CN103083673B - 一种抗肿瘤纳米药物载体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤纳米药物载体及其制备方法与应用。本发明通过壳聚糖和脱氧胆酸进行酰胺化反应形成共聚物壳聚糖-脱氧胆酸，壳聚糖-脱氧胆酸和甲醛形成希夫碱中间体后与聚乙二醇反应，得到的壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇与叶酸发生酰胺化反应而制备抗肿瘤纳米药物载体，利用肿瘤细胞表面叶酸受体高表达而正常组织很少有叶酸受体过分表达的特点，接有叶酸分子的抗肿瘤纳米药物载体与肿瘤细胞有更强的亲和力，克服了普通纳米粒功能较单一的缺点。制备的抗肿瘤纳米药物载体能够很好的避开吞噬细胞的吞噬，有利于在体内长期循环而不被清除，主动靶向修饰能够更好的与肿瘤细胞特异性结合，减少了药物对人体正常细胞的损害。
Description
技术领域
本发明属于纳米药物载体技术领域，特别涉及一种抗肿瘤纳米药物载体及其制备方法与应用。
背景技术
癌症是人类生命健康的最大杀手，化学治疗是癌症治疗最重要的手段，然而多数化学治疗药物缺少特定到达肿瘤组织的能力，对肿瘤细胞缺乏选择杀伤作用，在杀伤肿瘤细胞的同时也伤及正常细胞，特别是癌细胞因为给药处理产生耐药性，为了克服癌细胞的耐药性需要给予更高的抗癌药剂量，从而对正常细胞造成较大的副作用，甚至中断治疗；另一方面，多数抗肿瘤药物的功效由于其自身性质，如水溶性差、治疗窗口窄等也限制了肿瘤治疗的效果。
从上世纪70年代开始，纳米载体作为化疗药物传递系统用于癌症治疗引起了人们的极大关注。用于药物传递系统的纳米粒子其粒径在10～1000nm，可以有多种材料构成，包括聚合物、脂质、病毒和有机金属复合物等。
近年来，聚合物纳米制剂因为具有较好的理化性能而备受关注。聚合物胶束由双亲性的聚合物材料在水环境中自组装形成，是具有均一纳米级粒径及球形的核壳结构载体。其亲水性外壳可以增强胶束在水性生物介质的分散性和稳定性，并与生物介质相容，内核可包埋难溶性药物。特别是壳聚糖，由于其优良的细胞相容性、生物可降解性、生物粘附性、无毒性、无免疫原性、抗菌活性等优点，已被大量用于药物载体，传递蛋白、基因、药物等生物活性分子。因此，以壳聚糖为基础材料，对其进行疏水修饰，使其在水溶液中自组装形成胶束的药物载体被各国学者所研究。
简单疏水修饰的壳聚糖形成的胶束虽然具有可降解，无毒，载药量高等优点，但是作为抗肿瘤药物载体，经静脉注射后，这样的纳米粒也很容易被体内的吞噬细胞当作外来异物识别而被吞噬，在人体内循环的时间不是足够的长，降低了生物利用率。另外，简单疏水修饰的壳聚糖胶束也不具有很强的靶向性，不能够与肿瘤细胞特异的结合，从而不能够有效降低抗癌药物对正常细胞的毒副作用。在本研究之前，虽然有研究者分别制备了具有靶向性和体内长循环性的疏水壳聚糖胶束，但同时满足以上要求的传递载体系却很少。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗肿瘤纳米药物载体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的抗肿瘤纳米药物载体。
本发明的再一目的在于提供所述的抗肿瘤纳米药物载体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)壳聚糖疏水改性：
将壳聚糖(CS)和脱氧胆酸(DA)按摩尔比1:40～1:162于25～40℃反应48～72h，纯化后得到共聚物壳聚糖-脱氧胆酸(CS-DA)；
(2)聚乙二醇(MPEG)修饰壳聚糖-脱氧胆酸：
将步骤(1)制备的壳聚糖-脱氧胆酸和聚乙二醇溶于30～50ml1％(v/v)醋酸溶液中，室温搅拌15～30min后加入甲醛，室温反应1～6h，纯化后得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇(CS-DA-MPEG)聚合物；其中聚乙二醇与壳聚糖-脱氧胆酸的质量比为12:1～20：1，甲醛和壳聚糖-脱氧胆酸的质量比为1:2～1:4；
(3)接枝聚合物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的靶向修饰：
将叶酸(FA)和步骤(2)制备的壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇按质量比1:1～2:1于35～40℃水浴中避光反应16～24h，纯化后得到接枝共聚物载体壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸(CS-DA-MPEG-FA)；
(4)抗肿瘤纳米药物载体的制备：
将步骤(3)制备的接枝共聚物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸溶于醋酸溶液中，得到混合液，每毫升醋酸溶解接枝共聚物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸1～2mg；将混合液置于透析袋中透析后，将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到抗肿瘤纳米药物载体；
步骤(1)中：
所述的壳聚糖的分子量优选为50000；
所述反应的条件优选25℃磁力搅拌48～72h；
所述的反应优选在催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中进行；
所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与脱氧胆酸的摩尔比优选为2:1，所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比优选为3:1；
所述的纯化优选采用以下方法进行：待反应结束时，向反应瓶中加入氨水，离心，弃去上清液，甲醇洗涤沉淀3～5次后透析7天，冷冻干燥，得到共聚物壳聚糖-脱氧胆酸；
所述的冷冻干燥的条件为在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h；
优选的，所述的壳聚糖疏水改性采用以下方法进行：将壳聚糖溶于1％(v/v)醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液；将DA、EDC、NHS加入甲醇中活化半小时，得到混合液；然后将混合液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，25℃磁力搅拌48～72h，纯化后得到共聚物壳聚糖-脱氧胆酸；壳聚糖和脱氧胆酸的摩尔比为1:40～1:162；
步骤(2)中：
所述的聚乙二醇优选为甲氧基聚乙二醇；
所述的甲氧基聚乙二醇的分子量优选为5000；
所述的室温反应优选在二甲基亚砜(DMSO)中进行；
所述的纯化优选采用以下方法进行：向反应瓶中加入50ml丙酮使反应物沉淀下来，弃去上清液将沉淀透析7天，冷冻干燥，得到聚合物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇；
所述的冷冻干燥的条件为在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h；
步骤(3)中：
所述的避光反应优选在催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)中进行；
所述的叶酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的质量比优选为1:1；
所述的纯化优选采用以下方法进行：用氢氧化钠溶液将反应液的pH调至9后离心，弃去上清液将沉淀透析，冷冻干燥，得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸聚合物；
所述的透析的条件为在pH为7.4的PBS溶液中透析7天后在双蒸水中透析7天；
所述的冷冻干燥的条件为在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h；
优选的，所述的接枝聚合物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的靶向修饰采用以下方法进行：将壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇溶于1％(v/v)醋酸溶液中，得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇醋酸溶液；将叶酸溶解于DMSO中，加入0.3g EDC后避光搅拌1h，得到混合液，将混合液在30分钟内滴加到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇醋酸溶液中，于35～40℃水浴中避光搅拌反应16～24h，纯化后得到接枝共聚物载体壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸；叶酸和壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的质量比为1:1～2:1；
步骤(4)中：
所述的醋酸溶液优选为1％(v/v)醋酸水溶液；
优选的，每毫升醋酸溶解接枝共聚物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸1mg；
所述的透析优选为去离子水透析；
所述的透析袋截留分子量为10000；
所述的透析优选按照以下方法进行：先用生理盐水透析24h，然后用双蒸水透析24h，其中前3h每1h换一次双蒸水，以后每3h换一次双蒸水；
所述的冷冻干燥按照以下方法进行：在-10～-20℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干12～24h，优选在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h；
一种抗肿瘤纳米药物载体，由上述制备方法得到；
所述的抗肿瘤纳米药物载体可应用于输送多种治疗肿瘤的化疗药物，如阿霉素、紫杉醇、喜树碱等。
本发明的发明机理如图5所示。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过壳聚糖和脱氧胆酸进行酰胺化反应形成共聚物壳聚糖-脱氧胆酸，壳聚糖-脱氧胆酸和甲醛形成希夫碱中间体后与聚乙二醇反应，得到的壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇与叶酸发生酰胺化反应而制备抗肿瘤纳米药物载体。
制备得到的抗肿瘤纳米药物载体对药物的包载为非化学键结合，通过脱氧胆酸的疏水作用形成疏水微区，壳聚糖亲水骨架盘绕在疏水微区的外面形成亲水性外壳，使其在水溶液中具有最低的表面能，此外，在紧密的壳聚糖骨架间存在分子间和分子内氢键，进一步促进胶束的形成，这种独特的超分子结构很适合捕获疏水药物，从而增加小分子疏水药物的溶解，而连接到壳聚糖外壳上的聚乙二醇和叶酸分别起到了隐形和主动靶向的作用。亲水性强的聚乙二醇能够在纳米粒表面形成一层或者多层保护性的亲水衣膜，可阻碍调理作用，聚乙二醇自身的高分子链可以自由摆动，具有较高的柔韧性，对普通纳米粒能够起到更强的立体保护作用，避免被吞噬细胞快速吞噬，从而使该纳米粒子具备更长的血浆半衰期；叶酸体积小，被认为无免疫原性，并且稳定性高。利用肿瘤细胞表面叶酸受体高表达而正常组织很少有叶酸受体过分表达的特点，接有叶酸分子的抗肿瘤纳米药物载体与肿瘤细胞有更强的亲和力，使得抗肿瘤纳米药物载体同时又具备了主动靶向的特性，克服了普通纳米粒功能比较单一的缺点。该抗肿瘤纳米药物载体能够很好的避开吞噬细胞的吞噬，有利于在体内长期循环而不被清除，主动靶向修饰能够更好的与肿瘤细胞特异性结合，减少了药物对人体正常细胞的损害。
附图说明
图1是实施例1中不同接枝聚合物的红外谱图，其中：a为CS-DA-MPEG-FA的红外谱图，b为CS-DA-MPEG红外谱图，c为CS-DA红外谱图，d为CS红外谱图。
图2是实施例1中不同接枝聚合物的核磁氢谱图，其中：a为CS-DA-MPEG-FA的核磁氢谱图，b为CS-DA-MPEG的核磁氢谱图，c为CS-DA的核磁氢谱图，d为CS的核磁氢谱图,e为MPEG的核磁氢普图，f为FA的核磁氢普图。
图3是实施例1的壳聚糖-脱氧胆酸-乙二醇-叶酸纳米粒的透射电镜扫描图。
图4是效果实施例的壳聚糖-脱氧胆酸-乙二醇-叶酸纳米粒载阿霉素的体外累积释放曲线图，其中：a为载阿霉素纳米粒子在pH5.7的醋酸钠缓冲溶液中的体外累积释放曲线；b为载阿霉素纳米粒子在pH7.4的PBS缓冲溶液中的体外累积释放曲线。
图5是本发明的反应机理图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)壳聚糖疏水改性：
称取1.0g壳聚糖于反应瓶中，加入100ml的1％(v/v)醋酸水溶液将其溶解，得到壳聚糖醋酸溶液；将0.3180g DA(壳聚糖(CS)和脱氧胆酸(DA)摩尔比为1:40)、0.6211g EDC、0.1243g NHS加入到另一烧杯中，加入200ml甲醇活化半小时，得到混合液；然后将混合液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，磁力搅拌，25℃反应48h，待反应结束时，向反应瓶中加入60ml氨水，将反应物转移至离心管中离心10分钟(转速5000r/min)，弃去上清液，40ml甲醇洗涤沉淀3次，然后将沉淀转移到透析袋(透析袋截留分子量为10000，下同。)中透析7天，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得到壳聚糖-脱氧胆酸，其反应方程式为：
壳聚糖-脱氧胆酸聚合物(CS-DA)的鉴别：红外谱图中，1657cm-1和1600cm-1是CS的特征谱带，分别是酰胺I带羰基的伸缩振动和氨基的弯曲振动，而CS-DA的红外谱图显示在1559cm-1处出现酰胺II带的特征吸收，表明CS链上的氨基和DA的羧基发生了酰化反应；CS-DA的核磁氢谱中，化学位移0.5、0.7、0.8的多重峰是DA非常特征的核磁共振峰，证明了DA成功的接枝到CS的氨基上；
(2)聚乙二醇(MPEG)修饰壳聚糖-脱氧胆酸：
将0.112g步骤(1)制备的壳聚糖-脱氧胆酸溶于30ml1％(v/v)醋酸中，然后加入40ml DMSO、1.344g MPEG，室温搅拌15分钟后，加入0.056g甲醛(甲醛和壳聚糖-脱氧胆酸的质量比为1:2)，室温反应1h，加入50ml丙酮使反应物沉淀下来，弃去上清液将沉淀转移至透析袋(透析袋截留分子量为10000，下同。)中透析7天，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇，其反应方程式为：
壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇聚合物(CS-DA-MPEG)的鉴别：红外谱图中，2900cm-1附近是亚甲基-CH2的伸缩振动吸收峰，1100cm-1附近是醚键的伸缩振动吸收峰，发生反应后，2900cm-1和1100cm-1附近吸收峰相对强度明显高于CS，证明CS与MPEG发生了接枝反应；CS-DA-MPEG的核磁氢谱中，化学位移1.09的特征峰对应MPEG头上的甲基-CH3，3.30-3.66的多重峰对应于MPEG中的重复单元-CH2CH2O，再次证明了MPEG对CS-DA接枝反应的成功；
(3)接枝聚合物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的靶向修饰：
称取0.2g步骤(2)制备的壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇于圆底烧瓶中，加入50ml1％(v/v)醋酸溶液，搅拌至全溶，得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇醋酸溶液；称取0.2g叶酸(叶酸和壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的质量比为1:1)，用10mlDMSO搅拌将其溶解，再加入0.2g EDC避光搅拌1h，得到混合液，用恒压滴液漏斗将混合液在30min内滴加到上述壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的醋酸溶液中，于35℃水浴中避光搅拌反应16h，然后用氢氧化钠溶液将反应液pH调至9，将反应物倒入离心管中离心10分钟(转速5000r/min)，倾出上清液，将沉淀移至透析袋(透析袋截留分子量为10000，下同。)中，分别在pH为7.4的PBS和双蒸水中透析7天，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸聚合物，其反应方程式为：
壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸聚合物(CS-DA-MPEG-FA)的鉴别：红外谱图中，3400cm-1的峰的强度进一步降低，这主要是由于FA与CS-DA-MPEG发生了酰胺化反应，导致氨基的伸缩震动减弱；在CS-DA-MPEG-FA的核磁氢谱中，化学位移7.93和8.17对应FA芳环上的H的化学位移，而化学位移8.28则是FA喋啶环7位的H；
(4)抗肿瘤纳米药物载体的制备：
将10mg步骤(3)制备的壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸样品溶于10ml1％(v/v)醋酸水溶液(壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸和醋酸的质量体积比是1mg/ml)，得到混合液，将混合液装入透析袋(透析袋截留分子量为10000，下同。)中，先用生理盐水透析24h，然后再用双蒸水透析24h，在用双蒸水透析时，前3h内每1h换一次双蒸水，以后每3h换一次双蒸水，得到CS-DA-MPEG-FA纳米粒溶液，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得到抗肿瘤药物纳米载体，室温干燥保存。
实施例2
(1)壳聚糖疏水改性：
称取1.0g壳聚糖于反应瓶中，加入100ml的1％(v/v)醋酸水溶液将其溶解，得到壳聚糖醋酸溶液；将1.2720g DA(壳聚糖(CS)和脱氧胆酸(DA)摩尔比为1:162)、2.4844g EDC、0.4971g NHS加入到另一烧杯中，加入200ml甲醇活化半小时，得到混合液；然后将混合液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，磁力搅拌，25℃反应60h，待反应结束时，向反应瓶中加入60ml氨水，将反应物转移至离心管中离心10分钟(转速5000r/min)，弃去上清液，40ml甲醇洗涤沉淀4次，然后将沉淀转移到透析袋中透析7天，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得到壳聚糖-脱氧胆酸聚合物；
壳聚糖-脱氧胆酸聚合物(CS-DA)的鉴别：红外谱图中，1657cm-1和1600cm-1是CS的特征谱带，分别是酰胺I带羰基的伸缩振动和氨基的弯曲振动，而CS-DA的红外谱图显示在1559cm-1处出现酰胺II带的特征吸收，表明CS链上的氨基和DA的羧基发生了酰化反应；CS-DA的核磁氢谱中，化学位移0.5、0.7、0.8的多重峰是DA非常特征的核磁共振峰，证明了DA成功的接枝到CS的氨基上；
(2)聚乙二醇(MPEG)修饰壳聚糖-脱氧胆酸：
将0.224g壳聚糖-脱氧胆酸溶于40ml1％(v/v)醋酸中，然后加入50mlDMSO、4.480g MPEG，室温搅拌25分钟后，加入0.056g甲醛(甲醛和壳聚糖-脱氧胆酸的质量比为1:4)，室温反应4h，加入50ml丙酮使反应物沉淀下来，弃去上清液将沉淀转移至透析袋中透析7天，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇聚合物；
壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇聚合物(CS-DA-MPEG)的鉴别：红外谱图中，2900cm-1附近是亚甲基-CH2的伸缩振动吸收峰，1100cm-1附近是醚键的伸缩振动吸收峰，发生反应后，2900cm-1和1100cm-1附近吸收峰相对强度明显高于CS，证明CS与MPEG发生了接枝反应；CS-DA-MPEG的核磁氢谱中，化学位移1.09的特征峰对应MPEG头上的甲基-CH3，3.30-3.66的多重峰对应于MPEG中的重复单元-CH2CH2O，再次证明了MPEG对CS-DA接枝反应的成功；
(3)接枝聚合物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的靶向修饰：
称取0.2g壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇于圆底烧瓶中，加入50ml1％(v/v)醋酸水溶液，搅拌至全溶，得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇醋酸溶液；称取0.4g叶酸(叶酸和壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的质量比为2:1)，用10ml DMSO搅拌将其溶解，再加入0.4g EDC避光搅拌1小时，得到混合液，用恒压滴液漏斗将混合液在30分钟内滴加到上述壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇醋酸溶液中，于37℃水浴中避光搅拌反应24h，然后用氢氧化钠溶液将反应液pH调至9，将反应物倒入离心管中离心10分钟(转速5000r/min)，倾出上清液，将沉淀移至透析袋中，分别在pH为7.4的PBS和双蒸水中透析7天，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸聚合物；
壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸聚合物(CS-DA-MPEG-FA)的鉴别：红外谱图中，3400cm-1的峰的强度进一步降低，这主要是由于FA与CS-DA-MPEG发生了酰胺化反应，导致氨基的伸缩震动减弱；在CS-DA-MPEG-FA的核磁氢谱中，化学位移7.93和8.17对应FA芳环上的H的化学位移，而化学位移8.28则是FA喋啶环7位的H；
(4)抗肿瘤纳米药物载体的制备：
取10mg壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸样品溶于10ml1％(v/v)醋酸水溶液(壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸和醋酸的质量体积比是1mg/ml)，得到混合液，将混合液装入透析袋中，先用生理盐水透析24h，然后再用双蒸水透析24h，在用双蒸水透析时，前3h内每1h换一次双蒸水，以后每3h换一次双蒸水，得到CS-DA-MPEG-FA纳米粒溶液，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得到抗肿瘤药物纳米载体，室温干燥保存。
实施例3
(1)壳聚糖疏水改性：
称取1.0g壳聚糖于反应瓶中，加入100ml的1％(v/v)醋酸水溶液将其溶解，得到壳聚糖醋酸溶液；将0.8480g DA(壳聚糖(CS)和脱氧胆酸(DA)摩尔比为1:108)、1.6563g EDC、0.3315g NHS加入到另一烧杯中，加入200ml甲醇活化半小时，得到混合液；然后将混合液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，磁力搅拌，25℃反应72h，待反应结束时，向反应瓶中加入60ml氨水，将反应物转移至离心管中离心10分钟(转速5000r/min)，弃去上清液，40ml甲醇洗涤沉淀5次，然后将沉淀转移到透析袋中透析7天，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得到壳聚糖-脱氧胆酸聚合物；
壳聚糖-脱氧胆酸聚合物(CS-DA)的鉴别：红外谱图中，1657cm-1和1600cm-1是CS的特征谱带，分别是酰胺I带羰基的伸缩振动和氨基的弯曲振动，而CS-DA的红外谱图显示在1559cm-1处出现酰胺II带的特征吸收，表明CS链上的氨基和DA的羧基发生了酰化反应；CS-DA的核磁氢谱中，化学位移0.5、0.7、0.8的多重峰是DA非常特征的核磁共振峰，证明了DA成功的接枝到CS的氨基上；
(2)聚乙二醇(MPEG)修饰壳聚糖-脱氧胆酸：
将0.168g壳聚糖-脱氧胆酸溶于50ml1％(v/v)醋酸中，然后加入60mlDMSO、2.688g MPEG，室温搅拌30分钟后，加入0.056g甲醛(甲醛和壳聚糖-脱氧胆酸的质量比为1:3)，室温反应6h，加入50ml丙酮使反应物沉淀下来，弃去上清液将沉淀转移至透析袋中透析7天，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇聚合物；
壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇聚合物(CS-DA-MPEG)的鉴别：红外谱图中，2900cm-1附近是亚甲基-CH2的伸缩振动吸收峰，1100cm-1附近是醚键的伸缩振动吸收峰，发生反应后，2900cm-1和1100cm-1附近吸收峰相对强度明显高于CS，证明CS与MPEG发生了接枝反应；CS-DA-MPEG的核磁氢谱中，化学位移1.09的特征峰对应MPEG头上的甲基-CH3，3.30-3.66的多重峰对应于MPEG中的重复单元-CH2CH2O，再次证明了MPEG对CS-DA接枝反应的成功；
(3)接枝聚合物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的靶向修饰：
称取0.2g壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇于圆底烧瓶中，加入50ml1％(v/v)醋酸溶液，搅拌至全溶，得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇醋酸溶液；称取0.3g叶酸(叶酸和壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的质量比为1.5:1)，用10ml DMSO搅拌将其溶解，再加入0.3g EDC避光搅拌1h，得到混合液，用恒压滴液漏斗将混合液在30分钟内滴加到上述壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇醋酸溶液中，于40℃水浴中避光搅拌反应20h，然后用氢氧化钠溶液将反应液pH调至9，将反应物倒入离心管中离心10分钟(转速5000r/min)，倾出上清液，将沉淀移至透析袋中，分别在pH为7.4的PBS和双蒸水中透析7天，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸聚合物；
壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸聚合物(CS-DA-MPEG-FA)的鉴别：红外谱图中，3400cm-1的峰的强度进一步降低，这主要是由于FA与CS-DA-MPEG发生了酰胺化反应，导致氨基的伸缩震动减弱；在CS-DA-MPEG-FA的核磁氢谱中，化学位移7.93和8.17对应FA芳环上的H的化学位移，而化学位移8.28则是FA喋啶环7位的H；
(4)抗肿瘤纳米药物载体的制备：
取10mg壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸样品溶于10ml1％(v/v)醋酸水溶液(壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸和醋酸的质量体积比是1mg/ml)，得到混合液，将混合液装入透析袋中，先用生理盐水透析24h，然后再用双蒸水透析24h，在用双蒸水透析时，前3h内每1h换一次双蒸水，以后每3h换一次双蒸水，得到CS-DA-MPEG-FA纳米粒溶液，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得到抗肿瘤药物纳米载体，室温干燥保存。
效果实施例
将20mg阿霉素盐酸盐和10.468mg三乙胺置于圆底烧瓶中，加入1mlDMSO，室温避光搅拌12h，得到混合溶液；同时取20mg实施例2制备的CS-DA-MPEG-FA溶于10ml HCL/DMSO(HCL/DMSO体积比为3/7)中，得到混合液，然后将上述混合溶液加入该混合液中，室温避光搅拌反应24h，得到反应液，将反应液转移到截留分子量为10000的透析袋中，去离子水透析24h(每三小时换一次去离子水，且要避光)，得到载有阿霉素的CS-DA-MPEG-FA纳米粒溶液，冷冻干燥(在-10℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干24h)，得到负载阿霉素的CS-DA-MPEG-FA纳米载体，室温干燥保存；壳聚糖-脱氧胆酸-乙二醇-叶酸纳米粒载阿霉素的体外累积释放结果见图4。从图4中可以看出，在pH为5.7和pH为7.4的释放环境中，负载的药物阿霉素的累积释放率最终分别达到43％和25％左右，并且在前8h内，两个释放体系都没有出现暴释的现象，两个释放体系相比，在pH为7.4的条件下，阿霉素释放的速率更加缓慢。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)壳聚糖疏水改性：将壳聚糖溶于1％(v/v)醋酸水溶液中，得到壳聚糖醋酸溶液；将脱氧胆酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺加入甲醇中活化半小时，得到混合液；然后将混合液滴加到壳聚糖醋酸溶液中，25℃磁力搅拌48～72h，纯化后得到共聚物壳聚糖-脱氧胆酸；壳聚糖和脱氧胆酸的摩尔比为1:40～1:162；
(2)聚乙二醇修饰壳聚糖-脱氧胆酸：将步骤(1)制备的壳聚糖-脱氧胆酸和聚乙二醇溶于30～50ml1％醋酸溶液中，室温搅拌15～30min后加入甲醛，室温反应1～6h，纯化后得到壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇聚合物；聚乙二醇与壳聚糖-脱氧胆酸的质量比为12:1～20：1，甲醛和壳聚糖-脱氧胆酸的质量比为1:2～1:4；
(3)接枝聚合物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇的靶向修饰：将叶酸和步骤(2)制备的壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇按质量比1:1～2:1于35～40℃水浴中避光反应16～24h，纯化后得到接枝共聚物载体壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸；
(4)抗肿瘤纳米药物载体的制备：将步骤(3)制备的接枝共聚物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸溶于醋酸溶液中，得到混合液，每毫升醋酸溶解接枝共聚物壳聚糖-脱氧胆酸-聚乙二醇-叶酸1～2mg；将混合液置于透析袋中透析后，将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到抗肿瘤纳米药物载体。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的壳聚糖的分子量为50000。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于：所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与脱氧胆酸的摩尔比为2:1，所述的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为3:1。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇；所述的室温反应在二甲基亚砜中进行。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的避光反应在催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺中进行；所述的叶酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的质量比为1:1。
6.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的透析按照以下方法进行：先用生理盐水透析24h，然后用双蒸水透析24h，其中前3h每1h换一次双蒸水，以后每3h换一次双蒸水。
7.根据权利要求1所述的抗肿瘤纳米药物载体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的冷冻干燥按照以下方法进行：在-10～-20℃冷冻过夜后置于冻干机中冻干12～24h。
8.一种抗肿瘤纳米药物载体，由权利要求1～7任一项所述的制备方法得到。
9.权利要求8所述的抗肿瘤纳米药物载体在制备化疗药物中的应用。
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