TWI564035B - 微針貼片型豬用疫苗 - Google Patents
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Description
本發明是有關於一種動物用微針貼片型疫苗，特別是有關於一種預防或降低抗豬細菌性感染之微針貼片型豬用疫苗及其製造方法。
豬隻一般飼養較為密集，導致緊迫、豬隻免疫力下降，經常發生細菌性、病毒性或其他病原的感染。以豬鏈球菌(Streptococcus suis；S.suis)為例，其為一人畜共通傳染疾病，屬革蘭氏陽性球菌。根據豬鏈球菌莢膜表面多醣體(polysaccharide capsule；CPS)之不同，可區分為33種不同血清型，其中以第1、2、9、14和22型較具侵略性。
豬鏈球菌感染宿主非常廣泛，但主要還是以豬和人為主。在過去數十年間，於丹麥、中國江蘇及四川等地，曾爆發人類感染豬鏈球菌，而引起腦膜炎、鏈球菌中毒休克綜合症(STSS)甚至死亡等案例。豬鏈球菌常與豬生殖與呼吸道綜合症(porcine reproductive and respiratory syndrome；PRRS)造成混合感染，潛伏期可長達2週，常引起腦膜炎、心內膜炎、肺炎、關節炎、敗血症等臨床症狀，
嚴重者甚至突發性地死亡。此外，根據淡水家衛所於2008年進行台灣豬場呼吸道病原分析中發現，豬鏈球菌引起的細菌性疾病佔第一名(80%)，可見本病在豬隻疾病防疫上之重要。
傳統豬鏈球菌疫苗為不活化疫苗，僅能誘發之短效性及Th2(體液性)免疫反應，需經過多次免疫，才能達到保護效果。另一方面，有關豬鏈球菌感染機制，目前尚未完全明瞭，且礙於地域限制以及不同血清型造成疫苗之保護效力受阻，導致防疫上困難。
微針貼片(microneedle patchs)為近年來開發出的經皮傳輸藥物系統，利用貼片上微小針體將藥物送至皮下目標位置，可達到無痛及安全之目的。就疫苗傳輸的觀點，微針貼片可將抗原傳遞至皮表皮層或真皮層，而真皮層富含朗格漢細胞(langerhans cells)與樹突狀細胞(dendritic cells)，可快速且誘發全身性的免疫反應，有效減少抗原含量，進而降低疫苗之成本。
一般而言，微針貼片可包括固體型微針(solid microneedles)、塗鍍型微針(coated microneedles)、空心型(hollow microneedles)微針等。固體型微針屬於傳統型的微針貼片，利用微針本身硬度造成皮膚表面之微孔洞，再於微創之皮膚表面給予低分子量之藥物、生物性治療藥劑或疫苗等，由皮膚之毛細血管進行運送，具有局部或全身性效應。固體型微針過去以金屬或矽為主要材料，所包覆之藥物量有限，且易因使用不當而有斷針於皮內之疑慮。另
外，固體型微針在接種後，藥物容易殘留至皮膚表面，而無法有效將藥物成功送至皮膚內。
塗鍍型微針屬皮膚內溶解型之微針貼片，利用微針本身材料所帶之電荷，配合浸泡或噴霧等方式，將藥物塗鍍於微針表面，再穿刺皮膚而經皮傳輸。塗鍍型微針具有快速傳輸藥物之優點，但需使用水溶性物質以增加微針的黏性、潤濕微針表面及穩定藥物，而所使用藥物也需要耐烘乾與耐儲存。塗鍍型微針的缺點在於塗鍍的藥物劑量有限，而且在接種後，藥物容易殘留至皮膚表面。
空心型微針屬直接穿刺皮膚給予之微針貼片，可將液態形式之藥物填充於單一或多孔排列之空心型微針中，以微針孔給藥。空心型微針的缺點在於需考量到注射壓力、流速、運輸保溫與方便性。
有鑑於此，亟需發展一種微針貼片型豬用疫苗，藉以提供適用於動物用之微針疫苗，並改善習知傳統疫苗所誘發之短效性及Th2體液性免疫反應，需多次免疫才能達到效果等缺點。
因此，本發明之一態樣是在提供一種微針貼片型豬用疫苗，其係將由疫苗組成物以及聚合物所組成之可溶性針體，直接貼設於微針貼片的針柱上，可使受免疫動物同時產生體液性與細胞性免疫反應。
根據本發明之上述態樣，提出一種微針貼片型豬用疫苗。在一實施例中，微針貼片型豬用疫苗包括複數個底座、固設於前述底座上之複數個針柱以及直接貼設於前述針柱上之複數個可溶性針體。前述可溶性針體是由疫苗組成物以及聚合物所組成，疫苗組成物包含細菌性抗原以及醫藥學上可接受之載劑。
依據本發明一實施例，上述之細菌性抗原包括不活化菌體或重組蛋白。
依據本發明一實施例，上述之不活化細菌包括豬鏈球菌(Streptococcus suis；S.suis)。
依據本發明一實施例，上述之聚合物包含聚乙烯醇(polyvinyl alcohol；PVA)。
依據本發明一實施例，以上述可溶性針體之總使用量為100重量百分比，上述疫苗組成物之使用量可例如為0.1重量百分比至2.0重量百分比，且聚合物之使用量可例如為98.0重量百分比至99.9重量百分比。在另一例示中，以上述可溶性針體之總使用量為100重量百分比，上述疫苗組成物之使用量可例如為0.5重量百分比至1.5重量百分比，且聚合物之使用量可例如為99.5重量百分比至98.5重量百分比。
應用本發明之微針貼片型豬用疫苗，其係將由疫苗組成物以及聚合物所組成之可溶性針體，直接貼設於微針貼片的針柱上，以同時使受免疫動物產生體液性與細胞性免疫反應。
401/403‧‧‧曲線
501/503/505/511/513/515/521/601/603/605/611/613/615/621/701/703/705/711/713/715/721/801/803/805/811/813/815/821/823/825/901/903/905/911/913/915/921/1001/1003/1005/1011/1013/1015/1021/1101/1103/1105/1111/1113/1115/1121/1201/1203/1205/1211/1213/1215/1221‧‧‧直條
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：〔圖1a〕係顯示根據本發明一實施例之微針貼片型豬用鏈球菌疫苗外觀的光學顯微影像。
〔圖1b〕係顯示根據本發明一實施例之螢光微針貼片型豬用疫苗外觀的光學顯微影像(放大40倍)。
〔圖1c〕係顯示根據本發明一實施例之螢光微針貼片型豬用疫苗外觀的光學顯微影像。
〔圖1d〕係顯示根據本發明一實施例之微針貼片型豬用疫苗穿刺小鼠表皮的光學顯微影像。
〔圖2a〕係顯示根據本發明一實施例之螢光微針貼片型豬用疫苗外觀的光學顯微影像(放大5倍)。
〔圖2b〕係顯示根據本發明一實施例之螢光微針貼片型豬用疫苗外觀的螢光顯微影像(放大5倍)。
〔圖2c〕係顯示根據本發明一實施例之微針貼片型豬用疫苗穿刺小鼠表皮組織切片的光學顯微影像。
〔圖2d〕係顯示根據本發明一實施例之微針貼片型豬用疫苗穿刺小鼠表皮組織切片的螢光顯微影像。
〔圖3a〕至〔圖3f〕係顯示根據本發明一實施例之小鼠背部皮膚表面在利用實施例一之微針貼片型豬用疫苗的針體接種後不同時間穿刺之外觀影像以及紅腫程度，其中
圖3a至圖3f分別代表接種後0小時、2小時、6小時、12小時、24小時、34小時之外觀影像。
〔圖4〕係繪示根據本發明一實施例之小鼠背部皮膚利用實施例一之微針貼片型豬用疫苗的針體接種後之經皮水分散失量(trans-epidermal water loss；TEWL)的曲線圖。
〔圖5〕至〔圖7〕係繪示根據本發明一實施例之小鼠利用實施例一之微針貼片型豬用疫苗的針體接種後血清中的IgG(〔圖5〕)、IgG 2a(〔圖6〕)、IgG 1(〔圖7〕)之抗體力價直條圖。
〔圖8〕係繪示根據本發明一實施例之小鼠利用實施例一之微針貼片型豬用疫苗的針體接種後脾臟細胞增生指數直條圖。
〔圖9〕至〔圖11〕係繪示根據本發明一實施例之小鼠利用實施例一之微針貼片型豬用疫苗的針體接種二次後血清中的IFN-γ(〔圖9〕)、IL-12(〔圖10〕)、IL-4(〔圖11〕)之表現量直條圖。
〔圖12〕係繪示根據本發明一實施例之小鼠利用實施例一之微針貼片型豬用疫苗的針體接種一次後再進行攻毒之存活率。
承前所述，本發明提供一種微針貼片型豬用疫苗，其係將由疫苗組成物以及聚合物所組成之可溶性針體，直接貼設於微針貼片的針柱上。
本發明此處所稱之「微針貼片」係指溶解型微針(dissolving microneedles)。溶解型微針屬皮膚內生物降解型之微針貼片，利用微針針體的材料(水溶性或生物可降解性材料)包覆藥物，再穿刺皮膚而經皮傳輸。溶解型微針使用經美國食品和藥物管理局證實安全之材料，具有完全溶解或降解能力，不僅能改善其他微針貼片有藥物包覆劑量不足等問題，又無生物危害性與尖銳廢棄物等問題。
在一實施例中，適合之微針貼片可包含但不限於複數個底座、固設於前述底座上之複數個針柱以及直接貼設於針柱上之複數個可溶性針體。
在一實施例中，上述微針貼片的底座之尺寸與材料不拘，可視實際需求隨意調整。在一例示中，微針貼片的底座可例如為300μm×300μm，而底座上設有複數個針柱，其中，底座與針柱可以是一體成型，或者於底座上另固設前述針柱。
在一實施例中，本發明之微針貼片的針柱上直接貼設複數個可溶性針體，其中針柱與可溶性針體之高度不拘，可視實際需求或施用部位的皮膚厚度，任意調整針柱與可溶性針體之高度。在一例示中，當本發明之微針貼片應用於豬隻時，適用之微針貼片的針柱與可溶性針體之總高度可例如為1200μm，其中針柱之高度可例如為600μm，可溶性
針體之高度可例如為600μm。在此例示中，此可溶性針體能刺穿表皮層而達到真皮層。
在上述實施例中，本發明之微針貼片的底座與針柱之材料不拘，可為相同或不同，端視實際需求任意調整。在一例示中，本發明之微針貼片的底座與針柱之材料可為相同，包含但不限於聚乙烯吡咯酮(polyvinyl pyrrolidone；PVP)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol；PVA)或其任意組合。在另一例示中，底座與針柱之材料可包含重量比1：1之PVP與PVA。在又一例示中，底座與針柱之材料可包含50重量百分比之PVP/PVA之水溶液，其中PVP：PVA：水之重量比為1：1：2。
本發明之微針貼片的針柱數量及排列方式亦不拘，可視實際需求隨意調整。在一例示中，本發明之微針貼片的針柱數量可例如為81個，排列成9×9的陣列。
再者，本發明之微針貼片的可溶性針體材料可由疫苗組成物以及聚合物所組成。本發明此處所稱之「疫苗組成物」係指任何習知的細菌性抗原疫苗，可包括但不限於不活化疫苗、次單位疫苗等。在一例示中，當疫苗組成物為不活化疫苗時，可包含不活化菌體以及醫藥學上可接受之載劑，其中不活化菌體可例如豬鏈球菌(Streptococcus suis；S.suis)。在另一例示中，前述豬鏈球菌可例如為豬鏈球菌血清第2型。在其他實施例中，當疫苗組成物為次單位疫苗，可包含重組蛋白以及醫藥學上可接受之載劑。在又
一例示中，前述之疫苗組成物亦可使用豬鏈球菌血清第2型之次單位疫苗。
在一實施例中，前述醫藥學上可接受之載劑包含佐劑，其中前述佐劑之種類不拘，其具體例子可包括但不限於鋁膠佐劑、或油質佐劑(例如弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等)或上述之任意組合。在其他實施例中，為了增加免疫效果，亦可選擇性添加習知之免疫增效劑，例如具有物種專一性的CpG模組之免疫刺激性寡核苷酸等。
在一實施例中，前述之聚合物可使用習知水溶性之天然或合成聚合物，諸如單糖、多糖、碳水化合物(carbohydrate)、多肽、多元醇等，其具體例子如纖維素、羥丙基纖維素(HPC)、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素鈉(SCMC)、透明質酸鈉(HA)、糊精、幾丁聚糖環糊精、明膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、聚乙二醇(PEG)、聚環氧乙烷(PEO)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酸、聚磺苯乙烯(polystyrene sulfonate)及上述之任意組合。在一例示中，前述之聚合物可包含PVA。
本發明所製得之可溶性針體能有效改善藥物包覆劑量等問題。在一例示中，以可溶性針體之總使用量為100重量百分比，疫苗組成物之使用量可例如為0.1重量百分比至2.0重量百分比，且聚合物之使用量可例如為18.0重量百分比至19.9重量百分比；較佳者，疫苗組成物之使用量可例如為0.5重量百分比至1.5重量百分比，而聚合物之使
用量可例如為18.5重量百分比至19.5重量百分比；更佳者，疫苗組成物之使用量可例如為1.2重量百分比，而聚合物之使用量可例如為18.8重量百分比，其餘則為水。前述每一可溶性針體之疫苗組成物的不活化菌體或重組蛋白之含量，依據細菌種類、劑型等不同，而有不同的含量。以豬鏈球菌之不活化菌體為例，疫苗組成物可包含1×108CFU/mL至1×1010CFU/mL之不活化菌體，然以5×108CFU/mL至5×109CFU/mL為較佳，又以1×109CFU/mL為更佳。
倘若上述聚合物之使用量少於18.0重量百分比，則可溶性針體無法成型。倘若上述聚合物之使用量多於19.9重量百分比，則由此製得的可溶性針體會過於脆硬而難以操作，且穿刺皮膚後無法於預設時間內溶解並釋放出疫苗組成物。當上述聚合物之使用量為18.0重量百分比至19.9重量百分比時，則所得之可溶性針體可以有效穿刺皮膚，並使針體於預設時間內溶解並釋放出疫苗組成物。
在一實施例中，上述疫苗組成物、聚合物及水均勻混合後形成之可溶性針體混合液，可進一步平均鋪於微米級模具上，利用例如離心灌模、離心乾燥以及陰乾的方式製得可溶性針體。在一例示中，離心灌模、離心乾燥以及陰乾等處理係於溫度50℃以下進行，前述步驟以溫度10℃至40℃進行為較佳，又以溫度20℃至30℃進行為更佳。倘若離心灌模、離心乾燥以及陰乾等處理於溫度50℃以上進行，或者以其他乾燥速度過快的方式取代陰乾，則所得之可
溶性針體會因為水份液散過快，使得針體過於脆硬而難以操作。
在此說明的是，本發明之疫苗組成物無需使用任何保護劑，例如多醣類之海藻糖(trehalose)、蔗糖(sucrose)等，在製得微針貼片後仍保有良好的抗原性，故可進一步提高疫苗組成物的包覆劑量。
經動物試驗證實，本發明之微針貼片於皮下接種達預設時間，例如10分鐘後，微針貼片之可溶性針體即具有80%溶解能力，不僅有效將藥物集中於針體前端，控制與增加藥物包覆劑量，更能使受免疫動物同時產生體液性與細胞性免疫反應。
由於本發明的微針貼片型豬用疫苗，是由疫苗組成物以及聚合物所組成之可溶性針體，直接貼設於微針貼片的針柱上，因此能有效改善習知藥物包覆劑量不足等問題。其次，本發明的微針貼片型豬用疫苗於皮內接種達預設時間後，可溶性針體即具有較佳的溶解能力，不僅有效將藥物集中於針體前端，更能控制與增加藥物包覆劑量。再者，本發明的微針貼片型豬用疫苗可使受免疫動物同時產生體液性與細胞性免疫反應，故此技術可望應用在新劑型之豬用疫苗，以有效防治豬隻性疾病(例如豬鏈球菌症)。
以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
此實施例所使用之豬鏈球菌血清第2型(Streptococcus suis serotype 2；S.suis 2)係由國立屏東科技大學動物疫苗科技研究所朱純燕教授所提供。
首先，將豬鏈球菌血清第2型(S.suis 2)培養於含5%脫纖維羊血之血液瓊脂培養基上，於37℃恆溫培養箱中培養24h後，挑選單一菌落接種於3mL之托-休二氏培養液(Todd Hewitt Broth，THB，BD,MD,USA；內含3%之雞血清，chicken serum，CS)中，以37℃震盪培養12小時，再以1：100放大培養於100mL THB培養液內，以37℃震盪培養12小時。
然後，收取上述震盪培養後的菌體，以0.2%之福馬林(formalin)於室溫(10℃至40℃)進行24小時不活化處理。之後，利用市售微射流均質機處理前述不活化菌體。所得之不活化菌體與磷酸化鋁膠佐劑以重量比1：1之比例均勻混合後，再利用低溫離心乾燥機進行濃縮及乾燥。前述乾燥完成之豬用疫苗組成物置於4℃備用。
為了便於後續觀察與評估，以下實施例可使用FITC接枝之豬用疫苗組成物製備微針貼片型豬用疫苗，惟
在實際應用時，可以不使用FITC接枝之豬用疫苗組成物。首先，取0.129g(1.2%(w/v))之實施例一豬用疫苗組成物，與7.316mL之無菌二次水均勻混合後，再以比例1：10之比例與0.81mL之FITC螢光溶液(5mg之FITC溶於1mL之酒精溶液)混合，於4℃避光攪拌進行接枝反應至隔日。接著，將接枝後之半成品置於透析膜內，於4℃避光透析至隔日，即完成FITC接枝之豬用疫苗組成物。
首先，製備微針貼片之柱體與可溶性針體的微米級模具。在此實施例中，將聚二甲基矽氧烷(PDMS)攪拌均勻，置於恆溫震盪水浴槽內，去除PDMS內的氣泡後，注入不鏽鋼金字塔柱微針主體結構(總高1200μm、底部尺寸300μm x 300μm；陣列9×9)，使PDMS完全覆蓋並靜置於室溫(10℃至40℃)，待氣泡浮出後，即可將主體結構放至90℃烘箱內乾燥30分鐘，即可製得微米級模具。之後，微米級模具以121℃、30分鐘進行高溫高壓滅菌後備用。
首先，將0.129g(1.2%(w/v))之製備例一豬用疫苗組成物與無菌二次水8.127mL均勻混合後，再與1.910g(18.8%(w/v))之PVA(平均分子量47,000，Sigma-Aldrich Co.,LLC.)充分混合後，即完成金字塔柱之可溶性針體混合液。
取0.35mL之上述可溶性針體混合液，平均鋪於實施例一之微米級模具上，並置於離心管內，以5100rpm、28℃、30分鐘之條件進行離心灌模。待離心完成後，刮除微米級模具上多餘之可溶性針體混合液，再以5100rpm、28℃、2小時進行離心乾燥，隨後所得之可溶性針體放置室溫(10℃至40℃)陰乾至隔夜，其中，可溶性針體之疫苗組成物可包含1×109CFU/mL之豬鏈球菌不活化菌體。
接著，分別各秤取5g之PVP(聚乙烯咯烷酮)及PVA與10ml去離子水(PVP：PVA：DI water=1：1：2)50%(w/w)攪拌均勻後，將PVP/PVA混合物以薄層(約0.1g)平均鋪於上述含有可溶性針體的微米級模具上，以5100rpm、28℃、30分鐘進行離心灌模。待離心完成後，刮除微米級模具上多餘之PVP/PVA混合物，再將微米級模具放置室溫(10℃至40℃)陰乾1日後，隨後放置37℃、4小時去除多餘水分，即可將微針貼片型豬用疫苗由PDMS模板上拔離，置於4℃避光備用。
所得之微針貼片型豬用疫苗的外觀如圖1a(光學顯微影像)以及圖1b(放大40倍)所示。實施例一之可溶性針體為金字塔型之幾何微針，大小約為1平方公分(如圖1a所示)，可溶性針體與針柱之總高度為1200μm(其中可溶性針體之高度為600μm，針柱之高度為600μm)，底座尺寸為300μm x 300μm(如圖1b及圖2a所示)，一片微針可以配置為具有81個陣列排列之可溶性針體(如圖1c所示)。
實施例一之可溶性針體能有效包覆S.suis 2不活化菌體，其抗原含量為146.7±17.7μg(約為1×109CFU/mL)。
實施例二係使用與實施例一相同的方法製備螢光微針貼片型豬用疫苗，不同之處在於實施例二使用製備例二FITC接枝之豬用疫苗組成物製備金字塔柱之可溶性螢光針體。所得之螢光微針貼片型豬用疫苗的外觀如圖1c(光學顯微影像)所示。
此安全性試驗係將實施例二之螢光微針貼片型豬用疫苗，接種於4週齡之ICR小鼠背部皮膚，以評估皮膚穿刺試驗的效果。
首先，對ICR小鼠進行鎮定麻醉，其係於每隻小鼠之後腿肌肉注射0.05mL之麻醉劑(Zoletil 50)與鎮靜劑(Rompun)(麻醉劑與鎮靜劑之體積比為2：1)。接著，再以電動除毛刀將小鼠背部皮毛刮除後，再塗上除毛膏，停留5分鐘後，以清水擦拭乾淨，並以酒精棉清潔皮膚表面。
然後，將實施例二之螢光微針貼片型豬用疫苗固定於敷帖器中柱上(敷帖器強度2N)，進行皮膚穿刺(一片/隻)，同時於微針貼片上緩緩注入無菌之生理食鹽水
(0.85%)，輔助微針有效溶於皮膚表面，持續約3分鐘後，拔除微針貼片，並將小鼠置於保溫箱內甦醒。於微針貼片接種後持續觀察14日，其接種後的表皮外觀具有針體穿刺陣列狀之微創傷，如圖1d(光學顯微影像)所示。由圖1d可知，實施例二之微針可成功刺穿小鼠角質層並形成微創口，於皮膚表層可見具81個微針陣列之穿刺痕跡。所有受試小鼠對於實施例二之螢光微針貼片型豬用疫苗並無任何不良反應，且所有受試小鼠均健存且增重(圖未繪示)。
將完成上述安全性試驗之小鼠，以過量麻醉劑(Zoletil 50)犧牲後，隨即以手術刀片取下穿刺部位之皮膚(大小約為1.3cm×1.3cm)，以表皮直立的方式浸泡於冷凍切片劑(optimum cutting temperature compound,O.C.T.)內，再以液態氮急速冷凍OCT，即完成組織包埋，並避光保存於-80℃備用。
然後，利用冷凍切片機切割前述之OCT，取得小鼠皮層組織橫截面切片(厚度為10μm)。之後，利用倒立式螢光顯微鏡觀察微針之穿刺深度及釋放情形，其結果如圖2a至圖2d所示。
實施例一之微針貼片型豬用疫苗的針體的外觀如圖2a(放大5倍之光學顯微影像)所示。實施例二之螢光微針貼片型豬用疫苗的針體的外觀如圖2b(放大5倍之螢光顯微影像)所示。小鼠皮層組織之橫截面切片如圖2c(光學顯微影像)以及圖2d(螢光顯微影像)所示。
經冷凍切片所取得之小鼠皮層組織切片，可見微針具穿刺皮膚角質層之能力，而穿刺深度約為239.95±24.40μm(如圖2c所示)，橫跨表皮與真皮層間。此外，於螢光顯微鏡下可見S.suis 2之抗原殘留於穿刺點及皮層內(如圖2d所示)。
由於小鼠皮層較細薄，故選擇以強度2N之敷帖器進行穿刺，以降低穿刺力道及減少皮膚受損。
實施例一完成接種之小鼠亦利用數位影像於穿刺後每隔2小時拍攝小鼠表皮陣列傷口，記錄穿刺傷口程度及皮膚修復情形，其結果如圖3a至圖3f所示。
請參閱圖3a至圖3f，其係顯示小鼠背部皮膚表面在利用實施例一之微針貼片型豬用疫苗的針體接種後不同時間穿刺之外觀影像以及紅腫程度，其中圖3a至圖3f分別代表接種後0小時、2小時、6小時、12小時、24小時、34小時之外觀影像。
由於皮膚經微針穿刺後而受到破壞(角質層)，進而產生微孔洞，迫使體內水分往體表流失。此試驗結果證實，微針之穿刺效率達100%。於接種後2至6小時之傷口癒合及紅腫程度呈等比修復的情形(如圖3b至圖3c所示)。接種後12至24小時，可見皮膚表面的微孔洞與紅腫情況有顯著改善(如圖3d至圖3e所示)。而接種後34小時，微孔洞完全密合且有些許的毛髮生成(如圖3f所示)。所有受試小
鼠對於實施例二之螢光微針貼片型豬用疫苗並無任何不良反應，且所有受試小鼠均健存且增重(圖未繪示)。
另外，實施例一完成接種之小鼠利用水分散失測量儀(vapometer)之探頭輕觸皮膚，於接種後每隔2小時檢測穿刺微針後及未穿刺部位之經皮水分散失量(trans-epidermal water loss；TEWL)，藉此評估傷口癒合情形，其結果如圖4所示，其中圖4之橫軸代表接種後的小時數，縱軸代表測得之TEWL值(g/m2h)。
圖4結果顯示，經皮免疫之PVA抗原微針(即Vaccine-MN，曲線401)，於接種後第0小時之TEWL值為236.45±30.47g/m2h；接種後第2及6小時之TEWL值分別為147.98±39.23g/m2h與85.26±33.33g/m2h，可見傷口癒合程度呈正比線性關係；接種後第12及24小時之TEWL值分別為52.85±18.45g/m2h與31.88±3.37g/m2h，表示皮膚傷口逐漸癒合但回復速度較為緩慢；接種後第34小時之TEWL值為19.47±1.42g/m2h，而不施打微針貼片之對照組的TEWL值為19.55±0.69g/m2h(即Control(untreated)，曲線403)，證實小鼠皮膚具自行修復能力，且亦能使微孔洞完全密合。
上述評估方式3.1及3.2的試驗證明，本發明之微針貼片型豬用疫苗確實可避免傷口感染之疑慮。
選擇4週齡ICR小鼠共42隻，隨機分為7組，每組6隻，分別為Vaccine-MN：經皮免疫之PVA抗原微針；Vaccine-IM(PVA)：含PVA抗原以肌肉注射；Vaccine-IM：不含PVA抗原以肌肉注射；Control-MN：經皮免疫之PVA對照組微針(不含抗原)；Control-IM(PVA)：含PVA之對照組以肌肉注射(不含抗原)；Control-IM：不含PVA之對照組以肌肉注射(不含抗原)及Naive：0.85%生理食鹽水。於第一次免疫後14天再補強接種一劑量，分別檢測血清中抗體力價、細胞增生試驗以及細胞激素表現量，其結果如圖5至圖11所示。在圖5至圖11中，直條501、直條601、直條701、直條801、直條901、直條1001、直條1101代表Vaccine-MN組之結果，直條503、直條603、直條703、直條803、直條903、直條1003、直條1103代表Vaccine-IM(PVA)組之結果；直條505、直條605、直條705、直條805、直條905、直條1005、直條1105代表Vaccine-IM組之結果，直條511、直條611、直條711、直條811、直條911、直條1011、直條1111代表Control-MN組之結果，直條513、直條613、直條713、直條813、直條913、直條1013、直條1113代表Control-IM(PVA)組之結果；直條515、直條615、直條715、直條815、直條915、直條1015、直條1115代表Control-IM組之結果，直條521、直條621、直條721、直條821、直條921、直條1021、直條1121代表Naive組之結果，直條823代表
Positive-ConA組之結果，直條825代表before vaccination組之結果。
於接種前及接種後第0、14及28天採血，利用間接酵素連結免疫吸附法(Indirect ELISA)檢測小鼠血清中IgG、IgG 2a、IgG 1抗體力價，其結果分別如圖5(IgG)、圖6(IgG 2a)以及圖7(IgG 1)所示。血清檢體以1：250稀釋後再進行間接酵素連結免疫吸附法，所得之數據以Tukey significant test分析並以Mean±SEM呈現。圖5至圖7中不同字母代表各組間具有差異性(P<0.05)。
由圖5結果顯示，於接種後第14及28天，所有免疫組較對照組皆具顯著性差異(P<0.05)，但第14天之免疫組間無差異，而第28天之Vaccine-MN組(直條501)較Vaccine-IM(PVA)組(直條503)及Vaccine-IM組(直條505)具顯著性差異(P<0.05)。
由圖6結果顯示，於接種後第14及28天，Vaccine-MN組(直條601)較其他免疫組及對照組具顯著性差異(P<0.05)，而第28天之Vaccine-IM(PVA)組(直條603)及Vaccine-IM組(直條605)較對照組具顯著性差異(P<0.05)。
由圖7結果顯示，於接種後第14天，Vaccine-IM組(直條705)較其他免疫組及對照組具顯著性差異(P<0.05)，而第28天之所有免疫組較對照組皆具顯著性差異(P<0.05)，但各免疫組間無顯著性差異。
於補強接種後14天(第28天)採集小鼠脾臟細胞，分析脾臟細胞之增生指數，其結果如圖8所示。增生指數(stimulation index；S.I)值為(細胞經抗原刺激後之OD值-培養基之OD值)/(無抗原刺激之細胞OD值-培養基之OD值)。所測得之數據以Tukey significant test分析，圖8中不同字母代表各組間具有差異性(P<0.05)。
由圖8結果顯示，於補強接種後14天Vaccine-MN組(直條801)較其他免疫組及對照組具顯著性差異(P<0.05)，而其他免疫組與對照組間無顯著性差異。
於補強接種後14天(第28天)採集小鼠全血，利用細胞激素檢驗套組檢測小鼠經補強後二週後，血清中細胞激素IFN-γ、IL-12、IL-4之表現量，分別如圖9(IFN-γ)、圖10(IL-12)以及圖11(IL-4)所示。所測得之數據以Tukey significant test分析，圖9至圖11中不同字母代表各組間具有差異性(P<0.05)。
由圖9結果顯示，於補強接種後14天(第28天)，Vaccine-MN組(直條901)較其他免疫組及對照組具顯著性差異(P<0.05)，而Vaccine-IM(PVA)組(直條903)、Vaccine-IM組(直條905)以及Control-MN組(直條911)較其他對照組間具顯著性差異(P<0.05)。
由圖10結果顯示，於補強接種後14天(第28天)，Vaccine-MN組(直條1001)較其他免疫組及對照組具
顯著性差異(P<0.05)，而其他免疫組與對照組間無顯著性差異。
由圖11結果顯示，於補強接種後14天(第28天)，Vaccine-MN組(直條1101)、Vaccine-IM(PVA)組(直條1103)、Vaccine-IM組(直條1105)、Control-IM(PVA)組(直條1113)與Control-IM組(直條1115)較Control-MN組(直條1111)及Naive組(直條1121)間具顯著性差異(P<0.05)。
上述圖5至圖11之結果證明本發明的微針貼片型豬用疫苗在接種二劑量時，可提供充份的保護效力。
選擇4週齡ICR小鼠共70隻，隨機分為7組，每組10隻，分別為Vaccine-MN：經皮免疫之PVA抗原微針；Vaccine-IM(PVA)：含PVA抗原以肌肉注射；Vaccine-IM：不含PVA抗原以肌肉注射；Control-MN：經皮免疫之PVA對照組微針(不含抗原)；Control-IM(PVA)：含PVA之對照組以肌肉注射(不含抗原)；Control-IM：不含PVA之對照組以肌肉注射(不含抗原)及Naive：0.85%生理食鹽水。於第一次免疫後14天以10LD50(8x109CFU/mL)行腹腔攻毒S.suis 2活菌0.2mL，並每日觀察其存活率，其結果如圖12所示，其中圖12之橫軸代表免疫後天數，縱軸代表存活率(%)，直條1201代表Vaccine-MN組之結果，直條1203代表Vaccine-IM(PVA)組之結果，直條1205代表Vaccine-IM組之結果，直
條1211代表Control-MN組之結果，直條1213代表Control-IM(PVA)組之結果，直條1215代表Control-IM組之結果，直條1221代表Naive組之結果。
由圖12結果顯示，Vaccine-MN組(直條1201)及Vaccine-IM組(直條1205)較Vaccine-IM(PVA)組(直條1203)及對照組間具顯著性差異(P<0.05)。而Vaccine-MN組(直條1201)及Vaccine-IM組(直條1205)的存活率分別為60%和70%，其次Vaccine-IM(PVA)組(直條1203)的存活率為30%。
圖12之結果證明本發明的微針貼片型豬用疫苗在接種一劑量時，亦可提供充份的保護效力。
由上述數個實施例證實，本發明的微針貼片型豬用疫苗確實可提供充份的保護效力，可望應用在防治豬鏈球菌症。
需補充的是，本發明雖以特定的疫苗組成物、特定材料及規格的微針貼片、分析方法或特定儀器作為例示，說明本發明的微針貼片型豬用疫苗，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明的微針貼片型豬用疫苗亦可使用其他疫苗組成物、其他材料及規格的微針貼片、其他分析方法或其他儀器進行。
由上述實施例可知，本發明的微針貼片型豬用疫苗，其優點在於將由疫苗組成物以及聚合物所組成之可溶性針體，直接貼設於微針貼片的針柱上，當此微針貼片貼附
於受免疫動物的皮膚時，可同時使受免疫動物產生體液性與細胞性免疫反應。
雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
1201/1203/1205/1211/1213/1215/1221‧‧‧直條
Claims (5)
- 一種微針貼片型豬用疫苗，包含：一底座；複數個針柱，設於該底座上；以及複數個可溶性針體，直接貼設於該些針柱上，其中該些可溶性針體是由一疫苗組成物以及一聚合物所組成，該疫苗組成物包含一細菌性抗原以及一醫藥學上可接受之載劑，其中該細菌性抗原包括不活化菌體或重組蛋白，該不活化細菌包括豬鏈球菌(Streptococcus suis；S.suis)，且以該些可溶性針體之一總使用量為100重量百分比，該疫苗組成物之一使用量為1.2重量百分比，且該聚合物之一使用量為98.8重量百分比。
- 根據申請專利範圍第1項所述之微針貼片型豬用疫苗，其中該聚合物包含聚乙烯醇(polyvinyl alcohol；PVA)。
- 根據申請專利範圍第1項所述之微針貼片型豬用疫苗，其中該底座以及該些針柱之一材料為相同或不同。
- 根據申請專利範圍第1項所述之微針貼片型豬用疫苗，其中該底座以及該些針柱之一材料係選自於由聚乙烯吡咯酮(polyvinyl pyrrolidone；PVP)、聚乙烯醇(PVA)及其任意組合所組成之一族群。
- 根據申請專利範圍第1項所述之微針貼片型豬用疫苗，其中該底座以及該些針柱之一材料包括重量比1：1之聚乙烯吡咯酮(PVP)及聚乙烯醇(PVA)。
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| MC Chen,et al."Fully embeddable chitosan microneedles as a sustained release depot for intradermal vaccination",Biomaterials 34 (2013) 3077~3086. * |
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