CN113521309B - 人肝细胞生长因子基因在湿疹治疗中的应用及微针药械 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人肝细胞生长因子基因在湿疹治疗中的应用及微针药械。将人肝细胞生长因子基因构建到真核表达载体、病毒载体及基因表达框或微环DNA中，采用微针或注射等方式局部导入皮下后，能明显起到抗湿疹及相关症状的作用。因此，该人肝细胞生长因子基因在湿疹治疗方面，具有极好的应用前景，尤其是以微针器械的形式，不仅能抑制湿疹症状且副作用小。

Description

人肝细胞生长因子基因在湿疹治疗中的应用及微针药械
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种人肝细胞生长因子基因在湿疹治疗中的应用及微针药械。
背景技术
湿疹是由多种内外因素引起的一种皮肤炎症反应，常伴随有剧烈瘙痒，“瘙痒－搔抓”这一恶性循环进一步导致湿疹加重，致使其难愈合，易复发。目前治疗湿疹的药物主要是针对其瘙痒症状，采用多药联合的方式，如抗焦虑药多虑平和抗过敏药物糖皮质激素药膏等的局部应用。此外，也有应用清热利湿、养血润燥中药，及针刺的方式对湿疹进行治疗，取得了一定的治疗效果。然而由于湿疹易反复发作，患者需长期依赖激素类药物，会产生较大的副作用。
因此，仍需进一步开发一些副作用较小的治疗湿疹的药物。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种人肝细胞生长因子基因在湿疹治疗中的应用及微针药械，以改善现有技术中治疗湿疹的药物副作用严重的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种人肝细胞生长因子基因在制备治疗湿疹及湿疹相关疾病的药物或药械中的应用。
进一步地，人肝细胞生长因子基因以载体携带的形式存在于药物或药械中。
进一步地，载体为真核表达质粒、病毒、基因表达框、微环DNA或mRNA；优选地，真核表达质粒包括依次连接的真核细胞启动子、人肝细胞生长因子基因、polyA尾、细菌复制序列及抗生素抗性基因的超螺旋质粒DNA；优选地，作为载体携带人肝细胞生长因子基因的病毒包括：逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒；优选地，基因表达框包括依次连接的真核细胞启动子、增强子、人肝细胞生长因子基因及polyA尾的线性表达框；优选地，微环DNA包括依次连接的真核细胞启动子、人肝细胞生长因子基因、polyA尾及重组酶识别序列的超螺旋闭环DNA；优选地，mRNA指人肝细胞生长因子基因的信使RNA。
进一步地，药物的剂型为注射液、干粉制剂或载药微针。
进一步地，药物的给药方式选自局部皮下注射、或微针导入，优选微针导入采用微针贴或滚轮微针、微针注射器导入。
进一步地，湿疹相关疾病包括湿疹引起的红斑、丘疹、水疱、鳞屑、皮肤炎症反应和瘙痒中的任意一种或多种。
根据本发明的另一方面，提供了一种微针药械，微针药械中含有治疗湿疹及湿疹相关的药物，药物含有人肝细胞生长因子基因。
进一步地，药物中的人肝细胞生长因子基因以载体携带的形式存在，优选地，载体为真核表达质粒、病毒、基因表达框或微环DNA；更优选地，真核表达质粒含有人肝细胞生长因子基因和卡那霉素抗性基因序列，其中，人肝细胞生长因子基因位于巨细胞病毒启动子及牛生长激素基因的聚腺苷酸信号之间。
进一步地，微针药械为微针贴，优选地，微针贴为实心微针、中空微针、镀层微针；优选地，微针贴为可溶性微针；更优选地，可溶性微针的材质选自羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、蔗糖、透明质酸、甲壳素、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙内脂、聚碳酸酯、聚乙醇酸及聚二甲基硅氧烷中的任意一种或多种。
进一步地，药物中载体的浓度为0.001～0.5mg/cm2，优选为0.05～0.1mg/cm2；优选地，微针药械的材质为透明质酸，制备微针药械时，所使用的透明质酸的浓度为200～300mg/mL，更优选为250mg/mL；更优选地，透明质酸的分子量为10～200KD，优选为30～200KD，更优选为40～100KD，进一步优选为45～75KD。
应用本发明的技术方案，将人肝细胞生长因子基因构建到真核表达载体、病毒载体及基因表达框或微环DNA中，采用微针、注射等方式局部导入皮下后，能明显起到抗皮肤炎症和抑制瘙痒等湿疹相关症状的作用。因此，该人肝细胞生长因子基因在湿疹治疗方面，具有极好的应用前景，可进一步制备成载药微针器械。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例2含质粒DNA的透明质酸微针溶解后的凝胶电泳图；
图2A和图2B示出了根据本发明的实施例3中未给予pHGF治疗的湿疹模型小鼠皮肤状况图；
图3A和图3B示出了根据本发明的实施例3中给予pHGF微针治疗的湿疹模型小鼠皮肤状况图；
图4A和图4B示出了根据本发明的实施例3中给予pHGF皮下注射的湿疹模型小鼠皮肤状况图；
图5A至图5D示出了根据本发明的实施例3中各组小鼠背部剃毛区皮肤病理切片图,其中图5A显示的是正常小鼠的皮肤，图5B结果表明，模型组皮肤表皮脱落坏死，炎性浸润明显，皮肤附件损伤严重；从图5C和图5D分别可以看出，皮下注射组和微针组炎性浸润较轻，皮肤附件较完整，处于修复状态。而且，从图5D的微针组显示出比图5C的皮下注射组更好的疗效；
图6示出了实施例4所制备的pHGF可溶性微针贴在扫描电镜下的形貌；
图7示出了实施例5中不同分子量的透明质酸制备的pHGF可溶性微针贴的机械力测试的压力-位移曲线；
图8A至8C示出了实施例6中可溶性微针贴小鼠皮肤插入染色试验结果；其中，图8A是小鼠皮肤插入染色情况，图8B是插入前微针形态，图8C是插入后微针形态；
图9示出了实施例7中透明质酸可溶性微针贴介导pLUC皮下表达小动物活体成像结果；
图10示出了实施例8中小造模结束后小鼠皮损对比结果。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如前述，现有技术中针对湿疹的药物治疗后存在严重副作用等，为改善这一现状，本申请的发明人对开发新的治疗湿疹的药物进行了各种研究和尝试，首次发现人肝细胞生长因子对治疗湿疹具有一定的作用。具体研究如下：
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)最初作为一种肝细胞有丝分裂原从肝部分切除大鼠的血清中分离得到。HGF是一多功能生长因子，具有细胞迁移、增殖和促进胚胎期各器官形态发生的作用。它通过与其特异性膜受体c-met结合而发挥其多样生物学作用，是间质和上皮/内皮细胞间相互作用的重要信息分子，对胚胎发育、组织器官再生、伤口愈合和血管发生起着重要的调节作用。
发明人在之前的研究中，开发了一种合成的携带了肝细胞生长因子(HGF)的重组质粒pHGF，并在前期pHGF镇痛作用研究中发现，pHGF能抑制PGE2、5-HT及HIS等因子的高表达，可使小胶质细胞的促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达显著降低。已知5-HT、HIS及IL-6等也是主要的瘙痒介质，可诱导、协同介导瘙痒。因此发明人推测pHGF可能通过抑制瘙痒介质及炎症因子等的释放，切断“瘙痒－搔抓”的恶性循环。pHGF可能通过抑制炎症反应、抑制瘙痒介质的释放，对湿疹起到治疗作用。
为进一步证实上述推断，发明人进一步利用该重组质粒pHGF对具有湿疹的动物小鼠进行了治疗研究，发现能够大大改善湿疹的皮肤状况(具体见实施例部分)。
在上述研究结果的基础上，申请提出了本申请的方案。在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种人肝细胞生长因子基因在制备治疗湿疹及湿疹相关疾病的药物中的应用。
优选地，人肝细胞生长因子基因以载体携带的形式存在于药物中。
上述载体包括但不仅限于真核表达质粒、病毒、基因表达框、微环DNA或mRNA。这些载体均可以通过人工构建携带人肝细胞生长因子基因，转入哺乳动物细胞后能够表达肝细胞生长因子蛋白。现有的基因治疗研究表明，采用上述载体携带的基因药物对机体无明显的副作用。
上述真核表达质粒的具体结构并无特殊限制，只要能够表达人肝细胞生长因子基因，并表达人肝细胞生长因子蛋白即可。优选该真核表达质粒包括依次连接的真核细胞启动子、人肝细胞生长因子基因、polyA尾、细菌复制序列及抗生素抗性基因的超螺旋质粒DNA。
在一种实施例中，携带该人肝细胞生长因子基因的真核表达质粒为重组质粒pVAX1-HGF，该重组质粒采用pVAX1质粒载体骨架，人肝细胞生长因子基因(HGF)位于pCMV启动子与BGH poly(A)尾之间，该重组载体骨架上还带有细菌复制起始序列ORI及卡那霉素(Kana)抗性基因DNA序列(全长约为3.0kb)。其中，人肝细胞生长因子基因的具体序列为人肝细胞生长因子基因cDNA(全长约为2.3kb)。
上述作为载体携带人肝细胞生长因子基因的病毒可以采用现有的病毒载体。在本申请中上述病毒包括但不仅限于：逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒。
上述基因表达框包括依次连接的真核细胞启动子、增强子、人肝细胞生长因子基因及polyA尾的线性表达框。
上述微环DNA包括依次连接的真核细胞启动子、人肝细胞生长因子基因、polyA尾及重组酶识别序列的超螺旋闭环DNA。
上述各种载体中，真核细胞启动子可以选自任何的商业化的表达质粒中所使用过的启动子，比如，CMV、EF1α、SV40、PGK1、Ubc、hROSA26等。
在一种优选的实施例中，药物的剂型为注射液、干粉制剂或载药微针。本申请中优选推荐使用载药微针。注射剂可以按照药学领域的常规方法制备。成品于4℃保存。
上述药物的给药方式可以根据实际需要进行合理选择。在本申请中，从提高疗效角度考虑，本申请的药物的给药方式优选采用局部皮下注射或微针导入，优选微针导入为微针贴、滚轮微针或微针注射器导入。采用滚轮微针对皮肤涂抹后的重组HGF基因药物导入皮肤细胞中。
采用微针导入时，微针的具体结构可以是实心微针、中空微针或镀层微针。微针的具体材质也无特殊限制，可以是羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、蔗糖、透明质酸、甲壳素、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙内脂、聚碳酸酯、聚乙醇酸中的任意一种或多种。
更优选上述微针为可溶性微针，可溶性微针的生物相容性好，刺入皮肤后可形成自我修复的微孔道，且可在皮内自行溶解，使得大分子和水溶性药物的经皮传递效率大大提高，给药效果超越了传统皮肤给药制剂。并且通过设计加载药物的不同基质材料配比、制剂技术以及制备工艺等可达到缓控释。透明质酸对人体无毒害，亲水性极好，因此可将pHGF荷载至可溶性微针，通过微针的穿刺微孔，使pHGF直接进入真皮层表达而发挥作用。
本发明中的携带人肝细胞生长因子基因的载体可以通过在患处直接皮下注射及微针导入。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。
上述人肝细胞生长因子基因除了可以用于治疗湿疹外，还可以治疗因湿疹引起的相关疾病，湿疹相关疾病包括湿疹引起的红斑、丘疹、水疱、鳞屑、皮肤炎症反应和瘙痒中的任意一种或多种。
在本申请第二种典型的实施方式中，还提供了一种能够治疗湿疹的微针药械，该微针药械含有药物，该药物中含有治疗湿疹的人肝细胞生长因子基因。
药物中的人肝细胞生长因子基因以载体携带的形式存在，优选地，载体为真核表达质粒、病毒、基因表达框或微环DNA；更优选地，真核表达质粒含有人肝细胞生长因子基因和卡那霉素抗性基因序列，其中，人肝细胞生长因子基因位于巨细胞病毒启动子及牛生长激素基因的聚腺苷酸信号之间。
在优选的实施例中，该微针药械为微针贴，优选地，微针贴为实心微针、中空微针、镀层微针。从药物吸收利用及药效角度考虑，优选该微针贴为可溶性微针；更优选地，可溶性微针的材质选自羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、蔗糖、透明质酸、甲壳素、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙内脂、聚碳酸酯、聚乙醇酸、聚二甲基硅氧烷中的任意一种或多种。上述聚合物均指分子量在10～200KD的聚合物。
根据不同的规格，该微针药械中的药物可以配置成不同载体浓度的药物。在优选的实施例中，药物中载体的浓度为0.001～0.5mg/cm2，优选为0.05～0.1mg/cm2；优选地，微针贴的材质为透明质酸；优选地，制备该微针贴所用的透明质酸的浓度为200～300mg/mL，更优选为250mg/mL；透明质酸的分子量为10～200KD，优选为30～200KD，更优选为40～100KD，进一步优选为45～75KD。在一些优选的实施例中，透明质酸的分子量为41KD。该优选实施例中，通过对不同浓度，不同分子量的透明质酸制备的微针进行检测发现，浓度和分子量分别在上述范围时，所制备得到的微针的硬度及机械强度比较合适，浓度更高或者分子量更高，硬度会下降，而分子量更低，所制备的微针的机械性能下降。此处的分子量是指重均分子量。
下面结合具体实例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1
携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒载体的获得
一、菌体制备
采用哺乳动物细胞表达载体pVAX1(Invitrogen，产品目录号为V260-20，全长2999bp)为骨架，自行构建了的携带人肝细胞生长因子基因的质粒pHGF。
载体pVAX1含有CMV启动子、BGH ployA、卡那霉素抗性基因及pUC ori，其中，CMV启动子与BGH ployA之间是多克隆位点，包括T7启动子以及依次连接的限制性酶切位点。
CMV启动子位于137-724bp；T7启动子位于664-683bp；多克隆位点：696-811bp；
BGH poly A：829-1053bp；卡那霉素抗性基因：1226-2020bp；pUC ori：2320-2993bp。
人肝细胞生长因子基因(全长2.3Kb)置于酶切位点BamH I和XbaI之间，从而获得重组质粒pHGF(全长近5.3Kb)。宿主菌为大肠杆菌DH5α，按照常规方法进行发酵，离心后获得菌体，-20℃保存备用。
二、碱裂解破碎细胞提取质粒DNA
按照专利号为ZL201110089982.2(授权公告日为2013年8月28日，专利名称为制备质粒DNA的碱裂解系统及组合系统)中公开的裂解细胞提取质粒DNA的方法和装置进行质粒DNA的提取，其中的改进步骤如下：
1.通过连续碱裂解过程获得的澄清碱裂解液通过截留分子量为300KDa的超滤柱进行超滤浓缩。
2.获得的超滤浓缩液经Sepharose 6Fast Flow填料(GE公司，货号：17-0159-01)将携带人干细胞生长因子基因的质粒DNA与RNA分离。
3.将获得的质粒DNA溶液经Plasmidselect Xtra填料(GE公司，货号：28-4024-02)将超螺旋与开环的质粒DNA分离，获得超螺旋质粒DNA。
4.将获得的超螺旋质粒DNA经Source 15Q填料(GE公司，货号：17-0947-05)进一步精制，获得纯度更高的质粒DNA。
5.将获得的纯度高的质粒DNA经乙醇沉淀，无菌空气干燥，将固体质粒DNA冻存于-20℃.
实施例2：pHGF微针贴的制备
微模板法是最常用的微针浇注制备方法之一。该法的一般程序是先依靠微机电系统(MEMS)技术制得特定参数的微针阳模，然后使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)将微针阳模复制得到微针模板，最后将所需溶液滴入微针模板，通过抽真空或加热等方式排除微孔里和溶液中的空气，使得溶液更好地填满针孔槽，保证其机械强度，最后经凝固定形后分离即得到可溶性微针。
配方筛选：通过研究，发现透明质酸浓度从低到高时，微针的硬度逐渐增加，浓度达到250mg/mL时硬度好，超过这一值硬度成下降趋势。而对比10kD、50kD、960kD和1460kD各分子量，发现分子量较高时，硬度会显著降低，而分子量过小，机械强度也会下降，即50kD分子量下微针性能较好。
微针贴制备：将分子量为50kDa的透明质酸固体粉末溶解在超纯水中，配成250mg/mL的溶液，再将1.2mg的pHGF溶解于透明质酸溶液。取约400μL含药溶液滴加在PDMS模板(底宽300μm、高度800μm)表面，20℃抽真空至-0.05MPa约7min，室温下干燥10h后从模板上取下载药微针贴。
载药微针的凝胶电泳：图1为载药微针贴(1.2mg质粒)加3ml水溶解后的凝胶电泳图(主要检测微针贴中的药物是否能够溶出和/或降解)，从左至右依次是：DNAmarker(从上到下依次表示15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp)，原液(0.03mg/ml)，微针贴溶液稀释4倍，稀释8倍，稀释16倍，稀释32倍，稀释64倍。该结果表明，所制备的微针贴中含有目的质粒DNA。
实施例3：人肝细胞生长因子基因对BABL/c小鼠皮肤湿疹的治疗作用
动物模型：雄性BABL/c小鼠，适应性喂养3d后，随机分为湿疹模型组、pHGF微针组及pHGF皮下注射组3组，戊巴比妥钠麻醉后，在每只小鼠背部剃除鼠毛2cm×2cm。d1、d2、d3，以0.5％DNCB丙酮溶液涂于小鼠背部剃毛区皮肤致敏；而后2次/周以1％DNCB丙酮溶液涂抹小鼠背部剃毛区皮肤激发，28d后停止。
给药方式：模型组的小鼠剃毛区微针给药(仅PBS溶液)，每周1次；pHGF微针组的小鼠剃毛区0.1mg(溶于100μL的PBS)的pHGF微针给药，每周1次；pHGF皮下注射组的小鼠剃毛区0.1mg的pHGF皮下注射，每周1次。需要说明的是，没有采用表皮涂抹给药，是因为皮肤没有破损时，药物很难通过表皮进入真皮细胞，而皮肤破损后由于结痂，药物进入也比较困难。但这并不排除可以采用涂抹给药方的方式给药。
效果评价：图2A和图2B结果表明，未给予pHGF治疗的模型组小鼠背部皮肤粗糙、浸润增厚，伴有丘疹水疱及鳞屑，搔抓结痂痕迹明显；图3A和图3B结果表明，给予pHGF微针治疗的小鼠相对于模型组，其背部皮肤纹理较细，浸润较轻，丘疹水疱及搔抓结痂痕迹等不明显；图4A和图4B结果表明，给予pHGF皮下注射的小鼠相对于模型组，其背部皮肤纹理较细，浸润较轻，有较少鳞屑、水疱，搔抓结痂痕迹较轻。
进一步对各组小鼠的皮肤进行组织病理观察，结果如图5A至图5D所示。图5A显示的是正常小鼠的皮肤，图5B结果表明，模型组皮肤表皮脱落坏死，炎性浸润明显，皮肤附件损伤严重；从图5C和图5D分别可以看出，皮下注射组和微针组炎性浸润较轻，皮肤附件较完整，处于修复状态。而且，从图5D的微针组显示出比图5C的皮下注射组更好的疗效。
实施例4：制备荷载pHGF透明质酸可溶性微针贴
将分子量为10kD、41kD、960kD的透明质酸固体粉末溶解于2mg/mL的质粒溶液中，根据溶解后的澄清度及流动性配制成不同浓度的透明质酸溶液。取出约400μL浇注在PDMS微针模具凹槽表面，使其完全填充后，置于干燥皿内，使用循环水式多用真空泵抽真空至-0.08MPa并持续约5min。重复抽真空1～2次直至凹槽液面再无气泡生成。室温下干燥10h取出将微针贴与模具分离。
对不同分子量的透明质酸所制备的微针贴置于扫描电镜下进行观察，发现10kD、41kD透明质酸可溶性微针贴整体结构完整，针尖具备较好的硬度，而960kD透明质酸微针贴整体针尖偏软。图6示出了扫描电镜下观察可见实验制备的41kD透明质酸可溶性微针贴结构完整，针体均匀，排列整齐。
实施例5：透明质酸可溶性微针贴的表观及机械性能测试
表征观察：将可溶性微针贴用胶贴于支架侧面以观察针体，贴于支架上面以观察完整结构。
机械力测试：将可溶性微针贴置于万能试验机置物台中央，以初始压力为0.05N、最高压力为70N及压缩速率为0.05mm/min为参数，获得压力-位移曲线。
如图7所示，压力与位移曲线结果说明，相比于其他分子量，41kD的透明质酸载药微针贴在相同压力作用下形变量更小，机械强度更高，故优选用41kD透明质酸为原料制备可溶性微针贴。
实施例6：可溶性微针贴皮肤插入染色试验
BALB/c小鼠背部毛发剃出约2cm×2cm区域，亮蓝60标记的透明质酸可溶性微针贴按压背部皮肤，停留约3～5min后取下微针贴，观察皮肤染色情况，贴皮前后使用电子显微镜观察微针贴形态。
小鼠皮肤的微针贴片区域有明显的染色，证明亮蓝标记的透明质酸可溶性微针贴能穿透小鼠皮肤并使针尖溶解释放(见图8A至8C，其中，图8A是小鼠皮肤插入染色情况，图8B是插入前微针形态，图8C是插入后微针形态)。
实施例7：微针皮肤递送质粒的小动物活体成像
BALB/c小鼠背部毛发剃出约3cm×3cm区域，剃毛区按压负载pLUC透明质酸可溶性微针贴，停留约5min后揭下，1d后使用小动物活体成像系统观察质粒表达情况。透明质酸可溶性微针贴作用小鼠皮肤1d后，小动物成像结果显示均有较强发光，说明可溶性微针贴能够介导pLUC在小鼠皮下有明显的荧光素酶的表达(见图9)。
实施例8：小鼠湿疹模型的建立及给药
雄性BABL/c小鼠，适应性喂养3d后，随机分为湿疹模型组、阳性对照组、可溶性微针贴组及皮下注射组共4组，每组5只。各组小鼠背部选取约3cm×3cm区域进行毛发剃除。以丙酮：橄榄油(4：1)为基质配制浓度为0.5％及1％的DNCB溶液。d1、d2、d3以0.5％的DNCB溶液涂于小鼠背部剃毛区使皮肤致敏；而后2次/周以1％DNCB丙酮溶液涂抹小鼠背部剃毛区皮肤激发(4,7,11,14,17,20,23,26和28d)。湿疹模型组：不做处理；阳性对照组：小鼠背部剃毛区患处涂抹复方醋酸地塞米松乳膏，每周1次；可溶性微针贴组：小鼠背部剃毛区给予pHGF可溶性微针贴，每周1次；皮下注射组：小鼠皮下注射10μg的pHGF，每周一次。
皮肤症状观察评分造模结束后观察小鼠皮肤，依据相关文献记载的评分方法(参见赵辨.湿疹面积及严重度指数评分法[J].中华皮肤科杂志,2004,01):7-8.)，以红斑、鳞屑结痂、增厚及抓痕为皮损症状，每项症状分值为0～3分，其中0分：症状仔细观察后也不能确定；1分：症状存在，但必须仔细观察后才能察觉；2分：症状明显；3分：症状极为严重，各种皮损分值之间可记半0.5分。四项总分则为小鼠的皮损积分。统计采用IBM SPSSStatistics 19软件进行数据分析。多组间比较采用单因素方差分析，P<0.01时具差异具有统计学意义。
由于对小鼠皮肤致敏后需要维持其皮损状态，参照文献(Yu K,Wang Y,Wan T,etal.Tacrolimus nanoparticles based on chitosan combined with nicotinamide:enhancing percutaneous delivery and treatment efficacy for atopic dermatitisand reducing dose[J].Int J Nanomedicine,2018,13(129-142)，在造模的第4d，7d，11d，14d，17d，20d，23d，26d和28d给予DNCB激发，同时给药组每周进行一次给药。第28d激发结束后观察小鼠背部皮损情况。
结果如图10所示，模型组：小鼠背部皮肤损伤明显，出现红斑、结痂、鳞屑、皮肤粗糙及增厚等典型湿疹症状。阳性对照组：无明显红斑、丘疹，存在较轻的鳞屑、干皮，较明显的抓痕与结痂。皮肤重度薄化(非湿疹症状)。可溶性微针贴组：无明显抓痕或结痂，存在一定的鳞屑及增厚，皮肤修复较好。皮下注射组：无明显增厚及结痂，较轻的丘疹、鳞屑及干皮等，皮肤修复较好。各组小鼠湿疹造模结束后的皮损计分如表1所示。结果表明，阳性对照组、可溶性微针贴组及皮下注射组皮损积分均低于模型组，差异具有统计学意义(P＜0.01)；各治疗组之间无显著性差异(P＞0.05)。
表1各组小鼠湿疹症状积分
Figure BDA0003000148480000091
Figure BDA0003000148480000092
注：积分＝4个单项计分之和；**与模型组比较P＜0.01。
从以上结果表明，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒pHGF对湿疹具有治疗作用。
将外源HGF基因导入皮肤组织细胞中，能够改善并缓解湿疹导致的皮肤炎症。并且，本申请的实施例还表明通过采用皮下注射或者微针导入外源重组HGF基因的方式，能够更有效地改善和治疗湿疹。
而且，上述实施例还表明，本申请的携带肝细胞生长因子基因的载体稳定性高，在医学上安全性好且具有较好的疗效。且携带人肝细胞生长因子基因的载体易纯化、生产周期短，成本低等优点，有利于工业化生产，对治疗湿疹具有重要的应用前景和实际意义。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (24)

1.人肝细胞生长因子基因在制备治疗湿疹的药物或药械中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人肝细胞生长因子基因以载体携带的形式存在于所述药物或药械中。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述载体为真核表达质粒、病毒、基因表达框、微环DNA或mRNA。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
所述真核表达质粒包括依次连接的真核细胞启动子、所述人肝细胞生长因子基因、polyA尾、细菌复制序列及抗生素抗性基因的超螺旋质粒DNA。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
作为所述载体携带所述人肝细胞生长因子基因的病毒包括：逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
所述基因表达框包括依次连接的真核细胞启动子、增强子、所述人肝细胞生长因子基因及polyA尾的线性表达框。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
所述微环DNA包括依次连接的真核细胞启动子、人肝细胞生长因子基因、polyA尾及重组酶识别序列的超螺旋闭环DNA。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射液、干粉制剂或载药微针。
9.根据权利要求1或8所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式选自局部皮下注射、或微针导入。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述微针导入采用微针贴、滚轮微针或微针注射器导入。
11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药械为微针药械，所述微针药械中含有治疗湿疹的所述药物，所述药物含有所述人肝细胞生长因子基因。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述药物中的所述人肝细胞生长因子基因以载体携带的形式存在。
13.根据权利要求11或12所述的应用，其特征在于，所述微针药械为微针贴。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，
所述微针贴为实心微针、中空微针或镀层微针。
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述微针贴为可溶性微针。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述可溶性微针的材质选自羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、蔗糖、透明质酸、甲壳素、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙内脂、聚碳酸酯、聚乙醇酸及聚二甲基硅氧烷中的任意一种或多种。
17.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述药物中所述载体的浓度为0.001~0.5mg/cm2。
18. 根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述药物中所述载体的浓度为0.05~0.1 mg/cm2。
19.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，
所述微针药械的材质为透明质酸，制备所述微针药械时，所使用的所述透明质酸的浓度为200~300 mg/mL。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所使用的所述透明质酸的浓度为250mg/mL。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述透明质酸的分子量为10~200KD。
22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述透明质酸的分子量为30~200KD。
23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述透明质酸的分子量为40~100KD。
24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述透明质酸的分子量为45~75KD。
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