CN103520006A

CN103520006A - 一种柔性纳米脂质体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103520006A
Application number: CN201310479331.3A
Authority: CN
Inventors: 江妍
Original assignee: Tempstaff (suzhou) Co Ltd Pharmaceutical Technology
Current assignee: Tempstaff (suzhou) Co Ltd Pharmaceutical Technology
Priority date: 2013-10-14
Filing date: 2013-10-14
Publication date: 2014-01-22

Abstract

本发明涉及一种柔性纳米脂质体及其制备方法和应用。本发明的柔性纳米脂质体包括下列重量份的组分所制成：1-1000份中性磷脂、1-1000份胆固醇、0.5-500份表面活性剂、0.1-2份透明质酸和0.5-500份积雪苷。本发明的积雪苷柔性纳米脂质体，可以显著促进积雪苷的透皮吸收并提高其作用效率，还能提高积雪苷在皮肤表面和皮肤深层的滞留和作用时间；冻干粉末状态的积雪苷柔性纳米脂质体还利于使用、运输和贮存；本发明的柔性纳米脂质体的制备方法均可采用机械化方法，产品工艺和质量的稳定性好、重现性高。

Description

一种柔性纳米脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种柔性纳米脂质体及其制备方法，特别是指积雪苷柔性纳米脂质体及其制备方法，以及该柔性纳米脂质体在化妆品方面的应用。

背景技术

积雪苷是伞形科Umbelliferae积雪草Centella asiatica(L.)Urban的干燥全草或带根全草的提取物，可以紧致表皮与真皮连接部分，能使皮肤变柔软，有助于解决皮肤松弛现象，使皮肤光滑有弹性；帮助促进真皮层中胶原蛋白形成，使纤维蛋白再生，重新连接起来，从根本上消除妈妈纹，使肌肤达到紧致光滑的效果。还可帮助受损的组织愈合及紧实肌肤。作为传统药物在亚洲、非洲等地已经应用了很长时间，主要用于治疗皮肤和粘膜方面的疾病。由于其良好的促进成纤维细胞和胶原细胞的合成、抗菌、消炎等多方面的作用，近年来，越来越多的诸如疤痕修复、抗皱、抗衰老、去粉刺等功效型化妆品将积雪苷作为其主要活性成分之一。

专利申请号：200610066918.1，发明名称为一种积雪苷分散片及其制备方法的专利，其公开了一种积雪苷分散片，它主要由积雪草总苷、崩解剂、填充剂、矫味剂制备而成。

专利申请号为200610050184.8，发明名称为一种积雪苷外用液体制剂，它的有效成分由下列重量配比的原料制成：积雪苷0.1％～30.0％，药用溶媒70.0％～99.9％。

积雪苷用于化妆品的主要形式为霜膏剂型，由于皮肤的修复周期较长，而霜膏剂型的使用习惯，势必决定了积雪苷与皮肤接触时间较短，不能充分发挥积雪苷的作用效果和作用时间。

二十世纪六十年代出现的柔性纳米脂质体，可以通过其自身的柔性和变形性，高效地穿透比自身直径小数倍的皮肤孔道从而达到良好的透皮吸收效果，柔性纳米脂质体不仅可以包裹小分子活性物，对于分子量高达10⁶的生物大分子活性物质亦具有比较优良的皮肤透过性能，是化妆品制备中极具潜力的制备方法。另外，化妆品活性成分分别用脂质体包裹，可以有效避免这些成分可能存在的相互作用和理化反应，进一步提高了其稳定性和使用的安全性。

发明内容

本发明为了解决上述问题，提供一种透皮能力强且生物相容性好的积雪苷柔性纳米脂质体制剂。

本发明提供一种积雪苷柔性纳米脂质体，能保证积雪苷在其的稳定性和使用安全性。

本发明提供了一种简单，且具有较高的包封率和载药量的积雪苷柔性纳米脂质体制备方法。

本发明提供了一种柔性纳米脂质体在化妆品中的应用。

本发明的技术方案如下：

所述的柔性纳米脂质体包括下列重量份的组分所制成：1-1000份中性磷脂、1-1000份胆固醇、0.5-500份表面活性剂、0.1-20份透明质酸和0.5-500份积雪苷。

在本发明一较佳实施例中，本发明的柔性纳米脂质体包括下列重量份的组分所制成：100-120份中性磷脂、15-100份胆固醇、10-100份表面活性剂、0.1-20份透明质酸和0.5-60份积雪苷。

在本发明一更佳实施例中，本发明的柔性纳米脂质体包括下列重量份的组分所制成：100-120份中性磷脂、15-20份胆固醇、10-20份表面活性剂、0.1-20份透明质酸和40份积雪苷。

在本发明一较佳实施例中，所述的中性磷脂选自大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、二棕榈酸磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱、二月桂酸磷脂酰胆碱或者二棕榈酸磷脂酰乙醇胺中的一种或多种；所述的表面活性剂是胆酸钠或去氧胆酸钠。

本发明中性磷脂优选大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱中的一种或几种。

本发明中胆固醇的使用是为了调节脂质体膜的流动性和通透性，进而调整脂质体膜的稳定性。本发明使用的表面活性剂，可以使脂质体膜具有更大的弹性与变形性，从而促进脂质体的透皮吸收性能。优选胆酸钠或去氧胆酸钠。

在本发明一较佳实施例中，本发明的柔性纳米脂质体还包括占脂质体总重量0.1-0.5%的抗氧化剂；所述的氧化剂选自维生素C、维生素E、丁基羟基茴香醚（BHA）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、茶多酚、愈创树脂、芝麻酚或者波尔定碱中的一种或多种。

优选地为0.2%抗氧化剂，抗氧化剂优选地为维生素E和丁基羟基茴香醚（BHA）组成的混合抗氧化剂。

在本发明一较佳实施例中，本发明的柔性纳米脂质体可以包括相当于脂质体总重量2-8倍的冷冻保护剂。所述的冷冻保护剂可选用但不限于甘油、乳糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、海藻糖。优选乳糖和甘露醇。

在本发明一较佳实施例中，上述脂质成分与所包裹活性成分的重量比，对脂质体的稳定性、包封率及载药量有较大影响，适宜的脂质成分与所包裹活性成分的重量比在2:1至6:1；冻干保护剂与脂质体的重量比，对最终产品的载药量亦有较大影响，适宜的比例范围是冻干保护剂:脂质体3:1至6:1。

本发明提供了脂质体混悬液中，脂质体包裹的活性成分与游离的活性成分分离的透析方法，还可以采用低温超速离心法、柱层析法等分离脂质体与游离成分。

在本发明一实施例中，所述方法采用逆向蒸发法-超声-均质-挤出-冻干法，其包括如下步骤：

1）将所述比例的中性磷脂、胆固醇在10-50℃水浴条件下溶解于挥发性有机溶剂中；

2）将所述比例的表面活性剂、积雪苷、冷冻干燥保护剂水溶性成分在10-50℃水浴条件下溶解于pH=7.0的磷酸缓冲溶液中；

3)将步骤1）和2）混合超声成乳状，静置；

4）将步骤3）得到的乳液置于旋转蒸发仪上旋转蒸发得初步的脂质体混悬液；

5）将步骤4）得到脂质体混悬液，超声破碎60-90次后，5000PSI-10000PSI均质，最后通过挤出仪过滤膜；

6）将步骤5）得到的混悬液，置于截留分子量8000-14000的透析袋中，透析，从而分离脂质体包裹的活性成分和游离在磷酸缓冲液中的活性成分；

7）在步骤6）得到的脂质体混悬液于-50至-100℃预冻12小时以上，再置于冷冻干燥机冻干，得到冻干柔性纳米脂质体粉末。

所述步骤1中加入占脂质体总重量0.1-0.5%的复合抗氧化剂的脂溶性成分。

在本发明一实施例中，一种所述的柔性纳米脂质体在制备积雪苷化妆品活性成分方面的应用。

本发明的积极进步效果在于：本发明制备的柔性纳米脂质体粒径在50-200nm之间，保证了所包裹的活性成分具有更好的稳定性和皮肤吸收效果。而本发明采用的改良的逆向蒸发法-超声-均质-挤出-冻干法，产品制备方法简单、且具有较高的包封率和载药量；整个工艺过程均由机械手段完成，使产品工艺和质量具有较好的稳定性和重现性。本发明最终的产品为流动性良好的粉末，便于使用、运输和贮存。

具体实施方式：

实施例1

将10mg二棕榈酰中性磷脂酰胆碱、1mg胆固醇溶于氯仿中，将0.25mg维生素E与BHA混合抗氧化剂溶于少量乙醇中，再与氯仿液混合；将3mg积雪苷、2mg胆酸钠、1.5mg透明质酸、40mg乳糖溶于pH7.0的磷酸缓冲液中；将前述的磷酸缓冲液加入氯仿液中，超声形成均已乳剂，静置30分钟后，乳液置旋转蒸发仪上旋蒸去除有机溶剂，得到积雪苷脂质体混悬液；将脂质体混悬液用探针式超声细胞破碎仪超声90个循环（每循环超声5秒，间歇5秒，冰浴）后，用AVESTIN高压均质机均质3次，再通过AVESTIN挤出仪过100nm的微孔滤膜10次；将挤出的脂质体混悬液分子截留量8000-14000的透析袋中透析6小时，分离游离的积雪苷；所得的脂质体混悬液于-80℃预冻12小时后，放置于冷冻干燥机冷冻干燥成粉末状。

所得到的积雪苷柔性纳米脂质体的粒径和Zeta电位经Zitasizer（NanoZS，Malvern）纳米粒度及电位分析仪测定其粒径和Zeta电位分别为51.3±6.2nm、71.0±9.9mV；采用透析法法分离测得产品的包封率为42.6%。

实施例2

将100mg大豆卵中性磷脂、50mg胆固醇水浴超声溶于氯仿中，将0.26mg维生素E与BHA混合抗氧化剂溶于少量乙醇中，再与氯仿液混合；将35mg积雪苷、15mg胆酸钠、1.5mg透明质酸、400mg甘露醇溶于pH7.0的磷酸缓冲液中；将前述的磷酸缓冲液与氯仿溶液在水浴中超声成均匀乳浊液，静置30分钟后，旋转蒸发得脂质体混悬液；将脂质体混悬液用探针式超声细胞破碎仪超声60个循环（每循环超声5秒，间歇5秒，冰浴）后，用AVESTIN高压均质机均质3次，再通过AVESTIN挤出仪过100nm的微孔滤膜10次，挤出的脂质体混悬液放入透析袋（分子截留量8000-14000）中透析6小时；取透析袋中的脂质体混悬液，于-80℃预冻12小时后，放置于冷冻干燥机冷冻干燥成粉末状。

所得到的表皮活性因子柔性纳米脂质体的粒径和Zeta电位经Zitasizer（Nano ZS，Malvern）纳米粒度及电位分析仪测定其粒径和Zeta电位分别为107.6±21.3nm、64.1±6.6mV；采用透析法分离测得产品的包封率为27.61%。

实施例3

将1000mg大豆卵中性磷脂、50mg胆固醇水浴超声溶于氯仿中，将2.5mg维生素E与BHA混合抗氧化剂溶于少量乙醇中，再与氯仿液混合；将350mg积雪苷、150mg胆酸钠、15mg透明质酸、4000mg甘露醇溶于pH7.0的磷酸缓冲液中；将前述的磷酸缓冲液与氯仿溶液在水浴中超声成均匀乳浊液，静置30分钟后，旋转蒸发得脂质体混悬液；将脂质体混悬液用探针式超声细胞破碎仪超声90个循环（每循环超声5秒，间歇5秒，冰浴）后，用AVESTIN高压均质机均质3次，再通过AVESTIN挤出仪过100nm的微孔滤膜10次，挤出的脂质体混悬液放入透析袋（分子截留量8000-14000）中透析6小时；取透析袋中的脂质体混悬液，于-80℃预冻12小时后，放置于冷冻干燥机冷冻干燥成粉末状。

所得到的表皮活性因子柔性纳米脂质体的粒径和Zeta电位经Zitasizer（Nano ZS，Malvern）纳米粒度及电位分析仪测定其粒径和Zeta电位分别为137.8±19.6nm、59.5±8.0mV；采用透析法分离测得产品的包封率为26.88%。

上述实施例中，中性中性磷脂由日油株式会社提供，胆固醇、去氧胆酸钠以及胆酸钠由天津市大茂化学试剂厂生产，透明质酸由山东福瑞达生物医药有限公司生产，甘露醇和乳糖由上海实验试剂有限公司生产，BHA由上海QIGANG Pd生产，维生素E为美国Sigma产品，磷酸缓冲液根据中国药典自配，其余试剂均为市售产品，除有机溶剂外均符合食品或药用标准。

效果实施例1形态学

将积雪苷柔性纳米脂质体混悬液，磷钨酸负染，透射电镜下观察形态，见图1。图1积雪苷柔性纳米脂质体电镜图。A为刚制备的脂质体原液；B为冻干后重新悬浮的脂质体；C未加冻干保护剂的冻干脂质体；D为加冻干保护剂的冻干脂质体。

由图1中可以看出，所制备的脂质体为类圆形，大小较为均一，粒径＜200nm，脂质体膜具有“指纹”特征，确证了方法制备脂质体是成功的。在不加冻干保护剂时，得到的冻干脂质体为海绵状，容易吸湿和结块，加入冻干保护剂后，得到的冻干脂质体为流动性良好的粉末。

效果实施例2稳定性

取3批积雪苷柔性纳米脂质体及冻干积雪苷柔性纳米脂质体粉末，分别置于室温、4℃条件下，于0m和3m测定其包封率、pH、粒径和Zeta电位，并观察外观，以确定其稳定性。见表1。

表1积雪苷脂质体混悬液及冻干脂质体分别放置3个月后其稳定性结果

*脂质体混悬液包封率单位为%，冻干脂质体载药量单位为mg/每mg冻干粉；**冻干脂质体的pH、粒径和电位是将其用PBS溶液重新悬浮后测定；***表示与0月相比无显著性差异（P＞0.05）

由实验结果可以得到如下结论：脂质体及冻干脂质体，在室温和4℃条件下稳定性良好，药物泄露率＜5.0%。

效果实施例3体外释放特性

分别取积雪苷柔性纳米脂质体混悬液5ml（含积雪苷约78.2μg）和积雪苷溶液5ml（含积雪苷约80.0μg），分别置于透析袋中；积雪苷脂质体乳膏100mg（含积雪苷约78.3μg）置于滤纸筒中。按中国药典规定的桨法测定其释放特征，接收液PBS体积50ml，释放温度保持37.0℃，磁力搅拌速度为50rpm。在事先确定的时间点吸取0.5ml SBF接收液并随即补充相同体积的SBF溶液。采用前述的HPLC方法检测释放出的药物量。每个样本平行实验3次。结果见图2。图2不同样品累积释放结果。

由体外释放实验结果可以看出，脂质体配方具有明显的缓释功能，可以持续释放活性成分。3种样品的释放过程符合Hugichi方程，即样品的释放主要是一个扩散过程，该过程释放速率主要受含量、粒径大小的影响。

效果实施例4体外透皮吸收

分别配制积雪苷柔性脂质体（样品A）、积雪苷柔性脂质体（样品B）、积雪苷一般脂质体（样品C）及积雪苷溶液（样品D），并分别加入到同配方的空白膏体中，使每g膏体含积雪苷约0.25mg；去用于透皮吸收的商品化猪皮，根据Franz扩散池的口径(0.66cm²)，裁剪成适宜大小，使猪皮表面（角质层）朝上，安装于扩散池上，各涂抹膏体1g；接收液为PBS溶液，温度37℃，接收液体积2.5ml，在规定的时间点将所有接收液取出，同时补充新的接收液；按前面的方法检测接收液积雪苷含量，计算积雪苷累积透皮吸收量和百分率；最后一个时间点取样后，将猪皮正反面用蒸馏水冲洗，猪皮浸泡于50mlPBS液中24小时，测定浸泡液积雪苷含量，以确定积雪苷在猪皮中的滞留量。结果见图3和表2。图3实验样品24小时累积透皮吸收量。

表2不同样品在猪皮中的滞留量（n=3）

样品	平均滞留量（μg/cm²）	SD
			A	1539.68	411.27
B	1288.67	128.99
			C	980.55	113.41
B	301.17	99.87

由图3可以看出，所有样品都具有一定的透皮性能，样品A和B的皮肤透过程度显著高于其他2个样品（P＜0.05），而其他2个样本之间无显著差异（P＞0.05）；实验结果证实了含有柔性成分的积雪苷脂质体确实具有良好的皮肤透过性能，并能显著提高活性成分在皮肤中的滞留量，而不含柔性成分的脂质体的透皮性能和游离成分的类似。

上述效果实施例结果证实了采用逆相-超声-均质-挤出-冻干方法制备积雪苷柔性纳米脂质体是可行的，方法简便、重现性好、稳定性高；活性成分采用脂质体包裹后，具有缓释性能，可以延长作用时间；积雪苷柔性纳米脂质体，皮肤透过率高，更容易与皮肤结合而滞留于皮肤，有利于活性成分作用的充分发挥。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种柔性纳米脂质体，其特征在于：所述的柔性纳米脂质体包括下列重量份的组分所制成：1-1000份中性磷脂、1-1000份胆固醇、0.5-500份表面活性剂、0.1-2份透明质酸和0.5-500份积雪苷。

2.根据权利要求1所述的柔性纳米脂质体，其特征在于：其包括下列重量份的组分所制成：100-120份中性磷脂、15-100份胆固醇、10-100份表面活性剂、0.1-2份透明质酸和0.5-60份积雪苷。

3.根据权利要求1所述的柔性纳米脂质体，其特征在于：其包括下列重量份的组分：100-120份中性磷脂、15-20份胆固醇、10-20份表面活性剂、0.1-2份透明质酸和40份积雪苷。

4.根据权利要求1-3所述的柔性纳米脂质体，其特征在于：其还包括占脂质体总重量0.1-0.5%的抗氧化剂,优选地为0.2%抗氧化剂；所述的氧化剂选自维生素C、维生素E、丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、茶多酚、愈创树脂、芝麻酚或者波尔定碱中的一种或多种。

5.根据权利要求1-3所述的柔性纳米脂质体，其特征在于：其还包括相当于脂质体总重量2-8倍的冷冻保护剂；所述的冷冻保护剂选自甘油、乳糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖或者海藻糖的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的柔性纳米脂质体，其特征在于：所述的冻干保护剂:脂质体的重量比在3:1至6:1。

7.根据权利要求1-3所述的柔性纳米脂质体，其特征在于：所述的柔性纳米脂质体的粒径范围为50-200nm。

8.根据权利要求1-3所述的柔性纳米脂质体，其特征在于：所述的中性磷脂选自大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、二棕榈酸磷脂酰胆碱、二硬脂酸磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酸磷脂酰胆碱、二月桂酸磷脂酰胆碱或者二棕榈酸磷脂酰乙醇胺中的一种或多种；所述的表面活性剂是胆酸钠或去氧胆酸钠。

9.根据权利要求1-3所述的柔性纳米脂质体，其特征在于：所述的积雪苷为包裹的活性成分,脂质成分与所述的包裹活性成分的重量比在2:1至6:1。

10.一种根据权利要求5所述的柔性纳米脂质体的制备方法，其特征在于：所述方法采用逆向蒸发法-超声-均质-挤出-冻干法，其包括如下步骤：

2）将所述比例的表面活性剂、积雪苷、透明质酸和冷冻干燥保护剂在10-50℃水浴条件下溶解于pH=7.0的磷酸缓冲溶液中；

3)将步骤1）和2）混合超声成乳状，静置；

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1中加入占脂质体总重量0.1-0.5%的复合抗氧化剂的脂溶性成分。

12.一种根据权利要求1-3所述的柔性纳米脂质体在制备积雪苷化妆品活性成分方面的应用。