CN105311000A - 自溶性微针透皮贴片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于经皮给药技术领域中的自溶性微针,特别涉及自溶性微针透皮贴片及其制备方法。本发明通过将内源性的寡聚透明质酸和/或低分子量硫酸乙酰肝素同时作为微针基质材料和疫苗佐剂制备自溶性微针,并将疫苗负载于其中,从而获得本发明的自溶性微针疫苗透皮贴片。本发明的自溶性微针透皮贴片可实现疫苗的有效经皮免疫,增强疫苗的体液免疫应答。并且与现有肌肉注射免疫以及其他自溶性微针经皮免疫相比,能够显著增强疫苗的细胞免疫应答。
Description
技术领域
本发明属于经皮给药技术领域中的自溶性微针,特别涉及自溶性微针透皮贴片及其制备方法。
背景技术
目前大多数的疫苗都是采用皮下或肌肉注射的方式进行接种,存在疼痛、需专业人员操作、疫苗的药代动力学曲线不理想、注射针的重复使用会引发传染病的传播等问题。因此顺应性好、方便、高效、安全的新型疫苗递送系统的研究一直是疫苗领域的热点。经皮免疫(Transcutaneousimmunization,TCI)是指局部应用疫苗抗原和(或)佐剂于皮肤表面以引起免疫反应。皮肤是疫苗免疫的一个理想部位,其中含有比肌肉、皮下组织中更丰富的抗原呈递细胞(Antigenpresentingcells,APCs)。表皮中富含的朗格罕斯细胞(Langerhanscells,LCs)及真皮中富含的树突状细胞(dermaldendriticcells.dDCs),形成独特强有力的免疫识别、应答和效应网络。但是,传统的透皮技术仅适用于脂溶性小分子药物,生物大分子药物的经皮给药难以实现。因此经皮免疫的关键之处在于如何将足够量的疫苗抗原和佐剂透过角质层传递至皮肤中的免疫细胞。
基于BioMEMS技术开发的微针阵列经皮给药技术是药物释放领域的重大技术突破,它结合了注射和经皮给药两大优势,为经皮免疫提供了新的可能性。微针(Microneedles)长度小于1mm,其穿刺皮肤可产生微米级药物运送通道,允许大分子通过。控制微针的高度可使其穿刺深度不接触到神经末梢,无痛无血就可使生物大分子实现皮内释放。自溶性微针(self-dissolvingmicroneedles)是近几年来出现的一种新型微针。其采用可溶于水的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)等高分子材料作为微针的基质,药物分散在基质中,微针刺入皮肤后可溶解于皮肤组织液中,从而被机体吸收。与早期的硅或金属微针相比,自溶性微针应用于皮肤后能够溶解于其中,无需后续的处置和回收过程,而且降低了材料和工艺的成本。另外,由于采用医用材料,使最终获得药监部门批准的可能性大大增加。因此,自溶性微针已成为当今微针技术的发展趋势。
目前,研究表明微针介导的疫苗经皮免疫倾向于诱导更强的辅助性T细胞2(Th2)型体液免疫应答,对许多疾病而言,辅助性T细胞1(Th1)型的细胞免疫应答也是必须的(J.Control.Release,2010,147:326–332;PlosOne,2009,4:47-73)。因此需要选择合适的佐剂来提高经皮免疫所诱导的细胞免疫反应应答,实现体液免疫反应和细胞免疫反应的平衡。目前自溶性微针普遍采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、聚乙烯醇(PVA)等作为基质,其本身不具备佐剂的作用,佐剂的添加来自其他外源性材料。额外添加的佐剂会带来成本增加以及微针的成型性和机械强度变差的问题。此外,目前常用的佐剂包括铝佐剂、脂质体、弗氏佐剂、粘膜免疫佐剂、CpG序列、细胞因子以及纳米粒子佐剂,但是上市的人用疫苗佐剂经美国FDA批准的只有铝佐剂。铝佐剂主要诱导体液免疫应答,而细胞免疫很弱,无法解决经皮免疫中细胞免疫弱的问题。新型疫苗递送系统的研究开发致力于解决上述问题,达到有效、安全、稳定、经济的目的。
危险信号模式理论为我们提供了全新的视野。PollyMatzinger于1994年提出危险信号模式理论,在该模式中,免疫系统的功能是参与识别危险信号分子与非危险信号分子。细胞损伤释放的危险信号分子可以激活APC进而有效的激活T/B细胞产生相应的免疫应答。内源性危险信号具有交叉递呈抗原,诱导细胞免疫的特性,提示内源性危险信号可作为疫苗佐剂诱导特异性的细胞免疫应答。
KAScheibner等发现高分子量透明质酸的降解片段即低分子量透明质酸是一个内源性危险信号(theJournalofImmunology,2006,177:1272-1281)。当机体组织受损,高分子量透明质酸(分子量200万~600万)在氧自由基以及酶的作用下解聚为低分子量透明质酸(分子量20万)。低分子量透明质酸与TLR-2作用后,以依赖于MyD88/IL-1R相关激酶、TNFR相关因子-6、蛋白激酶Cζ、NF-κB的方式进行信号传导,激活机体的天然免疫应答;高分子量透明质酸则抑制TLR-2的信号传导。透明质酸是细胞外基质的重要成分,它是构成皮肤、玻璃体关节滑液和软骨组织的重要成分,具有独特的理化性质和生物学功能。透明质酸中的重复二糖单元在所有物种和组织中都是一致的,因此不导致透明质酸分子自身的免疫排斥。低分子量透明质酸(分子量<100万)是透明质酸的降解产物,具有完整的透明质酸结构,生物活性高,无毒副作用,目前主要在各类化妆品中用于保湿、抗衰老、晒后修复等。研究结果表明,寡聚透明质酸(分子量<10,000)能够明显增强灭活HAV抗原的免疫应答,具有强的免疫佐剂作用,其免疫佐剂效应优于铝佐剂(细胞与分子免疫学杂志,2008,24:183-185)。
GeoffreyBJ等发现(theJournalofImmunology,2002,168:5233-5239),可溶性硫酸肝素利用TLR4激活树突状细胞。硫酸肝素是一种酸性多糖,位于细胞膜和细胞外基质。硫酸肝素的降解产物,即低分子量硫酸肝素,能够活化树突状细胞。目前,低分子量硫酸乙酰肝素被认为是一种新型抗血栓和抗肿瘤转移药物,具有很强的抗血栓和抗肿瘤活性,调节免疫功能和调血脂、抗动脉粥样硬化等作用,无明显毒副作用。研究结果表明,低分子量硫酸乙酰肝素与乙肝表面抗原混合后,经鼻腔、肌肉及皮下注射3种途径免疫小鼠,既能有效增强特异性体液免疫应答,又能显著诱导CTL细胞免疫效应,是一种优于铝佐剂的潜在人用疫苗佐剂(中国生物制品学杂志,2011,24:5-9)。
发明内容
本发明的目的之一是克服现有的注射接种疫苗的缺点,提供一种适合于经皮免疫的自溶性微针疫苗透皮贴片,从而实现顺应性好、方便、高效、安全的疫苗递送。
本发明的目的之二是提供一种自溶性微针疫苗透皮贴片的制备方法。
本发明是将内源性的寡聚透明质酸和/或低分子量的硫酸乙酰肝素同时作为自溶性微针透皮贴片中的微针基质材料和疫苗佐剂,不用添加外源性佐剂来增强抗原的免疫原性,解决了现有经皮免疫技术难以诱导Th1型细胞免疫的问题。
本发明的自溶性微针透皮贴片是由微针基质材料、疫苗、疫苗佐剂和疫苗保护剂构成,其中,所述的微针基质材料和疫苗佐剂均为寡聚透明质酸、低分子量的硫酸乙酰肝素或其组合。
根据本发明的一种实施方式,其中,疫苗在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.001%~10%,疫苗保护剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.01%~30%,微针基质材料和疫苗佐剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的60%~99.98%。优选地,疫苗在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.01%~1%,疫苗保护剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.1%~20%,微针基质材料和疫苗佐剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的80%~99.8%。
所述的疫苗保护剂选自甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精、人血清白蛋白、明胶、精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-络氨酸、苯丙氨酸中的至少一种。优选地,所述的疫苗保护剂选自甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精中的至少一种。进一步优选地,所述的疫苗保护剂选自蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精中的至少一种。
本发明的自溶性微针透皮贴片中的寡聚透明质酸和/或低分子量的硫酸乙酰肝素同时作为微针基质材料和疫苗佐剂使用。与分子量较大的透明质酸和硫酸乙酰肝素相比,分子量小于10,000的寡聚透明质酸和分子量小于10,000的低分子量的硫酸乙酰肝素具有更好的佐剂作用,因此本发明中采用重均分子量在10,000以内的寡聚透明质酸和重均分子量在10,000以内的低分子量的硫酸乙酰肝素。作为微针基质材料而言,寡聚透明质酸和低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量越小,制得的微针硬度越强;重均分子量越大,微针的机械强度及韧性越强。因此寡聚透明质酸和低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量越小,用于刺入皮肤的微针越硬,越容易刺入皮肤,但是机械强度也随之降低,保存及刺入皮肤时容易折断。由此,本发明优选使用的是寡聚透明质酸的重均分子量的范围是5000<重均分子量<10,000,低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量的范围是4000<重均分子量<10,000。
根据本发明的一种实施方式,所述的自溶性微针透皮贴片的规格为每平方厘米含有16~484根微针,微针的高度在150~1000微米之间,针尖的直径在100纳米~20微米之间,微针的最大截面的锥角是20~60度。优选地,所述的自溶性微针透皮贴片的规格为每平方厘米含有36~256根微针,微针的高度为300~800微米,针尖的直径为500纳米~10微米,微针的最大截面的锥角是30~50度。所述的自溶性微针透皮贴片中的每根微针的截面形状是圆锥形或多面锥形。上述的自溶性微针透皮贴片的形状和规格赋予其较好的机械强度,刺穿皮肤时不易断裂。
根据本发明的一种实施方式,所述的疫苗可以选自减毒活疫苗、亚单位疫苗、多糖-蛋白质偶联疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗中的一种。
本发明中所述的减毒活疫苗是将病原微生物(细菌或病毒)在人工训育的条件下,促使病原微生物产生定向变异,使其极大程度地丧失致病性,但仍保留一定的剩余毒力、免疫原性和繁衍能力。优先选自麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗、卡介苗、乙脑减毒活疫苗、手足口疫苗中的一种。
本发明中所述的亚单位疫苗是从细菌或病毒培养物中,以生物化学和物理方法提取纯化有效特异性抗原制成的疫苗,或者是通过基因工程菌表达纯化有效特异性抗原制成的疫苗。优先选用乙肝疫苗或流感疫苗。
本发明中所述的多糖-蛋白质偶联疫苗是由长链糖分子构成,如细菌的多糖荚膜。优先选自肺炎球菌疫苗、A群流脑疫苗、A+C群流脑疫苗中的一种。
本发明中所述的DNA疫苗是将编码某一种病原生物特异抗原的基因插入到DNA载体上,获得的具有疫苗性质的DNA疫苗。优先选择表达乙型肝炎表面抗原基因(S)的DNA疫苗。
本发明中所述的病毒载体疫苗是将遗传改造的重组病毒作为载体,再从某一病原生物中获得一段特定的基因,将获得的一段特定的基因插入到重组病毒载体中,获得的具有疫苗性质的重组活病毒疫苗。所述的重组活病毒疫苗优先选用痘病毒载体疫苗或腺病毒载体疫苗。所述的痘病毒载体疫苗优先选用表达乙型肝炎表面抗原基因(S)的痘病毒载体疫苗;所述的腺病毒载体疫苗优先选用表达乙型肝炎表面抗原基因(S)的腺病毒载体疫苗。
本发明的自溶性微针透皮贴片的制备方法包括以下步骤:
(1)制备含有疫苗和疫苗保护剂的水溶液;
(2)制备含有微针基质材料和疫苗佐剂的水溶液;
(3)将步骤(1)制备的含有疫苗和疫苗保护剂的水溶液浇注到含有微孔阵列的模具上;使步骤(1)制备的含有疫苗和疫苗保护剂的水溶液填充到模具上的微孔中;干燥浇注的含有疫苗和疫苗保护剂的水溶液;
(4)将步骤(2)制备的含有微针基质材料和疫苗佐剂的水溶液浇注到步骤(3)干燥后的模具上;使步骤(2)制备的含有微针基质材料和疫苗佐剂的水溶液填充到含有疫苗和疫苗保护剂的水溶液干燥后塌陷出的微孔中;干燥浇注的含有微针基质材料和疫苗佐剂的水溶液,在含有微孔阵列的模具中得到自溶性微针透皮贴片;从所述的模具上剥离干燥后的自溶性微针透皮贴片。
所述的含有微孔阵列的模具是由聚二甲基硅氧烷制备而成的板,其每平方厘米表面含有16~484个微孔阵列(优选地,每平方厘米表面含有36~256个微孔阵列),微孔的高度在150~1000微米之间(优选地,微孔的高度为300~800微米),孔尖的直径在100纳米~20微米之间(优选地,孔尖的直径为500纳米~10微米),微孔的最大截面的锥角是20~60度(优选地,微孔的最大截面的锥角是30~50度)。
所述的每个微孔的截面形状是圆锥形或多面锥形。
所述的步骤(3)和步骤(4)可以通过离心力或压力实施。
所述的含有疫苗和疫苗保护剂的水溶液的配制及使用,是按照得到的疫苗在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.001%~10%,疫苗保护剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.01%~30%进行配制及使用(优选地,是按照得到的疫苗在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.01%~1%,疫苗保护剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.1%~20%进行配制及使用)。
所述的含有微针基质材料和疫苗佐剂的水溶液的配制及使用,是按照得到的微针基质材料和疫苗佐剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的60%~99.98%进行配制及使用(优选地,是按照得到的微针基质材料和疫苗佐剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的80%~99.8%进行配制及使用)。
本发明通过将内源性的寡聚透明质酸和/或低分子量硫酸乙酰肝素同时作为微针基质材料和疫苗佐剂制备自溶性微针,并将疫苗负载于其中,从而获得本发明的自溶性微针疫苗透皮贴片。本发明的自溶性微针透皮贴片可实现疫苗的有效经皮免疫,增强疫苗的体液免疫应答。并且与现有肌肉注射免疫以及其他自溶性微针经皮免疫相比,能够显著增强疫苗的细胞免疫应答。本发明与现有技术相比具有如下优点和效果:1)与注射免疫相比,微针作用于皮肤无痛感,不会留下感染点,可自行接种,无需专业人员操作;2)寡聚透明质酸和/或低分子量硫酸乙酰肝素作为基质材料的同时又作为佐剂,避免了佐剂的额外添加带来的成本增加以及微针的成型性和机械强度变差的问题;3)寡聚透明质酸和/或低分子量硫酸乙酰肝素是内源性物质,在免疫剂量范围内是安全可靠的;4)寡聚透明质酸和/或低分子量硫酸乙酰肝素作为疫苗佐剂,不仅能诱导抗原特异性的体液免疫应答,而且能诱导细胞免疫应答,明显优于铝佐剂。
附图说明
图1.本发明实施例1的三棱锥形自溶性微针。
图2.本发明实施例2的圆锥形自溶性微针。
图3.本发明实施例4的自溶性微针硬度测试。
图4.本发明实施例5的负载乙肝表面抗原的寡聚透明质酸微针经皮免疫诱导的血清抗-HBsIgG水平。
图5.本发明实施例6的负载乙肝DNA疫苗VR-S2S的低分子量的硫酸乙酰肝素微针经皮免疫诱导的血清抗-HBsIgG水平。
图6.本发明实施例7的负载重组腺病毒载体乙肝疫苗rMVA-E4的寡聚透明质酸/低分子量的硫酸乙酰肝素微针经皮免疫诱导的血清抗-HBsIgG水平。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求作进一步的调整,未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例1制作以乙肝表面抗原HBsAg为代表的亚单位疫苗自溶性微针透皮贴片
(1)模具的制备:依托表面有36个(6×6行)高约650微米的微针,微针的最大截面的锥角为35度,底座面积为0.5cm×0.5cm的四棱锥形不锈钢母模模具,取预聚合的聚二甲基硅氧烷10克和交联剂1克的混合物(SYLGARD184,siliconeelastomer,Dowcorning)并覆盖在母模模具上,在温度为80℃下放置30分钟左右,得到表面具有与所述的母模模具上微针针体的形状和数量相适配的所需数量的针孔的模具;
(2)将5毫克负载有5微克台盘兰(使用台盘兰是为了将目标药物在自溶性微针中的分布可视化)的HBsAg的PBS溶液与5毫克10重量%的海藻糖溶液混合均匀,将上述混合溶液覆盖到步骤(1)得到的表面有针孔的模具中,在封闭容器中加2个大气压10分钟,使所述的溶液进入到针孔中,将上述模具放于干燥器中,4℃条件下晾干;
(3)将寡聚透明质酸按照45重量%溶解到水中,作为基质材料制作液,然后将0.1克该基质材料制作液倒入步骤(2)干燥后得到的负载有台盘兰、HBsAg与海藻糖的塌陷出的针孔中,置于密闭容器中,在模具上方施加2个大气压,维持10分钟,使所述的针孔中残存的空气溢出;然后将覆盖有基质材料制作液的模具于干燥器中4℃条件下晾干,将干燥后的自溶性微针疫苗贴片取下,得到含寡聚透明质酸的自溶性微针疫苗贴片(如图1所示),自溶性微针针体的高度是650微米,针尖的角度是35度;其中台盘兰基本分布在每一根微针的针体部分,背衬层基本不含有台盘兰。所得的自溶性微针疫苗贴片中含疫苗5微克,疫苗保护剂(海藻糖)0.5毫克,微针基质材料(寡聚透明质酸)45毫克。
本实施例中选用的寡聚透明质酸的重均分子量为5000,由山东福瑞达生物医药有限公司提供。本实施例中使用的乙肝表面抗原由大连汉信生物制药有限公司提供。
实施例2制作以表达乙型肝炎表面抗原基因(S)的DNA疫苗VR-S2S为代表的DNA疫苗自溶性微针透皮贴片
(1)模具的制备:依托表面有81个(9×9行)高约500微米的微针,微针的最大截面的锥角为30度,底座面积为0.5cm×0.5cm的圆锥形不锈钢母模模具,取预聚合的聚二甲基硅氧烷10克和交联剂1克的混合物(SYLGARD184,siliconeelastomer,Dowcorning)并覆盖在母模模具上,在温度为80℃下放置30分钟左右,得到表面具有与所述的母模模具上微针针体的形状和数量相适配的所需数量的针孔的模具;
(2)将10毫克负载有10微克台盘兰(使用台盘兰是为了将目标药物在自溶性微针中的分布可视化)的VR-S2S的PBS溶液与10毫克20重量%的海藻糖溶液混合均匀,将上述溶液覆盖到步骤(1)得到的表面有针孔的模具中,在封闭容器中加2个大气压10分钟,使针体制作液进入到所述的针孔中,将上述模具放于干燥器中,4℃条件下晾干;
(3)将低分子量的硫酸乙酰肝素按照50重量%溶解到水中,作为基质材料制作液,然后将0.02克该基质材料制作液倒入步骤(2)干燥后得到的负载有台盘兰、VR-S2S与海藻糖的塌陷出的针孔中,置于密闭容器中,在模具上方施加2个大气压,维持10分钟,使所述的针孔中残存的空气溢出;然后将覆盖有基质材料制作液的模具于干燥器中4℃条件下晾干,将干燥后的自溶性微针疫苗贴片取下,得到含有低分子量硫酸乙酰肝素的自溶性微针疫苗透皮贴片(如图2所示),自溶性微针针体的高度是500微米,针尖的角度是30度,针尖直径是5微米;其中台盘兰基本分布在每一根微针的针体部分,背衬层基本不含有台盘兰。所得的自溶性微针疫苗贴片中含疫苗10微克,疫苗保护剂(海藻糖)2毫克,微针基质材料(寡聚透明质酸)10毫克。
本实施例中选用的低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量为4000,由山东福瑞达生物化工有限公司提供。本实施例中使用的表达乙型肝炎表面抗原基因(S)的DNA疫苗VR-S2S由解放军302医院提供。
实施例3制作以表达乙型肝炎表面抗原基因(S)的腺病毒载体疫苗rMVA-E4为代表的病毒载体疫苗自溶性微针透皮贴片
(1)模具的制备:依托表面有484个(22×22行)高约300微米的微针,微针的最大截面的锥角是45度,底座面积为1cm×1cm的八棱锥形不锈钢母模模具,取预聚合的聚二甲基硅氧烷10克和交联剂1克的混合物(SYLGARD184,siliconeelastomer,Dowcorning)并覆盖在母模模具上,在温度为80℃下放置30分钟左右,得到表面具有与所述的母模模具上微针针体的形状和数量相适配的所需数量的针孔的模具;
(2)将20毫克负载有200微克rMVA-E4的PBS溶液与20毫克30重量%的海藻糖溶液混合均匀,将上述溶液覆盖到步骤(1)得到的表面有针孔的模具中,在封闭容器中加2个大气压10分钟,使针体制作液进入到所述的针孔中,将上述模具放于干燥器中,4℃条件下晾干;
(3)将低分子量的硫酸乙酰肝素、寡聚透明质酸和海藻糖分别按照20重量%、20重量%,10重量%溶解到水中,作为含疫苗保护剂的基质材料制作液,然后将0.1克该制作液倒入步骤(2)得到的负载有疫苗的模具中,置于密闭容器中,在模具上方施加2个大气压,维持10分钟,使所述的针孔中残存的空气溢出;然后将覆盖有基质材料制作液的模具于干燥器中4℃条件下晾干,将干燥后的自溶性微针疫苗贴片取下,得到含有低分子量的硫酸乙酰肝素和寡聚透明质酸的自溶性微针疫苗透皮贴片,自溶性微针针体的高度是300微米,针尖的角度是45度,针尖直径是1微米。自溶性微针疫苗贴片中含疫苗200微克,疫苗保护剂(海藻糖)16毫克,寡聚透明质酸和低分子量的硫酸乙酰肝素各20毫克。
本实施例中选用的寡聚透明质酸的重均分子量为10,000、低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量为10,000,由山东福瑞达生物化工有限公司提供。本实施例中使用表达乙型肝炎表面抗原基因(S)的腺病毒载体疫苗rMVA-E4由解放军302医院提供。
实施例4
微针性能的测试:使用压力测试平台测试实施例1中制备的自溶性微针针尖可以承受的压力。以微针经受作用力后微针针尖有轻微变化,但是仍能基本刺穿猪耳朵皮肤角质层(角质层被刺穿时,台盘兰染色呈蓝色)时微针承受的压力作为自溶性微针针尖可以承受的最大压力。结果如图3所示,当压力增大到4N时微针最尖端开始出现轻微损害,而压力为2N时100%的针孔都被台盘兰染色,表明只需2N的力即可刺穿皮肤,这说明该自溶性微针贴片具有较高的硬度和刺穿皮肤性能。
比较例1
按照实施例1的制作方法,把寡聚透明质酸换成PVP-k30制作乙肝表面抗原HBsAg自溶性微针透皮贴片。PVP-k30由北京国人逸康科技有限公司提供,其余试剂与实施例1相同。
比较例2
按照实施例2的制作方法,把低分子量的硫酸乙酰肝素换成PVP-k30制作乙肝DNA疫苗VR-S2S自溶性微针透皮贴片。PVP-k30由北京国人逸康科技有限公司提供,其余试剂与实施例2相同。
比较例3
按照实施例3的制作方法,把低分子量的硫酸乙酰肝素和寡聚透明质酸的混合物换成PVP-k30制作重组腺病毒载体乙肝疫苗rMVA-E4自溶性微针透皮贴片。PVP-k30由北京国人逸康科技有限公司提供,其余试剂与实施例3相同。
比较例4
按照实施例1的制作方法,把寡聚透明质酸(重均分子量4000)换成高分子量透明质酸(重均分子量2×106)制作乙肝表面抗原HBsAg自溶性微针透皮贴片。透明质酸(重均分子量2×106)由山东福瑞达生物化工有限公司提供。
比较例5
按照实施例1的制作方法,把寡聚透明质酸(重均分子量4000)换成铝佐剂,形成的微针质地疏松,无法刺穿皮肤。
实施例5
本实施中是通过小鼠免疫试验来对实施例1中以寡聚透明质酸为微针基质的自溶性微针贴片、比较例1中的以PVP-k30为微针基质的自溶性微针贴片以及比较例4中的以高分子量透明质酸为微针基质的自溶性微针贴片的免疫效果进行对比。
(1)免疫
BALB/c小鼠分为实施例1组、比较例1组、比较例4组、对照组、空白组,每组25只小鼠。实施例1、比较例1组、比较例4组的小鼠处理前先用剪子将腹部毛去除,然后用手按压的方式分别将实施例1中寡聚透明质酸为基质材料的自溶性微针贴片、比较例1中的以PVP-k30为微针基质的自溶性微针贴片以及比较例4中的以高分子量透明质酸为微针基质的自溶性微针贴片作用于小鼠腹部,3分钟后将贴片取下。每只小鼠用一片贴片处理,每片贴片含乙肝表面抗原为5微克;对照组肌肉注射含铝佐剂的重组(酵母)乙型肝炎疫苗,剂量为每只小鼠0.4毫克Al(OH)3吸附5微克乙肝表面抗原;空白组,仅注射生理盐水,100微升/只。
免疫方案:共免疫3次,分别在0,2,4周免疫BALB/c小鼠。
(2)ELISA检测血清抗-HBsIgG水平
在初次免疫后4周,采集小鼠尾静脉血,分离血清,ELISA检测血清抗-HBsIgG水平,按蛋白微孔试剂盒方法进行检测,具体方法是:40微升HBsAg溶于10毫升1×包被稀释液,混匀,包被96孔酶标板,100微升/孔;酶标板放于湿盒,4℃过夜;倒掉孔内液体,拍净板子;加入1×BSA,200微升/孔;酶标板在37℃湿盒放置1小时;倒掉孔内液体,拍净板子;血清经倍比系列稀释后,加入酶标板,100微升/孔,37℃湿盒放置1小时;用试剂盒配制的洗液洗板4次,每次5分钟,末次拍净酶标板;加入试剂盒配制的二抗(peroxidase结合的羊抗鼠IgG),100微升/孔,37℃湿盒放置1小时;用洗液洗板4次,每次5分钟,末次拍净酶标板;加入试剂盒配制的显色液,100微升/孔,避光显色10~25分钟。加终止液,每孔100微升;酶标板放入酶标仪,在405nm处读板。
(3)乳酸脱氢酶法检测细胞毒活性
在初次免疫后6周,检测实施例1组、比较例1组、比较例4组、对照组、空白组诱导的细胞免疫水平(CTL反应)。
A.效应细胞制备
眼球取血后,快速取出小鼠脾脏,制成细胞悬液,用含质量浓度为10%小牛血清的RPMI1640培养基调细胞浓度到107/mL。培养1天后,加入5mg/LHBsAgCTL表位、1×106U/LrmIL-2及5mg/LConA,隔日半量换液,同时添加半量HBsAgCTL表位,rmlL-2及5mg/LConA。第5天时,收集细胞、计数,调整细胞密度至1×106/mL,作为效应细胞。
B.靶细胞制备
取对数生长期的P815细胞(P815传代后生长1d),用含10mg/LHBsAgCTL表位的RPMI1640培养液培养过夜,加入丝裂霉素至25mg/L,45分钟后收集细胞,调整细胞密度至1×104/孔,作为靶细胞。
C.CTL活性测定
采用96孔圆底塑料培养板进行,每个样至少设3个复孔。
分组加样:实验组每孔加靶细胞悬液和效应细胞悬液各100微升。效应细胞与靶细胞的比率(效:靶比)取100:1;最大释放组每孔加靶细胞悬液和1%TritonX-100水溶液各100微升。这样可使靶细胞完全破坏,胞内LDH全部释放;自发释放组每孔加靶细胞悬液和培养液各100微升。
微孔塑料板经800转/分钟离心5分钟。置37℃、体积浓度为5%CO2培养箱中培养5小时;取出微孔板,以2000转/分钟离心5分钟。从每孔中取出50微升上清液用于CTL的杀伤活性检测。
检测方法用乳酸脱氢酶(LDH)法。参照CytoTox96Non-RadioactiveCytotoxicityAssay试剂盒说明书进行。
计算方法:Cytotoxicity(%)=(实验释放-效自发释放-靶自发释放)/(靶最大释放-靶自发释放)×100%
动物实验结果如下(用SPSS软件分析实验结果,两组之间差异比较采用配对t检验,结果采用几何平均值±标准误):
在初次免疫后4周,实施例1组,比较例1组,比较例4组、对照组的Iog10IgG水平分别为3.86±0.35,3.21±0.24,2.80±0.12,3.30±0.19;而空白组诱导的抗HBsIgG水平则很低,接近于0(见图4)。在以上各个时间点,实施例1组、比较例1组、比较例4组和对照组诱导的抗-HBsIgG水平均显著高于空白组(P<0.01),实施例1组诱导的抗-HBsIgG水平显著高于比较例1组、比较例4组和对照组(P<0.05),比较例1组和对照组诱导的抗-HBsIgG水平则无显著性差异(P>0.05),比较例1组诱导的抗-HBsIgG水平显著高于比较例4组。说明PVP-k30为基质制备的自溶性微针贴片经皮免疫能够达到含铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射的免疫效果,寡聚透明质酸为基质材料制备的自溶性微针的免疫效果优于PVP-k30为基质材料制备的自溶性微针贴片经皮免疫和含铝佐剂乙肝疫苗肌肉注射,提示寡聚透明质酸起到了基质和佐剂的双重作用。与此同时,PVP-k30为基质制备的自溶性微针贴片的免疫效果优于以高分子量透明质酸为基质制备的自溶性微针贴片经皮免疫,表明高分子量透明质酸对免疫应答可能有一定的抑制作用。
在初次免疫后6周,实施例1组诱导的CTL活性显著高于比较例1组、比较例4组、对照组和空白组(P<0.01),而比较例1组、比较例4组、对照组诱导的CTL活性与空白组无显著差异(P>0.05),见表1。研究结果说明,寡聚透明质酸能够显著增强自溶性微针中乙肝表面抗原的细胞免疫应答,显著优于PVP-k30和铝佐剂。
表1寡聚透明质酸与乙肝表面抗原免疫诱导的CTL活性(%)
实施例1组 | 比较例1组 | 比较例4组 | 对照组 | 空白组 |
51.2±13.4 | 6.2±1.3 | 7.8±1.3 | 9.5±1.6 | 5.8±0.7 |
实施例6
本实施例中是通过小鼠免疫试验来对实施例2中以低分子量硫酸乙酰肝素为基质材料的自溶性微针贴片和比较例2中以PVP-k30为基质材料的自溶性微针贴片的免疫效果进行对比。
(1)免疫
BALB/c小鼠分为实施例2组,比较例2组,对照组、空白组,每组25只。实施例2组和比较例2组的小鼠处理前先用剪子将腹部毛去除,然后用手压的方式分别将实施例2中以低分子量硫酸乙酰肝素为基质材料的自溶性微针贴片和比较例2中以PVP-k30为基质材料的自溶性微针贴片作用于小鼠腹部,3分钟后将贴片取下。每只小鼠用一片贴片处理,每片贴片含VR-S2S为10微克;对照组肌肉注射VR-S2S,剂量为每只小鼠10微克VR-S2S;空白组,仅注射生理盐水,100微升/只。
免疫方案:共免疫3次,分别在0,2,4周免疫BALB/c小鼠。
(2)ELISA检测血清抗-HBsIgG水平
在初次免疫后4周,采集小鼠尾静脉血,分离血清,ELISA检测血清抗-HBsIgG水平,按蛋白微孔试剂盒方法进行检测,具体方法是:40微升HBsAg溶于10毫升1×包被稀释液,混匀,包被96孔酶标板,100微升/孔;酶标板放于湿盒,4℃过夜;倒掉孔内液体,拍净板子;加入1×BSA,200微升/孔;酶标板在37℃湿盒放置1小时;倒掉孔内液体,拍净板子;血清经倍比系列稀释后,加入酶标板,100微升/孔,37℃湿盒放置1小时;用试剂盒配制的洗液洗板4次,每次5分钟,末次拍净酶标板;加入试剂盒配制的二抗(peroxidase结合的羊抗鼠IgG),100微升/孔,37℃湿盒放置1小时;用洗液洗板4次,每次5分钟,末次拍净酶标板;加入试剂盒配制的显色液,100微升/孔,避光显色10~25分钟。加终止液,每孔100微升;酶标板放入酶标仪,在405nm处读板。
(3)乳酸脱氢酶法检测细胞毒活性
在初次免疫后6周,检测实施例2组、比较例2组、对照组、空白组诱导的细胞免疫水平(CTL反应)。
A.效应细胞制备
眼球取血后,快速取出小鼠脾脏,制成细胞悬液,用含质量浓度为10%小牛血清的RPMI1640培养基调细胞浓度到107/mL。培养1天后,加入5mg/LHBsAgCTL表位、1×106U/LrmIL-2及5mg/LConA,隔日半量换液,同时添加半量HBsAgCTL表位,rmlL-2及5mg/LConA。第5天时,收集细胞、计数,调整细胞密度至1×106/mL,作为效应细胞。
B.靶细胞制备
取对数生长期的P815细胞(P815传代后生长1d),用含10mg/LHBsAgCTL表位的RPMI1640培养液培养过夜,加入丝裂霉素至25mg/L,45分钟后收集细胞,调整细胞密度至1×104/孔,作为靶细胞。
C.CTL活性测定
采用96孔圆底塑料培养板进行,每个样至少设3个复孔。
分组加样:实验组每孔加靶细胞悬液和效应细胞悬液各100微升。效应细胞与靶细胞的比率(效:靶比)取100:1;最大释放组每孔加靶细胞悬液和1%TritonX-100水溶液各100微升。这样可使靶细胞完全破坏,胞内LDH全部释放;自发释放组每孔加靶细胞悬液和培养液各100微升。
微孔塑料板经800转/分钟离心5分钟。置37℃、体积浓度为5%CO2培养箱中培养5小时;取出微孔板,以2000转/分钟离心5分钟。从每孔中取出50微升上清液用于CTL的杀伤活性检测。
检测方法用乳酸脱氢酶(LDH)法。参照CytoTox96Non-RadioactiveCytotoxicityAssay试剂盒说明书进行。
计算方法:Cytotoxicity(%)=(实验释放-效自发释放-靶自发释放)/(靶最大释放-靶自发释放)×100%
动物实验结果如下(用SPSS软件分析实验结果,两组之间差异比较采用配对t检验,结果采用几何平均值±标准误):
在初次免疫后4周,实施例2组,比较例2组,对照组的Iog10IgG水平分别为3.24±0.16,2.63±0.11,2.72±0.12;而空白组诱导的抗HBsIgG水平则很低,接近于0(见图5)。在以上各个时间点,实施例2组、比较例2组和对照组诱导的抗-HBsIgG水平均显著高于空白组(P<0.01),实施例2组诱导的抗-HBsIgG水平显著高于比较例2组和对照组(P<0.05),而比较例2组和对照组诱导的抗-HBsIgG水平则无显著性差异(P>0.05)。说明低分子量的硫酸乙酰肝素为基质材料制备的自溶性微针的免疫效果优于PVP-k30为基质材料制备的自溶性微针贴片经皮免疫和肌肉注射免疫。提示低分子量的硫酸乙酰肝素起到了基质材料和佐剂的双重作用。
在初次免疫后6周,实施例2组诱导的CTL活性显著高于比较例2组、对照组和空白组(P<0.01),而比较例2组、对照组诱导的CTL活性与空白组无显著差异(P>0.05),见表2。研究结果说明,低分子量的硫酸乙酰肝素能够显著增强自溶性微针中乙肝DNA疫苗的细胞免疫应答,显著优于PVP-k30为基质材料的自溶性微针经皮免疫和肌肉注射免疫。
表2乙肝DNA疫苗免疫诱导的CTL活性(%)
实施例2组 | 比较例2组 | 对照组 | 空白组 |
40.6±9.6 | 7.1±1.8 | 7.4±2.3 | 6.0±1.7 |
实施例7
本实施例中是通过小鼠免疫试验来对实施例3中以寡聚透明质酸和低分子量硫酸乙酰肝素为基质材料的自溶性微针贴片和比较例3中的以PVP-k30为基质材料的自溶性微针贴片的免疫效果进行对比。
(1)免疫
BALB/c小鼠分为实施例3组,比较例3组,对照组、空白组,每组25只。实施例3组和比较例3组的小鼠处理前先用剪子将腹部毛去除,然后用手压的方式分别将实施例3中以寡聚透明质酸和低分子量的硫酸乙酰肝素为基质材料的自溶性微针贴片和比较例3中的以PVP-k30为基质材料的自溶性微针贴片作用于小鼠腹部,3分钟后将贴片取下。每只小鼠用一片贴片处理,每片贴片含rMVA-E4为20微克;对照组肌肉注射rMVA-E4,剂量为每只小鼠20微克rMVA-E4;空白组,仅注射生理盐水,100微升/只。
免疫方案:共免疫3次,分别在0,2,4周免疫BALB/c小鼠。
(2)ELISA检测血清抗-HBsIgG水平
在初次免疫后4周,采集小鼠尾静脉血,分离血清,ELISA检测血清抗-HBsIgG水平,按蛋白微孔试剂盒方法进行检测,具体方法是:40微升HBsAg溶于10毫升1×包被稀释液,混匀,包被96孔酶标板,100微升/孔;酶标板放于湿盒,4℃过夜;倒掉孔内液体,拍净板子;加入1×BSA,200微升/孔;酶标板在37℃湿盒放置1小时;倒掉孔内液体,拍净板子;血清经倍比系列稀释后,加入酶标板,100微升/孔,37℃湿盒放置1小时;用试剂盒配制的洗液洗板4次,每次5分钟,末次拍净酶标板;加入试剂盒配制的二抗(peroxidase结合的羊抗鼠IgG),100微升/孔,37℃湿盒放置1小时;用洗液洗板4次,每次5分钟,末次拍净酶标板;加入试剂盒配制的显色液,100微升/孔,避光显色10~25分钟。加终止液,每孔100微升;酶标板放入酶标仪,在405nm处读板。
(3)乳酸脱氢酶法检测细胞毒活性
在初次免疫后6周,检测实施例3组、比较例3组、对照组、空白组诱导的细胞免疫水平(CTL反应)。
A.效应细胞制备
眼球取血后,快速取出小鼠脾脏,制成细胞悬液,用含质量浓度为10%小牛血清的RPMI1640培养基调细胞浓度到107/mL。培养1天后,加入5mg/LHBsAgCTL表位、1×106U/LrmIL-2及5mg/LConA,隔日半量换液,同时添加半量HBsAgCTL表位,rmlL-2及5mg/LConA。第5天时,收集细胞、计数,调整细胞密度至1×106/mL,作为效应细胞。
B.靶细胞制备
取对数生长期的P815细胞(P815传代后生长1d),用含10mg/LHBsAgCTL表位的RPMI1640培养液培养过夜,加入丝裂霉素至25mg/L,45分钟后收集细胞,调整细胞密度至1×104/孔,作为靶细胞。
C.CTL活性测定
采用96孔圆底塑料培养板进行,每个样至少设3个复孔。
分组加样:实验组每孔加靶细胞悬液和效应细胞悬液各100微升。效应细胞与靶细胞的比率(效:靶比)取100:1;最大释放组每孔加靶细胞悬液和1%TritonX-100水溶液各100微升。这样可使靶细胞完全破坏,胞内LDH全部释放;自发释放组每孔加靶细胞悬液和培养液各100微升。
微孔塑料板经800转/分钟离心5分钟。置37℃、体积浓度为5%CO2培养箱中培养5小时;取出微孔板,以2000转/分钟离心5分钟。从每孔中取出50微升上清液用于CTL的杀伤活性检测。
检测方法用乳酸脱氢酶(LDH)法。参照CytoTox96Non-RadioactiveCytotoxicityAssay试剂盒说明书进行。
计算方法:Cytotoxicity(%)=(实验释放-效自发释放-靶自发释放)/(靶最大释放-靶自发释放)×100%
动物实验结果如下(用SPSS软件分析实验结果,两组之间差异比较采用配对t检验,结果采用几何平均值±标准误):
在初次免疫后4周,实施例3组,比较例3组,对照组的Iog10IgG水平分别为2.51±0.18,1.70±0.10,1.62±0.14;而空白组诱导的抗HBsIgG水平则很低,接近于0(见图6)。在以上各个时间点,实施例3组、比较例3组和对照组诱导的抗-HBsIgG水平均显著高于空白组(P<0.01),实施例3组诱导的抗-HBsIgG水平显著高于比较例3组和对照组(P<0.05),而比较例3组和对照组诱导的抗-HBsIgG水平则无显著性差异(P>0.05)。说明寡聚透明质酸和低分子量的硫酸乙酰肝素为基质材料制备的自溶性微针的免疫效果优于PVP-k30为基质材料制备的自溶性微针贴片经皮免疫和rMVA-E4肌肉注射。提示寡聚透明质酸和低分子量的硫酸乙酰肝素起到了基质材料和佐剂的双重作用。
在初次免疫后6周,实施例3组诱导的CTL活性显著高于比较例2组、对照组和空白组(P<0.01),而比较例3组、对照组诱导的CTL活性与空白组无显著差异(P>0.05),见表3。研究结果说明,寡聚透明质酸和低分子量的硫酸乙酰肝素能够显著增强自溶性微针中乙肝病毒载体疫苗的细胞免疫应答,显著优于PVP-k30为基质材料的自溶性微针经皮免疫和肌肉注射免疫。
表3重组腺病毒载体乙肝疫苗免疫诱导的CTL活性(%)
实施例3组 | 比较例3组 | 对照组 | 空白组 |
27.6±6.7 | 5.4±1.2 | 6.5±2.0 | 5.2±0.5 |
Claims (12)
1.一种自溶性微针透皮贴片,其特征是:所述的自溶性微针透皮贴片是由微针基质材料、疫苗、疫苗佐剂和疫苗保护剂构成,其中,所述的微针基质材料和疫苗佐剂均为寡聚透明质酸、低分子量的硫酸乙酰肝素或其组合。
2.根据权利要求1所述的自溶性微针透皮贴片,其特征是:所述的疫苗在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.001%~10%,疫苗保护剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.01%~30%,微针基质材料和疫苗佐剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的60%~99.98%。
3.根据权利要求2所述的自溶性微针透皮贴片,其特征是:所述的疫苗在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.01%~1%,疫苗保护剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的0.1%~20%,微针基质材料和疫苗佐剂在所述的自溶性微针透皮贴片中所占的百分含量为总重量的80%~99.8%。
4.根据权利要求1、2或3所述的自溶性微针透皮贴片,其特征是:所述的疫苗保护剂选自甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精、人血清白蛋白、明胶、精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-络氨酸、苯丙氨酸中的至少一种。
5.根据权利要求1、2或3所述的自溶性微针透皮贴片,其特征是:所述的寡聚透明质酸的重均分子量在10,000以内;所述的低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量在10,000以内。
6.根据权利要求5所述的自溶性微针透皮贴片,其特征是:所述的寡聚透明质酸的重均分子量的范围是5000<重均分子量<10,000;所述的低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量的范围是4000<重均分子量<10,000。
7.根据权利要求1、2或3所述的自溶性微针透皮贴片,其特征是:所述的疫苗选自减毒活疫苗、亚单位疫苗、多糖-蛋白质偶联疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗中的一种。
8.根据权利要求7所述的自溶性微针透皮贴片,其特征是:所述的减毒活疫苗选自麻疹疫苗、风疹疫苗、腮腺炎疫苗、卡介苗、乙脑减毒活疫苗、手足口疫苗中的一种;
所述的亚单位疫苗是乙肝疫苗或流感疫苗;
所述的多糖-蛋白质偶联疫苗选自肺炎球菌疫苗、A群流脑疫苗、A+C群流脑疫苗中的一种;
所述的DNA疫苗是表达乙型肝炎表面抗原基因(S)的DNA疫苗;
所述的病毒载体疫苗是具有疫苗性质的重组活病毒疫苗;所述的重组活病毒疫苗是痘病毒载体疫苗或腺病毒载体疫苗。
9.根据权利要求8所述的自溶性微针透皮贴片,其特征是:所述的痘病毒载体疫苗是表达乙型肝炎表面抗原基因(S)的痘病毒载体疫苗;所述的腺病毒载体疫苗是表达乙型肝炎表面抗原基因(S)的腺病毒载体疫苗。
10.根据权利要求1、2或3所述的自溶性微针透皮贴片,其特征是:所述的自溶性微针透皮贴片的规格为每平方厘米含有16~484根微针,每根微针的截面形状是圆锥形或多面锥形,微针的高度在150~1000微米之间,针尖的直径在100纳米~20微米之间,微针的最大截面的锥角是20~60度。
11.一种权利要求1~10任意一项所述的自溶性微针透皮贴片的制备方法,其特征是,所述的制备方法包括以下步骤:
(1)制备含有疫苗和疫苗保护剂的水溶液;
(2)制备含有微针基质材料和疫苗佐剂的水溶液;
(3)将步骤(1)制备的含有疫苗和疫苗保护剂的水溶液浇注到含有微孔阵列的模具上;使步骤(1)制备的含有疫苗和疫苗保护剂的水溶液填充到模具上的微孔中;干燥浇注的含有疫苗和疫苗保护剂的水溶液;
(4)将步骤(2)制备的含有微针基质材料和疫苗佐剂的水溶液浇注到步骤(3)干燥后的模具上;使步骤(2)制备的含有微针基质材料和疫苗佐剂的水溶液填充到含有疫苗和疫苗保护剂的水溶液干燥后塌陷出的微孔中;干燥浇注的含有微针基质材料和疫苗佐剂的水溶液,在含有微孔阵列的模具中得到自溶性微针透皮贴片;从所述的模具上剥离干燥后的自溶性微针透皮贴片。
12.根据权利要求11所述的的制备方法,其特征是:所述的含有微孔阵列的模具是由聚二甲基硅氧烷制备而成的板,其每平方厘米表面含有16~484个微孔阵列,每个微孔的截面形状是圆锥形或多面锥形,微孔的高度在150~1000微米之间,孔尖的直径在100纳米~20微米之间,微孔的最大截面的锥角是20~60度。
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Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106237318A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-12-21 | 湖北大学 | 一种卡介苗干粉微针疫苗及其制备方法 |
CN107158368A (zh) * | 2017-05-11 | 2017-09-15 | 广州新济药业科技有限公司 | 流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片及其制备方法 |
CN107362352A (zh) * | 2016-05-12 | 2017-11-21 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种蛋白或多肽组合物及其制备方法和用途 |
CN107412943A (zh) * | 2017-04-17 | 2017-12-01 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种可溶性微针贴片及其制备方法 |
CN108379573A (zh) * | 2018-03-26 | 2018-08-10 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | 一种百日咳疫苗微针阵列及其制备方法 |
CN109106947A (zh) * | 2018-06-11 | 2019-01-01 | 艾美康淮生物制药(江苏)有限公司 | 一种介导性ca16灭活疫苗、其制备方法及其应用 |
CN109200012A (zh) * | 2017-07-06 | 2019-01-15 | 中科微针(北京)科技有限公司 | 一种含有无机盐的分层溶解微针 |
CN110680798A (zh) * | 2018-07-04 | 2020-01-14 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种含佐剂mf59和芦荟提取物组合的肺炎多糖疫苗可溶性微针 |
CN110680916A (zh) * | 2018-07-04 | 2020-01-14 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种含铝佐剂和罗非昔布组合的甲肝疫苗可溶性微针 |
CN110947085A (zh) * | 2018-09-27 | 2020-04-03 | 中科微针(北京)科技有限公司 | 一种加速聚乙烯醇可溶性微针成型和速溶给药的方法及制备的微针 |
CN111315410A (zh) * | 2017-11-10 | 2020-06-19 | Lts勒曼治疗系统股份公司 | 用于施加肝炎疫苗的微针系统 |
CN113350263A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-09-07 | 贵州中医药大学 | 一种雷公藤甲素自溶性微针 |
CN113521309A (zh) * | 2020-04-16 | 2021-10-22 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 人肝细胞生长因子基因在湿疹治疗中的应用及微针药械 |
CN113766913A (zh) * | 2020-04-03 | 2021-12-07 | 考司美德制药株式会社 | 短时间溶解微针 |
CN114558242A (zh) * | 2022-03-04 | 2022-05-31 | 优微(珠海)生物科技有限公司 | 一种可溶性微针及其制造方法 |
CN114903843A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-08-16 | 优微(珠海)生物科技有限公司 | 一种微针制剂、微针贴片及其制备方法 |
CN116059155A (zh) * | 2021-10-31 | 2023-05-05 | 江苏熙美生物科技有限公司 | 一种无痛可溶给药微针及其制备方法 |
-
2014
- 2014-06-27 CN CN201410301920.7A patent/CN105311000B/zh active Active
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
SACHIKO HIROBE ET AL.: ""Development and Clinical Study of a Self-Dissolving Microneedle Patch for Transcutaneous Immunization Device"", 《PHARMACEUTICAL RESEARCH》 * |
SHU LIU ET AL.: ""Transdermal delivery of relatively high molecular weight drugs using novel self-dissolving microneedle arrays fabricated from hyaluronic acid and their characteristics and safety after application to the skin"", 《EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACEUTICS AND BIOPHARMACEUTICS》 * |
舒晓明等: ""低分子量透明质酸增强HAV抗原诱导的小鼠体液免疫应答的研究"", 《细胞与分子免疫学杂志》 * |
Cited By (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107362352A (zh) * | 2016-05-12 | 2017-11-21 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种蛋白或多肽组合物及其制备方法和用途 |
CN107362352B (zh) * | 2016-05-12 | 2021-04-02 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种蛋白或多肽组合物及其制备方法和用途 |
CN106237318A (zh) * | 2016-08-24 | 2016-12-21 | 湖北大学 | 一种卡介苗干粉微针疫苗及其制备方法 |
CN107412943A (zh) * | 2017-04-17 | 2017-12-01 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种可溶性微针贴片及其制备方法 |
CN107158368A (zh) * | 2017-05-11 | 2017-09-15 | 广州新济药业科技有限公司 | 流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片及其制备方法 |
CN107158368B (zh) * | 2017-05-11 | 2023-08-08 | 广州新济药业科技有限公司 | 流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片及其制备方法 |
CN109200012A (zh) * | 2017-07-06 | 2019-01-15 | 中科微针(北京)科技有限公司 | 一种含有无机盐的分层溶解微针 |
CN111315410A (zh) * | 2017-11-10 | 2020-06-19 | Lts勒曼治疗系统股份公司 | 用于施加肝炎疫苗的微针系统 |
CN108379573A (zh) * | 2018-03-26 | 2018-08-10 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | 一种百日咳疫苗微针阵列及其制备方法 |
CN109106947A (zh) * | 2018-06-11 | 2019-01-01 | 艾美康淮生物制药(江苏)有限公司 | 一种介导性ca16灭活疫苗、其制备方法及其应用 |
CN110680916A (zh) * | 2018-07-04 | 2020-01-14 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种含铝佐剂和罗非昔布组合的甲肝疫苗可溶性微针 |
CN110680798A (zh) * | 2018-07-04 | 2020-01-14 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种含佐剂mf59和芦荟提取物组合的肺炎多糖疫苗可溶性微针 |
CN110680798B (zh) * | 2018-07-04 | 2024-02-09 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种含佐剂mf59和芦荟提取物组合的肺炎多糖疫苗可溶性微针 |
CN110680916B (zh) * | 2018-07-04 | 2023-11-10 | 辽宁成大生物股份有限公司 | 一种含铝佐剂和罗非昔布组合的甲肝疫苗可溶性微针 |
CN110947085A (zh) * | 2018-09-27 | 2020-04-03 | 中科微针(北京)科技有限公司 | 一种加速聚乙烯醇可溶性微针成型和速溶给药的方法及制备的微针 |
CN113766913A (zh) * | 2020-04-03 | 2021-12-07 | 考司美德制药株式会社 | 短时间溶解微针 |
CN113521309A (zh) * | 2020-04-16 | 2021-10-22 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 人肝细胞生长因子基因在湿疹治疗中的应用及微针药械 |
CN113521309B (zh) * | 2020-04-16 | 2023-07-07 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 人肝细胞生长因子基因在湿疹治疗中的应用及微针药械 |
CN113350263A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-09-07 | 贵州中医药大学 | 一种雷公藤甲素自溶性微针 |
CN113350263B (zh) * | 2021-06-04 | 2022-05-17 | 贵州中医药大学 | 一种雷公藤甲素自溶性微针 |
CN116059155A (zh) * | 2021-10-31 | 2023-05-05 | 江苏熙美生物科技有限公司 | 一种无痛可溶给药微针及其制备方法 |
CN114558242B (zh) * | 2022-03-04 | 2022-09-27 | 优微(珠海)生物科技有限公司 | 一种可溶性微针及其制造方法 |
CN114558242A (zh) * | 2022-03-04 | 2022-05-31 | 优微(珠海)生物科技有限公司 | 一种可溶性微针及其制造方法 |
CN114903843B (zh) * | 2022-06-02 | 2023-01-13 | 优微(珠海)生物科技有限公司 | 一种微针制剂、微针贴片及其制备方法 |
CN114903843A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-08-16 | 优微(珠海)生物科技有限公司 | 一种微针制剂、微针贴片及其制备方法 |
Also Published As
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