CN114392361B

CN114392361B - 一种羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物及其应用

Info

Publication number: CN114392361B
Application number: CN202210076725.3A
Authority: CN
Inventors: 范家铭; 勾颜年; 何通川; 钟佳敏; 赵飘; 董祥玉; 郭美春
Original assignee: Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2022-01-23
Filing date: 2022-01-23
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2042-01-23
Also published as: CN114392361A

Abstract

本发明提供了一种羧甲基壳聚糖‑腺病毒混合物，羧甲基壳聚糖在混合物中的浓度范围为1.25%‑2.5%（%：g/100ml in PBS），该混合物用于制备体内基因转导载体，可延长腺病毒介导外源基因表达时间，减轻急慢性免疫反应，在基于腺病毒作为体内靶向基因转导系统的基因表达、疾病模型研究、基因治疗、疫苗研发等基础及临床转化研究领域具有广阔的应用前景。本发明提供了一种羧甲基壳聚糖‑腺病毒混合物制备肝纤维化治疗药物中的应用，通过肝内注射混合物，羧甲基壳聚糖包裹腺病毒Ad‑IL10可有效控制IL‑10的释放和产生，从而缓解CCl₄诱导的小鼠肝纤维化，为肝纤维化等慢性肝疾病的靶向基因治疗提供了重要的技术手段。

Description

一种羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物及其应用

技术领域：

本发明属于分子生物学、病毒学领域。具体涉及一种羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物及在腺病毒体内转导中的应用。

技术背景

肝脏是人体的关键器官，具有消化、代谢、解毒、免疫和凝血等多种生理功能，大多数单基因肝遗传性疾病、代谢紊乱、病毒感染和恶性肿瘤，常规的药物及手术治疗无法根治，肝脏靶向基因治疗是潜在的治疗方法之一。有效和安全的肝内基因转导是基因治疗的关键，外源基因如何能在肝细胞中发挥最大效应，载体的选择极为重要。理想的载体应具备特异性高、亲和力强、基因荷载量大、整合转染效率高、抗原性及毒性小和基因表达安全性高等优点。

基因表达系统一般分为两类：基于病毒载体的表达系统和基于非病毒载体的表达系统。病毒载体系统包括一系列复制缺陷型重组病毒；最常用的是腺病毒（Ad）载体、腺相关病毒（AAV）载体、慢病毒载体等。腺病毒（Adenovirus, 缩写Ad）是一种非包膜线性双链DNA病毒，通过受体介导的内吞作用，将Ad基因组转移至细胞核内，实现靶细胞内外源基因的表达。与其他病毒载体相比，腺病毒载体具有以下优点：病毒学特性明确，遗传稳定性好；基因转导效率高，体外实验接近100%；可转导不同类型的组织细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞所限；具有非整合特性，腺病毒基因组独立于宿主细胞基因组，瞬间表达，安全性高；易于大规模生产并获得高滴度病毒。因此，腺病毒载体在基因治疗临床试验方面有了越来越多的应用，成为目前使用最广泛且最具前景的病毒载体之一。目前，腺病毒载体作为体内靶向基因转导系统尚有以下不足：1. 所介导的外源基因为一过性表达，在部分组织器官（如肝脏、肾脏等代谢旺盛的器官）的表达时间相对较短；2. 载体本身的免疫源性，会潜在引发宿主的急性免疫反应和慢性损伤。

肝脏是人体最大的代谢器官，其血流解剖学特征使得任何经腹腔和静脉系统的外源性基因均可到达肝脏，其中的腺病毒载体是肝脏定向基因治疗的理想基因载体之一。肝脏血流丰富、新陈代谢快，腺病毒载体介导的基因表达肝内维持时间短（活体呈像荧光可观察时间为3天，极少数超过5天，治疗至少需1周2次，且超过1月，体内抗体产生，影响基因表达效果，后期需加大腺病毒治疗量），尤其面临脂肪肝、肝纤维化、肝硬化、肝癌等肝慢性疾病时，腺病毒载体治疗频率高且周期长，是对资源的浪费，也给治疗对象造成极大的痛苦。

壳聚糖是一种线性多糖聚合物，作为几丁质脱乙酰化的产物，具有安全无毒、生物相容、体内外可生物降解的特点，近年来在伤口愈合、生物成像、组织工程和药物递送等生物医学领域有着广泛的应用。相关研究表明，聚乙烯亚胺（PEI）/壳聚糖共聚物在体内外都是有效的DNA/siRNA载体；壳聚糖和聚乙二醇壳聚糖纳米粒包裹β-连环蛋白的siRNA，可有效降低体外结肠癌细胞中的β-连环蛋白水平；十四烷基季铵化壳聚糖/脂质体聚合物具有较低的细胞毒性，可用于癌细胞靶向基因传递。羧甲基壳聚糖（Carboxymethylchitosan,缩写CMC）是壳聚糖的高级衍生物，由甲壳质在碱性条件下与氯乙酸反应得到，羧甲基的导入，破坏了壳聚糖分子的二次结构，使其结晶度大大降低，与壳聚糖相比，羧甲基壳聚糖的物理、化学性质均得到优化，具有100%水溶性、成膜性及极强的重金属螯合作用，这种中性、纯天然和完全无毒的产物在医学保健、工农业等领域均显示出更加优越的特点。CMC对腺病毒肝内基因传递效率、免疫源性的影响未见报道。

发明内容

为了解决腺病毒肝内转导外源性基因表达时间相对较短，免疫毒性高两大难题，本发明的目的是通过以下措施实现的：

本发明提供了一种羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物，包含羧甲基壳聚糖和腺病毒，羧甲基壳聚糖的羧化度在80%以上。

优选的，腺病毒在混合物中的浓度范围为10¹²pfu/ml。

优选的，羧甲基壳聚糖在混合物中的浓度范围为1.25%-2.5%（%：g/100ml inPBS）。

优选的，羧甲基壳聚糖在混合物中的浓度为1.3%（%：g/100ml in PBS）。

本发明提供了上述羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物在制备体内基因载体中的应用。

本发明还提供了一种应用羧甲基壳聚糖辅助腺病毒体内转导的方法，包含以下步骤：

步骤1：扩增并纯化携带外源基因的腺病毒；

步骤2：将10¹²pfu/ml 腺病毒15µl 与2.5-5%（%：g/100ml in PBS）羧甲基壳聚糖15µl 混合，获得30µl混合物；

步骤3：将混合物皮下注射或定点注射入靶组织。

本发明还提供了一种羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物在肝纤维化基因治疗中的应用。

所述腺病毒外源表达IL-10。

所述肝纤维化包含但不限于病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性疾病引起的肝纤维化。

羧甲基壳聚糖与表达IL-10腺病毒的混合物肝内注射，优化的，每7-10天注射一次，持续4-8周。

有益效果：

1.本发明提供了一种羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物，羧甲基壳聚糖在混合物中的浓度范围为1.25%-2.5%（%：g/100ml in PBS），该混合物在体内可延长腺病毒介导外源基因表达时间（皮下外源基因表达持续50天，肝内外源基因表达持续7天），减轻急性免疫反应（表皮和肝内注射均显著减轻免疫反应）。

2.本发明提供了一种羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物在制备体内基因载体中的应用，羧甲基壳聚糖的亲水性能提高腺病毒体内基因转导效率；延长腺病毒介导外源基因在体内表达的时间；有效地减轻了体内腺病毒诱导的宿主免疫反应。在基于腺病毒介导的基因表达、慢性肝疾病模型研究、基因治疗、疫苗研发等基础及临床转化研究领域具有广阔的应用前景。

3.本发明提供了一种羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物介导IL-10肝内表达的方法及在肝纤维化基因治疗中的应用，通过肝内注射混合物，羧甲基壳聚糖包裹Ad-IL10可有效缓释IL-10，延长其作用时间，从而缓解CCl₄诱导的小鼠肝纤维化，保护肝脏。该方法为肝纤维化的靶向基因治疗提供了重要的技术手段。

附图说明

图1. 不同浓度CMC对体内注射Ad-Fluc（萤火虫荧光素酶基因，fireflyluciferase, FLuc）基因表达时长的影响（A.0-5% CMC/Ad-Fluc混合物皮下注射，不同时间点的小鼠全身活体成像图； B. 1.3%CMC/Ad-Fluc混合物肝内注射，不同时间点的小鼠全身活体成像图）

图2. CMC对皮下注射Ad-GFP急性免疫反应的影响（A.1.3% CMC/Ad-GFP于小鼠皮下注射的示意图；B. 皮肤及皮下组织HE染色和IHC染色）

图3. CMC对肝内注射Ad-GFP急性免疫反应的影响（A. 肝组织HE染色； B. 肝组织IHC染色）

图4. CMC对肝内注射Ad-GFP慢性免疫反应的影响（A. 肝内注射1.3% CMC/Ad-GFP时间频率示意图；B. 肝组织HE染色；C. 肝组织IHC染色）

图5. CMC对肝内注射Ad-IL10基因治疗小鼠肝纤维化形态学的影响（A. 腹腔注射CCL₄和肝内注射1.3%CMC/Ad-IL10的时间频率示意图；B.肝脏图像；C. 肝组织HE染色；D.肝组织天狼星红染色）

图6. CMC对肝内注射Ad-IL10基因治疗小鼠肝纤维化分子标志物的影响

图7. 小鼠肝内注射Ad操作图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

动物实验经重庆医科大学研究和实验动物使用伦理委员会批准，所有实验程序均遵循指南进行。

实施例1. 不同浓度CMC对体内注射Ad基因表达时长的影响

皮下注射范例：

将10µl 10¹²pfu/ml的Ad-FLuc和10µl 不同浓度0%、2.5%、5%、10%（%：g/100ml）CMC混合，混合物总体积为20µl，分别包含10¹⁰pfu Ad-Fluc和的0µg、250µg、500µg、1000µgCMC。

C57BL/6J小鼠（雄性，6周龄，不分组，n=4），背部脊柱两侧皮下注射，依次注射20µl不同CMC浓度混合物，如图1A所示。使用IVIS光谱活体成像系统（Perkin Elmer，Waltham，MA），以D-荧光素钾（Gold Biotechnology Inc.）作为荧光素酶底物，在注射后3、9、15、21、28，35，43，和50天进行全身光学生物发光成像。 0% CMC组的荧光信号在第3天达到峰值，但在注射后15天显著减少，1.25%和2.5%CMC组的注射部位在注射后50天内显示出可检测的荧光信号（图1A，图b）。而5% CMC组没有表现出比1.25%和2.5%CMC组更高的荧光信号，这表明高浓度CMC可能阻碍腺病毒载体的释放，从而限制外源基因Fluc的表达（图1A，图b），提示1.25%-2.5% CMC的Fluc在皮下表达时效最长，故选择1.3% CMC作为后续研究。

肝内注射范例：

实验组：将15µl 10¹²pfu/ml的Ad-FLuc和15µl 2.6% CMC（%：g/100ml）混合，混合物总体积为30µl，包含1.5×10¹⁰pfu Ad-Fluc和390µgCMC。对照组：将15µl 10¹²pfu/ml的Ad-FLuc和15µl PBS混合，混合物总体积为30µl，包含1.5×10¹⁰pfu Ad-Fluc和0µgCMC。

C57BL/6J小鼠（雄性，6周龄，随机分为实验组和对照组，每组n=4），肝内注射总体积30µl混合物，如图1B所示。在注射后3、7和12天进行全身光学生物发光成像。在相同成像参数条件下，第3天实验组和对照组均检测到强烈的荧光信号，第7天仅实验组可检测到较强的荧光信号；第12天实验和对照组均未检测到明显荧光信号（图1B，a与b）。

以上结果提示，1.25%-2.5% CMC可有效延长Ad介导的外源性基因在体内的表达时间。

实施例2. CMC对体内注射Ad免疫反应的影响

皮下注射范例：

实验组：将15µl 10¹²pfu/ml的Ad-GFP和15µl 2.6% CMC（%：g/100ml）混合，混合物总体积为30µl，包含1.5×10¹⁰pfu Ad-GFP和390µgCMC。对照组：将15µl 10¹²pfu/ml的Ad-GFP和15µl PBS混合，混合物总体积为30µl，包含1.5×10¹⁰pfu Ad-GFP和0µgCMC。

C57BL/6J小鼠（雄性，6周龄，随机分为实验组和对照组，每组n=9）背部上下两侧皮下注射30µl混合物，分别于注射后6h、24h和72h各处死小鼠，实验组和对照组各3只。注射后24h，对照组的注射部位出现丘疹，而实验组注射部位未出现丘疹（图2A）。H&E染色显示，注射后6h和24h，对照组在注射部位及附近产生大量炎性细胞，而实验组注射部位及附近的炎性细胞数量显著少于对照组（图2B，图a）。IHC染色显示，与对照组相比，实验组中的炎症细胞（CD45阳性）、成熟抗原呈递细胞（CD54阳性）、成熟T淋巴细胞（CD40L和CD3D阳性）的数量以及TNFα和IL1β的表达显著降低（图2B，图b）。

肝内注射范例1：

实验组：将15µl 10¹²pfu/ml的Ad-GFP和15µl 2.6% CMC（%：g/100ml）混合，混合物总体积为30µl，包含1.5×10¹⁰pfu Ad-GFP和390µgCMC。对照组：将15µl 10¹²pfu/ml的Ad-FDP和15µl PBS混合，混合物总体积为30µl，包含1.5×10¹⁰pfu Ad-Fluc和0µgCMC。

C57BL/6J小鼠（雄性，6周龄，随机分为实验组和对照组，每组n=30），肝内注射30µl混合物，分别在注射后6h、24h和72h处死小鼠，每组5只。H&E结果显示，在注射后24h和72h，对照组肝血窦及附近可见更多的炎性细胞（图3A）。IHC染色结果显示，实验组的炎症细胞（CD45阳性）、成熟抗原呈递细胞（CD54阳性）、成熟T淋巴细胞（CD40L和CD3D阳性）的数量及TNFα和IL1β的表达均显著低于对照组（图3B）。

肝内注射范例2：

C57BL/6J小鼠（雄性，6周龄，随机分为实验组和对照组，n=20），肝内注射30µl混合物，分别在注射后4w和8w处死小鼠，每组5只。H&E染色结果显示，注射4w和8w后，实验组中央静脉和门静脉周围的炎性细胞数量均显著低于对照组（图4B）。IHC结果显示，实验组炎症细胞（CD45阳性）和B细胞（CD20阳性）的数量（图4C），以及炎症相关因子TNFα和IL1β的表达显著低于对照组。

上述结果提示，CMC可以有效地降低Ad免疫原性、减轻宿主体内免疫反应。

实施例3. CMC对Ad体内基因治疗肝纤维化影响。

Ad-IL10基因治疗小鼠肝纤维化范例：

将CCl₄溶液和橄榄油按照1：4体积比混合，配制20%CCl₄溶液。空白组：将15µl 10¹²pfu/ml的Ad-GFP和15µl PBS混合，混合物总体积为30µl，包含1.5×10¹⁰pfu Ad-GFP和0µgCMC。对照组：将15µl 10¹²pfu/ml的Ad-IL10和15µl PBS混合，混合物总体积为30µl，包含1.5×10¹⁰pfu Ad-IL10和0µgCMC。实验组：将15µl 10¹²pfu/ml的Ad-IL10和15µl 2.6% CMC混合，混合物总体积为30µl，包含1.5×10¹⁰pfu Ad-IL10和390µgCMC。

C57BL/6J小鼠（雄性，6周龄，随机分为空白组、对照组和实验组，每组n=10）。3组动物均腹腔注射2.0µl/g 20% CCl₄溶液，每周2次，同时肝内注射30µl混合物，每10天1次，分别在注射后4w和8w处死小鼠，每组各5只。肝组织外观显示，3组小鼠肝表面颗粒状粗糙，在第8w，对照组和实验组肝表面白色结节数量明显少于空白组（图5B）。H&E染色显示，空白组肝组织内大量炎性细胞和气球状肝细胞，对照组、实验组症状逐渐减轻（图5C）。天狼星红染色显示，空白组肝组织中央静脉和门静脉周围有大量胶原沉积和纤维间隔假小叶，对照组、实验组症状逐渐明显减轻（图5D）。IHC结果显示，与空白组和对照组相比，实验组中IL-10的表达增高（图6a），Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）表达显著下调（图6，图b-d）。

上述结果提示，CMC包裹的Ad-IL10可有效缓释IL-10，增强IL-10的表达，并更好地缓解CCl₄诱导的小鼠肝纤维化。

Claims

1.一种羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物介导目的基因体内转导的方法，包含以下步骤：

步骤1：扩增并纯化携带目的基因的腺病毒；

步骤2：将10¹²pfu/ml 腺病毒15µl与2.5-5% 的羧甲基壳聚糖15µl混合于PBS中，获得30µl羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物，所述2.5-5%的羧甲基壳聚糖按质量体积比计算，表示100ml PBS中含有2.5-5g羧甲基壳聚糖；

步骤3：将混合物皮下注射或肝内定点注射；

所述方法为非疾病诊断治疗目的的方法。

2.一种羧甲基壳聚糖-腺病毒混合物在制备肝纤维化治疗药物中的应用，其特征在于：所述腺病毒携带IL10目的基因。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肝纤维化包含病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性疾病引起的肝纤维化。