CN109106947A - 一种介导性ca16灭活疫苗、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种介导性CA16灭活疫苗,包括免疫量的CoxA16病毒灭活纯化抗原,还包括甘油、蔗糖、角鲨烯、Tween‑20和硫酸乙酰肝素。本发明提供了一种可用于制备经特定免疫模式进行免疫的介导性CA16灭活疫苗,该疫苗制品经细胞内化介导进入呼吸道粘膜细胞后,可刺激上皮细胞内天然免疫系统,促进DC系统及T/B细胞对病毒抗原的识别及特异性免疫系统的启动和分化。
Description
技术领域
本发明属于医学生物技术领域。具体地说,本发明涉及一种通过介导CoxA16病毒抗原进入呼吸道粘膜细胞的介导性CA16灭活疫苗及其免疫方法。
背景技术
柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A 16 Strain,CA16)作为肠道病毒家族的成员之一,在儿童常见的手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)的病原谱中具有重要意义。2008年,我国安徽省阜阳地区亦出现了较大规模的手足口病流行,而且感染者主要出现在婴幼儿,因此引起了社会各界的严重关切。对此,我国卫生部自2008年5月起,将手足口病正式列入法定报告的传染病种类之中。2009年,我国手足口病的病原体流行特征,由2008年的以EV71病毒感染为主,逐渐转变为EV71和CA16的共流行,并且这样的流行特征趋势有增无减。有数据表明,CA16病毒与EV71病毒引起的手足口病例比例已达该病例的80%以上。随着EV71灭活疫苗的上市应用,CA16病毒很可能成为儿童手足口病的主要病原。因此,CA16疫苗的研发与应用也明显具有重要的公共卫生意义。
近年来,随着相关研究工作的推进,对CA16疫苗的研究已取得多重的技术进步,但由于CA16病毒感染的病理学及相关免疫学机理仍不十分清楚,其产品迄今尚未取得实质性进展。我们前期有关CA16灭活疫苗的非人灵长类实验结果提示,常规的CA16灭活疫苗制备方法及常规免疫模式难以获得良好的免疫反应,尤其是在病毒攻击时未能表现有效的免疫临床保护效果。尽管这一动物模型的结果尚不能完全支持CA16病毒在人体内的感染与免疫机理,但深入优化和探讨CA16灭活疫苗制备方法及疫苗免疫模式,对该疫苗免疫学机理过程的进一步了解显然是十分必要的。
本发明所采用的CA16病毒灭活抗原,其毒种及其制备技术均具有自主知识产权。(中国专利号为CN201210328369.6,授权公告号为CN102839159B)
发明内容
本发明的目的在于克服现有的CA16灭活疫苗及免疫模式的不足,利用特定配方进行介导性CA16灭活疫苗的制备,其能够通过细胞内化介导进入呼吸道粘膜细胞,并刺激上皮细胞内天然免疫系统,募集并激活不同型别的天然淋巴细胞(Innate Lymphoid Cells,ILCs),协同DC细胞的抗原摄取和递呈。诱导完整有效的特异性免疫反应。
本发明技术方案的提出基于下述思路:
大量的人群流行病学和临床观察,以及我们前期的动物实验结果提示,CA16和EV71均可以通过人体呼吸系统导致感染,而呼吸道上皮组织作为具有天然免疫机能的器官,在机体抗病毒感染免疫反应的激活过程中能够发挥重要的作用。而近期受到人们广泛关注的天然淋巴细胞ILCs则是完成这一作用的主要成分之一。这类被分为三个型别(ILC1、ILC2、ILC3)的细胞群通常在上皮细胞产生的一类以TNFα因子家族成员为主的配体信号分子的刺激下激活,并通过表达特征性受体和配体发挥信号传递作用及非特异性炎症介导效应,以及机理尚不清楚的特异性免疫反应协调效应,这样一个系统的过程,形成了机体特异性抗病毒免疫反应的基础。
CA16病毒作为一种以人类为主要宿主的肠道病毒,可以感染包括呼吸道上皮细胞在内的人类的多种细胞。因此,基于该病毒能够通过呼吸道传播,我们在本发明实施之前首先关注了CA16病毒感染体外培养的人支气管上皮细胞16HBE的过程。在感染复数为0.1~0.2的情况下,CA16病毒可以引起16HBE细胞的典型细胞病变过程。伴随细胞逐渐肿胀、变圆,最终脱落这一过程的是病毒动力学增殖过程。对感染不同时间的细胞特定转录产物——即对ILCs具有激活信号分子功能的转录做了特异的q-RT-PCR检测结果表明,该上皮细胞在CA16病毒感染的早期,就可以上调其针对ILCs的炎性信号分子(见图1A-图1C)。这一结果提示,CA16感染气管内具有重要天然免疫启动作用的上皮细胞的过程,实际上是一个上调组织内激活天然免疫系统信号分子的阶段。
为了实现病毒抗原,而不是活病毒对机体天然免疫反应的刺激,并能够在小鼠模型上观察这一刺激对免疫系统的信号效应,我们利用灭活的CA16病毒抗原,与具有介导抗原颗粒进入细胞的类脂质配方混合后,实现了针对小鼠气管上皮细胞效率>50%的抗原颗粒内化。在此基础上,我们对已经介导CA16抗原颗粒进入的小鼠气管上皮细胞的相关信号分子的表达变化亦做了实时监测。结果表明,该细胞的CD160、GITRL、LIGHT、CD40L、TNF-α、IFN-λ、等免疫信号分子均表现出不同程度的上调(见图2A-图2B)。这一结果与CA16病毒感染人气管上皮细胞的结果相似,提示了我们使用抗原内化介导的方法也可以同样刺激小鼠气管上皮细胞的天然免疫分子信号系统。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现:
一种介导性CA16灭活疫苗,包括免疫量的CoxA16病毒灭活纯化抗原,还包括甘油、蔗糖、角鲨烯、Tween-20和硫酸乙酰肝素,所述的疫苗剂型为鼻腔免疫疫苗制剂。
每100~200μl疫苗中含有CoxA16病毒灭活纯化抗原200U。
所述的疫苗中,甘油的百分含量为3%(ml/ml),蔗糖的百分含量为3%(g/ml),角鲨烯的百分含量为1.5%(ml/ml),Tween-20的百分含量为0.5%(ml/ml),硫酸乙酰肝素的含量为50μg/剂量(100~200μl)。
所述的介导性CA16灭活疫苗,每100μl疫苗中含有如下组分:CA16病毒灭活纯化抗原200U,甘油3μl,蔗糖3μg,角鲨烯1.5μl,Tween-20 0.5μl及硫酸乙酰肝素50μg。
所述的CA16灭活疫苗的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)采用二倍体细胞KMB17株及CA16病毒GX-2K-D株,按照CA16灭活疫苗的生产及检定规程制备出质量合格的CA16病毒灭活纯化抗原;
2)将上述经灭活的CA16病毒纯化抗原,以磷酸缓冲液稀释,同时加入甘油、蔗糖、角鲨烯、Tween-20及硫酸乙酰肝素,得到的混合制剂即为所需的介导性CoxA16灭活疫苗成品。
所述的CA16灭活疫苗在制备防治CoxA16病毒引起的疾病的药物中的应用。
所述的CA16灭活疫苗的免疫方式是鼻腔免疫。
本申请中,
“甘油”在本申请的疫苗中的作用是:具有稳定溶液体系,介导抗原成分进入细胞的辅助作用。
“蔗糖”在本申请的疫苗中的作用是:作为稳定剂成分,具有缓解刺激和增加疫苗受种者对该剂型接受度的作用。
“角鲨烯”在本申请的疫苗中的作用是:具有作为脂质体能够介导抗原进入细胞的作用。
“Tween-20”在本申请的疫苗中的作用是:具有稳定抗原在溶液体系中的作用及辅助抗原进入细胞中的作用。
“硫酸乙酰肝素”在本申请的疫苗中的作用是:具有促进抗原刺激机体产生细胞免疫的作用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、提供了一种可用于制备经特定免疫模式进行免疫的介导性CA16灭活疫苗,该疫苗制品经细胞内化介导进入呼吸道粘膜细胞后,可刺激上皮细胞内天然免疫系统,促进DC系统及T/B细胞对病毒抗原的识别及特异性免疫系统的启动和分化。
2、提供了一种介导性CA16灭活疫苗以鼻喷方式进行的特定免疫方法,可刺激机体天然免疫系统募集并激活不同型别的ILCs,协同DC细胞的抗原摄取和递呈,能够使病毒抗原的刺激作用转化为天然免疫—特异性免疫的完整激活过程。
3、采用一种具有介导抗原颗粒进入细胞的类脂质(如角鲨烯)配方,实现了针对小鼠气管上皮细胞的效率>50%的CA16病毒抗原颗粒内化,及其对机体天然免疫反应的刺激,并在小鼠模型上观察这一刺激对免疫系统的信号效应,对已经介导CA16病毒抗原颗粒进入的小鼠气管上皮细胞的相关信号分子的表达变化所进行的实时监测结果表明,该细胞的CD160、GITRL、LIGHT、OC40L、TNF-α等免疫信号分子均表现出不同程度的上调(见图3A-图3B)。
4.在CA16灭活疫苗以常规免疫模式难以获得良好的免疫反应,尤其是在病毒攻击时未能表现有效的免疫临床保护效果的情况下,本发明所制备的介导性CA16灭活疫苗及免疫方法可诱导完整有效的天然免疫——特异性免疫反应,并出现DC细胞与CA16抗原的共定位(见图4A-图4C)。并诱导小鼠产生抗CA16病毒的血清中和抗体,同时表现出CTL的阳转(见图5A-图5C),分泌相应的细胞因子参与机体的免疫作用,使疫苗发挥最佳效果。
附图说明
图1A为16HBE细胞感染CA16病毒后48小时内的形态变化;
图1B为16HBE细胞感染CA16的动力学增殖曲线;
图1C为16HBE细胞感染CA16病毒后细胞内ILCs激活相关信号分子的表达变化;
图2A为CA16抗原在CP-M175细胞中内化效率的荧光检测(使用灰度软件对荧光强度进行检测);
图2B为CA16抗原内化后CP-M175细胞ILCs激活相关的信号分子表达变化;
图3A为CA16抗原在呼吸道组织中的分布(组织样品包括用CA16灭活疫苗免疫小鼠后第1,2,3天的口、鼻以及肺组织);
图3B为CA16抗原免疫的小鼠呼吸道组织中ILCs激活相关信号分子的表达;
图4A为CA16抗原免疫的小鼠的呼吸黏膜组织中,CA16抗原和ILC1以及ILC3的共焦荧光显微镜观察图像;
图4B为CA16抗原免疫的小鼠的呼吸黏膜组织中,ILC1激活分泌的的免疫分子的检测;
图4C为CA16抗原免疫的小鼠的呼吸黏膜组织中,CA16抗原和DC细胞的共聚焦荧光显微镜观察图像;
图5A为CA16灭活疫苗通过不同途径免疫小鼠后诱导的中和抗体滴度;
图5B为CA16灭活疫苗通过不同途径免疫小鼠后诱导的IFN-γ特异的免疫反应;
图5C为CA16灭活疫苗通过不疫途径免疫小鼠后乳鼠的保护效率检测(以CA16病毒攻击免疫后小鼠产下的乳鼠,并检测14天内乳鼠的生存率曲线)。
具体实施方式
通过借助以下实施例将更加详细地说明本发明的特点。需要指出的是,以下实施例仅仅是说明性的,本发明的保护范围并不受这些实施例的限制。
实施例中,
人二倍体细胞KMB17株:知识产权归中国医学科学院医学生物学研究所,本研究获得授权使用。
CA16病毒GX-20K-D株:保藏编号CGMCC No.6350,具体见申请人已经授权的专利,专利号为CN201210328369.6,授权公告号为CN102839159B。
实施例1 特定途径免疫用介导性CA16灭活疫苗的制备
采用人二倍体细胞KMB17株及具有自主知识产权的CA16病毒GX-20K-D株,按照CoxA16灭活疫苗的工艺技术及检定规程制备出质量合格的CoxA16病毒灭活纯化抗原。
将上述经灭活的CA16病毒纯化抗原,以磷酸缓冲液稀释,同时加入甘油、蔗糖、角鲨烯、Tween-20及硫酸乙酰肝素,得到的混合制剂即为所需的介导性CoxA16灭活疫苗成品。制备成特定途径免疫用介导性CA16灭活疫苗。每100μl该疫苗中含有CA16病毒灭活纯化抗原200U,甘油3μl,蔗糖3μg,角鲨烯1.5μl,Tween-20 0.5μl及硫酸乙酰肝素50μg。
实施例2 特定途径免疫用介导性CA16灭活疫苗鼻喷免疫方法
取配制好的特定途径免疫用介导性CA16灭活疫苗,经鼻腔喷雾法免疫Balb/c小鼠,可刺激该小鼠的天然免疫系统募集并激活不同型别的ILCs,协同DC细胞的抗原摄取和递呈,促进DC系统及T/B细胞对病毒抗原的识别及特异性免疫系统的启动和分化。同时,可诱导小鼠产生抗CA16病毒的血清中和抗体,并表现出CTL的阳转,进一步分泌相应的细胞因子参与机体的免疫作用,诱导完整有效的特异性免疫反应,使疫苗发挥最佳效果。
具体检测如下:
一、采用组织培养的方法对已经介导CA16抗原颗粒进入的小鼠气管上皮细胞CP-M175的相关信号分子的表达变化进行实时监测
方法:
利用能够表达GFP荧光蛋白的CA16重组病毒105CCID50(体积200ul)与lipofectin-2000转染缓冲液混合后(lipofectin-2000是一种多用途转染试剂,可在各种贴壁细胞和悬浮细胞系中提供高效转染。使用时参照产品说明书进行),加入生长于6孔板(二个孔)的小鼠气管上皮细胞CP-M175株(细胞数约为5x105/每孔),37℃培养24小时后,置于荧光显微镜下,确定转染细胞已经具有荧光表现后,计数200个细胞中表达荧光的细胞数,由此确定抗原进入细胞的转染效率。对已经介导CA16抗原颗粒进入的小鼠气管上皮细胞CP-M175的相关信号分子的表达变化进行实时监测。
结果:
CA16病毒灭活抗原颗粒经转染内化进入小鼠气管上皮细胞CP-M175后,细胞上调了ILCs激活相关信号分子的表达(见图2A-图2B,图2A-图2B显示该介导性CA16灭活疫苗病毒抗原颗粒经内化介导进入小鼠气管上皮细胞CP-M175后,细胞天然免疫ILCs激活相关信号分子的表达,并表现出上调的趋势。)。
图2A显示:使用灰度软件对CA16抗原在CP-M175细胞中内化效率的荧光强度进行检测的结果。
图2B显示:CA16抗原内化后CP-M175细胞ILCs激活相关的信号分子的表达变化,结果表明该细胞的CD160、GITRL、LIGHT、OC40L、TNF-α、IFN-α、IFN-β等免疫信号分子均表现出不同程度的上调。
结论:
对已经介导CA16抗原颗粒进入的小鼠气管上皮细胞CP-M175的相关信号分子的表达变化所进行的实时监测表明,CA16病毒灭活抗原以内化的方式进入小鼠气管上皮细胞CP-M175,可以上调ILCs激活相关信号分子的表达,刺激天然免疫系统募集并激活不同型别的ILCs,协同DC细胞的抗原摄取和递呈,促进DC系统及T/B细胞对病毒抗原的识别及特异性免疫系统的启动和分化。
二、在小鼠模型上观察CA16疫苗抗原刺激对免疫系统的信号效应,对已经介导CA16病毒抗原颗粒进入的小鼠呼吸道细胞的相关信号分子的表达变化进行实时监测
方法:
取配制好的特定途径免疫用介导性CA16灭活疫苗,经鼻腔喷雾法免疫Balb/c小鼠。随后分别在免疫后的第1,2,3天取小鼠口腔、鼻腔及肺组织样品,确定其质量后以细胞RNA提取溶剂TRNzol-A+溶解后用于定量的细胞天然免疫相关型号分子的RNA-PCR扩增检测(各具体引物序列见表-1),并以每100mg组织为单位确定其中各靶分子的mRNA拷贝数,对已经介导CA16病毒抗原颗粒进入的小鼠呼吸道细胞的相关信号分子的表达变化进行实时监测。
表1.细胞天然免疫相关信号分子RNA-PCR检测引物序列
4-1BBL F | AAGCCTCAGGTAGATGACT |
4-1BBL R | GAACGGTCCACTAACTTGT |
BTLA F | GCCAGGACAGGAGAGTTA |
BTLA R | CTTACACCAAGTCACATTAGG |
CD160 F | CCTGAGACCAACTTAGAACA |
CD160 R | AACACCAACTGAGATGACTT |
GITRL F | CCAAGGTGTCCAGAATGAA |
GITRL R | TGAGATGAACTCTTCCAACA |
IKKα F | TGGAAGAGACTGCTGACA |
IKKα R | ATGAAGAACACTTGCTGAGA |
IKKβ F | CTCCGAAGATACTTGAACCA |
IKKβ R | CGATGCGATGTCACTCAG |
LIGHT F | TTCTGAGCACCTACATTCC |
LIGHT R | CTTCTGACCAACCATTCCT |
LTα3 F | ACTGCCGCTTCCTCTATA |
LTα3 R | GTGTCATGTGGAGAACCT |
NIK F | AGCAACTGGAGATAGAACTG |
NIK R | CTGAGGCAGGAGAGGATT |
OC40L F | TGCTTCTGTGCTTCATCTAT |
OC40L R | ATCTGGTAACTGCTCCTCT |
RANKL F | TCACTCTGTCCTCTTGGTA |
RANKL R | CAGGTAATAGAAGCCATCTTG |
TAK F | CCATCACTTACACAGCAATC |
TAK R | CCTCACAGATACATACACAGA |
TLIA F | AATAAGCAACAACTGGTTCC |
TLIA R | ATTAGTCTGTCTCCTTCTTCC |
TNFα F | GTGGAACTGGCAGAAGAG |
TNFβ R | GAGAAGAGGCTGAGACATAG |
GAPDH F | GGTGAAGGTCGGTGTGAACG |
GAPDH R | CTCGCTCCTGGAAGATGGTG |
IFNα F | CTTCCTVAGACTCATAACCT |
IFNα R | AGTCCTTCCTGTCCTTCA |
IFNβ F | AACTCCACCAGCAGACAG |
IFNβ R | GAGAGCAGTTGAGGACATC |
结果:
通过小鼠模型,对已经介导CA16病毒抗原颗粒进入的小鼠呼吸道组织样品的病理组织学检测,以及小鼠呼吸道细胞的相关信号分子的表达变化进行实时监测的结果表明,介导性CA16灭活疫苗,经鼻腔喷雾法免疫Balb/c小鼠后,其抗原成分可分布于相应的呼吸道组织中,并引发相应的组织病理学改变,从而诱导呼吸道组织细胞的CD160、GITRL、LIGHT、OC40L、TNF-α、等免疫信号分子的表达呈现出不同程度的上调(见图3A-图3B,表示该介导性CA16灭活疫苗病毒抗原颗粒经小鼠鼻腔免疫后,在呼吸道组织中分布较广,并能够刺激这些组织中与天然免疫系统相关信号分子的上调)。
图3A显示:CA16抗原在呼吸道组织中的分布(组织样品包括用CA16灭活疫苗免疫小鼠后第1,2,3天的口、鼻以及肺组织)。该介导性CA16灭活疫苗病毒抗原颗粒经小鼠鼻腔免疫后,在呼吸道组织中分布较广。
图3B显示:介导性CA16灭活疫苗免疫的小鼠在其呼吸道组织中ILCs激活相关信号分子的表达上调。
结论:
特定途径免疫用介导性CA16灭活疫苗,经鼻腔喷雾法免疫Balb/c小鼠后,可刺激小鼠呼吸道组织细胞对免疫系统的信号效应,并诱导呼吸道组织细胞免疫信号分子的表达上调,刺激天然免疫系统募集并激活不同型别的ILCs,协同DC细胞的抗原摄取和递呈,促进DC系统及T/B细胞对病毒抗原的识别及特异性免疫系统的启动和分化。
三、介导性CA16灭活疫苗经小鼠鼻腔免疫后的效果检测
方法:
1、通过小鼠鼻腔途径导入介导性CA16疫苗抗原旨在模拟病毒自然感染模式以刺激免疫系统,并寻找到该CA16抗原与天然免疫系统的相关关系。因此,我们在对该病毒抗原进入气管粘膜上皮细胞后能够被细胞内天然免疫相关的模式识别受体(Patternrecognizing receptor,PRR)识别并引起相关基因反应的认识基础上,用共聚焦荧光显微镜对ILCs及DC与CA16抗原的荧光共定位进行观察,对ILCs活化表达产物的部分细胞因子进行组织化学检查,还通过对DC表面标志性分子CD116+/CD103+与CA16抗原的共定位进行观察,以确定CA16抗原与ILCs及DC是否具有共定位关系,并激活ILCs分泌其它免疫分子。
2、在经小鼠鼻腔途径导入介导性CA16疫苗抗原免疫模式已有效激活呼吸道粘膜组织中的ILCs及天然免疫系统的基础上,进一步对这一抗原免疫过程在小鼠体内诱导免疫反应的指标进行分析,以评价小鼠鼻腔途径导入CA16疫苗抗原免疫模式可诱导完整有效的天然免疫——特异性免疫反应的特性。
结果:
(1)用共聚焦荧光显微镜对ILCs及DC与CA16抗原的荧光共定位进行观察的结果表明,CA16抗原在呼吸道粘膜组织中和ILC1以及ILC3具有共定位关系。
图4A显示:CA16抗原免疫的小鼠的呼吸道粘膜组织中,共聚焦荧光显微镜观察结果显示了CA16抗原和ILC1以及ILC3共定位关系。
图4B显示:CA16抗原免疫的小鼠的呼吸道粘膜组织中,通过组织化学方法的检测,确定了ILC1激活所分泌的部分免疫分子。
图4C显示:CA16抗原免疫的小鼠的呼吸道粘膜组织中,通过对DC表面标志性分子CD116+/CD103+与CA16抗原的共聚焦荧光显微观察所显示的CA16抗原和DC细胞的共定位关系。
(2)对经小鼠鼻腔途径导入CA16疫苗抗原免疫模式在小鼠体内诱导免疫反应的指标进行分析的结果显示,单纯一次或二次鼻腔免疫均可以诱导小鼠产生抗CA16的血清中和抗体。而对小鼠CTL反应的Elispot检测结果也表明,无论一次或二次免疫刺激,均可检测到明显的IFN-γ特异性细胞免疫反应的阳转。同时,还对以CA16病毒攻击免疫后小鼠产下的乳鼠进行保护效率的检测。
图5A显示:介导性CA16灭活疫苗通过不同途径免疫小鼠后,对其诱导产生的中和抗体效价进行检测。结果表明,单纯一次或二次鼻腔免疫均可以诱导小鼠产生抗CA16的血清中和抗体,其中以二次免疫后的8周可诱导产生相对较高的中和抗体水平。
图5B显示:介导性CA16灭活疫苗通过不同途径免疫小鼠后,对其所诱导的IFN-γ特异性细胞免疫反应进行检测。结果表明,无论一次或二次免疫刺激,均可诱导产生明显的IFN-γ特异性细胞免疫反应的阳转。
图5C显示:介导性CA16灭活疫苗通过不疫途径免疫小鼠后,再以CA16病毒攻击免疫后小鼠产下的乳鼠,检测14天内乳鼠的生存率曲线。结果表明,该疫苗对乳鼠有明显的保护效果。
结论:本发明所制备的介导性CA16灭活疫苗及免疫方法可诱导完整有效的天然免疫——特异性免疫反应,并出现DC细胞与CA16抗原的共定位(见图4A-图4C,表示该介导性CA16灭活疫苗病毒抗原颗粒进入呼吸道粘膜组织后,可明显激活ILCs系统,并出现DC细胞与CoxA16抗原的共定位)。并诱导小鼠产生抗CA16病毒的血清中和抗体,同时表现出CTL的阳转(见图5A-C,表示该介导性CA16灭活疫苗病毒抗原颗粒经小鼠鼻腔免疫后的免疫反应评价表明,其可以诱导小鼠产生抗CA16病毒的血清中和抗体,同时表现出CTL的阳转),分泌相应的细胞因子参与机体的免疫作用,使疫苗发挥最佳效果。
Claims (7)
1.一种介导性CA16灭活疫苗,其特征在于,包括免疫量的CoxA16病毒灭活纯化抗原,还包括甘油、蔗糖、角鲨烯、Tween-20和硫酸乙酰肝素,所述的疫苗剂型为鼻腔免疫疫苗制剂。
2.根据权利要求1所述的介导性CA16灭活疫苗,其特征在于,每100~200μl疫苗中含有CoxA16病毒灭活纯化抗原 200U。
3.根据权利要求1所述的介导性CA16灭活疫苗,其特征在于,在所述的疫苗中,甘油的百分含量为3%(ml/ml),蔗糖的百分含量为3%(g/ml),角鲨烯的百分含量为 1.5%(ml/ml),Tween-20的百分含量为0.5%(ml/ml),硫酸乙酰肝素的含量为50μg/剂量。
4.根据权利要求1所述的介导性CA16灭活疫苗,其特征在于,每100μl疫苗中含有如下组分:CA16病毒灭活纯化抗原200U,甘油3μl,蔗糖3μg,角鲨烯1.5μl,Tween-20 0.5μl及硫酸乙酰肝素50μg。
5.如权利要求1-4任意一项所述的CA16灭活疫苗的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)采用二倍体细胞KMB17株及CA16病毒GX-2K-D株,按照CA16灭活疫苗的生产及检定规程制备出质量合格的CA16病毒灭活纯化抗原;
2)将上述经灭活的CA16病毒纯化抗原,以磷酸缓冲液稀释,同时加入甘油、蔗糖、角鲨烯、Tween-20及硫酸乙酰肝素,得到的混合制剂即为所需的介导性CoxA16灭活疫苗成品。
6.如权利要求1-4任意一项所述的CA16灭活疫苗在制备防治CoxA16病毒引起的疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的CA16灭活疫苗的免疫方式是鼻腔免疫。
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