JPWO2005021045A1

JPWO2005021045A1 - 針無注射器を用いた皮膚疾患の遺伝子治療

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Publication number: JPWO2005021045A1
Application number: JP2005513546A
Authority: JP
Inventors: 康夫椚座; 奈留也冨田; 吉川　秀樹; 秀樹吉川; 義明谷山; 克人玉井; 森下　竜一; 竜一森下
Original assignee: Anges MG Inc
Current assignee: Anges Inc
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-08-27
Publication date: 2006-10-26
Also published as: CN1842349A; AU2004268457A1; EP1671655A1; WO2005021045A1; US20070293447A1; EP1671655A4; CA2537184A1

Abstract

本発明は、皮膚疾患、特に難治性皮膚疾患に対し、臨床上有用性の高い治療方法を提供する。具体的には、ガス圧または弾性部材の弾力によりピストンを移動させ薬液を噴射する針無注射器を用い、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス等のポリヌクレオチドを、１回あたり１０μｇ〜１０ｍｇ、創傷、皮膚潰瘍、乾癬等の皮膚疾患周囲に噴射／皮下導入する。

Description

本発明は、針無注射器を用いポリヌクレオチドを皮下導入することを特徴とする、皮膚疾患の治療方法に関するものである。

皮膚疾患は、例えば創傷、皮膚潰瘍、アトピー性皮膚炎、褥創、熱傷、凍瘡、光線過敏症、乾癬、掌蹠膿胞症、湿疹、強皮症など多岐に亘るが、難治性のものが多い。
これらの中でも慢性（難治性）創傷は、具体的には「解剖学的・機能的統合をめざして正しい順序と時期で治癒しない創傷や解剖学的・機能的修復プロセスを経ない創傷」と定義され、いかなる積極的で適当な治療に対しても、その形状、外観における反応がみられず、２−４週間後にも治癒の傾向がみられない創傷をいい、難治性皮膚疾患の一つである。
また皮膚潰瘍は、持続的な圧迫／摩擦・床ずれや末梢循環障害（血管閉塞性病変など）により血流やリンパ流がうっ滞して組織が虚血状態に陥り、それが持続することによって細胞が壊死することによって起こる、難治性皮膚疾患の一つである。
乾癬には臨床上いくつかの病型があるが、通常は尋常性乾癬が一般的であり、１．表皮の肥厚・角化、２．表皮／真皮への炎症細胞浸潤を伴う、難治性の慢性炎症性角化疾患の一つである。
これらの皮膚疾患に対し、従来は副腎皮質ホルモン、免疫抑制剤、ビタミンＡ酸、活性型ビタミンＤ３、抗ウイルス剤、インターフェロン、プロスタグランディンなどの薬剤が治療に用いられてきたが、有効性、安全性、再発予防などの観点から満足できる薬剤はなかった。
なお、ＵＳ２００２／０６４８７６号公報および特表２００３−５０２３５０号公報は参照として本明細書に組み入れられる。

本発明において解決しようとする問題点は、皮膚疾患、特に難治性皮膚疾患に対し、臨床上有用性の高い治療方法がなかったことである。
本発明は、具体的には下記の皮膚疾患の治療方法である。
（１）針無注射器を用いポリヌクレオチドを皮下導入することを特徴とする皮膚疾患の治療方法。
（２）針無注射器を用い、皮膚疾患周囲にポリヌクレオチドを噴射／皮下導入することを特徴とする皮膚疾患の治療方法。
（３）ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスから選ばれた一種である、（１）〜（２）記載の治療方法。
（４）１回あたり１０μｇ〜１０ｍｇのポリヌクレオチドを、皮膚疾患周囲の複数箇所に分割して噴射／皮下導入することを特徴とする、（１）〜（３）記載の治療方法。
（５）針無注射器が、ガス圧または弾性部材の弾力によりピストンを移動させ薬液を噴射することを特徴とする、（１）〜（４）記載の治療方法。
（６）ガスがヘリウム、窒素または空気であり、弾性部材がバネである、（５）記載の治療方法。
（７）ポリヌクレオチドが、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子である、（１）〜（６）記載の治療方法。
（８）オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号１または２に示される配列を含むＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドである、（１）〜（７）記載の治療方法。
（９）皮膚疾患が創傷、皮膚潰瘍または乾癬である、（１）〜（８）記載の治療方法。
（１０）創傷が、術後創傷またはけが・事故に基づく創傷である、（１）〜（９）記載の治療方法。
（１１）皮膚潰瘍が難治性皮膚潰瘍である、（１）〜（１０）記載の治療方法。
（１２）難治性皮膚潰瘍が糖尿病性潰瘍、褥瘡（圧迫性潰瘍）、静脈不全に伴う潰瘍または動脈不全に伴う潰瘍である、（１）〜（１１）記載の治療方法。
（１３）針無注射器を用い、疾患周囲に肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子を噴射／皮下導入することを特徴とする創傷、皮膚潰瘍の治療方法。
（１４）針無注射器を用い、疾患周囲に肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子を噴射／皮下導入することを特徴とする、（１３）記載の治療方法。
（１５）針無注射器を用い、疾患周囲にＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドを噴射／皮下導入することを特徴とする乾癬の治療方法。
（１６）針無注射器を用い皮下導入するための、ポリヌクレオチドを有効成分とする皮膚疾患の治療・改善・予防剤。
（１７）針無注射器を用い、皮膚疾患周囲に噴射／皮下導入するための、ポリヌクレオチドを有効成分とする皮膚疾患の治療・改善・予防剤。
（１８）ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスから選ばれた一種である、（１６）または（１７）記載の治療・改善・予防剤。
（１９）皮膚疾患周囲の複数箇所に分割して噴射／皮下導入するための、１回あたり１０μｇ〜１０ｍｇのポリヌクレオチドを有効成分とする、（１６）ないし（１８）記載の治療・改善・予防剤。
（２０）針無注射器が、ガス圧または弾性部材の弾力によりピストンを移動させ薬液を噴射することを特徴とする、（１６）ないし（１９）記載の治療・改善・予防剤。
（２１）ガスがヘリウム、窒素または空気であり、弾性部材がバネである、（２０）記載の治療・改善・予防剤。
（２２）ポリヌクレオチドが、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子である、（１６）ないし（２１）記載の治療・改善・予防剤。
（２３）オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号１または２に示される配列を含むＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドである、（１６）ないし（２２）記載の治療・改善・予防剤。
（２４）皮膚疾患が創傷、皮膚潰瘍または乾癬である、（１６）ないし（２３）記載の治療・改善・予防剤。
（２５）創傷が、術後創傷またはけが・事故に基づく創傷である、（１６）ないし（２４）記載の治療・改善・予防剤。
（２６）皮膚潰瘍が難治性皮膚潰瘍である、（１６）ないし（２５）記載の治療・改善・予防剤。
（２７）難治性皮膚潰瘍が糖尿病性潰瘍、褥瘡（圧迫性潰瘍）、静脈不全に伴う潰瘍または動脈不全に伴う潰瘍である、（１６）ないし（２６）記載の治療・改善・予防剤。
（２８）針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入するための、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子を有効成分とする、創傷、皮膚潰瘍の治療・改善・予防剤。
（２９）針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入するための、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子を有効成分とする、（２８）記載の治療・改善・予防剤。
（３０）針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入するための、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドを有効成分とする、乾癬の治療・改善・予防剤。
（３１）針無注射器を用い皮下導入する皮膚疾患の治療・改善・予防剤を製造するためのポリヌクレオチドの使用。
（３２）針無注射器を用い、皮膚疾患周囲に噴射／皮下導入する皮膚疾患の治療・改善・予防剤を製造するためのポリヌクレオチドの使用。
（３３）ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスから選ばれた一種である、（３１）または（３２）記載の使用。
（３４）１回あたり１０μｇ〜１０ｍｇのポリヌクレオチドを、皮膚疾患周囲の複数箇所に分割して噴射／皮下導入することを特徴とする、（３１）ないし（３３）記載の使用。
（３５）針無注射器が、ガス圧または弾性部材の弾力によりピストンを移動させ薬液を噴射することを特徴とする、（３１）ないし（３４）記載の使用。
（３６）ガスがヘリウム、窒素または空気であり、弾性部材がバネである、（３５）記載の使用。
（３７）ポリヌクレオチドが、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子である、（３１）ないし（３６）記載の使用。
（３８）オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号１または２に示される配列を含むＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドである、（３１）ないし（３７）記載の使用。
（３９）皮膚疾患が創傷、皮膚潰瘍または乾癬である、（３１）ないし（３８）記載の使用。
（４０）創傷が、術後創傷またはけが・事故に基づく創傷である、（３１）ないし（３９）記載の使用。
（４１）皮膚潰瘍が難治性皮膚潰瘍である、（３１）ないし（４０）記載の使用。
（４２）難治性皮膚潰瘍が糖尿病性潰瘍、褥瘡（圧迫性潰瘍）、静脈不全に伴う潰瘍または動脈不全に伴う潰瘍である、（３１）ないし（４１）記載の使用。
（４３）針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入する創傷、皮膚潰瘍の治療・改善・予防剤を製造するための、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子の使用。
（４４）針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入する治療・改善・予防剤を製造するための、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子の（４３）記載の使用。
（４５）針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入する乾癬の治療・改善・予防剤を製造するための、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドの使用。
ここで本発明における針無注射器とは、注射針を用いずに、ガス圧または弾性部材の弾力によりピストンを移動させて薬液を皮膚に噴射し、薬剤成分を皮下、より好ましくは皮下の細胞内に投与する医療機器を意味する。
具体的には例えば、シマジェット（登録商標）（島津製作所製）、メディ・ジェクタービジョン（Ｍｅｄｉ−ＪｅｃｔｏｒＶｉｓｉｏｎ）（登録商標）（Ｅｌｉｔｅｍｅｄｉｃａｌ社製）、ペンジェット（ＰｅｎＪｅｔ）（登録商標）（ＰｅｎＪｅｔ社製）などが市販されている。
従来の針付注射器と異なり、針無注射器のメリットとしては、疼痛や感染の危険性を回避できることが挙げられる。
次に本発明におけるポリヌクレオチドとは、具体的には例えば、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスを挙げることができる。
ここでこれらのポリヌクレオチドは裸のままでもよいし、各種ベクターあるいはプラスミドに構成されていてもよい。
本発明におけるポリヌクレオチドは限定されず、公知のものはいずれも対象となり得るが、好適例としては例えば、血管新生因子の遺伝子、プロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子、一酸化窒素合成酵素（ＮＯｓ）遺伝子、転写因子のデコイオリゴヌクレオチド等を挙げることができる。
血管新生因子の遺伝子としてさらに具体的には、例えば肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）遺伝子、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）遺伝子等を挙げることができ、中でも肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子がより好ましい。肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子の配列は、具体的には例えば特許第２５７７０９１号に開示されている。
プロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子とは、プロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）からプロスタグランジンＩ２（ＰＧＩ２）を生成する過程に関わる酵素の遺伝子であり、具体的配列は例えば、特再表９５／０３００１３号に開示されている。
転写因子のデコイオリゴヌクレオチドとしてさらに具体的には、例えばＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチド、Ｅ２Ｆデコイオリゴヌクレオチド、ＡＰ−１デコイオリゴヌクレオチド、Ｅｔｓデコイオリゴヌクレオチド、ＳＴＡＴ−１デコイオリゴヌクレオチド、ＳＴＡＴ−６デコイオリゴヌクレオチド、ＧＡＴＡ−３デコイオリゴヌクレオチド等を挙げることができ、中でもＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドがより好ましい。
ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えばＧＧＧＲＡ（Ｃ，Ｔ）ＴＹＹＡ（Ｃ，Ｔ）Ｃを含む配列（Ｒはプリン塩基、Ｙはピリミジン塩基を意味する）を挙げることができ、さらに具体的には、例えば配列表の配列番号１または２に示される配列を含むオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
また本発明における皮膚疾患も限定されないが、特に難治性皮膚疾患が好適であり、具体的には例えば、創傷、皮膚潰瘍、乾癬を挙げることができる。
創傷も限定されないが、さらに具体的には術後創傷、けが・事故に基づく創傷を挙げることができる。
皮膚潰瘍も限定されないが、より好ましくは難治性皮膚潰瘍であり、さらに好ましくは糖尿病性潰瘍、褥瘡（圧迫性潰瘍）、静脈不全に伴う潰瘍または動脈不全に伴う潰瘍を挙げることができる。
ここで本発明における最も好ましい実施形態としては、以下の組み合わせを挙げることができる。
１）針無注射器を用い、疾患周囲の複数箇所に、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子を噴射／皮下導入することを特徴とする創傷、皮膚潰瘍の治療方法。
２）針無注射器を用い、疾患周囲の複数箇所に、プロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子を噴射／皮下導入することを特徴とする創傷、皮膚潰瘍の治療方法。
３）針無注射器を用い、疾患周囲の複数箇所に、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子を噴射／皮下導入することを特徴とする創傷、皮膚潰瘍の治療方法。
４）針無注射器を用い、疾患周囲の複数箇所に、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドを噴射／皮下導入することを特徴とする乾癬の治療方法。
本発明におけるポリヌクレオチドの投与量も、疾患の種類・程度・発現部位・面積、患者の年齢、性別、合併症、併用薬等によって異なり限定されないが、通常１回あたり１０μｇ〜１０ｍｇのポリヌクレオチドを、皮膚疾患周囲の複数箇所に分割して噴射／皮下導入することが好ましい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

図１は、ＹｅｌｌｏｗＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ（Ｖｅｎｕｓ）の発現は表皮組織のみに認められたことを示す写真である。
図２は、ＬａｃＺの発現は表皮組織のみに認められたことを示す写真である。
図３は、シマジェット噴射群で注射群に較べて約１００倍のルシフェラーゼ活性を示し、高い導入効率が得られたことを示した図である。
図４は、４、６日目にてＨＧＦ、ＰＧＩＳ噴射群にて創傷治癒促進効果を認めた図である。また同時噴射群（Ｇｒｏｕｐ５）では効果の増強を認めたことを示す図である。
図５は、ＨＧＦ、ＰＧＩＳとも創周囲血流の増強効果を認めたことを示す写真である。
図６は、ＨＧＦ、ＰＧＩＳとも創部表皮組織にその遺伝子発現を認めたことを示す写真である。
図７は、ＨＧＦ蛋白質の上昇を認めたことを示す図である。

以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。

導入部位の確認
ＹｅｌｌｏｗＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ（Ｖｅｎｕｓ）プラスミド（Ｖｅｎｕｓ／ｐＣＳ２）ラット皮膚噴射による導入部位の確認。（図１参照）
方法：（１）ラット背部皮膚剃毛後、カネボウｅｐｉｌａｔ除毛クリームで除毛後シマジェットにてＹｅｌｌｏｗＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ（Ｖｅｎｕｓ）／ｐＣＳ２１００μｇ／１００μｌ噴射した。比較のため、対照にはＶｅｎｕｓを含まないプラスミド（ｐＣＳ２）を用いた。
（２）２４時間後にラットを犠牲死させ、打ち込み部位の皮膚を採取した。
（３）ＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄに組織を入れ液体窒素で急速凍結した後、切片を作製し蛍光顕微鏡で観察した。
結果：ＹｅｌｌｏｗＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｔｅｉｎ（Ｖｅｎｕｓ）の発現は表皮組織のみに認められた。
ｌａｃＺプラスミド（ｐｃＬａｃＺ）ラット皮膚噴射による導入部位の確認。（図２参照）
方法：（１）ラット背部皮膚剃毛、除毛後シマジェットにてｐｃＬａｃＺ２００μｇ／２００μｌ噴射した。
（２）２４時間後にラットを犠牲死させ、打ち込み部位の皮膚を採取した。
（３）ＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄに組織を入れ液体窒素で急速凍結した後、切片を作製した。切片を１％グルタールアルデヒドで固定し、β−ｇａｌ染色液で染色し、顕微鏡で観察した。
結果：ＬａｃＺの発現は表皮組織のみに認められた。

導入効率の評価
ルシフェラーゼ活性測定（図３参照）
方法：（１）ラット背部皮膚剃毛、除毛後、それぞれ５０μｇ／５０μｌおよび１００μｇ／１００μｌのルシフェラーゼプラスミド（ｐＧＬ３ｌｕｃ）をラット皮膚にシマジェットで噴射した。
比較するために同量のプラスミドをラット皮内に２６Ｇ注射器で注入した。
（２）２４時間後にラットを犠牲死させ、打ち込み部を中心に約２ｃｍ四方の皮膚を採取した。コントロールとして無処置のラット皮膚も採取した。
（３）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１ｍｌ加えてハサミでできるだけ細かくカットした。
（４）−８０℃１０分で急速冷凍し、その後室温で解凍した。これを２回繰り返した。
（５）５０００ｒｐｍ、１０分遠心し、上清を採取した。
（６）ルシフェラーゼ活性を測定した。（ＢｅｒｔｈｏｌｄＬＢ９５０７）
図３に各処置における総ルシフェラーゼ活性を表示した。なお、図３において、「皮注５０」、「皮注１００」は、それぞれ５０μｇ／５０μｌ、１００μｇ／１００μｌのｐＧＬ３ｌｕｃプラスミドをラット皮内に注入したことを示し、「シマ５０」、「シマ１００」は、それぞれ５０μｇ／５０μｌ、１００μｇ／１００μｌのｐＧＬ３ｌｕｃプラスミドをラット皮膚にシマジェットで噴射したことを示す。
結果：シマジェット噴射群で注射群に較べて約１００倍のルシフェラーゼ活性を示し高い導入効率を確認した。

創傷治癒効果の検討
ラット創傷治癒障害モデルの作製
ラット創傷治癒傷害モデルの作製には、ステロイドとして水溶性プレドニゾロン（ＰｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅＳｏｄｉｕｍＳｕｃｃｉｎａｔｅ：Ｐｚ、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ＆ＣＯ．，ＬＴＤ）を投与したラットモデルを利用した。ステロイド投与ラットモデルは、ステロイドの投与により、創抗張力、上皮化、血管新生、創収縮などの傷害が起こり、その結果、創傷治癒の遅延を生じる。
（１）７週オスのＷｉｓｔｅｒラットに３０ｍｇ／ｋｇの水溶性プレドニゾロン（ＰｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅＳｏｄｉｕｍＳｕｃｃｉｎａｔｅ、Ｓｈｉｏｎｏｇｉ＆ＣＯ．，ＬＴＤ）を筋肉内注射し、３日後（創作製当日）に再び３０ｍｇ／ｋｇの水溶性プレドニゾロンを筋肉内注射した。コントロール群にはＰＢＳを筋肉注射した。
（２）ラット背部皮膚剃毛、除毛後、直径１．６ｃｍ（面積約２ｃｍ^２）の円形の皮膚を全層切除した創を作製した。
プラスミド導入
（３）創周囲にシマジェットでプラスミド（ＨＧＦ、ＰＧＩＳ、又はＨＧＦ＋ＰＧＩＳ）を５箇所噴射した。いずれも一種類のプラスミド、１回の噴射において、１００μｇ／１００μｌのプラスミド量、液量を使用した。
コントロールとしてＰＢＳを噴射した。（各群ｎ＝６）
ＨＧＦプラスミド；ＣＡＳ登録Ｎｏ．［６２７８６１−０７−８］
ＰＧＩＳプラスミド；ＷＯ９５／３００１３号公報の配列番号１１に記載されたｃＤＮＡを、ｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込んだ。

創面積の計測（図４および下表参照）
（４）創作製０，２，４，６，９，１２日目に創をトレーシングペーパーでトレースした後、スキャナで取り込みＮＩＨｉｍａｇｅ１．６１で面積を計算した。０日目を１００とし以後割合を計算した。
結果：４、６日目にてＨＧＦ、ＰＧＩＳ噴射群にて創傷治癒促進効果を認めた。同時噴射群（Ｇｒｏｕｐ５）では効果の増強を認めた。

血流測定（図５参照）
（５）創作製４日目にラット背部創周囲の血流の状態をＬａｓｅｒＤｏｐｐｌｅｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｏｒ）で測定した。
結果：ＨＧＦ、ＰＧＩＳとも創周囲血流の増強効果を認めた。
ＨＧＦ、ＰＧＩＳの遺伝子発現の確認（図６参照）
創部の皮膚を採取し、ＨＧＦ及びＰＧＩＳの免疫染色を以下の手順で行った。
ＨＧＦの免疫染色
採取した皮膚標本をパラフィン固定した後、切片を作製した。切片を１００％キシレン５分、３回、１００％アルコール５分、２回、９９％アルコール５分、９０％アルコール５分、７５％アルコール５分で脱パラフィンした後、１０分間水洗した。９５℃、１５分間賦活化した。切片を８０％メタノール／０．６％過酸化水素と３％過酸化水素で処理した後、正常ヤギ血清で３０分間ブロッキングした。１０倍希釈した一次抗体（抗ヒトＨＧＦｂ（Ｈ４９５）ウサギポリクローナル抗体、１８１３４免疫生物研究所）を加え、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体洗浄後、二次抗体（抗ウサギ抗体、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅＡＢＣｋｉｔｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ）を加え、室温で３０分間インキュベートした。二次抗体を洗浄後、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＥｌｉｔｅＡＢＣｒｅａｇｅｎｔを加え、３０分間インキュベートした。ＤＡＢ（フナコシ）で染色した後、ヘマトキシリン・エオシンでカウンター染色した。切片を脱水、封入し、検鏡に供した。
結果：ＨＧＦの発現が表皮組織に認められた。
ＰＧＩＳの免疫染色
採取した皮膚標本から凍結切片を作成し、冷凍庫で一晩乾燥させた後、冷アセトン（−２０℃）で１５分間固定した。アビジン、ビオチンをブロックした後、８０％メタノール／０．６％過酸化水素と３％過酸化水素で処理した。コンプレックス抗体（一次抗体、抗ＰＧＩＳＣ末端部分ペプチドウサギポリクローナル抗体（１０００倍希釈）と二次抗体、抗ウサギ・ビオチン標識ヤギ抗体（ＤＡＫＯＥ０４３２）（３００倍希釈）及びウサギ正常血清の混合物）を加え、４℃で一晩インキュベートした。抗体洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯＥ１０１６）を室温で３０分間反応させ、ＤＡＢ（フナコシ）で染色後、ヘマトキシリン・エオシンでカウンター染色した。切片を脱水、封入し、検鏡に供した。
結果：ＰＧＩＳの発現が表皮組織に認められた。

ＨＧＦ蛋白質定量（図７参照）
（１）ラット背部皮膚剃毛、除毛後ＨＧＦプラスミドをシマジェットで噴射２４時間後にラットを犠牲死させ、組織（約４０ｍｇ）を採取した。
（２）８００μｌのＰＢＳで洗浄後、１０倍量の抽出バッファーを加えてホモジナイズした。
（抽出バッファー：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）；２ＭＮａＣｌ；０．１％Ｔｗｅｅｎ８０；１ｍＭＥＤＴＡ；１ｍＭＰＭＳＦ）
（３）１５０００ｒｐｍ、４℃、３０分遠心した。
（４）上清を採取しＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）で測定した。
結果：ＨＧＦ蛋白質の上昇を認めた。
産業上の利用の可能性
本発明の実施により、従来臨床上有用性の高い治療方法がなかった皮膚疾患、特に難治性皮膚疾患に対する治療方法が提供される。

【配列表】

Claims

針無注射器を用いポリヌクレオチドを皮下導入することを特徴とする皮膚疾患の治療方法。
針無注射器を用い、皮膚疾患周囲にポリヌクレオチドを噴射／皮下導入することを特徴とする皮膚疾患の治療方法。
ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスから選ばれた一種である、請求項１または２記載の治療方法。
１回あたり１０μｇ〜１０ｍｇのポリヌクレオチドを、皮膚疾患周囲の複数箇所に分割して噴射／皮下導入することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか一項記載の治療方法。
針無注射器が、ガス圧または弾性部材の弾力によりピストンを移動させ薬液を噴射することを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一項記載の治療方法。
ガスがヘリウム、窒素または空気であり、弾性部材がバネである、請求項５記載の治療方法。
ポリヌクレオチドが、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子である、請求項１ないし６のいずれか一項記載の治療方法。
オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号１または２に示される配列を含むＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドである、請求項１ないし７のいずれか一項記載の治療方法。
皮膚疾患が創傷、皮膚潰瘍または乾癬である、請求項１ないし８のいずれか一項記載の治療方法。
創傷が、術後創傷またはけが・事故に基づく創傷である、請求項１ないし９のいずれか一項記載の治療方法。
皮膚潰瘍が難治性皮膚潰瘍である、請求項１ないし１０のいずれか一項記載の治療方法。
難治性皮膚潰瘍が糖尿病性潰瘍、褥瘡（圧迫性潰瘍）、静脈不全に伴う潰瘍または動脈不全に伴う潰瘍である、請求項１ないし１１のいずれか一項記載の治療方法。
針無注射器を用い、疾患周囲に肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子を噴射／皮下導入することを特徴とする創傷、皮膚潰瘍の治療方法。
針無注射器を用い、疾患周囲に肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子を噴射／皮下導入することを特徴とする、請求項１３記載の治療方法。
針無注射器を用い、疾患周囲にＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドを噴射／皮下導入することを特徴とする乾癬の治療方法。
針無注射器を用い皮下導入するための、ポリヌクレオチドを有効成分とする皮膚疾患の治療・改善・予防剤。
針無注射器を用い、皮膚疾患周囲に噴射／皮下導入するための、ポリヌクレオチドを有効成分とする皮膚疾患の治療・改善・予防剤。
ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスから選ばれた一種である、請求項１６または１７記載の治療・改善・予防剤。
皮膚疾患周囲の複数箇所に分割して噴射／皮下導入するための、１回あたり１０μｇ〜１０ｍｇのポリヌクレオチドを有効成分とする、請求項１６ないし１８のいずれか一項記載の治療・改善・予防剤。
針無注射器が、ガス圧または弾性部材の弾力によりピストンを移動させ薬液を噴射することを特徴とする、請求項１６ないし１９のいずれか一項記載の治療・改善・予防剤。
ガスがヘリウム、窒素または空気であり、弾性部材がバネである、請求項２０記載の治療・改善・予防剤。
ポリヌクレオチドが、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子である、請求項１６ないし２１のいずれか一項記載の治療・改善・予防剤。
オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号１または２に示される配列を含むＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドである、請求項１６ないし２２のいずれか一項記載の治療・改善・予防剤。
皮膚疾患が創傷、皮膚潰瘍または乾癬である、請求項１６ないし２３のいずれか一項記載の治療・改善・予防剤。
創傷が、術後創傷またはけが・事故に基づく創傷である、請求項１６ないし２４のいずれか一項記載の治療・改善・予防剤。
皮膚潰瘍が難治性皮膚潰瘍である、請求項１６ないし２５のいずれか一項記載の治療・改善・予防剤。
難治性皮膚潰瘍が糖尿病性潰瘍、褥瘡（圧迫性潰瘍）、静脈不全に伴う潰瘍または動脈不全に伴う潰瘍である、請求項１６ないし２６のいずれか一項記載の治療・改善・予防剤。
針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入するための、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子を有効成分とする、創傷、皮膚潰瘍の治療・改善・予防剤。
針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入するための、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子を有効成分とする、請求項２８記載の治療・改善・予防剤。
針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入するための、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドを有効成分とする、乾癬の治療・改善・予防剤。
針無注射器を用い皮下導入する皮膚疾患の治療・改善・予防剤を製造するためのポリヌクレオチドの使用。
針無注射器を用い、皮膚疾患周囲に噴射／皮下導入する皮膚疾患の治療・改善・予防剤を製造するためのポリヌクレオチドの使用。
ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスから選ばれた一種である、請求項３１または３２記載の使用。
１回あたり１０μｇ〜１０ｍｇのポリヌクレオチドを、皮膚疾患周囲の複数箇所に分割して噴射／皮下導入することを特徴とする、請求項３１ないし３３のいずれか一項記載の使用。
針無注射器が、ガス圧または弾性部材の弾力によりピストンを移動させ薬液を噴射することを特徴とする、請求項３１ないし３４のいずれか一項記載の使用。
ガスがヘリウム、窒素または空気であり、弾性部材がバネである、請求項３５記載の使用。
ポリヌクレオチドが、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子である、請求項３１ないし３６のいずれか一項記載の使用。
オリゴヌクレオチドが、配列表の配列番号１または２に示される配列を含むＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドである、請求項３１ないし３７のいずれか一項記載の使用。
皮膚疾患が創傷、皮膚潰瘍または乾癬である、請求項３１ないし３８のいずれか一項記載の使用。
創傷が、術後創傷またはけが・事故に基づく創傷である、請求項３１ないし３９のいずれか一項記載の使用。
皮膚潰瘍が難治性皮膚潰瘍である、請求項３１ないし４０のいずれか一項記載の使用。
難治性皮膚潰瘍が糖尿病性潰瘍、褥瘡（圧迫性潰瘍）、静脈不全に伴う潰瘍または動脈不全に伴う潰瘍である、請求項３１ないし４１のいずれか一項記載の使用。
針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入する創傷、皮膚潰瘍の治療・改善・予防剤を製造するための、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子および／またはプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子の使用。
針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入する治療・改善・予防剤を製造するための、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）遺伝子およびプロスタサイクリン合成酵素（ＰＧＩＳ）遺伝子の請求項４３記載の使用。
針無注射器を用い、疾患周囲に噴射／皮下導入する乾癬の治療・改善・予防剤を製造するための、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドの使用。