CN102091334A - 一种腺病毒-壳聚糖纳米复合材料的制备方法 - Google Patents

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韩志超
许杉杉
李立藏
申孟芝
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Abstract

本发明公开了一种腺病毒-壳聚糖纳米复合材料的制备方法，包括聚乙二醇-叶酸缩合物的合成，壳聚糖-聚乙二醇缩合物、壳聚糖-叶酸缩合物以及壳聚糖-聚乙二醇-叶酸的合成，腺病毒-壳聚糖纳米复合物的制备等步骤，制得腺病毒-壳聚糖纳米复合材料，通过对腺病毒进行化学修饰来减少其对肝脏的毒性，降低抗体对其的抵制；通过在腺病毒表面的离子交联壳聚糖或其与聚乙二醇以及叶酸的缩合物，提供了化学交联位点以及实现靶向的物质，维持了腺病毒的原始生物活性的同时，也延长了其在体内循环的时间，且不降低其生物活性和传染性，进一步地，还可提高靶向部位的局部浓度，治疗效果好且可实现大规模加工生产。

Description

一种腺病毒-壳聚糖纳米复合材料的制备方法
技术领域
本发明涉及靶向基因治疗的纳米复合材料的制备方法，更具体地，是一种腺病毒-壳聚糖纳米结构复合材料的制备方法。
背景技术
腺病毒(Ad)携带相关材料可用于转基因抗癌治疗，同时联合化疗、放疗来增强抗癌效果。Ad有很多优势，如高传染性和基因治疗的可控制插入性等，但由于没有材料能够把足够多的Ad输送到病灶部位，对肿瘤细胞进行充分的感染，因此，当前以Ad为媒介的治疗主要局限于局部瘤内的监管。为了成功实现联合治疗，需要在目标肿瘤部位得到局部高浓度的Ad。
为了进行有效地基因治疗，需要一个可以被系统性监管的以Ad为媒介的肿瘤靶向系统。然而，在进行全身Ad传送时会遇到多种困难，例如，Ad会被主体(人)的抗体抑制，在体循环中存活周期短，而且会被肝脏吸收，在靶向疾病部位的浓度较低等。血液中的Ad会很快被中和抗体识别，中和抗体可以钝化病毒表面纤维蛋白的识别能力，从而降低其传染性，从而导致需要增加抗肿瘤治疗所需的有效病毒的剂量。由于Ad会被肝脏网状内皮系统的肝细胞或库普费尔氏细胞吸收从而导致很高的肝脏毒性。此外，传统的Ad是通过增加-弥散-滞留(EPR)机制被动地传输到肿瘤细胞的，这要求Ad的局部浓度非常高。鉴于以上因素，要实现Ad被传送至离疾病较近部位以实现选择性病毒传染，达到有效治疗的目的尚有待研究。
研究表明，可以采用对Ad进行化学修饰的方法来减少肝毒性、降低抗体对Ad的抵制，包括Ad表面的PEG修饰，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺修饰以及封入脂质体胶囊等。然而，Ad表面的PEG修饰虽可以阻止体循环中抗体对他的抵制，延长体内循环时间，但表面PEG的存在也会降低Ad的对肿瘤细胞的感染能力。此外，通过EPR机制被动聚积的Ad浓度仍然不够起到抗癌效果，因此需要提供一种具有高效靶向功能的改进型腺病毒，提高病灶部位的Ad浓度。
发明内容
本发明目的在于提供一种毒性低、感染力强且具有靶向功能的腺病毒-壳聚糖纳米复合材料的制备方法。
本发明是通过如下技术手段实现的：针对壳聚糖及其与聚乙二醇和叶酸的化合物与腺病毒表面的离子交联后，可以提供化学交联位点以及靶向功能的特点，通过将腺病毒和壳聚糖及其与聚乙二醇和叶酸的化合物进行静电纺丝后，用磷酸三甲苯脂接收池接收，提供一种毒性低、感染力强且具有靶向功能的腺病毒-壳聚糖纳米复合材料，且工艺简单、产率高，易于实现产业化。
本发明的制备腺病毒-壳聚糖纳米复合材料的方法，包括如下步骤：
(1)聚乙二醇-叶酸缩合物的合成：将叶酸、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺按照1∶1∶1～1∶5∶5的摩尔比溶于二甲基亚砜，在氮气保护下活化6～48小时，过滤后得到活化的叶酸溶液，然后按照叶酸与聚乙二醇的摩尔比为20∶1～1∶2的比例加入重均分子量为2000～10000的聚乙二醇，在氮气保护下反应1～24小时，加入丙酮沉淀后离心除去多余叶酸，上清液用去离子水透析后冻干即得到聚乙二醇-叶酸缩合物；
(2)壳聚糖-聚乙二醇缩合物、壳聚糖-叶酸缩合物以及壳聚糖-聚乙二醇-叶酸的合成：将低分子量的壳聚糖溶于蒸馏水，配制成质量百分浓度为0.1％～10％的壳聚糖溶液，搅拌过夜；然后在常温下分别按摩尔比为1∶1∶1～5∶5∶1加入聚乙二醇、二氯乙烷以及N-羟基丁二酰亚胺，按摩尔比为1∶1∶1～5∶5∶1加入叶酸、二氯乙烷以及N-羟基丁二酰亚胺，按摩尔比为1∶1∶1～5∶5∶1加入聚乙二醇-叶酸缩合物、二氯乙烷以及N-羟基丁二酰亚胺，搅拌过夜，反应液分别用去离子水透析，冻干后得到壳聚糖-聚乙二醇缩合物、壳聚糖-叶酸缩合物以及壳聚糖-聚乙二醇-叶酸缩合物，其中，壳聚糖与聚乙二醇的摩尔比为1∶5～5∶1，壳聚糖与叶酸的摩尔比为1∶5～5∶1；
(3)腺病毒-壳聚糖纳米复合物的制备：将低分子量壳聚糖、壳聚糖-聚乙二醇缩合物、壳聚糖-叶酸缩合物以及壳聚糖-聚乙二醇-叶酸缩合物分别在常温下溶解于磷酸盐缓冲液中，制成质量百分浓度为1％的溶液；将所述溶液分别与60μl浓度为1×1012VP/ml的腺病毒混悬液混合，得到腺病毒/壳聚糖混合液、腺病毒/壳聚糖-聚乙二醇混合液、腺病毒/壳聚糖-叶酸混合液、腺病毒/壳聚糖-聚乙二醇-叶酸混合液，将上述混合液按照体积比为1∶1∶1∶1～2∶3∶2∶3的比例再次全部混合后进行静电纺丝，其中，所述静电纺丝的参数如下：电压为10～20KV、溶液流速为2～10mL/h、针尖到磷酸三甲苯脂接收池的接收距离为5～15cm，接收后缓慢搅动10～30min，再进行离心浓缩除去未反应的物质，得到腺病毒-壳聚糖纳米复合材料，于4℃下储存。
磷酸盐缓冲液(PBS)是医学领域常用的一种溶液，其PH＝7.4，与人体血液等渗，主要成分为磷酸氢钠、磷酸二氢钠、氯化钠以及氯化钾。
按照本发明制备腺病毒-壳聚糖纳米复合材料，通过将壳聚糖及其与聚乙二醇和叶酸的缩合物混合腺病毒进行静电纺丝，再与三聚磷酸盐原位离子交联制得腺病毒-壳聚糖纳米复合材料，其中，腺病毒被有效包裹，但其生物活性和传染性却没有降低，且具有靶向功能，实现了在体循环中延长活性周期，且提高了靶向部位的局部浓度，生产工艺简单、易于操作，可实现大规模产业化。
具体实施方式
以下描述本发明的优选实施方式，但并非用以限定本发明。
实施例1：
按照如下方法制备腺病毒-壳聚糖纳米复合材料：
(1)聚乙二醇-叶酸缩合物的合成：将叶酸、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺按照1∶2∶2的摩尔比溶于二甲基亚砜，在氮气保护下活化12小时，经孔径为0.2μm的膜过滤后得到活化的叶酸溶液，然后按照叶酸与聚乙二醇的摩尔比为15∶1的比例加入重均分子量为3400的聚乙二醇，在氮气保护下反应4小时，加入丙酮沉淀后离心除去多余叶酸，上清液用去离子水透析后冻干即得到聚乙二醇-叶酸缩合物；
(2)壳聚糖-聚乙二醇缩合物、壳聚糖-叶酸缩合物以及壳聚糖-聚乙二醇-叶酸的合成：将低分子量的壳聚糖溶于蒸馏水，配制成质量百分浓度为1.0％的壳聚糖溶液，搅拌过夜；然后在常温下分别按摩尔比2∶2∶1加入聚乙二醇、二氯乙烷以及N-羟基丁二酰亚胺，按摩尔比2∶2∶1加入叶酸、二氯乙烷以及N-羟基丁二酰亚胺，按摩尔比2∶2∶1加入聚乙二醇-叶酸缩合物、二氯乙烷以及N-羟基丁二酰亚胺，搅拌过夜，反应液分别用去离子水透析，冻干后得到壳聚糖-聚乙二醇缩合物、壳聚糖-叶酸缩合物以及壳聚糖-聚乙二醇-叶酸缩合物，其中，壳聚糖与聚乙二醇的摩尔比为1∶1，壳聚糖与叶酸的摩尔比为1∶1；
(3)腺病毒-壳聚糖纳米复合物的制备：将低分子量壳聚糖、壳聚糖-聚乙二醇缩合物、壳聚糖-叶酸缩合物以及壳聚糖-聚乙二醇-叶酸缩合物分别在常温下溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中，制成质量百分浓度为1％的溶液；将所述溶液分别与60μl浓度为1×1012VP/ml的腺病毒混悬液混合，得到腺病毒/壳聚糖混合液、腺病毒/壳聚糖-聚乙二醇混合液、腺病毒/壳聚糖-叶酸混合液、腺病毒/壳聚糖-聚乙二醇-叶酸混合液，将上述混合液按照体积比为1∶1∶1∶1的比例再次全部混合后进行静电纺丝，其中，所述静电纺丝的电纺系统(NNC-ESP 200，Nano NC，Seoul，Korea)的参数如下：电压15KV、溶液流速5mL/h、针尖到磷酸三甲苯脂(TPP)接收池的接收距离5cm，接收后缓慢搅动20min，再进行离心浓缩除去未反应的物质，得到腺病毒-壳聚糖纳米复合材料，于4℃下储存。
实践证明，利用本发明的方法制备的腺病毒-壳聚糖纳米复合材料对肝脏的毒性低，且具有靶向功能，其中，腺病毒被有效包裹，但其生物活性和传染性却没有降低，从而实现了其在体循环中延长活性周期，且提高了靶向部位的局部浓度，另外，生产工艺简单、易于操作，可实现大规模产业化。

Claims (1)

1.一种腺病毒-壳聚糖纳米复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)聚乙二醇-叶酸缩合物的合成：将叶酸、二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺按照1∶1∶1～1∶5∶5的摩尔比溶于二甲基亚砜，在氮气保护下活化6～48小时，过滤后得到活化的叶酸溶液，然后按照叶酸与聚乙二醇的摩尔比为20∶1～1∶2的比例加入重均分子量为2000～10000的聚乙二醇，在氮气保护下反应1～24小时，加入丙酮沉淀后离心除去多余叶酸，上清液用去离子水透析后冻干即得到聚乙二醇-叶酸缩合物；
(2)壳聚糖-聚乙二醇缩合物、壳聚糖-叶酸缩合物以及壳聚糖-聚乙二醇-叶酸的合成：将低分子量的壳聚糖溶于蒸馏水，配制成质量百分浓度为0.1％～10％的壳聚糖溶液，搅拌过夜；然后在常温下分别按摩尔比为1∶1∶1～5∶5∶1加入聚乙二醇、二氯乙烷以及N-羟基丁二酰亚胺，按摩尔比为1∶1∶1～5∶5∶1加入叶酸、二氯乙烷以及N-羟基丁二酰亚胺，按摩尔比为1∶1∶1～5∶5∶1加入聚乙二醇-叶酸缩合物、二氯乙烷以及N-羟基丁二酰亚胺，搅拌过夜，反应液分别用去离子水透析，冻干后得到壳聚糖-聚乙二醇缩合物、壳聚糖-叶酸缩合物以及壳聚糖-聚乙二醇-叶酸缩合物，其中，壳聚糖与聚乙二醇的摩尔比为1∶5～5∶1，壳聚糖与叶酸的摩尔比为1∶5～5∶1；
(3)腺病毒-壳聚糖纳米复合物的制备：将低分子量壳聚糖、壳聚糖-聚乙二醇缩合物、壳聚糖-叶酸缩合物以及壳聚糖-聚乙二醇-叶酸缩合物分别在常温下溶解于磷酸盐缓冲液中，制成质量百分浓度为1％的溶液；将所述溶液分别与60μl浓度为1×1012VP/ml的腺病毒混悬液混合，得到腺病毒/壳聚糖混合液、腺病毒/壳聚糖-聚乙二醇混合液、腺病毒/壳聚糖-叶酸混合液、腺病毒/壳聚糖-聚乙二醇-叶酸混合液，将上述混合液按照体积比为1∶1∶1∶1～2∶3∶2∶3的比例再次全部混合后进行静电纺丝，其中，所述静电纺丝的参数如下：电压为10～20KV、溶液流速为2～10mL/h、针尖到磷酸三甲苯脂接收池的接收距离为5～15cm，接收后缓慢搅动10～30min，再进行离心浓缩除去未反应的物质，得到腺病毒-壳聚糖纳米复合材料，于4℃下储存。
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