各自温度的温箱中保温5天，之后观察CPE的存在。

实施例5

人类柯萨奇病毒A16的冷适应型温度敏感性毒株在细胞中的病毒特征结果

在通过相继更低保温温度的100次传代，冷适应型CA16毒株在以≤5MOI病毒接种物接种和28℃保温温度的3天内能在Vero细胞中导致完全CPE，但是在37℃保温温度需要4天达到完全CPE。在39.5℃保温温度，未观察到CPE。

使用28℃和37℃保温温度测定CA16的冷适应型温度敏感性毒株的病毒复制效价。当滴定培养平板分别在28℃和37℃保温时，CA16的冷适应型温度敏感性毒株的效价是1X10⁸CCID₅₀/ml和1X10⁷CCID₅₀/ml。

在描述本发明上下文(特别是权利要求上下文)中使用的术语“一个”和“所述”和类似用语包括单数和复数形式，除非另有说明或者上下文明确相反。除非另有说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”是开放术语(即指“包括但不限于”)。除非另外指出，本文中引用数值范围仅是作为各自引用落入该范围内的每个独立数值的简约方法，每个独立数值就如被各自在本文引用一样而并入本说明书中。例如，如果公开了范围10-15，则11、12、13和14也公开了。本文所述所有方法均可以任何合适顺序进行，除非本文另有说明或者上下文明显相反。本文提供的任何和所有实施例或举例语言(例如“如”)仅为更好说明本发明，不是对本发明范围的限制，除非另有说明。说明书中的语言不应被理解为表明任何未声明元素是本发明实践必须的。

应理解本发明方法和组合物可以以各种实施方案掺入，本文仅公开了一些。本发明实施方案在本文描述，包括发明人已知进行本发明的最佳方式。那些实施方案的变化在本领域技术人员阅读上述说明书后可以明了。发明人预期本领域技术人员在合适时采用这种变化，发明人意在本发明可以不以本文具体描述的方案进行实践。因此，本发明包括相应法律允许的权利要求书中引用的主题的所有修改和等价物。另外，在所有可能变化中上述元素的任何组合均涵盖在本发明中，除非本文另有说明或者上下文指示相反。

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权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株。

2.权利要求1的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株，其中所述毒株是EV71:TLLβP20。

3.权利要求1的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株，其中所述毒株是EV71:TLLαP20。

4.包含权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的组合物。

5.权利要求4的组合物，其进一步包含药物学可接受载体。

6.权利要求4或5的组合物，其进一步包含佐剂。

7.权利要求4-7任一项的组合物，其是疫苗。

8.权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或权利要求4-8任一项的组合物，用于引起对象中的保护性免疫应答。

9.权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或权利要求4-8任一项的组合物，用于防止对象受肠病毒71相关疾病累及。

10.权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或权利要求4-8任一项的组合物，用于延迟肠病毒71感染对象中肠病毒71相关疾病的发作或减缓所述疾病的进展速度。

11.权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或权利要求4-8任一项的组合物在制备引起对象中的保护性免疫应答的药物中的应用。

12.权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或权利要求4-8任一项的组合物在制备用于防止对象受肠病毒71相关疾病累及的药物中的应用。

13.权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或权利要求4-8任一项的组合物在制备用于延迟肠病毒71感染对象中肠病毒71相关疾病的发作或减缓所述疾病进展速度的药物中的应用。

14.在对象中引起保护性免疫应答的方法，包括给予所述对象预防、治疗或免疫学有效量的权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或权利要求4-8任一项的组合物。

15.权利要求14的方法，其中所述对象已暴露于野生型肠病毒71。

16.用于防止对象受肠病毒71相关疾病累及的方法，包括给予所述对象预防、治疗或免疫学有效量的权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或权利要求4-8任一项的组合物。

17.权利要求16的方法，其中所述对象已暴露于野生型肠病毒71。

18.用于延迟肠病毒71感染对象中肠病毒71相关疾病的发作或减缓所述疾病进展速度的方法，包括给予所述对象预防、治疗或免疫学有效量的权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或权利要求4-8任一项的组合物。

19.权利要求14-18任一项的方法，其中所述对象是人类对象。

20.用于用冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株免疫接种对象的试剂盒，包含权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株或权利要求4-8任一项的组合物、药物学可接受载体及使用说明材料。

21.权利要求20的试剂盒，其进一步包括施用器。

22.产生冷适应型温度敏感性病毒的方法，包括下述步骤：

(i)制备亲本野生型病毒参考原种；

(ii)保温用亲本野生型病毒参考原种以较高感染复数(MOI)感染的细胞培养物，保温温度为大约34℃至大约36℃，优选大约34℃，保温5代或更多代，直至每一代获得完全细胞病变效应(CPE)，其中使用较低MOI接种物和较短保温时间使每一代获得完全CPE；及(iv)

(iii)保温用前一步骤所得的病毒以较高MOI感染的细胞培养物，保温温度比前一步骤低大约1℃至大约3℃，保温5代或更多代，直至每一代获得完全细胞病变效应(CPE)，其中使用较低MOI接种物和较短保温时间使每一代获得完全CPE；及

(iv)以系统性逐步渐进降低保温温度的方式重复步骤(iii)，直至达到选择用于病毒的最佳复制的靶向温度。

23.权利要求22的方法，其中亲本野生型病毒参考原种是通过在大约36℃至大约38℃、优选大约37℃的温度保温用野生型病毒感染的细胞培养物一代或两代直至获得完全细胞病变效应(CPE)而制备的。

24.权利要求22或23的方法，其中所述病毒是小RNA病毒科、优选肠病毒属的成员。

25.权利要求24的方法，其中所述病毒是肠病毒71或柯萨奇病毒A16。

26.权利要求22-25任一项的方法，其中所述靶向温度是大约26℃至大约29℃，优选大约28℃。

27.权利要求22-26任一项的方法，其中所述病毒在所述方法的每一步骤中的传代如下进行：在病毒获得完全细胞病变效应(CPE)后，立即获得含有病毒的澄清培养物上清并将此上清传递到每个相继的新鲜细胞的新培养瓶中。

28.权利要求22-27任一项的方法，其中所述较高MOI是20。

29.权利要求28的方法，其中在病毒导致完全CPE后，用病毒以20MOI接种含有新鲜铺满的单层Vero细胞的新培养瓶再传代3个代次。

30.权利要求22-29任一项的方法，其中所述较低MOI是5-10。

31.权利要求30的方法，其中在病毒导致完全CPE后，用病毒以5-10MOI接种含有新鲜铺满的单层Vero细胞的新培养瓶再传代至少3个代次。

32.权利要求31的方法，其中在以所述5-10MOI再传代至少3个代次之后开始或重复步骤(iii)。

33.权利要求27-32任一项的方法，其中完全CPE发生在接种后3天内。

34.权利要求22-33任一项的方法，其中所述细胞是Vero细胞。

35.权利要求22-34任一项的方法，其中Vero细胞在补加胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM)中培养。

36.权利要求35的方法，其中所述培养基补加1％FCS。

37.制备疫苗的方法，包括使用权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株。

38.制备疫苗的方法，包括使用包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的核酸。

39.权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株用于疫苗开发的应用。

40.包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的核酸用于疫苗开发的应用。

41.权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株，用于疫苗开发。

42.包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的核酸，用于疫苗开发。

43.权利要求1-3任一项的冷适应型温度敏感性肠病毒71毒株的应用。

44.包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的核酸的应用。

Claims