CN113350263A - 一种雷公藤甲素自溶性微针 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种雷公藤甲素自溶性微针。本发明按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP 24‑29份、PVA 7.8‑8.3份、CMC‑Na0.45‑0.65份、雷公藤甲素0.28‑0.42份、蒸馏水40‑45份和无水乙醇20‑23份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP32‑37份、PVA 9‑12份和蒸馏水53‑58份。本发明具有微针成型性与机械强度均好，载药量的RSD值为0.98％，且工艺稳定可行，载药微针针尖可以使药物大部分较迅速到达体内迅速起效，加之微针基质的缓释效果，可以提高雷公藤甲素的用药安全性，通过减少滑膜中细胞的炎性浸润，减少炎症因子TNF‑ɑ、IL‑17、PGE2、IgG、IgM、IgA的表达以及升高OPG的表达、降低RANKL表达和RANKL/OPG比值的趋势，实现对类风湿关节炎的治疗的优点。

Description

一种雷公藤甲素自溶性微针
技术领域
本发明属于自溶性微针技术领域，特别是一种雷公藤甲素自溶性微针。
背景技术
雷公藤多苷的主要成分之一雷公藤甲素(triptolide，TP)既是主要活性成分也是毒性成分。是目前雷公藤制剂质量控制标准的主要成分。多项研究发现TP具备以下性质：(1)在纯水中几乎不溶，在临床研究中具有生物利用率低、吸收差、血药浓度难以达到治疗浓度，但高浓度又导致毒副作用以致难以成剂等缺点；(2)体内的消除速率快，呈非线性消除，主要通过粪便、尿液、胆汁途径排泄；(3)致死量小具有半衰期分别为31天和204天，其中TP在氯仿中稳定性好，而碱性介质和亲水性溶剂会加速其降解，温度与pH也会影响其降解；(5)TP是中性化合物，分子中不含任何酸性、碱性、易离子化的基团，无法有效地离子化，碰撞中也无法生成特征性碎片离子，因此质谱响应差。研究发现TP可以抑制RA滑膜成纤维细胞中IFNγ的表达和产生，使Th17细胞分化受损，从而起到免疫抑制和抗炎的作用；TP还能明显改善II型胶原诱导关节炎大鼠关节肿胀情况，机制与促进IL-10、TGF-β表达，增加Treg细胞比例，抑制IL-17、TNF-ɑ、VEGF、IFN-γ表达有关，并且短期内无明显肝毒性。TP与TG虽然是治疗RA的有效药物，但从上可知毒性大、水溶性低、治疗靶点不明等因素限制了其临床应用。
微针(microneedles，MNs)作为一种新型物理促渗技术，能直接穿透皮肤给药。具有无痛穿透力，能使水溶性药物及大分子药物穿透角质层、治疗效果好、相对安全，传递药物几乎无损伤性、剂量稳定、成本低等突出性能，在过去的几十年中引起了科学界和工业界的广泛关注。而微针中的自溶性微针(dissolving microneedles，DMNs)因能包载药物，并在插入皮肤后能溶解，具有良好的生物相容性，因此被广泛使用。自溶性微针还有药物缓释作用，可根据治疗需求制作不同降解速度的自溶性微针。
目前尚无，雷公藤甲素结合微针的研究。
发明内容
本发明目的在于提供一种雷公藤甲素自溶性微针。本发明具有微针成型性与机械强度均好，载药量的RSD值为0.98％，且工艺稳定可行，载药微针针尖可以使药物大部分较迅速到达体内迅速起效，加之微针基质的缓释效果，可以提高雷公藤甲素的用药安全性，通过减少滑膜中细胞的炎性浸润，减少炎症因子TNF-ɑ、IL-17、PGE2、IgG、IgM、IgA的表达以及升高OPG的表达、降低RANKL表达和RANKL/OPG比值的趋势，实现对类风湿关节炎的治疗的优点。
本发明采用如下技术方案实现发明目的：
一种雷公藤甲素自溶性微针，按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP 24-29份、PVA 7.8-8.3份、CMC-Na0.45-0.65份、雷公藤甲素0.28-0.42份、蒸馏水40-45份和无水乙醇20-23份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP32-37份、PVA 9-12份和蒸馏水53-58份。
前述的雷公藤甲素自溶性微针中，按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP 26-27份、PVA 8-8.1份、CMC-Na0.5-0.6份、雷公藤甲素0.3-0.4份、蒸馏水42-43份和无水乙醇21-22份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP34-35份、PVA 10-11份和蒸馏水55-56份。
前述的雷公藤甲素自溶性微针中，按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP 26.78份、PVA 8.03份、CMC-Na 0.54份、雷公藤甲素0.37份、蒸馏水42.85份和无水乙醇21.42份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP 34.48份、PVA 10.34份和蒸馏水55.17份。
前述的雷公藤甲素自溶性微针中，所述的雷公藤甲素自溶性微针按照以下步骤制备：
(1)针头的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方称取针尖材料充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，离心，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥，得针尖含药的微针模具；
(2)微针背衬层的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方称取基质材料搅拌均匀，离心，除去气泡后注入针尖含药的微针模具，离心，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
前述的雷公藤甲素自溶性微针中，所述的雷公藤甲素自溶性微针按照以下步骤制备：
(1)针头的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方称取针尖材料充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，3900-4100r/min离心8-12min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥5-7h，得针尖含药的微针模具；
(2)微针背衬层的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方称取基质材料搅拌均匀4900-5100r/min离心18-22min除去气泡后注入针尖含药的微针模具，3900-4100r/min离心4-6min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
前述的雷公藤甲素自溶性微针中，所述的雷公藤甲素自溶性微针按照以下步骤制备：
(1)针头的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方称取针尖材料充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，4000r/min离心10min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥6h，得针尖含药的微针模具；
(2)微针背衬层的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方称取基质材料搅拌均匀5000r/min离心20min除去气泡后注入针尖含药的微针模具，4000r/min离心5min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
前述的雷公藤甲素自溶性微针中，所述的雷公藤甲素自溶性微针用于类风湿关节炎的治疗。
前述的雷公藤甲素自溶性微针中，所述的雷公藤甲素自溶性微针用于类风湿关节炎的治疗是通过减少滑膜中细胞的炎性浸润，减少炎症因子TNF-ɑ、IL-17、PGE2、IgG、IgM、IgA的表达以及升高OPG的表达、降低RANKL表达和RANKL/OPG比值的趋势实现。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明确定DMNs-TP微针的针尖基质处方PVP 26.78％、PVA 8.03％、CMC-Na0.54％、雷公藤甲素0.37％、蒸馏水42.85％和无水乙醇21.42％；微针的背衬层基质处方为PVP 34.48％与PVA 10.34％、蒸馏水55.17％。以此处方按照本发明提出的两步离心法制备微针：针头的制备：将针尖材料称取充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，4000r/min离心10min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥6h后取出备用；微针背衬层的制备：称取基质材料搅拌均匀5000r/min离心20min除去气泡后注入针尖含药的微针模具，4000r/min离心5min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。所得微针成型性与机械强度均好，载药量的RSD值为0.98％，且工艺稳定可行。
2、本发明采用两步离心法制备微针，载药微针针尖可以使药物大部分较迅速到达体内迅速起效，加之微针基质的缓释效果，可以提高雷公藤甲素的用药安全性。
3、本发明制得的DMNs-TP微针可通过减少滑膜中细胞的炎性浸润，减少炎症因子TNF-ɑ、IL-17、PGE2、IgG、IgM、IgA的表达以及升高OPG的表达、降低RANKL表达和RANKL/OPG比值的趋势，实现对类风湿关节炎的治疗。
附图说明
图1为不同除气泡方法基质溶液的直观图；
图2为单一基质微针阵列与针形结果图；
图3是PVP与不同韧性材料配比的结果图；
图4是基质不同比例微针的表征图；
图5是PVP：PVA(10:3、3:1)鼠皮穿刺表征图；
图6是不同加水量微针的表征图；
图7是不同干燥方法微针贴片形态图；
图8是不同增塑剂微针的表征图；
图9是不同助溶剂微针的表征图；
图10是加醇量对微针影响的表征图；
图11是不同多苷加药量微针的表征图；
图12是DMNs-TP形态学观察图；
图13是DMNs-TP的皮肤穿刺形态图；
图14是各组大鼠体重变化图；
图15是大鼠造模完成后各组的足爪图片；
图16是给药结束后各组的足爪图片；
图17是各组脏器指数图；
图18是各组大鼠滑膜H&E染色情况(×200)；
图19是各组大鼠关节软骨H&E染色情况(×200)；
图20是各炎症因子标准曲线图；
图21是各组中OPG、RANKL蛋白影响的Western Blot电泳图。
其中，图1中，A是无任何处理的结果、B是超声处理的结果、C是离心处理的结果；
图2中,A是50％PVP的结果、B是60％PVP的结果、C是70％PVP的结果、D是15％PVA的结果、E是2％HA的结果、F是1％CMC-Na的结果、G是15％海藻酸钠的结果、H是10％硫酸软骨素的结果、I是15％硫酸软骨素；
图3中，A为PVPK30+卡波姆940的结果、B为PVP+PVA的结果、C为PVP+HAP的结果、D为PVP+海藻酸钠的结果、E为PVP+CMC-Na的结果、F为PVP+Dex-40的结果；
图4中表示的比例，A是1:1、B是1：2、C是1:3、D是1:4、E是2:1、F是2:3、G是3:1、H是3：2、I是3:4、J是4:1、K是4:3、L是10:3；
图5中比例，A是10:3、B是3:1；
图6中加水量，A是6mL、B是8mL、C是10mL、D是12mL、E是14mL；
图7中干燥方法，A是室温干燥、B是烘箱干燥、C是真空干燥；
图8中增塑剂，A是CMC-Na、B是PEG-400、C是甘油、D未加；
图9中助溶剂，A是无水乙醇、B是PEG-400、C是丙二醇、D是丙三醇；
图10中助溶剂用量，A是0.2mL、B是0.4mL、C是0.6mL、D是0.8mL；
图11中加药量，A是6mL、B是7mL、C是8mL、D是9mL、E是10mL；
图12中，A是4*10的显微镜图、B是相机全景图；
图13中，A为DMNs-TP穿刺后亚甲基蓝染色图(全景)，B为DMNs-TP的皮肤穿刺H&E染色图(皮肤角质层被穿透，穿刺深度为186.81μm)；
图15中，A是空白对照组、B是模型组、C是雷公藤多苷片组、D是吡罗昔康组、E是TG低剂量组、F是TG中剂量组、G是TG高剂量组、H是TP低剂量组、I是TP中剂量组、J是TP高剂量组；
图16中，A是空白对照组、B是模型组、C是雷公藤多苷片组、D是吡罗昔康组、E是TG低剂量组、F是TG中剂量组、G是TG高剂量组、H是TP低剂量组、I是TP中剂量组、J是TP高剂量组；
图17中，A是心脏指数图、B是肝脏指数图、C是脾脏指数图、D是肺脏指数图、E是肾脏指数图；
图18中，A是空白对照组、B是模型组、C是雷公藤多苷片组、D是吡罗昔康组、E是TG低剂量组、F是TG中剂量组、G是TG高剂量组、H是TP低剂量组、I是TP中剂量组、J是TP高剂量组；
图19中，A是空白对照组、B是模型组、C是雷公藤多苷片组、D是吡罗昔康组、E是TG低剂量组、F是TG中剂量组、G是TG高剂量组、H是TP低剂量组、I是TP中剂量组、J是TP高剂量组；
图21中，A是空白组、B是模型组、C是DMNs-TP高剂量组、D是吡罗昔康组、E是DMNs-TG低剂量组、F是DMNs-TG中剂量组、G是DMNs-TG高剂量组、H是DMNs-TP低剂量组、I是雷公藤多苷片组、J是DMNs-TP中剂量组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细描述。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现有常规方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得到的配料或材料。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1，一种雷公藤甲素自溶性微针，按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP 24份、PVA 7.8份、CMC-Na0.45份、雷公藤甲素0.28份、蒸馏水40份和无水乙醇20份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP32份、PVA 9份和蒸馏水53份。
雷公藤甲素自溶性微针按照以下步骤制备：
(1)针头的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方称取针尖材料充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，3900r/min离心8min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥5h，得针尖含药的微针模具；
(2)微针背衬层的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方称取基质材料搅拌均匀4900r/min离心18min除去气泡后注入针尖含药的微针模具，3900r/min离心4min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
实施例2，一种雷公藤甲素自溶性微针，按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP 29份、PVA 8.3份、CMC-Na0.65份、雷公藤甲素0.42份、蒸馏水45份和无水乙醇23份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP37份、PVA 12份和蒸馏水58份。
雷公藤甲素自溶性微针按照以下步骤制备：
(1)针头的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方称取针尖材料充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，4100r/min离心12min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥7h，得针尖含药的微针模具；
(2)微针背衬层的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方称取基质材料搅拌均匀5100r/min离心22min除去气泡后注入针尖含药的微针模具，4100r/min离心6min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
实施例3，按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP 26份、PVA 8份、CMC-Na0.5份、雷公藤甲素0.3份、蒸馏水42份和无水乙醇21份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP 34份、PVA 10份和蒸馏水55份。
雷公藤甲素自溶性微针按照以下步骤制备：
(1)针头的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方称取针尖材料充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，3950r/min离心9min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥5.5h，得针尖含药的微针模具；
(2)微针背衬层的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方称取基质材料搅拌均匀4950r/min离心19min除去气泡后注入针尖含药的微针模具，3950r/min离心4.5min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
实施例4，按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP 27份、PVA 8.1份、CMC-Na0.6份、雷公藤甲素0.4份、蒸馏水43份和无水乙醇22份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP 35份、PVA 11份和蒸馏水56份。
雷公藤甲素自溶性微针按照以下步骤制备：
(1)针头的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方称取针尖材料充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，4050r/min离心11min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥6.5h，得针尖含药的微针模具；
(2)微针背衬层的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方称取基质材料搅拌均匀5050r/min离心21min除去气泡后注入针尖含药的微针模具，4050r/min离心4-6min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
实施例5，按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP26.78份、PVA 8.03份、CMC-Na 0.54份、雷公藤甲素0.37份、蒸馏水42.85份和无水乙醇21.42份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP 34.48份、PVA 10.34份和蒸馏水55.17份。
雷公藤甲素自溶性微针按照以下步骤制备：
(1)针头的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方称取针尖材料充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，4000r/min离心10min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥6h，得针尖含药的微针模具；
(2)微针背衬层的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方称取基质材料搅拌均匀5000r/min离心20min除去气泡后注入针尖含药的微针模具，4000r/min离心5min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
实施例6。雷公藤甲素自溶性微针的应用，将实施例1-5中得到的雷公藤甲素自溶性微针用于类风湿关节炎的治疗，用于类风湿关节炎的治疗是通过减少滑膜中细胞的炎性浸润，减少炎症因子TNF-ɑ、IL-17、PGE2、IgG、IgM、IgA的表达以及升高OPG的表达、降低RANKL表达和RANKL/OPG比值的趋势实现。
为得到本发明技术和验证本发明技术效果，发明人做了大量相关试验，部分试验记录如下：
试验例1。DMNs-TP和DMNs-TG的制备
自溶性微针是指由实心微针的基底部与其前端的可溶性针状结构结合而成的一类微针，由可溶性或生物可降解基质构成，这类微针的基质在插入皮肤后能溶解，具有良好的生物相容性。基质材料的选择直接影响微针的制备及皮肤穿刺等性能。本试验拟设计和制备微针，通过材料的比例、加水量等筛选初步筛选自溶性微针基质处方，通过微针针尖的溶剂以及加药量，以微针的成型性、机械性能以及载药量正交优选制备工艺，并对微针的皮肤穿刺效果及体外溶解性能进行考察。
1实验材料
1.1仪器、设备
仪器名称 厂家
微针模具(A36型) 台州微芯医药科技有限公司
DZF-6210型真空干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司
H2050R型台式高速大容量冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司
101-3AB型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司
TDL-5A型大容量离心机 上海程捷仪器设备有限公司
SK8210LHC型超声波清洗器 上海科导超声仪器有限公司
实验用水为去离子水，其他试剂均为分析纯。
2微针的制备方法及评价指标
2.1微针的制备
Verbaan等人研究了不同长度的微针刺入皮肤的效果，发现小于300μm的微针不能有效刺入皮肤。张鸣天等人用荧光分析法对比了不同长度的微针刺入活体小鼠腹部皮肤的效果，发现较优的微针高度应大于500μm。本实验选用针长为550μm的微针模具制备微针。
实验中采取两步离心法制备DMNs-TP及DMNs-TG。第1步，微针头的制备：按一定比例称取基质材料于烧杯中，加入一定量对照品的含醇水溶液，充分溶解并搅拌均匀。将含药的基质液注入微针模具中，在常温条件下，4000r/min(3580×g)离心10min，除去并收集微针模具表面多余的含药基质液，放入干燥器中干燥6h后取出备用；第2步，微针背衬层的制备：称取基质材料溶于去离子水，搅拌均匀离心除去气泡后注入微针模具，4000r/min(3580×g)离心5min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，用弯镊小心脱模，即得含药自溶性微针。微针模具放入热水中超声清洗后，放入鼓风干燥箱干燥。
2.2微针成型性的评价
为考察基质材料的成型性，设置成膜性、平整度、气泡量、含针率四个指标进行综合的评价。并考察其相容性。通过肉眼及正置光学显微镜下观察其外观形态。具体检测项目见表1-1所示。
表1-1自溶性微针成型性观察项目
Figure BDA0003101137230000101
2.3微针机械性能的评价
采用铝箔穿刺和离体大鼠皮肤穿刺实验来对微针的机械强度进行考察。具体步骤见表1-2所示。
表1-2微针机械效能观察项目
Figure BDA0003101137230000102
3微针处方前研究
两步离心法制备的微针由背衬层以及针尖两层构成，考虑微针载药量低以及针尖载药会降低微针机械性能等问题，需对微针的针尖是否加入增塑剂以及助溶剂进行考察。实验对影响微针制备中的因素如基质溶液除气泡方法、微针的基质材料以及基质材料的加水量、微针干燥方法进行了考察，确定了微针针尖增塑剂的种类、助溶剂的种类以及助溶剂的量。
3.1微针基质的选择和筛选
3.1.1基质溶液除气泡方法的选择
微针基质溶解后会产生大量的气泡，基质溶液气泡的有无直接影响了后续微针制备的成型性。本实验分别考察了静置、超声与离心除气泡的效果，时间均为20min，离心转数为5000r/min，而超声频率为53HZ。
3.1.2微针背衬层单一基质微针制备的筛选
自溶性微针的给药机理是微针刺入皮肤后针尖到达真皮层或活性表皮层，药物随着针体融化而释放，从而达到透皮给药作用，这就要求基质材料固化后具有足够的机械强度、溶解性、稳定性。目前用于微针制备的基质材料可分为天然材料与合成聚合物材料两大类。前者主要包括糖类与蛋白质类。而后者具有结构和性能可调控，且成本相对较低的优点。实验中分别配好20％、30％、40％、50％、60％、70％的PVP溶液；10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％的PVA溶液；1％、2％、3％的HA溶液；10％、15％、20％、25％的硫酸软骨素溶液；30％、50％、70％的海藻糖溶液；20％、30％的蔗糖溶液及20％、30％的ɑ-葡聚糖溶液；10％、15％的海藻酸钠溶液；2％的CMC-Na溶液取单一的基质来浇注模具，制备聚合物微针贴片，以“2.2项下”“2.3项下”方法综合进行考察。
3.1.3微针背衬层复合基质材料微针制备的筛选
根据单一基质的筛选后筛选出了PVP基质，PVP属于脆性材料，将它制备成微针会使微针阵列易碎，而将几种材料复合制备微针能弥补单一材料的不足，达到“1+1＞2”的效果。制备过程中改变制备工艺，将两种或两种以上的材料按不同方式复合，可以制备出不同结构的微针，从而得到单一材料微针不具备的性质。目前复合方式主要包括均匀型、层状型、包衣型、包裹微粒型四类。包裹微粒型较均匀型以及层状型来说可以解决药物的载入可能会降低材料的强度的问题。实验拟将PVP与PVA、HA、卡波姆940、海藻酸钠、Dex-40、CMC-Na溶液混合制备微针，对用量进行优选。
3.1.4微针背衬层复合基质材料比例的筛选
有研究表明，称取脆性材料5g与韧性材料1.5g，往里面加入10mL的蒸馏水，均匀溶解后能制得针形良好，机械效能优的微针。本实验优选PVP与PVA最优配比。分别以PVP与PVA配比1:1、1:2、1:3、1:4、2:1、2:3、3:1、3:2、3:4、4:1、4:2、4:3及10:3，按照上述“2.1项下”方法制备微针，基质材料与加水量的比例13：20，制备复合材料微针，显微镜下观察其成形性，铝箔穿刺考察微针的机械效能。
3.2微针背衬层加水量的选择
在DMNs-TP制备的过程中，需要向PVP与PVA的基质材料中加入适量水来进行溶解，而加水量直接影响微针的机械强度。实验中考察了6、8、10、12、14mL，按照“2.1项下”项方法，PVP与PVA配比为10:3，制备DMNs-TP，相机下观察其成形性，并通过铝箔穿刺观察其机械强度。
3.3干燥方法的选择
干燥方式对微针的形态有很大影响。实验对室温干燥器干燥、30℃烘箱干燥以及30℃真空干燥三种进行考察，分别让微针在三种方式下干燥，以“2.2、2.3项下”微针的成型性评分作为考察指标。
3.4微针针尖处方优化
3.4.1微针针尖增塑剂的选择
微针制备时，为保证针尖的机械性能，在针尖基质中加入增塑剂以增强微针的机械效能。本实验中在基质中加入0.1g的CMC-Na、甘油以及PEG-400等增塑剂，与未加增塑剂的微针机械性能进行比较筛选。
3.4.2微针针尖助溶剂的选择
由于实验中微针所载的药均为脂溶性成分，为了更好地使微针载药，且使其载药均匀，实验中在针尖的基质材料中加入一定量的助溶剂来加大药物的溶解。本实验中考察了无水乙醇、甘油、丙二醇等助溶剂对药物溶解情况以及微针的机械强度的影响。实验前发现5mg甲素在加入了0.4mL的助溶剂后能完全分散并溶解于基质材料类，为进一步增大载药量，在针尖基质材料液里加入7mg的甲素(过量)以及0.4mL不同的助溶剂，按照“2.1项下”项方法制备微针，并观察微针的载药量，载药均匀度以及成型性以及机械性能。其中甲素的色谱条件为甲醇：水＝42:58(v/v)；流速：1.0mL/min；检测波长：218nm。
3.4.3微针针尖加醇量的选择
通过上述实验可知在针尖基质材料液中加入无水乙醇可以增大甲素的溶解度，但因为基质材料是水溶性的，往其中加入乙醇会影响微针的机械性能等，同时也会影响微针的载药量。本实验在考察了0.2、0.4、0.6、0.8mL不同加醇量，按照“2.1项下”项方法制备微针，并观察微针的载药量，载药均匀度以及机械性能。
3.4.4正交优选DMNs-TP微针针尖处方
其中加水量、加醇量以及加药量为因素，以成型性、机械性能、载药量、载药均匀度为评价指标，正交试验优选DMNs-TP针尖制备。其中成型性与机械性能根据客观评分，而载药量评分，则是当载药为0-50μg时评70分，50-100μg时评80分，100-150μg时评90分，150-200μg时评100分；RSD值评分则为当RSD值为0-2.5％为90分，2.5-5％为80分，5-7.5％为70分，7.5-10％为60分，10-15％为50分，15以上的为40分。其权重系数分别为(0.2，0.2，0.4，0.2)，综合评分＝成型性评分×0.2+机械性能评分×0.2+载药量评分×0.4+RSD值评分×0.2，正交表以及正交试验表结果见表1-3、1-4所示。
表1-3正交因素表
Figure BDA0003101137230000131
表1-4正交试验表
Figure BDA0003101137230000141
3.4.5DMNs-TG加药量的选择
结果表明，0.8mL水与0.4mL的乙醇最多可以溶解7mg的多苷提取物，因此实验中考察了往针尖材料中加入6mg、7mg、8mg、9mg、10mg的多苷提取物后是否会对微针的成型性以及机械效能产生影响，并同时观察微针的载药量和载药均匀度。
4实验结果
4.1微针基质选择和筛选
4.1.1基质除气泡方法选择结果
结果如图1所示，静置20min后，基质气泡几乎没有变化；而超声20min之后，基质中气泡大约一半被去除；而当离心20min之后，基质中的气泡全部被去除。结果显示：离心除气泡效果最好。离心时间可根据制备基质溶液的量来进行变化。
4.1.2微针背衬层单一基质材料制备微针的结果
结果见表1-5可知，不同浓度的单一基质制备微针时，其中能得到完整的微针阵列和较好的微针形态的有50％、60％、70％的PVP溶液；15％的PVA溶液；2％的HA溶液；2％的海藻酸钠溶液；1％的CMC-Na溶液；10％、15％的硫酸软骨素溶液；结果如图2所示。可从结果得知其中PVP为脆性材料，制备的微针贴片易发生断裂，而PVA，HA等均为相对韧性的材料，实验中选用脆性与韧性材料的搭配来制备复合的自溶性微针，实验中通过将韧性材料加到脆性材料里来改善脆性材料易碎的性质。因此本次实验选用PVP作为脆性材料。
表1-5单一基质材料制备微针的结果
Figure BDA0003101137230000142
Figure BDA0003101137230000151
4.1.3微针背衬层复合基质材料制备微针的结果
结果见表1-6可知，PVP和PVA搭配制备的微针综合性能较优，微针阵列与针形结果如图3所示。
表1-6PVP与不同韧性材料配比成型性评分结果表
Figure BDA0003101137230000152
4.1.4微针背衬层复合基质材料比例的筛选结果
结果见表1-7中可知，PVP与PVA比例为3:1和10:3时，其综合的物理性能较优，但根据鼠皮穿刺发现10:3比例的微针其微针穿刺鼠皮时的孔洞要比3:1比例的微针多，表明10:3比例的微针的穿刺效果要好些，故选择10:3比例的微针。具体穿刺情况结果如图4、5所示。
表1-7复合基质材料比例筛选的结果评分表
Figure BDA0003101137230000153
Figure BDA0003101137230000161
4.2微针背衬层加水量结果
结果见表1-8所示，结果发现，加水量为8mL制备的DMNs-TP成形性和机械强度最优。具体表征结果如图6所示。
表1-8不同加水量微针的性能评分表
加水量(mL) 成膜性 平整度 气泡量 含针率 机械效能 总评分
6 3 3 3 3 良，不易弯曲 12
8 3 3 3 3 优，不易弯曲 12
10 3 3 3 3 优，较易弯曲和断裂 12
12 3 2 3 2 优，易断裂 10
14 3 2 3 2 优，易断裂 10
4.2微针背衬层加水量结果
结果见表1-8所示，结果发现，加水量为8mL制备的DMNs-TP成形性和机械强度最优。具体表征结果如图6所示。
表1-8不同加水量微针的性能评分表
加水量(mL) 成膜性 平整度 气泡量 含针率 机械效能 总评分
6 3 3 3 3 良，不易弯曲 12
8 3 3 3 3 优，不易弯曲 12
10 3 3 3 3 优，较易弯曲和断裂 12
12 3 2 3 2 优，易断裂 10
14 3 2 3 2 优，易断裂 10
4.3干燥方法选择的结果
不同干燥方式成型性具体评分结果见表1-9所示，而形态图结果如图7所示，研究发现真空干燥后微针贴片内布满气泡，气泡在的地方微针不可见；30℃恒温干燥后微针贴片会出现皱缩，且背衬层会有少量的气泡。干燥器常温干燥后的微针基层平整，微针阵列清晰，微针的数目和针形与模具的相同，针尖锐利，微针的长度一致，形态较好，无断针或弯针等现象，表明干燥器常温干燥效果更好。夏季制备时置于室内干燥器干燥，温度在30±5℃内波动；冬季制备时，将干燥器置于真空干燥箱内，不加压，温度设置30℃进行干燥。
表1-9不同干燥方式微针成型性评分表
Figure BDA0003101137230000162
Figure BDA0003101137230000171
4.4微针针尖处方优选结果
4.4.1微针增塑剂的选择结果
结果如图8可以看出，当往微针基质材料中加入CMC-Na的微针机械性能要强于未加以及加其他的。因此结果表明往微针的针尖基质材料中加入CMC-Na可以增加微针的机械效能。
4.4.2微针针尖助溶剂的选择结果
微针中加入助溶剂载药及均匀度结果见表1-10所示，机械性能结果如图1-9所示。结果发现，加入助溶剂后，微针的成型性均良好；在微针针尖加入无水乙醇时，微针的载药最大且微针的载药均匀度良好，微针的机械效能无太大的影响，且微针能穿刺过大鼠的皮肤，因此本实验中选用无水乙醇作为助溶剂。
表1-10不同助溶剂微针的表征
Figure BDA0003101137230000172
4.4.3微针针尖加醇量的选择结果
微针针尖加入不同量的无水乙醇结果见表1-11所示，微针机械性能结果如图10所示。结果表明，实验中加入0.6mL的乙醇时，微针针尖机械性能不受太大影响，且载药量适中，其RSD值小于3％，符合要求。
表1-11不同加醇量微针的表征
Figure BDA0003101137230000173
Figure BDA0003101137230000181
4.4.4正交优选结果
由极差R可知，对微针针尖影响最大的加水量(A)，其次是加醇量(B)，加药量(C)。以两组平行正交数据组间误差为误差项进行方差估算，结果见表1-13，由表1-12结果分析可见，DMNs-TP的针尖处方最佳提取工艺为A2B1C3，即0.8mL的水、0.4mL的无水乙醇以及7mg的甲素对照品。
表1-12正交试验数据
Figure BDA0003101137230000182
从上可知，最佳微针针尖处方为A2B1C3，即加水量0.8mL，加醇量0.4mL、以及加药量为7mg。
表1-13正交试验数据方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
加水量(mL) 55.336 2 22.031 19.000 *
加醇量(mL) 141.556 2 56.359 19.000 *
加药量(mg) 166.889 2 66.445 19.000 *
误差 2.5117 2
注：F0.05(1，2)＝19，F值＞19表明有显著性差异。
4.4.5DMNs-TG加药量的选择
微针针尖加入不同药量的成型性以及机械效果情况结果如图11所示，微针的载药量以及微针载药均匀性结果见表1-14所示。可以知道，当往微针针尖加入8mg的多苷提取物时，微针的成型性及机械效能未受太大影响，且其载药均匀性好，因此实验中往微针针尖的材料中加入8mg的多苷溶液。
表1-14不同多苷加药量微针的表征
Figure BDA0003101137230000191
5DMNs-TP制备工艺的确定及验证
5.1DMNs-TP制备工艺的确定
根据单因素实验考察了制备微针的单一以及复合基质的种类、复合基质的比例、加水量、基质溶液除气泡的方法、干燥方法、针尖加入的助溶剂的种类、增塑剂的种类、并用正交试验优选助溶剂的用量以及载药量以及加水量等，最终确定了DMNs-TP的制备工艺为采用两步离心法制备微针，其背衬层处方为PVP 34.48％与PVA 10.34％、蒸馏水55.17％，溶解后离心，5000r/min离心20min除气泡的基质溶液；微针针尖处方为PVP 26.78％、PVA8.03％、CMC-Na 0.54％、雷公藤甲素0.37％、蒸馏水42.85％和无水乙醇21.42％，使其充分溶解。制备时取50μL左右的针尖材料液置于PDMS阴模中，置于离心机上4000r/min离心10min后取出，刮去多余的材料液后，置于干燥器内室温干燥6h后，取出，在上面加入0.9mL的背衬层材料液，置于离心机上4000r/min离心5min后取出，置于干燥器内干燥，干燥后脱模即得。
5.2DMNs-TP微针性能验证
5.2.1DMNs-TP载药量及载药均匀度的测定
按上述方法制备了3份DMNs-TP，测定其载药量，并测定其3份微针载药量的RSD值，观察药液是否分布均匀，结果发现微针的载药量为154.46±1.52μg，RSD值0.98％，结果见表1-15。
表1-15DMNs-TP微针载药量
Figure BDA0003101137230000201
5.2.2微针成型性考察
肉眼观察微针的成型，观察微针的针型是否清晰完整，并用相机进行拍照。并将所制备好的微针置于正置光学显微镜下观察其外观形态，结果如图12所示。
5.2.3皮肤穿刺性能考察
为进一步确定微针的穿刺效果，将制备好的DMNs-TP，快速压入脱毛活体SD大鼠上的皮肤处按压1min后，移除DMNs，并进行亚甲基蓝染色和H&E染色；具体步骤按“2.3项下”方法进行。结果如图1-13所示。结果发现，微针能穿透大鼠的皮肤角质层，具有良好的机械性能。
6自溶性微针的处方与制备
6.1自溶性微针的处方
已确定DMNs-TP微针的针尖基质处方PVP 26.78％、PVA 8.03％、CMC-Na 0.54％、雷公藤甲素0.37％、蒸馏水42.85％和无水乙醇21.42％；DMNs-TG微针的针尖基质处方为PVP 26.77％、PVA 8.03％、CMC-Na 0.54％、雷公藤多苷0.43％、蒸馏水42.82％和无水乙醇21.41％；而微针的背衬层基质处方为PVP 34.48％与PVA 10.34％、蒸馏水55.17％。
6.2自溶性微针的制备
按照“2.1项下”步骤制备微针。针头的制备：将针尖材料称取充分溶解并
搅拌均匀后注入微针模具中，4000r/min离心10min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥6h后取出备用；微针背衬层的制备：称取基质材料搅拌均匀5000r/min离心20min除去气泡后注入针尖含药的微针模具，4000r/min离心5min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
7讨论与总结
按上述方法制备3份DMNs-TP进行成型性与成型性能，同时测定其载药量后发现三份微针成型性与机械强度均好，载药量的RSD值为0.98％，说明该工艺稳定可行。
采用两步离心法制备微针，载药微针针尖可以使药物大部分较迅速到达体内迅速起效，加之微针基质的缓释效果，可以提高雷公藤甲素的用药安全性。
试验例2。DMNs-TP以及DMNs-TG对RA的初步药效学研究
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)主要是以滑膜细胞增生，多种炎性细胞浸润，结缔组织增生，及软骨和骨组织的破坏为病理特点的一种慢性的自身免疫性疾病。研究表明，TNF-ɑ、IL-17、IgG、IgA、IgM、PGE2的表达与RA的发病密切相关。有研究还发现，OPG/RANKL/RANK信号通路可以降低关节周围骨量减少、骨侵蚀和损伤，从而达到治疗RA的作用。
本实验中将牛Ⅱ胶原蛋白和不完全氟氏佐剂低温等体积充分乳化后两次足跖皮下注射的方法来造类风湿性关节炎病理模型。将雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组、吡罗昔康贴片组、雷公藤多苷片组、DMNs-TP高中低组以及DMNs-TG高中低组。实验中对给药期间大鼠体重、关节指数以及组肿胀度的变化进行观察，同时对各组大鼠关节滑膜和软骨进行H&E染色观察炎性细胞的浸润情况，并用ELISA检测各组给药后血清中TNF-ɑ、IL-17、IgG、IgA、IgM、PGE2因子含量，Western Blot检测各组大鼠关节滑膜中OPG、RANKL表达。吡罗昔康贴片和雷公藤多苷片均为已经上市的对类风湿性关节炎有较好的治疗作用的剂型，考虑自溶性微针的给药方式，选用吡罗昔康贴片作为阳性药；同时考虑DMNs-TG与雷公藤多苷片有相同的药效成分，实验中还将雷公藤多苷片作为另一阳性药。
1实验材料
1.1实验仪器
Figure BDA0003101137230000221
1.2实验试剂
Figure BDA0003101137230000222
Figure BDA0003101137230000231
Figure BDA0003101137230000241
1.3实验动物
SD大鼠(240±20g)，批号：430726200100342862；许可证号：SCXK(湘)2019-0013，由长沙天勤生物技术有限公司提供。
2自溶性微针的初步药效学研究
2.1实验方法
2.1.1动物分组
将100只SD大鼠适应性喂养1w后，随机分为空白组；模型组；雷公藤多苷自溶性微针高、中、低剂量组；雷公藤甲素自溶性微针高、中、低剂量组；吡罗昔康贴片组以及雷公藤多苷片剂组。
2.1.2造模方法
造模前将买来的胶原溶液与不完全氟氏佐剂从4℃冰箱中取出，取一份冰乙酸与牛II型胶原配成的胶原溶液不完全氟氏佐剂低温等体积充分乳化，乳化后取一滴滴入装满水的烧杯中，呈水滴状即证明充分乳化。随后将除正常组外的9组大鼠先左后足跖皮下注射乳化剂0.4mL，造模第14d同法右后足跖注射0.1mL加强造模6d。
2.1.3给药各组的制备
按第一部分“6.1项下”的处方制备DMNs-TP作为高剂量，中剂量加药量为高剂量的一半，低剂量加药量为中剂量的一半；按第一部分“6.1项下”的处方制备DMNs-TG，作为高剂量，中剂量加药量为高剂量的一半，低剂量加药量为中剂量的一半。吡罗昔康贴片以及雷公藤多苷片组的给药剂量则根据体型系数换算法公式计算。结果可知雷公藤多苷片组以5.6mg/kg进行灌胃，1d/1次；吡罗昔康组为每天1贴，即4.47mg/kg。其余各微针贴片组均为每天一片面积为2.75cm2微针贴剂进行给药。每组每天均正常给水和饲料。造模完成后开始给药，给药时间为28d。
Figure BDA0003101137230000251
(D代表种属剂量(mg/Kg)，R代表体系系数，大鼠的体表系数为0.09，人的体表系数为0.1、W表示体重。一般人体重按60kg计。大鼠按照0.25kg计。)
2.1.4数据处理
所有数据采用
Figure BDA0003101137230000252
表示，采用SPSS17.0软件进行数据的处理统计，计量数据资料符合正态分布的采用单因素方差分析，方差齐性时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett’sT3法比较。P<0.05为差异具有统计学意义。
2.2检测指标
2.2.1大鼠外观评估及体质量变化
观察大鼠给药及造模期间皮毛光泽度和精神状态，分别于造模前、第二次造模、给药前、给药14d、给药结束后测定大鼠体质量，做好记录。
2.2.2大鼠关节炎指数评分
分别于造模后及给药后对每组大鼠的后足关节及继发病变程度进行观察并评分，评分标准见表2-1所示。
表2-1大鼠关节指数评分项目表
Figure BDA0003101137230000253
2.2.3大鼠足肿胀度的观察
相机拍取大鼠给药前及给药后足爪图片，并用游标卡尺测量大鼠足趾肿胀的厚度，即为足趾肿胀度；分别于造模前、造模后(给药前)、给药14d、28d测量各组大鼠的左后足容积，并进行分析。
2.2.4大鼠脏器指数测定
研究表明，雷公藤甲素以及雷公藤多苷具备多种脏器毒性。实验于给药后处死大鼠，取出各组大鼠的心、肝、脾、肺、肾后，剔除脂肪和筋膜，挤尽血液，用滤纸吸干表面的液体并精密称量，分别计算其占体质量的比例(mg/g)。
2.2.5H&E染色对各组大鼠关节滑膜和软骨
各组大鼠结束给药后，禁食不禁水喂养24h后，取出各组大鼠的关节滑膜与关节软骨置于4％的多聚甲醛中固定，后按照文献查阅的H&E染色的步骤进行染色。
2.2.6ELISA测定大鼠血清中的TNF-α、IL-17、IgG、IgA、IgM、PGE2
大鼠给药28d后，禁食不禁水喂养24h后腹主动脉取血，3000r/min，10min分离血清，分别按TNF-α、IL-17、IgG、IgA、IgM、PGE2试剂盒方法，检测各组大鼠血清中上述指标含有量。
2.2.7Western Blot测定各组大鼠关节滑膜中OPG、RANKL的表达
大鼠给药28d，禁食不禁水喂养24h后，处死。取出各组大鼠的3个关节滑膜置于空EP管中，置于-80℃冰箱冷冻保存。将低温冷冻保存的各组大鼠滑膜组织粉碎后，加入细胞裂解液提取蛋白，后进行电泳(蛋白上样量为40μg)，恒流电转到PVDF膜后TBST漂洗，加入5％脱脂奶粉避光封闭2h后漂洗5次，加入一抗(RANKL、OPG的1/1000稀释液)4℃恒温过夜。漂洗3次后添加二抗(RANKL、OPG的1/50000稀释液)，TBST漂洗5次后加入ECL，曝光后用BandScan分析胶片灰度值(选择GAPDH为内参蛋白)。
3实验结果
3.1大鼠外观及体质量变化
结果如图14所示，造模后，除空白组外，各组大鼠精神萎靡、毛发暗淡、后足红肿，行动受限，24h后足爪明显肿胀，14d后出现对侧足爪发生继发性病变，20d后模型足大鼠普遍出现足爪红肿；给药后各组大鼠精神较好，进食正常，毛色有光泽，与正常组相似。从下列体重变化图可以看出，造模后除空白组之外，其余各组的体重增长都有明显降低，而开始给药后，各组的体重增长又有了升高。
3.2大鼠关节指数的测量
结果见表2-2所示，造模后各组之间的关节指数与空白组相比，差异极显著(P<0.01)，说明该方法造模效果好；而各组与模型组相比，无显著性差异，说明该方法的造模效果稳定。给药结束后，吡罗昔康组、DMNs-TP高剂量组以及DMNs-TG高剂量组与模型组相比，差异极显著(P<0.01)；而雷公藤多苷片组、DMNs-TP中剂量组、DMNs-TP低剂量组、DMNs-TG中剂量组与DMNs-TG低剂量组与模型组相比，差异显著(P<0.05)；关节指数直观分析数据说明，吡罗昔康组、DMNs-TP高剂量组以及DMNs-TG高剂量组的治疗效果要优于雷公藤多苷片组、DMNs-TP中剂量组、DMNs-TP低剂量组、DMNs-TG中剂量组与DMNs-TG低剂量组；而DMNs-TP高剂量组的效果要优于DMNs-TG高剂量组，从上述数据可以知道，各给药组效果最好的是DMNs-TP高剂量组。
表2-2各组大鼠造模后关节指数评分比较(
Figure BDA0003101137230000271
n＝8，分)
组别 关节指数评分(给药前) 关节指数评分(给药后)
空白对照组 0<sup>4)</sup> 0<sup>4)</sup>
模型组 8.11±0.60<sup>2)</sup> 6.11±0.60<sup>2)</sup>
吡罗昔康组 8.33±1.22<sup>2)</sup> 3.33±0.50<sup>2)4)</sup>
雷公藤多苷片组 7.80±0.42<sup>2)</sup> 4.50±0.53<sup>2)3)</sup>
DMNs-TP高剂量组 7.70±0.48<sup>2)</sup> 3.67±0.82<sup>2)4)</sup>
DMNs-TP中剂量组 7.89±0.33<sup>2)</sup> 3.71±1.25<sup>2)3)</sup>
DMNs-TP低剂量组 7.80±1.14<sup>2)</sup> 4.00±0.92<sup>2)3)</sup>
DMNs-TG高剂量组 7.70±1.25<sup>2)</sup> 4.13±0.35<sup>2)4)</sup>
DMNs-TG中剂量组 7.70±0.48<sup>2)</sup> 4.50±0.76<sup>2)3)</sup>
DMNs-TG低剂量组 7.88±1.13<sup>2)</sup> 4.88±0.64<sup>2)3)</sup>
注：与正常组比较，1)P<0.05；2)P<0.01。与模型组比较，3)P<0.05；4)P<0.01。
3.3大鼠足爪图片及大鼠肿胀度
各组不同时期足肿胀度结果见表2-3所示，造模后各组大鼠足肿胀度图片如图15所示，结束后各组足肿胀度图片如图16所示。从表2-3可知，造模后，除空白组外，各组足肿胀程度明显上升；各组之间的关节指数与空白组相比，差异极显著(P<0.01)，说明该方法造模效果稳定。给药结束后，各治疗组除DMNs-TG低剂量组外均与模型组差异极显著(P<0.01)，说明各治疗组除DMNs-TG低剂量组外均对RA有治疗作用；而DMNs-TG低剂量组虽然有改善的趋势，但无明显差异(P＞0.05)。各治疗组与空白组相比，除阳性药组外，DMNs-TP各组间高剂量组、中剂量组无明显差异(P＞0.05)，低剂量组差异极显著(P<0.01)；而DMNs-TG各组间高剂量组无明显差异(P＞0.05)，中剂量组及低剂量组差异极显著(P<0.01)；说明DMNs-TP高剂量组、中剂量组和DMNs-TG高剂量组效果优于DMNs-TP低剂量组和DMNs-TG中剂量组、低剂量组，其中DMNs-TP高剂量组效果最好。
表2-3各组大鼠在不同时间的足肿胀度数据(
Figure BDA0003101137230000281
n＝8，cm)
Figure BDA0003101137230000282
注：与正常组比较，1)P<0.05；2)P<0.01。与模型组比较，3)P<0.05；4)P<0.01。
3.4各组大鼠脏器指数的情况
给药后各组大鼠脏器指数结果见表2-4所示，结果发现大鼠造模后心脏指数、肺脏指数、脾脏指数、肾脏指数、肝脏指数均显著性上升，与空白组相比有显著性差异(P<0.01)。给药结束后，各治疗组大鼠的脏器指数有不同程度的下降，与模型组相比，其中DMNs-TP高剂量组的心脏指数、肝脏指数、脾脏指数、肺脏指数显著性降低(P<0.01)，肾脏指数有降低(P<0.05)；DMNs-TP中剂量组脾脏指数显著性降低(P<0.01)；心脏指数、肺脏指数有降低(P<0.05)；DMNs-TP低剂量组的心脏指数、肺脏指数有降低(P<0.05)；DMNs-TG各剂量组的脾脏指数显著性降低(P<0.01)，肺脏指数有降低(P<0.05)；雷公藤多苷片组的脾脏指数有显著性降低(P<0.01)；吡罗昔康组的心脏指数、肺脏指数、肾脏指数有降低(P<0.05)，脾脏指数显著性降低(P<0.01)。综上，DMNs-TP组降低脏器指数的效果最好且效果优于雷公藤多苷片组及吡罗昔康组，但DMNs-TG各组降低脾脏指数的效果要优于其他各组，且其效果比雷公藤多苷片组要好。具体脏器指数趋势结果如图如17所示。
表2-4各组大鼠脏器指数的比较(
Figure BDA0003101137230000283
n＝8，mg/g)
Figure BDA0003101137230000291
注：与正常组比较，1)P<0.05；2)P<0.01。与模型组比较，3)P<0.05；4)P<0.01。
3.5各组大鼠H&E染色的情况
滑膜H&E结果如图18所示，正常组大鼠滑膜细胞排列规则、层次明显；模型组见滑膜细胞脉络模糊且排列紊乱，滑膜下层纤维组织增生，炎性细胞浸润及结缔组织增生；DMNs-TP高、中剂量组与DMNs-TG高及吡罗昔康组、雷公藤多苷片组上述情况明显减少；低剂量组上述情况轻微减少。各组滑膜炎病理学评分结果见表2-5所示，结果表明正常组无滑膜炎，模型组为高度滑膜炎，DMNs-TP中、低剂量组与DMNs-TG中、低剂量组为中度滑膜炎，DMNs-TP高剂量组、DMNs-TG高剂量组，雷公藤多苷片组及吡罗昔康组为轻度滑膜炎；模型组较之正常组评分显著升高，给药后各组均明显下降，其中DMNs-TP高、中剂量组与DMNs-TG高剂量组下降最多，其中DMNs-TP高剂量组和吡罗昔康组下降度类似，DMNs-TG高剂量组下降幅度较少与雷公藤多苷片组下降幅度大致相同；但与空白相比，DMNs-TP高剂量组无差异(P＞0.05)，吡罗昔康组有差异(P<0.05)；DMNs-TG高剂量组、雷公藤多苷片组有显著差异(P<0.01)；综上可知，DMNs-TP与DMNs-TG各剂量组均能抑制RA大鼠滑膜炎症和血管新生，以DMNs-TP高剂量组为最优。
关节滑膜H&E结果如图19所示，从H&E染色中可以知道，空白组小鼠软骨表层结构完整，软骨细胞均匀分布，软骨基质染色均匀，潮线基本平整，未见其他明显变化；模型组小鼠可见关节组织缺失严重，软骨结构紊乱部分变薄直至缺失，且软骨细胞大量减少消失，局部可见血细胞在外游离；其余各给药组软骨组织关节软骨表面较模型组更为完整，裂隙减小，软骨细胞较模型组更多，无血细胞在外游离。Markin’s评分结果见表2-6所示，与空白组相比，DMNs-TP高剂量组及吡罗昔康组外的Markin’s评分无显著差异，其余各给药组的Markin’s评分均显著减少(P<0.01)，与模型组相比，各给药组的Markin’s评分均显著减少(P<0.01)，说明各给药组对RA大鼠的关节软骨均有明显改善作用，以DMNs-TP高剂量组和吡罗昔康组最优。
表2-5各组大鼠膝关节滑膜滑膜炎评分比较(
Figure BDA0003101137230000301
n＝3，分)
组别 滑膜细胞增殖 结缔组织增生 炎性细胞浸润 滑膜炎评分
空白对照组 0.00±0.00 0.67±0.58 0.00±0.00 0.67±0.58
模型组 1.67±0.58 2.67±0.58 4.00±0.00 8.33±1.15<sup>4)</sup>
雷公藤多苷片组 1.00±1.00 1.33±0.58 1.00±0.00 3.33±1.53<sup>2)</sup>
吡罗昔康组 0.33±0.58 2.00±0.00 0.33±0.58 2.67±0.58<sup>1)4)</sup>
DMNs-TP高剂量组 0.33±0.58 1.33±1.15 0.67±0.58 2.33±1.53<sup>4)</sup>
DMNs-TP中剂量组 0.67±0.58 1.67±0.58 0.33±0.58 3.00±1.00<sup>2)4)</sup>
DMNs-TP低剂量组 1.00±1.00 2.00±0.00 1.67±0.58 4.33±0.58<sup>2)4)</sup>
DMNs-TG高剂量组 0.67±0.58 0.67±0.58 2.67±0.58 3.67±0.58<sup>2)4)</sup>
DMNs-TG中剂量组 0.33±0.58 1.67±1.53 2.00±1.00 4.33±0.58<sup>2)4)</sup>
DMNs-TG低剂量组 0.67±0.58 1.00±1.00 3.00±1.00 5.00±1.00<sup>2)4)</sup>
注：与正常组比较，1)P<0.05；2)P<0.01。与模型组比较，3)P<0.05；4)P<0.01。
表2-6各组大鼠膝关节Markin’s评分比较(
Figure BDA0003101137230000302
n＝3，分)
组别 Markin’s评分
空白对照组 0±0
模型组 10.67±0.58<sup>2)4)</sup>
雷公藤多苷片组 2.67±0.58<sup>2)4)</sup>
吡罗昔康组 0.67±0.58<sup>4)</sup>
DMNs-TP高剂量组 0.67±0.58<sup>4)</sup>
DMNs-TP中剂量组 2.33±0.58<sup>2)4)</sup>
DMNs-TP低剂量组 2.67±0.58<sup>2)4)</sup>
DMNs-TG高剂量组 2.33±0.58<sup>2)4)</sup>
DMNs-TG中剂量组 3.00±1.00<sup>2)4)</sup>
DMNs-TG低剂量组 4.33±0.58<sup>2)4)</sup>
注：与正常组比较，1)P<0.05；2)P<0.01。与模型组比较，3)P<0.05；4)P<0.01。
3.6血清中TNF-α、IL-17、IgG、IgA、IgM、PGE2的表达
根据各因子标准品的OD值绘制标准品的剂量反应曲线，结果如图20所示。将各组的值带入得到具体的剂量，其血清中TNF-α、IL-17、IgG、IgA、IgM、PGE2的表达结果见表2-7、2-8所示。各组小鼠血清ELISA结果，模型组血清中TNF-α、IL-17、PGE2、IgG、IgA、IgM各炎症因子的值均高于空白对照组，有显著性差异(P<0.01)，说明实验造模成功；给药结束后，与空白组相比DMNs-TP高剂量组中PGE2无明显差异(P＞0.05)、IgG、IgA、IgM有差异(P<0.05)，其余因子显著性差异(P<0.01)；吡罗昔康组中PGE2无明显差异(P＞0.05)，IgG、IgA有差异(P<0.05)，其余因子显著性差异(P<0.01)；雷公藤多苷片组及DMNs-TG高剂量组中PGE2有差异(P<0.05)，其余因子显著性差异(P<0.01)；其余各组各因子均为显著性差异(P<0.01)。与模型组相比，各组之间除了DMNs-TG低剂量组、空白组之外的炎症因子的降低都具有显著性差异(P<0.01)，DMNs-TG低剂量组的TNF-α、PGE2、IgG降低有差异(P<0.05)，IL-17、IgA、IgM的降低都具有显著性差异(P<0.01)，由此说明各组对于RA均有治疗作用。与贴剂组相比，DMNs-TP中剂量组IgA有差异(P<0.05)；DMNs-TP低剂量组的PGE2、IgG、IgA有差异(P<0.05)，IgM有显著差异(P<0.01)；DMNs-TG中剂量组的IgG、IgA、TNF-α、PGE2有差异(P<0.05)，IgM有显著性差异(P<0.01)；DMNs-TG低剂量组的TNF-α、PGE2、IgG有显著差异(P<0.01)，IgA、IgM有差异(P<0.05)。与雷公藤多苷片组相比，DMNs-TP中剂量组IgA有显著差异(P<0.01)；DMNs-TP低剂量组IgA、IgM有差异(P<0.05)；DMNs-TG低剂量组TNF-α、IL-17、PGE2、IgG、IgA、IgM有显著性差异(P<0.01)。综上可知，疗效最优的是DMNs-TP高剂量组。
表2-7各组大鼠血清中TNF-α、IL-17、PGE2的表达(
Figure BDA0003101137230000311
n＝8，OD值，pg/mL)
组别 TNF-α IL-17 PGE2
空白对照组 46.40±14.87<sup>4)6)8)</sup> 35.60±9.44<sup>4)6)8)</sup> 82.24±32.06<sup>4)7)</sup>
模型组 193.39±56.63<sup>2)6)8)</sup> 83.55±8.24<sup>2)6)8)</sup> 228.15±73.06<sup>2)6)8)</sup>
雷公藤多苷片组 115.57±23.04<sup>2)4)</sup> 56.32±3.50<sup>2)4)</sup> 126.43±31.70<sup>1)4)</sup>
吡罗昔康组 93.61±25.59<sup>2)4)</sup> 51.86±2.53<sup>2)4)</sup> 114.43±30.73<sup>4)</sup>
DMNs-TP高剂量组 95.34±23.53<sup>2)4)</sup> 45.47±4.81<sup>2)4)</sup> 123.33±37.90<sup>4)</sup>
DMNs-TP中剂量组 117.91±36.06<sup>2)4)</sup> 52.41±5.99<sup>2)4)</sup> 143.21±35.88<sup>2)4)</sup>
DMNs-TP低剂量组 123.93±24.39<sup>2)4)</sup> 57.52±9.86<sup>2)4)</sup> 159.28±41.20<sup>2)5)4)</sup>
DMNs-TG高剂量组 111.68±24.36<sup>2)4)</sup> 52.59±8.95<sup>2)4)</sup> 126.18±17.57<sup>1)4)</sup>
DMNs-TG中剂量组 135.49±33.52<sup>2)4)5)</sup> 56.81±7.47<sup>2)4)</sup> 159.12±35.26<sup>2)5)4)</sup>
DMNs-TG低剂量组 155.12±44.09<sup>2)3)6)8)</sup> 62.51±8.47<sup>2)4)8)</sup> 181.75±44.04<sup>2)3)6)8)</sup>
注：与正常组比较，1)P<0.05；2)P<0.01。与模型组比较，3)P<0.05；4)P<0.01；与吡罗昔康组比较，5)P<0.05；6)P<0.01；与雷公藤多苷片组比较，7)P<0.05；8)P<0.01。
表2-8各组大鼠血清中IgG、IgA、IgM的表达(
Figure BDA0003101137230000321
n＝8，OD值)
Figure BDA0003101137230000322
注：与正常组比较，1)P<0.05；2)P<0.01。与模型组比较，3)P<0.05；4)P<0.01；与吡罗昔康组比较，5)P<0.05；6)P<0.01；与雷公藤多苷片组比较，7)P<0.05；8)P<0.01。
3.7滑膜中OPG、RANKL的表达
电泳结果如图21所示，滑膜中OPG、RANKL的表达结果见表2-9所示。实验结果表明，与空白对照组相比，模型组大鼠踝关节滑膜组织中OPG的蛋白表达降低，RANKL蛋白表达及RANKL/OPG的比值均显著升高(P<0.01)，说明模型造模成功；与模型组相比，DMNs-TP各剂量组以及DMNs-TG各剂量组均可以升高OPG的表达、降低RANKL表达和RANKL/OPG比值的趋势，且呈现出一定的量效关系。其中高剂量组作用效果最佳，中剂量组次之，低剂量组虽有降低的趋势，但DMNs-TG低剂量组无统计学意义(P＞0.05)。综上可知，DMNs-TG
及DMNs-TP各剂量组对RA均有不同程度的治疗作用，尤以DMNs-TP高剂量组最优。
表4-9各组大鼠滑膜中OPG、RANKL的蛋白表达以及RANKL/OPG比值
Figure BDA0003101137230000323
Figure BDA0003101137230000324
Figure BDA0003101137230000331
注：与正常组比较，1)P<0.05；2)P<0.01。与模型组比较，3)P<0.05；4)P<0.01；与吡罗昔康组比较，5)P<0.05；6)P<0.01；与雷公藤多苷片组比较，7)P<0.05；8)P<0.01。
4总结与讨论
采用牛Ⅱ胶原蛋白和不完全氟氏佐剂造模后，除空白组外，其余各组之间的关节肿胀度以及关节指数与模型组相比无明显差异，说明该造模方法稳定。造模后，模型组较正常组大鼠足爪见明显肿胀、畸形及溶骨现象，给药后各组症状均有减轻，正常组未见异常；H&E染色显示，正常组大鼠滑膜及软骨组织形态正常，模型组大鼠滑膜组织中有大量炎细胞浸润、结缔组织增生，软骨组织中结构紊乱，软骨细胞大量减少消失，局部可见血细胞在外游离；给药后各组上述情况均有减少，尤其是DMNs-TP高剂量组；各治疗组大鼠的脏器指数均有不同程度地降低，DMNs-TP组降低脏器指数的效果最好且效果还优于雷公藤多苷片组及吡罗昔康组，但DMNs-TG各组降低脾脏指数的效果要优于其他各组，其效果比雷公藤多苷片组还要好。ELISA结果分析发现各治疗组TNF-ɑ、IL-17、PGE2、IgG、IgM、IgA的表达较模型组均有明显减少；免疫组化结果显示，模型组大鼠滑膜组织中OPG的表达显著降低、RANKL及RANKL/OPG比值显著升高，用药后各组较之模型组OPG的表达升高，RANKL、RANKL/OPG比值下降，尤其是DMNs-TP高剂量组。
上述实验表明，DMNs-TP以及DMNs-TG各剂量组可以通过改善滑膜组织的炎性浸润、结缔组织增生等情况，以及可以降低大鼠血清中炎性因子的TNF-ɑ、IL-17、PGE2、IgG、IgM、IgA水平，并通过调控OPG/RANKL/RANK信号通路来发挥治疗RA的作用。DMNs-TP高剂量组与吡罗昔康组比较可以知道，两者疗效几乎相当，但微针剂型载药低，贴剂载药大，能更好地节约成本。且雷公藤甲素制备成微针剂型可以控制甲素的释放，其生殖毒性得到改善，更好地提高了TP的生物利用度。将DMNs-TG高剂量组与雷公藤多苷片剂组比较可以知道，由于DMNs-TG的给药剂量低于雷公藤多苷片灌胃组，而DMNs-TG高剂量组的疗效却要优于雷公藤多苷片剂组，说明微针作为一种新型物理透皮技术，其治疗作用较于传统的剂型其具备优势，能够直接作用于给药部位，较少的剂量便可以达到与口服相同的效果，更加说明了微针作为新型物理透皮技术的优越性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种雷公藤甲素自溶性微针，其特征在于：按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP24-29份、PVA7.8-8.3份、CMC-Na0.45-0.65份、雷公藤甲素0.28-0.42份、蒸馏水40-45份和无水乙醇20-23份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP32-37份、PVA9-12份和蒸馏水53-58份。
2.根据权利要求1所述的雷公藤甲素自溶性微针，其特征在于：按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP26-27份、PVA8-8.1份、CMC-Na0.5-0.6份、雷公藤甲素0.3-0.4份、蒸馏水42-43份和无水乙醇21-22份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP34-35份、PVA10-11份和蒸馏水55-56份。
3.根据权利要求2所述的雷公藤甲素自溶性微针，其特征在于：按照重量份计，所述雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方为PVP26.78份、PVA8.03份、CMC-Na0.54份、雷公藤甲素0.37份、蒸馏水42.85份和无水乙醇21.42份；所述雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方为PVP34.48份、PVA10.34份和蒸馏水55.17份。
4.根据权利要求1-3任一项所述的雷公藤甲素自溶性微针，其特征在于：所述的雷公藤甲素自溶性微针按照以下步骤制备：
(1)针头的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方称取针尖材料充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，离心，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥，得针尖含药的微针模具；
(2)微针背衬层的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方称取基质材料搅拌均匀，离心，除去气泡后注入针尖含药的微针模具，离心，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
5.根据权利要求4所述的雷公藤甲素自溶性微针，其特征在于：所述的雷公藤甲素自溶性微针按照以下步骤制备：
(1)针头的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方称取针尖材料充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，3900-4100r/min离心8-12min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥5-7h，得针尖含药的微针模具；
(2)微针背衬层的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方称取基质材料搅拌均匀4900-5100r/min离心18-22min除去气泡后注入针尖含药的微针模具，3900-4100r/min离心4-6min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
6.根据权利要求5所述的所述的雷公藤甲素自溶性微针，其特征在于：所述的雷公藤甲素自溶性微针按照以下步骤制备：
(1)针头的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的针尖基质处方称取针尖材料充分溶解并搅拌均匀后注入微针模具中，4000r/min离心10min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥器干燥6h，得针尖含药的微针模具；
(2)微针背衬层的制备：按照雷公藤甲素自溶性微针的背衬层基质处方称取基质材料搅拌均匀5000r/min离心20min除去气泡后注入针尖含药的微针模具，4000r/min离心5min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，脱模，即得。
7.根据权利要求1-6任一项所述的所述的雷公藤甲素自溶性微针，其特征在于：所述的雷公藤甲素自溶性微针用于类风湿关节炎的治疗。
8.根据权利要求7所述的所述的雷公藤甲素自溶性微针，其特征在于：所述的雷公藤甲素自溶性微针用于类风湿关节炎的治疗是通过减少滑膜中细胞的炎性浸润，减少炎症因子TNF-ɑ、IL-17、PGE2、IgG、IgM、IgA的表达以及升高OPG的表达、降低RANKL表达和RANKL/OPG比值的趋势实现。
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