TWI685566B

TWI685566B - 穩定之適於冷之溫度敏感型嵌合腸病毒之發展

Info

Publication number: TWI685566B
Application number: TW104119175A
Authority: TW
Inventors: 克彬邱
Original assignee: 新加坡商淡馬錫生命科學研究院公司
Priority date: 2014-06-12
Filing date: 2015-06-12
Publication date: 2020-02-21
Also published as: TW201625787A; WO2015190999A1; CN106795499B; CN106795499A; SG11201610282QA

Abstract

本發明係關於嵌合病毒病毒株，尤其關於穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株EV71：eTLLβP20及EV71：TLLeC5及穩定之嵌合腸病毒病毒株TLLeCA16。本發明亦關於包含此等病毒株之核苷酸序列之載體及包含此等病毒株之疫苗。

Description

穩定之適於冷之溫度敏感型嵌合腸病毒之發展

序列提交

本申請案連同序列表一起以電子格式提出申請。序列表之檔名為2577236TWSequenceListing.txt(於2015年4月23日建立)且大小為62kb。序列表之電子格式之資訊以其全文引用方式併入本文中。

本文中用於闡述本發明之先前技術或提供關於實務之其他詳細內容之公開案及其他材料係以引用的方式併入，及出於方便性而分別匯集於參考書目中。

手足口病(HFMD)為特徵係手掌及腳底上之皮膚發疹(疹)並同時出現影響口腔之黏膜皮膚水皰潰瘍性病灶(黏膜疹)之發熱性疾病複徵症候群。該疾病係由多種腸病毒引起，其中克沙奇病毒A16(coxsackievirus A16)(CA16)及腸病毒71(EV71)為主要致病物(1)。除了HFMD之外，EV71與一系列其他臨床疾病包括非特異性發熱性疾病、急性嬰幼兒呼吸道感染、無菌性腦膜炎、腦炎及脊髓灰質炎樣急性無力胺體麻痺相關聯(1-3)。如同其他腸病毒，EV71及CA16係直徑為28至30nm之小無包膜病毒。病毒衣殼係二十面體對稱性及由60個相同單元(原體(protomers))組成，其中各單元係由四個病毒結構蛋白VP1至VP4中之一個複本組成。衣殼環繞約7,450個核苷酸(nts)之單股正性RNA基因組之核心。病毒基因組係由編碼約2200個胺基酸之聚合蛋白質且在其5'端經約750個nts之長非轉譯區域及在其3'端經約85個nts之短非轉譯區域(其3'端具有可變長度的聚腺苷酸束(poly-A tract))側鏈修飾之單一開放閱讀框架組成。人腸病毒71(HEV71)依小核糖核酸病毒科中之腸病毒屬歸類為人腸病毒A物種(2,3)。EV71被分為三個主要基因群(genogroup)(A、B、及C)，且基於其主要衣殼蛋白(VP1)基因之種系分析，基因群B及C分別進一步被細分為基因型B1至B5及C1至C5(4)。

在最近15年，尤其在亞太地區，EV71之活性及毒性增加，引起HFMD嚴重爆發及尤其在幼兒中造成中樞神經系統神經疾病後遺症及死亡率。目前，既無用於治療因EV71引起之疾病之特異性抗病毒藥物，亦無用於控制及防止感染之任何有效疫苗。活減毒口服及滅活親本脊髓灰質炎病毒疫苗在預防脊髓灰質炎方面之成效指明藉由疫苗接種預防因EV71引起之疾病之潛力(28)。已報告許多以往開發EV71疫苗的嘗試且有些甚至已達到臨床試驗之各種階段(29-49)。然而，需要解決有效疫苗之若干挑戰以控制及防止HFMD爆發(50-52)。首先，HFMD係由多種腸病毒引起，其中尤其在爆發情況中EV71及CA16為主要致病物(5-27)。Chou等人(2012)之一項最近公開的研究證實抗EV71之抗體將不會交叉保護抗CA16之感染及反之亦然(50)。極度需要靶向EV71及CA16二者之多價疫苗以防止因此兩主要致病物所引起的HFMD爆發。其次，發現EV71在最近15年快速地演變及已知EV71之多於一種基因型共循環及在世界各地引起爆發。已發現感染後之各種基因型與特定基因型間之交叉保護免疫性不均勻及候選EV71疫苗需要解決此問題以對所有已知循環基因型提供充分交叉保護。

最近，已開發EV71之穩定之適於冷之溫度敏感型減毒病毒株，EV71：TLLβP20。請參見2013年1月18日申請之國際申請案第PCT/SG2013/000027號，該案係以全文引用的方式併入本文中。甚至在將培養細胞接種高病毒感染倍數(m.o.i)之病毒接種物時，病毒亦不會在於39.5℃之溫度(人體高溫發熱體溫)下培養之培養細胞中複製。EV71：TLLβP20在所界定培養條件下不僅具表現型上穩定性而且具基因上穩定性。在溫度逆轉研究中藉由多個繼代來確定穩定性。最近已在猴研究中證實此可能候選EV71疫苗之安全性、免疫原性及有效性(中和抗體)。然而，猴研究中藉由EV71：TLLβP20引起之中和抗體顯示抗EV71之在類似基因群中之基因型之高中和抗體效價，但抗歸屬一不同基因群之基因型之中和效價低。該發現證實先前公開的在日本國家級傳染性疾病機構(National Institute of Infectious Disease)(NIID)進行之猴研究之發現，其顯示由一種基因型引起之中和抗體賦予抗同源基因群之EV71病毒株之高中和抗體效價，但抗歸屬異種基因群之病毒株之中和效價較低(32)。

因此，需要開發適用於開發因EV71及/或CA16引起之HFMD之疫苗之嵌合病毒病毒株。

本發明係關於嵌合病毒病毒株，尤其關於穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株EV71：eTLLβP20及EV71：TLLeC5及穩定之嵌合腸病毒病毒株TLLeCA16、及其滅活形式。本發明亦關於包含此等病毒株之核苷酸序列之載體及包含此等病毒株之疫苗。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株及穩定之嵌合腸病毒病毒株、及其滅活形式。在一個實施例中，該穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株係如本文所述之EV71：eTLLβP20。在另一實施例中，該穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株係如本文所述之EV71：TLLeC5，其具有EV71基因型C5之衣殼蛋白。在一額外實施例中，該穩定之嵌合腸病毒病毒株係如本文所述之TLLeCA16，其具有CA16之衣殼蛋白。

在第二態樣中，本發明提供一種單獨地或與述於國際申請案第PCT/SG2013/000027號中之親本穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株EVL：TLLβP20組合之包含本文所述腸病毒71病毒株及嵌合腸病毒病毒株中之一或多者之組合物。如本文中所用，「單獨地」意指組合物包含病毒株EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16中之一或多者。亦如本文中所用，「與...組合」意指組合物包含病毒株EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16中之一或多者及親本EV71：eTLLβP20。在一個實施例中，該組合物單獨地或與親本EVL：TLLβP20組合地包含有效量之本文所述病毒株中之一或多者。在一些實施例中，一種、一些或所有該等病毒株可係病毒株之滅活形式。在另一實施例中，該組合物包含一或多種生理上或醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，該組合物係疫苗。單獨地或與親本EVL：TLLβP20組合地包含一或多種本文所述病毒株之疫苗係使用熟習此相關技術者熟知的技術來製造。如本文中所用，「單獨地」意指疫苗包含病毒株EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16中之一或多者。亦如本文中所用，「與...組合」意指疫苗包含病毒株EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16中之一或多者及親本EV71：eTLLβP20。在一個實施例中，疫苗包含一或多種活病毒株。在另一實施例中，該一或多種活病毒株係經減毒。在一額外實施例中，疫苗包含一或多種滅活病毒株。在另一實施例中，疫苗可係口服疫苗。此等疫苗適用於藉由利用熟習相關技術者熟知的技術向個體(諸如人類個體)投與疫苗來提供抗親本病毒株之免疫性。

在第三態樣中，本發明提供一種在個體(諸如人類個體)中引發保護性免疫反應之方法，該方法包括單獨地或與親本EVL：TLLβP20組合地向個體投與預防上或治療上或免疫上有效量之一或多種本文所述病毒株。在一個實施例中，保護性免疫反應保護個體抵抗由腸病毒71及/或克沙奇病毒CA16引起之疾病。在一個實施例中，該疾病係手足口病。在另一實施例中，該疾病係無菌性腦膜炎。在一額外實施例中，該疾病係腦炎。在另一實施例中，該疾病係脊髓灰質炎樣麻痺。在一個實施例中，單獨或與親本EVL：TLLβP20組合地投與一或多種本文所述之病毒株作為疫苗。在一額外實施例中，該個體已暴露於野生型腸病毒71及/或克沙奇病毒CA16。在另一實施例中，單獨地或與親本EVL：TLLβP20組合地投與一或多種本文所述病毒株來預防個體(諸如人類個體)罹患與腸病毒71相關之疾病及/或與克沙奇病毒CA16相關之疾病。在一額外實施例中，該個體已暴露於野生型腸病毒71及/或克沙奇病毒CA16。在另一實施例中，單獨地或與親本EVL：TLLβP20組合地投與一或多種本文所述病毒株來延遲受病毒感染個體(諸如人類個體)中與腸病毒71相關之疾病及/或與克沙奇病毒CA16相關之疾病之發作或減慢其發展速率。在一些實施例中，一種、一些或全部病毒株係滅活。

在第四態樣中，本發明提供與本文所述病毒株相關聯之疫苗技術。在一個實施例中，本文所述之病毒株係用於製造疫苗之方法中。在另一實施例中，將包含以SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：83描述之核苷酸序列之核酸用於製造疫苗之方法中。在一額外實施例中，本文所述之腸病毒71病毒株、或其滅活形式係用於發展疫苗。在另一實施例中，包含以SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：83描述之核苷酸序列之核酸係用於發展疫苗。

圖1顯示呈現經改造之穩定之適於冷之溫度敏感型EV71：eTLLβP20之基因組結構及各別經編碼蛋白質之示意圖。粗黑條指示病毒基因組之編碼區(P1、P2、及P3)及較細條指示病毒基因組之5'及3'非編碼(NC)區。灰色指示經轉譯之聚合蛋白質及裂解後之各別病毒蛋白質。

圖2a及2b顯示呈現EV71：eTLLβP20及基因型C之EV71之基因組結構之示意圖。圖2a呈現EV71：eTLLβP20(黑色)及經轉譯之聚合蛋白質(灰色)之基因組結構。圖2b呈現基因型C5之EV71(黑色，具有點圖樣)之基因組結構。

圖2c顯示呈現經改造之穩定之適於冷之溫度敏感型嵌合腸病毒71(EV71：TLLeC5)之基因組結構及各別經編碼蛋白質之示意圖。EV71：TLLeC5之衣殼蛋白質基因(P1)(黑色，具有點圖樣)及經轉譯蛋白質(VP1、2、3、4)(灰色，具有點圖樣)係衍生自基因型C5之EV71。

圖3a及3b顯示呈現EV71：eTLLβP20及克沙奇病毒CA16之基因組結構之示意圖。圖3a呈現EV71：eTLLβP20(黑色)及經轉譯聚合蛋白質(灰色)之基因組結構。圖3b呈現克沙奇病毒CA16(黑色，具有垂直線圖樣)之基因組結構。

圖3c顯示呈現經改造之穩定之適於冷之溫度敏感型嵌合腸病毒TLLeCA16之基因組結構及各別經編碼蛋白質之示意圖。TLLeCA16之衣殼蛋白質基因(P1)(黑色，具有垂直線圖樣)及經轉譯蛋白質(VP1、2、3、4)(灰色，具有垂直線圖樣)係衍生自克沙奇病毒CA16。

本發明係關於嵌合病毒株，尤其關於穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株EV71：eTLLβP20及EV71：TLLeC5及穩定之嵌合病毒株TLLeCA16。本發明亦關於包含此等病毒株之核苷酸序列之載體及包含此等病毒株之疫苗。

因此，在一個態樣中，本發明提供腸病毒71病毒株及嵌合病毒株。在一個實施例中，穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株係本文所述之EV71：eTLLβP20。在另一實施例中，穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株係本文所述之EV71：TLLeC5，其具有EV71基因型C5之衣殼蛋白質基因。在一額外實施例中，穩定之嵌合腸病毒病毒株係本文所述之TLLeCA16，其具有CA16之衣殼蛋白質基因。在2012年10月25日依位於美國維吉尼亞州20110馬納薩斯市10801大學大道(10801 University Boulevard,Manassas,Virginia 20110,USA)之美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)之布達佩斯條約(Budapest Treaty)存放述於國際申請案第PCT/SG2013/000027號中之親本病毒株EV71：TLLβP20且指派為寄存編號PTA-13285。在2014年5月30日依位於中華人民共和國武漢市430072武漢大學(Wuhan University,Wuhan 430072 Peoples Republic of China)之中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection)之布達佩斯條約存放EV71：eTLLβP20，且指派為寄存編號CCTCC V201414。在2014年5月30日依中國典型培養物保藏中心之布達佩斯條約存放EV71：TLLeC5，且指派為寄存編號CCTCC V201415。在2014年5月30日依中國典型培養物保藏中心之布達佩斯條約存放TLLeCA16，且指派為寄存編號CCTCC V201416。

在第二態樣中，本發明提供一種單獨地或與述於國際申請案第PCT/SG2013/000027號中之親本EV71病毒株EVL：TLLβP20組合地包含一或多種本文所述病毒株之組合物。如本文中所用，「單獨地」意指組合物包含病毒株EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16中之一或多者。亦如本文中所用，「與...組合」意指組合物包含EV71病毒株EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16中之一或多者及親本 EV71：eTLLβP20。在一個實施例中，組合物單獨地或與親本EV71：TLLβP20組合地包含有效量之一或多種本文所述病毒株。在一些實施例中，一種、一些或全部該等病毒株可係病毒株之滅活形式。在另一實施例中，組合物包含一或多種生理上或醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，組合物係疫苗。單獨地或與親本EVL：TLLβP20組合地包含一或多種本文所述病毒株之疫苗係利用熟習相關技術者熟知的技術來製造。如本文中所用，「單獨地」意指疫苗包含病毒株EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16中之一或多者。此外，如本文中所用，「與...組合」意指疫苗包含病毒株EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16中之一或多者及親本EV71：eTLLβP20。在一個實施例中，疫苗包含一或多種活病毒株。在另一實施例中，該一或多種活病毒株係經減毒。在一額外實施例中，疫苗包含一或多種滅活病毒株。在另一實施例中，疫苗可係口服疫苗。此等疫苗適用於藉由利用熟習相關技術者熟知的技術向個體(諸如人類個體)投與疫苗來提供抗親本病毒株之免疫性。

應瞭解，當用於引發個體之保護性免疫反應或預防個體罹患與病毒相關之疾病或延遲與病毒相關之疾病之發作或減慢其發展速率時，本文所述之病毒株係以額外包含一或多種生理上或醫藥上可接受之載劑的組合物形式投與個體。醫藥上可接受之載劑為熟習相關技術者所熟知，且包括(但不限於)0.01M至0.1M且較佳0.05M之磷酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或0.9%鹽水中之一或多者。此等載劑亦包括水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。水性載劑包括水、醇性/水性溶液、乳液或懸浮液、鹽水及緩衝介質。非水性溶劑之實例係丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄欖油)及可注射之有機酯(例如油酸乙酯)。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer's)葡萄糖、葡萄糖及氯化鈉、乳酸化林格氏及不揮發油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充液、電解質補充液(例如以林格氏葡萄糖為基礎者)及類似物。固體組合物可包括無毒固體載劑，例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、纖維素或纖維素衍生物、碳酸鈉及碳酸鎂。對於利用氣溶膠的投藥(諸如用於肺及/或鼻內給藥)，藥劑或組合物較佳係經無毒的表面活性劑(例如C6至C22脂肪酸或天然甘油酯之酯類或部分酯)及推進劑調配。為利於鼻內給藥，可包括例如卵磷脂之其他載劑。醫藥上可接受之載劑可進一步包括少量輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、防腐劑及其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑及螯合劑，其等可增進該等活性成分之存放期及/或有效性。如此項技術中所熟知，可調配即時性組合物以在投藥給個體後提供活性成分之快速、持續或延遲釋放。

在第三態樣中，本發明提供一種於個體(諸如人類個體)中引起保護性免疫反應之方法，該方法包括單獨地或與親本EVL：TLLβP20組合地向個體投與預防上或治療上或免疫上有效量之一或多種本文所述病毒株或其滅活病毒株。在一個實施例中，該保護性免疫反應保護個體抵抗由腸病毒71及/或克沙奇病毒CA16引起之疾病。在一個實施例中，該疾病係手足口病。在另一實施例中，該疾病係無菌性腦膜炎。在一額外實施例中，該疾病係腦炎。在另一實施例中，該疾病係脊髓灰質炎樣麻痺。在一個實施例中，投與單獨或與親本EVL：TLLβP20組合之一或多種本文所述病毒株作為疫苗。在一額外實施例中，該個體已暴露於野生型腸病毒71及/或克沙奇病毒CA16。在另一實施例中，單獨地或與親本EVL：TLLβP20組合地投與一或多種本文所述病毒株來防止個體(諸如人類個體)罹患與腸病毒71相關之疾病及/或與克沙奇病毒CA16相關之疾病。在一額外實施例中，該個體已暴露於野生型腸病毒71及/或克沙奇病毒CA16。在另一實施例中，單獨地或與親本EVL：TLLβP20組合地投與一或多種本文所述病毒株來延遲受病毒感染之個體(諸如人類個體)中與腸病毒71相關之疾病及/或與克沙奇病毒CA16相關之疾病之發作或減慢其發展速率。

如本文中所用，「投與」意指利用熟習相關技術者已知的各種方法及傳遞系統中之任一者來傳遞。可進行例如腹膜內、腦內、靜脈內、口服、經黏膜、皮下、經皮、皮內、肌內、局部、非經腸道、藉由植入物、脊髓內、淋巴內、病灶內、心包或硬膜外投藥。藥劑或組合物亦可以氣溶膠投藥，例如用於肺及/或鼻內給藥。投藥可例如以1次、複數次及/或經一或多個延長時期進行。

可例如藉由將原始劑量之疫苗投給個體，隨後在一段適當時間後投給一或多次後續疫苗，來完成引發個體之保護性免疫反應。投給疫苗之間的一段適當時間可輕易地由熟習此項技術者決定，且其通常約為數個星期至數個月。然而，本發明不受限於任何特定的投藥方法、途徑或頻率。

「預防上有效劑量」或「免疫上有效劑量」係指當投與易受病毒感染或易罹患病毒相關病症的個體時，於該個體中引發保護該個體免受病毒感染或免罹患該病症之免疫反應的任何疫苗量。「保護」該個體意指降低該個體受該病毒感染的可能性或減少該疾病在該個體中發病的可能性(減少至少兩倍，較佳至少十倍)。例如，如果個體有1%的機會受病毒感染，則降低兩倍該個體受該病毒感染之可能性將導致該個體有0.5%的機會受病毒感染。最佳地，「預防上有效劑量」於該個體中引發完全預防該個體受病毒感染或完全預防該病症在該個體中發作之免疫反應。

任何即時免疫作用及治療方法之某些實施例可進一步包括向該個體投與至少一種佐劑。「佐劑」將意指適於增強抗原之免疫原性並促進個體免疫反應的任何試劑。許多適合與以蛋白質及核酸為基礎的疫苗併用之佐劑(包括微粒佐劑)及將佐劑與抗原結合的方法為熟習相關技術者所熟知。適合與蛋白質免疫接種併用之佐劑包括(但不限於)明礬、弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)(FCA)、弗氏不完全佐劑(FIA)、明礬佐劑、基於皂苷之佐劑(諸如Quil A)及QS-21及類似物。

在第四態樣中，本發明提供與本文所述病毒株相關聯之疫苗技術。在一個實施例中，於製造疫苗之方法中使用本文所述之病毒株。在另一實施例中，於製造疫苗之方法中使用包含以SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：83描述之核苷酸序列之核酸。在一額外實施例中，將本文所述之病毒株或其滅活形式用於疫苗之發展。在另一實施例中，將包含以SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：83描述之核苷酸序列之核酸用於疫苗之發展。

本發明亦提供一種用於利用本文所述穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株或其滅活形式、及/或本文所述穩定之嵌合腸病毒病毒株或其滅活形式使個體免疫之套組。在一些實施例中，該套組包括兩種或更多種本文所述之穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株或其滅活形式，且包含或不含本文所述之穩定之嵌合腸病毒病毒株。該套組包括本文所述之穩定之適於冷之溫度敏感型病毒株或其滅活形式、及/或本文所述之穩定之嵌合腸病毒株或其滅活形式、醫藥上可接受之載劑、施藥器、及其使用之說明材料。本發明包括熟習相關技術者已知之套組之其他實施例。該等說明可提供任何有用於指導投與本文所述之穩定之適於冷之溫度敏感型病毒株或其滅活形式之資訊。

除非另有指示，否則本發明之實施採用習知的化學、分子生物學、微生物學、重組DNA、遺傳學、免疫學、細胞生物學、細胞培養及轉基因生物學技術，其等屬於相關技藝之技術範圍。參見：例如， Maniatis等人，1982,Molecular Cloning(紐約冷泉港(Cold Spring Harbor)冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))；Sambrook等人，1989,Molecular Cloning，第2版(紐約冷泉港冷泉港實驗室出版社)；Sambrook與Russell,2001,Molecular Cloning，第3版(紐約冷泉港冷泉港實驗室出版社)；Green與Sambrook,2012,Molecular Cloning，第4版(紐約冷泉港冷泉港實驗室出版社)；Ausubel等人，1992,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，包括定期更新)；Glover,1985,DNA Cloning(牛津市IRL出版社)；Russell,1984,Molecular biology of plants：a laboratory course manual(紐約冷泉港冷泉港實驗室出版社)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes(紐約學術出版社(Academic Press)，1992)；Guthrie與Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(紐約學術出版社，1991)；Harlow與Lane,1988,Antibodies(紐約冷泉港冷泉港實驗室出版社)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins編輯1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins編輯1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL出版社，1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(紐約學術出版社股份有限公司(Academic Press,Inc.))；Methods In Enzymology，第154及155卷(Wu等人編輯)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer與Walker編輯，倫敦學術出版社，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第I至IV卷(D.M.Weir與C.C.Blackwell編輯，1986)；Riott,Essential Immunology，第6版，牛津市Blackwell科學出版社，1988；Fire等人，RNA Interference Technology：From Basic Science to Drug Development(劍橋市劍橋大學出版社(Cambridge University Press),2005)；Schepers,RNA Interference in Practice,Wiley-VCH,2005；Engelke,RNA Interference(RNAi)：The Nuts & Bolts of siRNA Technology,DNA出版社，2003；Gott,RNA Interference,Editing,and Modification：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(新澤西州托托華人類出版社(Human Press,Totowa)，2004)；Sohail,Gene Silencing by RNA Interference：Technology and Application,CRC,2004。

實例

參考以下實例來描述本發明，該等實例係以例示方式提供而非意欲以任何方式限制本發明。使用相關技術中熟知的標準技術或具體述於下文之技術。

實例1 材料及方法

細胞株及病毒：用於此研究中之所有細胞株係從美國組織典型培養物保藏中心(ATCC^®；American Tissue Type Culture Collection)獲得。該等細胞株係生長於補充10%(^v/_v)胎牛血清(FBS,i-DNA^®新加坡)及0.22%(^w/_v)碳酸氫鈉(NaHCO₃,Sigma Aldrich^®,USA)之杜貝卡氏改良依格培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM,Gibco^®,USA)中。除非另有陳述，否則培養Vero細胞(ATCC,CCL81)並維持在37℃之培養溫度。在感染之前，改由1% DMEM更換10% DMEM之培養基及於隨後在潮濕的5% CO₂環境中於各別實驗培養溫度下培養經感染細胞。使用實驗室確立的腸病毒71之穩定之適於冷之溫度敏感型病毒株(EV71：TLLβP20)、基因型C5之臨床腸病毒71分離物及屬於增殖於Vero細胞中之基因群B(譜系2)之克沙奇病毒A16之臨床分離物來產生嵌合腸病毒之穩定之適於冷之溫度敏感型病毒株(EV71：TLLeC5及TLLeCA16)。

使用衍生自實驗室確立的腸病毒71之穩定之適於冷之溫度敏感型病毒株(EV71：TLLβP20)之全長病毒RNA基因組來產生腸病毒71(EV71)之感染性cDNA選殖體，稱作EV71：eTLLβP20，其包含在兩個由經定製之特異性限制酶識別之病毒基因組之特異性部位處之經改造核苷酸變化。隨後使用EV71：eTLLβP20之感染性cDNA選殖體來產生嵌合病毒EV71：TLLeC5及嵌合病毒TLLeCA16之感染性cDNA選殖體。

病毒滴定：在Vero細胞中依述於世界衛生組織(World Health Organization)之脊髓灰質炎病毒實驗手冊2004「Poliovirus Laboratory Manual 2004」中略作修改之方法，藉由微量滴定試驗測定病毒效價及遵循Reed & Munch(1938)之方法將病毒效價計算為每毫升之50%細胞培養感染劑量(CCID₅₀)(53-55)。簡言之，在利用相等體積的氯仿處理以分散病毒聚集物之後，在包含1% FCS之DMEM中製得澄清病毒上清液之10倍連續稀釋。在96孔平底組織培養盤中之Vero細胞單層(10⁴個細胞/孔)中接種100μl經連續稀釋之病毒原液且在5% CO₂環境中於各個別培養溫度下培養。連續5天每天觀察經接種培養盤中CPE之存在。

溫度敏感性表現型試驗：使用兩種方法，於28℃、37℃及39.5℃之培養溫度下評估Vero細胞中病毒株之生長特徵。第一方法係評估病毒株引起經接種單層細胞中之完全CPE(經感染細胞死亡之動力學)所需的天數，及第二方法係評估於各特定測試溫度下培養之經接種細胞之上清液中病毒株之效價。簡言之，在第一方法中，將三個包含相似年齡及細胞密度之融合單層Vero細胞之T-25組織培養瓶的生長培養基更換為維持培養基(含有1% FCS之DMEM)。接著置於各別培養箱中1小時，使各瓶中之培養基平衡達到待測試的指定溫度，隨後以病毒感染倍數(m.o.i)10之劑量接種病毒株。若在10天的培養結束時未觀測到 CPE，則將上清液傳代至新的含新鮮製備單層Vero細胞之瓶中，及以類似方式再培養10天。若在第二次繼代培養後未觀測到CPE，則認為病毒無複製。在第二方法中，將10⁴個細胞/100μl密度之Vero細胞懸浮液接種於三個96孔細胞培養盤之各孔中及在5% CO₂之環境中於37℃下培養。在培養10小時後，接著藉由置於各別培養箱中1小時使各細胞培養盤平衡達到待測試的特定溫度。隨後將各孔中之細胞接種100μl病毒株之10倍連續稀釋，接著轉移至各別培養溫度之培養箱。連續5天每天觀測經接種之培養盤中CPE之存在及遵循Reed & Munch(1938)之方法將病毒效價計算為每毫升中之50%細胞培養感染劑量(CCID₅₀)(40)。

基因穩定性及溫度敏感性逆轉試驗：為評估於指定培養環境及細胞類型下培養之病毒株之基因穩定性，進一步在Vero細胞中於5 m.o.i之病毒接種物下繼代培養病毒株二十次且於28℃之培養溫度下培養。在二十次的繼代培養結束時，藉由如上所述於28℃、37℃及39.5℃之培養溫度下培養來評估病毒株之溫度敏感性表現型特徵。隨後將其各別基因組之完整核苷酸序列定序及針對其各別親本病毒之初始源基因組序列進行分析。

於穩定之適於冷之溫度敏感型嵌合病毒株上進行溫度敏感性逆轉表現型試驗以評估其等將如何快速逆轉為其初始野生型之表現型特徵。簡言之，在培養於T-25瓶中之Vero細胞之單層中連續繼代培養所選病毒株5次且在5% CO₂之環境中於37℃之溫度下培養。每次繼代培養使用10 m.o.i之病毒接種物。藉由上文針對溫度敏感性表現型試驗所述之類似方法於28℃、37℃及39.5℃之培養溫度下評估每次繼代培養之所得病毒株在Vero細胞中之生長特徵。在於37℃之溫度下培養之Vero細胞中之6次連續繼代培養後，藉由桑格方法(Sanger method)定序經繼代培養3次及6次之病毒株之完整基因組及分析可能已逆轉為其各自親本病毒株之基因序列之突變。

實例2 分子選殖之試劑、載體(質體)及一般方法

使用大腸桿菌(Escherichia coli(E.coli))菌株TOP10(Invitrogen)來製備用作用來選殖衍生自RT-PCR或病毒基因組之5'快速擴增cDNA端(5'-RACE)之DNA片段之保持載體之pZErO^TM-2質體(Invitrogen)。使用XL10-Gold超勝任大腸桿菌菌株(Agilent Technologies)來製備用於建構各別經改造嵌合腸病毒之感染性cDNA選殖體之質體(pACYC177)(New England Biolabs)。將限制酶BamHI及AatII(New England Biolabs)用於在分別選殖EV71：TLLβP20之近端及遠端片段至隨後用於建構EV71：eTLLβ之感染性cDNA選殖體之pACYC177質體中之定點消解(sites-specific digestion)。將限制酶對ClaI與XmaI(New England Biolabs)用於定點消解EV71基因型C5之經PCR擴增P1基因區為pACYC177質體。將限制酶對NheI與XhoI(New England Biolabs)用於定點消解CA16之經PCR擴增P1基因區為pACYC177質體。將限制酶對MluI與EagI(New England Biolabs)用於自帶有各別插入物之pACYC177質體定點消解C5及CA16之P1基因區以隨後選殖為帶有EV71：eTLLβ之全長cDNA基因組之pACYC177質體來產生各別的嵌合病毒。

使用T4 DNA連接酶(Fermentas)來進行DNA片段之所有連接。使用iProof High-Fidelity DNA聚合酶(Bio-Rad)來進行定點突變(SDM)。於SDM後，在進行DpnI消解之前，使用離心管柱(spin column)(台灣Geneaid Biotech)純化PCR反應。藉由利用40 U DpnI(New England Biolabs)酶處理，於37℃下培養6小時接著於80℃下滅活20分鐘來移除甲基化質體。接著使用離心管柱(台灣Geneaid Biotech)純化反應產物且轉型至XL10-Gold超勝任大腸桿菌細胞中。將經轉型之細菌細胞接種於包含100μg/ml安比西林(Ampicillin)及35μg/ml康黴素(Kanamycin)之LB板上以篩選並選擇在SDM位點具有所需改變之選殖體。使用QIAGEN Plasmid Maxi套組(德國Qiagen)來自所選選殖體大量提取質體。使用BigDye Terminator v3.0循環測序反應套組(Applied Biosystems,USA)進行DNA定序且使用BioEdit程式分析結果(56,57)。

RNA提取、RT-PCR及定序之一般分子方法：使用QIAamp病毒RNA迷你套組(德國Qiagen)自分別感染EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5或TLLeCA16之Vero細胞之培養上清液提取病毒RNA。藉由逆轉錄使用SuperScript II逆轉錄酶(Invitrogen)及無規六聚物或各別的下游特異性引物來進行第一股cDNA合成。第一股cDNA隨後充作用於使用GoTaq Green PCR混合物(Promega,USA)及各別特異性引物對PCR擴增病毒基因組之標靶片段之模板。所產生的經擴增片段經直接定序或選殖至保持質體載體pZErO^TM-2中且使用BigDye Terminator定序套組(Applied Biosystems,USA)定序純化質體中之插入物。使用引物Race-2R進行5'-RACE以確定病毒基因組之5'端(非轉譯區)之核苷酸序列來合成單股cDNA。單股cDNA經苯酚-氯仿提取，純化並連接至寡核苷酸RACE-DT88(3'端脫氧腺苷(cordecypin)阻斷轉接子)(58)。使用與寡核苷酸RACE-DT88互補之引物RACE-DT89、及引物Race-3R擴增經連接之產物。亦使用引物對EV71-19F及寡聚-(dT)₁₅進行3'-RACE以確定3'-UTR病毒序列。將PCR擴增產物選殖至pZErO^TM-2載體(Invitrogen)中且經轉型至大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen)中。使用BigDye Terminator定序套組(Applied Biosystems,USA)來定序所提取質體中之插入物。

帶有病毒基因組之全長cDNA之插入物之質體之轉染：使用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)來進行帶有各別經改造/嵌合病毒之全長cDNA基因組之質體之轉染。將由轉染試劑、帶有各別經改造/嵌合病毒(EV71：eTLLβ、EV71：TLLeC5或TLLeCA16)之病毒基因組之全長cDNA之質體及表現T7聚合酶之質體組成之混合物轉移至24孔盤中之新接種的Vero細胞上。於37℃下培養5小時後，移去混合物及利用無菌PBS洗滌細胞兩次。於最後一次洗滌後，將其更換為1% DMEM及於28℃在5%二氧化碳之環境中培養。於培養10天後，將24孔盤各孔中之細胞及上清液傳遞至新接種於6孔盤上之新Vero細胞上。一旦經接種之Vero細胞已達成完全細胞病變效應(CPE)，則隨後將包含病毒之培養上清液傳遞至培養於T25瓶中之新接種的Vero細胞上。

引物：表1至4闡明用於本文所述實例中之引物。

實例3 建構EV71：eTLLβP20之感染性cDNA選殖體

RNA提取及cDNA合成：使用QIAamp病毒RNA迷你套組(德國Qiagen)提取病毒RNA(EV71：TLLβP20)及依照製造商指示來進行。使用SuperScript II逆轉錄酶(Invitrogen)來進行單股cDNA合成。簡言之，將5μg經提取RNA、100pmol特異性引物(用於產生5'-近端片段之EV71-9R_2011B、或用於產生3'-遠端片段之ACYC-TLLb-D-R)及5μl 10mM dNTP混合物加入無核酸酶水中且將反應體積調整至60μl。於65℃下培養反應混合物10min及在冰(4℃)中淬滅5min。隨後，將20μl 5X第一股緩衝劑(First-Strand Buffer)、10μl 0.1M DTT及5μl RNA酶抑制劑(40U/μl)添加至該反應混合物及使其在42℃下培養5min。此後，添加5μl SuperScript II RT(200U/μl)及於46℃下培養所得混合物30min，接著於50℃下再培養30min。藉由於72℃下培養該反應混合物15min來終止該反應。接著藉由添加6.5μl RNA酶H(1.5U/μl)移去與cDNA股互補之RNA及於37℃下培養25min。使用標準的苯酚-氯仿提取方案來提取及純化所合成的單股cDNA。

用於建構病毒基因組之全長cDNA複本之片段之PCR擴增：藉由RT-PCR擴增兩片段中之病毒RNA基因組，接著將病毒基因組之近端 (5')cDNA片段(約3500bp)連接至其擴增遠端(3')cDNA片段(約4000bp)，來產生約7500bp之病毒基因組(EV71：eTLLβP20)之全長cDNA複本。使用引物對ACYC-TLLb-Pf-F(順向引物)及ACYC-TLLb-Pf-R(反向引物)藉由PCR擴增使用引物EV71-9R_2011B逆轉錄病毒基因組所合成之單股cDNA來產生近端片段。使用引物對ACYC-TLLb-D-F(順向引物)及ACYC-TLLb-D-R(反向引物)藉由PCR擴增使用引物ACYC-TLLb-D-R所合成之單股cDNA來產生遠端(3')片段。使用初始變性溫度為98℃之iProof High-Fidelity Master Mix(Bio-Rad)進行PCR反應2min接著進行10個98℃ 10 s、65℃ 30 s及72℃ 2min之循環，隨後再繼續進行35個98℃ 10 s及72℃ 2.5min及最後72℃延長5min之循環。如國際專利申請案第PCT/SG2013/000027號中所揭示之EV71：TLLβP20之核苷酸序列描述於SEQ ID NO：83。

將EV71：TLLβP20之近端及遠端片段選殖至pACYC177：分別利用限制酶BamHI及AatI消化經PCR產生之近端及遠端片段及選殖至以類似方式經相同限制酶組消化之質體pACYC177中。簡言之，分別利用50 U BamHI及AatII藉由於37℃下培養2h，接著於65℃下滅活30min來加倍消化4μg pACYC177(其具有針對BamHI及AatII之獨特切割位點)及約1μg近端及遠端PCR產物。分別對已消化之DNA片段進行凝膠純化。接著使用在於22℃下培養1h，及接著於70℃下滅活5min之20μl反應混合物中之5 U T4 DNA連接酶(Fermentas)將已消化之PCR產物連接至已消化之pACYC177。接著取10微升(10μl)連接混合物藉由在100μl反應中電穿孔，接著在400μl SOC培養基中於30℃下培養2h而轉型至XL10電穿孔法勝任大腸桿菌細胞中。此後，接著將150μl電穿孔法轉型細胞接種至包含100μg/ml安比西林及35μg/ml康黴素之LB板上。接著篩選存在正確插入物之陽性選殖體及選擇用來製備大量質體。例行進行定序以確認成功地連接至載體之全長序列的插入物。帶有EV71：TLLβP20基因組之近端及遠端部分之cDNA複本之pACYC177質體分別命名為pACYC177(TLLβP20近端)及pACYC177(TLLβP20遠端)。

pACYC177(TLLβP20近端)之定點突變(SDM)：在包含病毒基因組之近端片段之質體上進行基於PCR之定點突變以引入位於VP4基因區之5'端之獨特限制酶(MluI)識別位點。建立MluI及EagI限制酶切割位點以利於隨後選殖克沙奇病毒A16或腸病毒71基因型C5之P1區來產生各別嵌合病毒。使用連同100ng質體一起包含引物SDM-pACYC-Pf-F及SDM-pACYC-Pf-R之iProof High-Fidelity DNA聚合酶(Bio-Rad)來進行該反應。在98℃初始變性2min後，使該反應經歷35個98℃ 10 s、65℃ 30 s及72℃ 4min、接著最後72℃延長5min之循環。接著藉由於37℃下利用40U DpnI(New England Biolabs)處理2h，接著於80℃下滅活20min來移除甲基化質體。該反應混合物接著經離心管柱純化且藉由電穿孔轉型至XL10電穿孔法勝任大腸桿菌細胞中及如上所述回收轉型大腸桿菌細胞。隨後進行篩選以選擇在SDM位點具有所需核苷酸改變之選殖體。使用QIAGEN質體最大化套組(德國Qiagen)來自此等所選的具有所需核苷酸改變之選殖體提取大量質體。

建構EV71：eTLLβP20之全長感染性cDNA選殖體：分別用40 U限制酶BamHI及EagI(New England Biolabs)消化保持近端及遠端片段之質體及進行凝膠純化接著使用離心管柱提取。藉由使用2 U T4 DNA連接酶(Fermentas)將具有所需SDM位點之「自由」近端片段連接至已消化之帶有EV71：TLLβP20之遠端片段之質體pACYC177(TLLβP20遠端)。將經連接之質體轉型至XL10電穿孔法勝任大腸桿菌細胞中，接種至100μg/ml安比西林及35μg/ml康黴素之LB板上及於30℃下培養。接著篩選選殖體及選擇用於製備大量包含病毒基因組之全長cDNA複本之質體。使用完整TLLbP20引物組來進行定序以確認具有經改造限制酶(MluI及EagI)位點之EV71：TLLβP20之全長基因組(命名為EV71：eTLLβP20)成功地選殖至載體中。帶有EV71：TLLβP20之經修飾全長cDNA複本之pACYC177質體命名為pACYC177(EV71：eTLLβP20)。EV71：eTLLβP20之核苷酸序列描述於SEQ ID NO：84。

回收經改造之EV71：eTLLβP20病毒：使用包含總計800ng呈1：2比之pACYC177(EV71：eTLLβ)質體及T7聚合酶質體之Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)於在24孔盤中以3×10⁴個細胞/孔之接種密度接種過夜之Vero-81細胞上進行轉染。簡言之，於室溫下藉由稀釋於OPTI-MEM中之2μl Lipofectamine培養該混合物20分鐘。此後，將該混合物複合物添加至該等細胞及於37℃下培養5h。接著移去該混合物複合物；洗滌細胞及更換為1% DMEM並於28℃下培養。於後轉染10天後，將細胞及上清液傳遞至接種於6孔盤上之新鮮Vero細胞上。於達到完全細胞病變效應後，接著將細胞及上清液傳遞至培養於T25瓶中之新鮮Vero細胞上。進一步將病毒於培養於28℃下之Vero細胞中培養20個繼代(EV71：eTLLβP20)以確認其基因及表現型穩定性。

實例4 建構嵌合病毒EV71：TLLeC5之感染性全長cDNA選殖體

病毒及RNA：使歸屬基因型C5之腸病毒71病毒株(EV71：C5)(C5/3437/SIN-06)於生長於經補充1%胎牛血清之杜貝卡氏改良依格培養基(DMEM)中之Vero細胞中於30℃之培養溫度下在含5% CO₂之潮濕環境中繼代培養15次。使用QIAamp病毒RNA迷你套組(德國Qiagen)提取病毒RNA且依照製造商指示來進行。

衣殼蛋白質基因(P1)之PCR擴增：使用引物pACYC-C5-P1-F及pACYC-C5-P1-R對EV71基因型C5之整個衣殼蛋白質基因(P1)區進行RT-PCR擴增。使用包含經改造ClaI及MluI限制酶識別序列之pACYC-C5-P1-F引物及包含經改造XmaI及EagI限制酶識別序列之引物 pACYC-C5-P1-R來促進EV71基因型C5之衣殼蛋白質基因首先選殖至pACYC177載體中及隨後進入EV71：eTLLβP20之全長cDNA選殖體中。使用iProof High-Fidelity Master Mix(Bio-Rad)來進行此2.6kbp衣殼蛋白質基因(P1)區之擴增。EV71 C5之未經修飾P1基因之核苷酸序列描述於SEQ ID NO：85。

消化及將C5-P1片段選殖至pACYC177中：分別於37℃下用20 U ClaI及XmaI消化pACYC177及C5 RT-PCR擴增產物2小時。藉由於65℃下滅活反應混合物20分鐘來終止酶反應。對經消化之pACYC177進行凝膠純化。進行離心管柱純化以獲得經限制核酸內切酶消化後包含懸掛「黏性末端」之C5-P1 PCR擴增產物。接著藉由在於22℃下培養1h接著於70℃下滅活5min之20μl反應混合物中之2 U T4 DNA連接酶(Fermentas)將經純化C5 DNA連接至經消化的pACYC177。藉由電穿孔將10微升經純化之帶有C5-P1 DNA之pACYC177(現命名為pACYC177(C5-P1))轉型至XL10電穿孔法勝任大腸桿菌細胞中及如上所述回收經轉型大腸桿菌細胞。接著篩選及選擇帶有具有正確插入物之質體之陽性選殖體用來製備大量質體。亦進行定序以確認全長插入物成功地選殖至載體。

EV71：C5 P1基因之定點突變：於帶有C5之P1區之質體上進行定點突變以將第858位胺基酸自丙胺酸改變為蘇胺酸。連同50ng質體pACYC177(C5-P1)一起使用引物pACYC-C5P1-TITTL-F及pACYC-C5P1-TITTL-R來進行PCR定點突變。使用iProof High-Fidelity DNA聚合酶(Bio-Rad)一開始於98℃變性2min，接著進行15個98℃ 10 s、66℃ 30 s及72℃ 4min之循環，接著繼續進行35個98℃ 10 s、69℃ 30 s及72℃ 4min之循環、及最後72℃延長5min，來進行該反應。接著在進行DpnI消化之前對PCR反應進行離心管柱純化。40 U DpnI(New England Biolabs)於37℃下培養6h接著於80℃下滅活20min，以移除甲基化質體。該反應混合物隨後進行離心管柱純化及如上所述轉型至XL10電穿孔法勝任大腸桿菌細胞中。進行篩選以選擇具有所需SDM位點之選殖體。使用QIAGEN質體萃取套組(plasmid maxi kit)(德國Qiagen)在此等選殖體中萃取大量質體。帶有定點突變處所需核苷酸變化之質體命名為pACYC177(eC5-P1)。

建構EV71：TLLeC5之感染性全長cDNA選殖體：已純化之兩種質體pACYC177(EV71：eTLLβP20)及pACYC177(eC5-P1)分別利用20 U MluI及EagI消化，於37℃下培養6小時，接著於65℃下滅活30分鐘，以終止該消化。將經消化的產物進行凝膠純化。經消化之包含衍生自pACYC177(eC5-P1)之eC5之P1區之片段使用2 U T4 DNA連接酶(Fermentas)，在20μl反應混合物中，於22℃下培養1h接著於70℃下滅活5min，而連接至經消化之不含初始P1區之pACYC177(EV71：eTLLβP20)。連接之產物在100μl反應中進行電穿孔法，接著在400μl SOC培養基中於30℃下培養2h，而經轉型至XL10電穿孔法勝任大腸桿菌細胞中。此後，接著將150μl電穿孔法轉型細胞接種至包含100μg/ml安比西林及35μg/ml康黴素之LB板上。隨後進行陽性選殖體之篩選及全基因組之定序。帶有全長cDNA基因組之質體pACYC177命名為pACYC177(EV71：TLLeC5)。EV71：TLLeC5之核苷酸序列描述於SEQ ID NO：86。

回收經改造之嵌合EV71：TLLeC5病毒：藉由如前文所述用於回收經改造EV71：eTLLβP20病毒之類似實驗室方法將pACYC177(EV71：TLLeC5)質體轉染至Vero細胞上來回收經改造之嵌合EV71：TLLeC5病毒。將病毒於在28℃下培養之Vero細胞中進一步培養20個繼代以確認其基因及表現型穩定性。

實例5 建構嵌合病毒TLLeCA16之感染性全長cDNA選殖體

CA16之衣殼蛋白質基因(P1)(CA16-P1)之PCR擴增：以如針對提取EV71基因型C5之RNA所述之類似方法來提取CA16病毒RNA。使用引物pACYC-CA16P1-F及pACYC-CA16-P1-R進行CA16之P1(衣殼蛋白質基因)區之擴增。pACYC-CA16-P1-F引物包含經改造之NheI及MluI限制酶識別序列及引物pACYC-CA16-P1-R包含經改造之XhoI及EagI限制酶識別序列，以促進CA16之衣殼蛋白質基因選殖至pACYC177載體中及隨後選殖至EV71：eTLLβP20「主鏈」之全長cDNA中。使用iProof High-Fidelity Master Mix(Bio-Rad)進行此2.6kbp衣殼蛋白質基因(P1)區之擴增。CA16之未修飾P1基因之核苷酸序列描述於SEQ ID NO：87。

將PCR擴增片段CA16-P1區選殖至pACYC177中：分別利用50 U NheI及XhoI於37℃之反應溫度下消化pACYC177及CA16-P1區之PCR擴增產物2小時。使酶反應於65℃下滅活30分鐘。將經消化之pACYC177及CA16-P1二者凝膠純化。接著使用在於22℃下培養1h接著於70℃下滅活5min之20μl反應混合物中之5U T4 DNA連接酶(Fermentas)將經限制核酸內切酶(RE)消化之CA16-P1 DNA連接至經消化之pACYC177。藉由電穿孔將10微升帶有CA16-P1 DNA之經純化pACYC177(現命名為pACYC177(CA16-P1))轉型至XL10電穿孔法勝任大腸桿菌細胞中及如上所述回收經轉型之大腸桿菌細胞。

定點突變CA16 P1基因：於帶有CA16之P1區之質體上進行定點突變以將第858位胺基酸自離胺酸改變為蘇胺酸。使用iProof High-Fidelity DNA聚合酶(Bio-Rad)將引物pACYC-CA16P1-TITTL-F及pACYC-CA16P1-TITTL-R與50ng質體pACYC177(CA16-P1)一起進行98℃之初始變性2min，接著進行15個98℃ 10 s、66℃ 30 s及72℃ 4min之循環，接著繼續進行35個98℃ 10 s、69℃ 30 s及72℃ 4min之循環、及最後72℃延長5min。接著在進行DpnI消化之前使PCR反應經離心管柱純化。藉由於37℃下培養6h接著於80℃下滅活20min之40 U DpnI(New England Biolabs)來移除甲基化質體。接著將反應混合物進行離心管柱純化及如上所述轉型至XL10電穿孔法勝任大腸桿菌細胞中。進行篩選以選擇具有所需SDM位點之選殖體。使用QIAGEN質體最大化套組(德國Qiagen)來自此等選殖體提取大量質體。帶有定點突變處所需核苷酸改變之質體命名為pACYC177(eCA16-P1)。

建構TLLeCA16之感染性全長cDNA選殖體：分別用於37℃下培養6小時之20U MluI及EagI消化經純化之質體pACYC177(EV71：eTLLβP20)及pACYC177(eCA16-P1)。此後，藉由於65℃下滅活30分鐘來終止消化。將經消化產物進行凝膠純化。使用在20μl反應混合物中之2 U T4 DNA連接酶(Fermentas)將包含衍生自pACYC177之CA16之P1區之經消化片段(eCA16-P1)連接至經消化之不含初始P1區之pACYC177(EV71：eTLLβP20)。將反應混合物於22℃下培養1h接著於70℃下滅活5min。藉由在100μl反應中電穿孔接著在400μl SOC培養基中於30℃下培養2h將經連接產物轉型至XL10電穿孔法勝任大腸桿菌細胞中。此後，接著將150μl電穿孔法轉型細胞接種於包含100μg/ml安比西林及35μg/ml康黴素之LB板上。相應地，隨後進行陽性選殖體之篩選及全基因組之定序。帶有感染性全長cDNA基因組之質體pACYC177命名為pACYC177(TLLeCA16)。TLLeCA16之核苷酸序列描述於SEQ ID NO：88。

回收經改造之嵌合TLLeCA16病毒：藉由如前面針對藉由使用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)轉染回收經改造EV71：eTLLβP20病毒所述之類似實驗室方法將pACYC177(TLLeCA16)質體轉染至Vero細胞中來回收經改造之嵌合TLLeCA16病毒。進一步將病毒於在28℃下培養之Vero細胞中培養20個繼代以確認其基因及表現型穩定性。

實例6 EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16之cDNA複本及所回收病毒

pACYC177(EV71：eTLLβP20)質體帶有EV71：eTLLβP20之完整基因組之感染性cDNA複本。如前面所述藉由轉染Vero細胞中之pACYC177(EV71：eTLLβ)質體來回收病毒株。隨後將所回收的病毒於在28℃下培養之Vero細胞中再培養20個繼代(EV71：eTLLβP20)以確認其基因及表現型穩定性。

pACYC177(EV71：TLLeC5)質體帶有EV71：TLLeC5之完整基因組之感染性cDNA複本。藉由如前面針對回收經改造EV71：eTLLβ病毒所述之類似實驗室方法將pACYC177(EV71：TLLeC5)質體轉染至Vero細胞中來回收經改造之嵌合EV71：TLLeC5病毒。以類似方式將所回收的病毒於在28℃下培養之Vero細胞中再培養20個繼代以確認其基因及表現型穩定性。

pACYC177(TLLeCA16)質體帶有TLLeCA16病毒之完整基因組之感染性cDNA複本。藉由如前面針對使用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)回收經改造EV71：eTLLβ病毒所述之類似實驗室方法轉染pACYC177(TLLeCA16)質體至Vero細胞中來回收經改造之嵌合TLLeCA16病毒。以類似方式將所回收的病毒於在28℃下培養之Vero細胞中再培養20個繼代以確認其基因及表現型穩定性。

實例7 經改造腸病毒之基因組結構

呈現經改造之穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒(EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16)之基因組結構及各別編碼蛋白質之示意圖顯示於圖1、2及3中。示意性地，EV71：eTLLβP20之代表性基因組結構及編碼蛋白質與EV71：TLLβP20 之代表性基因組結構及編碼蛋白質並無差異，僅除了兩種特異性限制核酸內切酶(MluI及EagI)序列(ACGCGT及CGGCCG)經改造至基因組中，一者位於約蛋白質編碼基因區(nt 770至775)開始處之VP4基因序列中及另一者位於約VP1及2A基因接合(nt 3341至3346)處之2A基因序列中時之核苷酸含量。在所引入MluI位點(ACGCGT)之核苷酸改變(小寫，gCGatc)導致胺基酸改變(絲胺酸>纈胺酸，S10V)及在所引入EagI位點(CGGCCG)之核苷酸改變(小寫，tGGCCa)導致病毒聚合蛋白質之胺基酸位置867處之胺基酸改變(麩醯胺酸>精胺酸，Q867R)。EV71：TLLeC5及TLLeCA16二者在此兩所引入特異性限制核酸內切酶(MluI及EagI)位點保留與EV71：eTLLβP20相同的核苷酸序列改變。此外，EV71：TLLeC5之衣殼蛋白質基因(P1)區之核苷酸序列係完全地衍生自歸屬基因型C5之EV71之分離物之基因組之等效區及TLLeCA16之衣殼蛋白質基因(P1)區之核苷酸序列係衍生自克沙奇病毒A16(基因群B，譜系2)之等效核苷酸序列，如圖2及3中由不同圖樣(分別為點條及垂直線條)所指示。

實例8 經改造之腸病毒之基因改變

將於培養於28℃下之Vero細胞中培養20繼代後經基因改造之穩定之適於冷之溫度敏感型腸病毒(EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16)之完整基因組完全地定序及其各別核苷酸及胺基酸之與各個別基因中之初始源基因組序列(EV71：TLLβP20，但不包括經EV71基因型C5及CA16之各別P1區置換之P1區)之差異顯示於表5、6及7中。粗體且在圓括號中之編號係出於特定目的刻意使用所引起之改變。EV71：eTLLβP20之基因組與其初始基因組源序列間具有9處核苷酸差異(6處係經故意引入以產生供特異性限制核酸內切酶用之位點)及導致3處胺基酸改變(2處係引入的)(表5)。EV71：eTLLβP20之基因組中不會導致胺基酸改變之一種自發突變(A 2966 G)發生於VP1基因中。導致胺基酸改變(絲胺酸>白胺酸，S3L)之其他2種自發突變(C 754 T、C 3362 A)發生於VP4基因中。

EV71：TLLeC5之基因組與其初始基因組源序列之差異在於8個核苷酸及5個胺基酸(表6)。其中，僅2個核苷酸(C 3362 A、A 5044 T)及1個胺基酸(天冬醯胺酸>異白胺酸，N1433I)係歸因於自發突變。TLLeCA16之基因組與其初始基因組源序列之差異在於14個核苷酸及5個胺基酸(表7)。其中，7個核苷酸係歸因於自發突變，導致3處胺基酸改變。一種導致自蘇胺酸至丙胺酸(T156A)之胺基酸改變之自發核苷酸突變(A 1212 G)發生於VP2基因中。兩種導致自丙胺酸至纈胺酸(A465V)之胺基酸改變之自發突變(C 2140 T、G 2405 A)發生於VP3基因中。兩種發生於VP1基因中之自發突變(T 3341 C、G3344 C)不會導致任何胺基酸改變。然而，兩種發生於2A基因中之自發突變(C 3362 T、C 3424 G)導致自絲胺酸至半胱胺酸(S893C)之胺基酸改變。

實例9 經改造之腸病毒之表現型特徵

經基因修飾(EV71：eTLLβP20)及經改造之嵌合(EV71：TLLeC5及TLLeCA16)腸病毒於Vero細胞中保留如其初始親本病毒株(EV71：TLLβP20)般之適於冷之溫度敏感性生長特徵。與培養於37℃ 下之細胞相比，在培養於28℃下之Vero細胞中所有病毒株展現更有效率之複製(經感染細胞以較快速率達成完全CPE且在培養上清液中產生較高病毒效價)。類似於其初始親本病毒，如由不存在CPE及在培養10天後於經接種細胞中之病毒抗原檢測為陰性所指示，在培養於39.5℃下之Vero細胞中所有該等病毒株無法複製。藉由在盲目繼代培養各別所得培養上清液至培養於28℃、37℃及39.5℃下之Vero細胞之新培養物中後於經接種細胞中不存在CPE及病毒抗原之檢測為陰性，證實培養上清液中不存在病毒子代。

使用28℃及37℃之培養溫度來評估此三種經基因改造之適於冷之病毒株之病毒複製特徵及重複該等試驗至少4次。在培養於28℃之培養溫度之Vero細胞中繼代培養20次後，EV71：eTLLβP20分別耗時3及7天以引發培養於28℃及37℃下之經培養Vero細胞之單層中之完全CPE。當經滴定之培養物分別於28℃及37℃下培養時，EV71：eTLLβP20之效價為2.15×10⁷ CCID₅₀/ml及4.64×10⁶ CCID₅₀/ml(表8)。EV71：TLLeC5亦分別耗時3及7天以引起培養於28℃及37℃下之經培養Vero細胞之單層中之完全CPE。在經感染Vero細胞之培養上清液中於28℃之培養溫度下EV71：TLLeC5達成2.15×10⁸ CCID₅₀/ml之病毒效價及於37℃下達成2.15×10⁷ CCID₅₀/ml之效價(表9)。TLLeCA16分別耗時3及4天以引發培養於28℃及37℃下之經培養Vero細胞之單層中之完全CPE。TLLeCA16於28℃之培養溫度下達成4.64×10⁷ CCID₅₀/ml之病毒效價及於37℃下達成2.15×10⁶ CCID₅₀/ml之效價(表10)。總而言之，所有三種經基因改造之適於冷之病毒株需要較少天數來引起完全細胞死亡及達成於培養上清液中就培養於28℃下之經接種Vero細胞而言高約一個對數之病毒效價。

實例10 溫度相關生長敏感性之逆轉的試驗

藉由此三種經基因改造之適於冷之溫度敏感型病毒株於培養於37℃下之Vero細胞中之連續6次繼代培養來進行基於溫度相關生長敏感性之病毒表現型特徵之逆轉的評估。一旦經培養細胞達成完全CPE，則將每次於37℃下連續繼代培養之澄清培養上清液再接種於Vero細胞之新培養物中。衍生自培養於37℃之Vero細胞中之各個別繼代之病毒株之於28℃、37℃及39.5℃之培養溫度下就細胞死亡動力學及病毒效價而言之生長特徵顯示於表8、9、及10中。在培養於37℃之細胞中連續繼代培養3次後，在Vero細胞中於39.5℃之培養溫度下EV71：eTLLβP20無法產生出活性感染性顆粒(不含陽性免疫螢光染色的細胞)。在培養於37℃之細胞中連續繼代培養3次後，在Vero細胞中於39.5℃之培養溫度下EV71：TLLeC5亦無法產生出活性感染性顆粒。在培養於37℃之細胞中連續繼代培養2次後，在Vero細胞中於39.5℃之培養溫度下TLLeCA16無法產生出活性感染性顆粒(不含陽性免疫螢光染色的細胞)。

實例11 溫度逆轉試驗中EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16之基因組之突變

將在培養於37℃之Vero細胞中連續繼代培養6次後繼代3及6處之EV71：eTLLβP20、EV71：TLLeC5及TLLeCA16之完整基因組定序及分析基因突變。在Vero細胞中於37℃之培養溫度下連續繼代培養6次所得繼代3及6處之EV71：eTLLβP20、及EV71：TLLeC5之基因之各個別片段處之核苷酸及對應胺基酸突變之數目顯示於表11及12中。在繼代3處，發生於核苷酸位置3346(G 3346 A)之病毒2A基因中之逆轉突變為其野生型病毒基因組序列導致在EV71：eTLLβP20聚合蛋白質之胺基酸位置867處自精胺酸至麩醯胺酸(R867Q)之胺基酸改變。相同逆轉突變為其野生型病毒基因組序列維持於繼代6之EV71：eTLLβP20中。此外，缺失15個核苷酸導致缺失5個胺基酸及在於繼代6定序之EV71：eTLLβP20之基因組約58%(7/12)之VP1基因中發生胺基酸天冬醯胺酸改變為組胺酸(N667H)(表11)。令人感興趣地，發生於核苷酸位置3346(G 3346 A)之病毒2A基因中之相同逆轉突變為其野生型病毒基因組序列導致在於EV71：eTLLβP20聚合蛋白質中注意到的胺基酸位置867之自精胺酸至麩醯胺酸(R867Q)之胺基酸改變亦發生於繼代3及6之EV71：TLLeC5之一致基因組序列中。除了逆轉突變外，溫度逆轉研究中繼代3及6之EV71：TLLeC5之基因組序列在病毒2C基因(C 4566 T)中具有導致自組胺酸至離胺酸(H1274Y)之胺基酸改變的自發突變。藉由於定序其完整基因組時發生在核苷酸位置1212之核苷酸鳥嘌呤(G)或腺嘌呤(A)中任一者之混合群體在繼代3及6二者之TLLeCA16之一致基因組序列中未檢測到突變。將包含核苷酸序列之混合群體之PCR擴增產物選殖至質體pZErO^TM-2中且轉型至大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen)中。針對突變篩選大腸桿菌之23種所選選殖體之質體。23種選殖體中有13種保留鳥嘌呤殘基及10種選殖體具有帶有腺嘌呤殘基之質體然核苷酸突變不會導致病毒一致基因組之任何胺基酸改變。

於說明本發明(尤其以下申請專利範圍)中使用之術語「一」及「該」及類似指示詞應解釋為涵蓋單數及複數，除非另外於本文中指明或者內容明顯相衝突。除非另外註明，否則術語「包括」、「具有」、「包含」、及「含有」應解釋為開放式術語(亦即意指「包括，但不限於」)。除非本文另作指明，否則本文中所列舉之數值範圍僅欲充當個別地指示落在該範圍內之各個別數值之速記方法，及各個別數值經併入本說明書中，如同其於本文中個別地引用般。例如，若揭示範圍10至15，則亦揭示11、12、13、及14。除非另外於本文中指明或者內容明顯相衝突，否則述於本文中之所有方法可以任何適宜順序進行。除非另有聲明，否則使用任何及所有實例、或本文中提供之例示性語言(例如，「諸如」)僅欲更佳地闡述本發明而不會對本發明之範疇造成限制。不應將本說明書中之語言理解為指示任何未主張要素為實施本發明之基礎。

應瞭解本發明之方法及組合物可呈各種實施例形式併入，本文中僅揭示其中的數種。本文描述本發明之實施例，包括本發明者已知之實施本發明之最佳方式。熟習相關技術者在閱讀上述說明時當可明瞭該等實施例之變化形式。本發明者期望熟習相關技術者適當地使用該等變化形式，及本發明者意欲以除如本文所明確描述者外的方式實施本發明。據此，本發明包括為適用法律准許之本發明隨附申請專利範圍中所列舉標的之所有修改及等效物。此外，除非另外於本文中指明或者內容明顯相衝突，否則本發明涵蓋上述要素以其所有可能變化形式之任何組合。

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【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

1.食品工業發展研究所；104年09月24日；BCRC 970067

2.食品工業發展研究所；104年09月24日；BCRC 970068

3.食品工業發展研究所；104年09月24日；BCRC 970069

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

1.中國大陸；China Center for Type Culture Collection(CCTCC)；2014年05月30日；CCTCC V201414

2.中國大陸；China Center for Type Culture Collection(CCTCC)；2014年05月30日；CCTCC V201415

3.中國大陸；China Center for Type Culture Collection(CCTCC)；2014年05月30日；CCTCC V201416

<110> 新加坡商淡馬錫生命科學研究院公司

<120> 穩定之適於冷之溫度敏感型嵌合腸病毒之發展

<130> 2577-236TW

<150> US 62/011,406

<151> 2014-06-14

<160> 88

<170> PatentIn第3.5版

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<223> 寡核苷酸引物

<400> 78

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

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<210> 81

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 81

<210> 82

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸引物

<400> 82

<210> 83

<211> 7437

<212> DNA

<213> 腸病毒71，菌株EV71：TLLβP20

<400> 83

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<212> DNA

<213> 腸病毒71，菌株EV71：eTLLβP20

<400> 84

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<211> 2586

<212> DNA

<213> 腸病毒71，菌株C5

<400> 85

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<212> DNA

<213> 腸病毒71，菌株EV71：TLLeC5

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<211> 2586

<212> DNA

<213> 克沙奇病毒A16

<400> 87

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<211> 7439

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合病毒菌株TLLeCA16

<400> 88

Claims

一種適於冷之溫度敏感型病毒株，其係選自以下之群：食品工業發展研究所寄存編號BCRC 970067之病毒株EV71：eTLLβP20；食品工業發展研究所寄存編號BCRC 970068之病毒株EV71：TLLeC5；以及食品工業發展研究所寄存編號BCRC 970069之病毒株TLLeCA16。
如請求項1之適於冷之溫度敏感型病毒株，其中該病毒株係食品工業發展研究所寄存編號BCRC 970067之EV71：eTLLβP20。
如請求項1之適於冷之溫度敏感型病毒株，其中該病毒株係食品工業發展研究所寄存編號BCRC 970068之EV71：TLLeC5。
如請求項1之適於冷之溫度敏感型病毒株，其中該病毒株係食品工業發展研究所寄存編號BCRC 970069之TLLeCA16。
如請求項1至4中任一項之適於冷之溫度敏感型病毒株，其係用於引發個體中之保護性免疫反應。
如請求項1至4中任一項之適於冷之溫度敏感型病毒株，其係用於預防個體罹患與腸病毒71相關之疾病及/或與克沙奇病毒A16(Coxsackievirus A16)相關之疾病。
如請求項1至4中任一項之適於冷之溫度敏感型病毒株，其係用於受腸病毒71感染之個體及/或受克沙奇病毒A16感染之個體中延遲與腸病毒71相關之疾病及/或與克沙奇病毒A16相關之疾病之發作或減慢其速率。
一種包含一或多種如請求項1至4中任一項之適於冷之溫度敏感型病毒株之組合物。
如請求項8之組合物，其進一步包含食品工業發展研究所寄存編號BCRC 970064之適於冷之溫度敏感型腸病毒71病毒株EV71：TLLβP20。
如請求項8或9之組合物，其進一步包含醫藥上可接受之載劑。
如請求項8或9之組合物，其進一步包含佐劑。
如請求項8或9之組合物，其係疫苗。
如請求項12之組合物，其中該疫苗係口服活減毒疫苗。
如請求項12之組合物，其中該疫苗係滅活疫苗。
如請求項8或9之組合物，其係用於引發個體中之保護性免疫反應。
如請求項8或9之組合物，其係用於預防個體罹患與腸病毒71相關之疾病及/或與克沙奇病毒A16相關之疾病。
如請求項8或9之組合物，其係用於受腸病毒71感染之個體及/或受克沙奇病毒A16感染之個體中延遲與腸病毒71相關之疾病及/或與克沙奇病毒A16相關之疾病之發作或減慢其速率。
一種以如請求項1至4中任一項之適於冷之溫度敏感型病毒株或其滅活形式、或如請求項8至14中任一項之組合物於製造用於引發個體中保護性免疫反應之藥物上之用途。
一種以如請求項1至4中任一項之適於冷之溫度敏感型病毒株或其滅活形式、或如請求項8至14中任一項之組合物於製造用於預防個體罹患與腸病毒71相關之疾病及/或與克沙奇病毒A16相關之疾病之藥物上之用途。
一種以如請求項1至4中任一項之適於冷之溫度敏感型病毒株或其滅活形式、或如請求項8至14中任一項之組合物於製造用於受腸病毒71感染之個體及/或受克沙奇病毒A16感染之個體中延遲與腸病毒71相關之疾病及/或與克沙奇病毒A16相關之疾病之發作或減慢其速率之藥物上之用途。
一種用於為具有適於冷之溫度敏感型病毒株之個體進行免疫之套組，其包含如請求項1至4中任一項之適於冷之溫度敏感型病毒株或其滅活形式、或如請求項8至14中任一項之組合物、醫藥上可接受之載劑、及其用途之說明材料。
如請求項21之套組，其進一步包含施藥器。
一種製造疫苗之方法，其包括使用如請求項1至4中任一項之適於冷之溫度敏感型病毒株或其滅活形式。
一種製造疫苗之方法，其包括使用一或多種包含描述於SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：88之核苷酸序列之核酸。
如請求項24之方法，其進一步包括使用包含描述於SEQ ID NO：83之核苷酸序列之核酸。
一種如請求項1至4中任一項之適於冷之溫度敏感型病毒株或其滅活形式用於發展疫苗上之用途。
一種使用一或多種包含描述於SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：88之核苷酸序列之核酸於發展疫苗上之用途。
如請求項27之用途，其進一步包括使用包含描述於SEQ ID NO：83之核苷酸序列之核酸。
如請求項1至4中任一項之適於冷之溫度敏感型病毒株或其滅活形式，其係用於發展疫苗。
一種包含描述於SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：88之核苷酸序列之核酸，其係用於發展疫苗。
一種包含描述於SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：88之核苷酸序列之核酸。
一種包含如請求項31之核酸之病毒載體。