CN114504565B

CN114504565B - 肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒及其制备方法

Info

Publication number: CN114504565B
Application number: CN202210254701.2A
Authority: CN
Inventors: 宋晓丽; 吴嘉敏; 陈露; 张树伟; 顾军; 闫彩凤
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2042-03-15
Also published as: CN114504565A

Abstract

本发明公开了一种肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒及其制备方法。所述方法先利用脱氧胆酸对壳聚糖进行改性，然后用聚乙二醇进行亲水改性，再对壳聚糖进行叶酸修饰，最后用N‑乙酰‑L‑半胱氨酸修饰壳聚糖，提供巯基，As₂O₃与巯基通过AS^Ⅲ‑S的形式负载到壳聚糖上。本发明的以As^Ⅲ‑S稳定三价砷的同时通过自组装形成载砷量可调控的纳米载药体系，可在肿瘤高GSH环境下释放活性砷化物，提高药物利用度的同时降低其副作用。

Description

肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米药物载体技术领域，涉及一种肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

As₂O₃对肝癌具有较好的临床治疗效果，已被国家食品药品监督管理局正式批准用于肝癌治疗。然而，由于砷具有高的全身毒性、较差的药代动力学，以及网状内皮系统能迅速将As₂O₃及其产物从血液中清除，因此目前的研究主要通过设计、制备纳米药物载体达到包封、靶向等作用，从而降低其毒副作用，提高抗癌生物利用度。

纳米药物载体具有提高生物利用率、提高疏水性药物溶解性、延长药物的清除半衰期、提高有效血药浓度时间和实现靶向给药的优点。目前报道的脂质体和聚合物纳米胶束等纳米药物载体，可提高As₂O₃的抗癌活性和治疗效果。但脂质体不稳定，储存过程中脂膜易破裂，导致药物泄露，且脂质体包封率较低，控释效果不理想。近年来，聚合物因其易加工、易修饰等特性，成为化疗药物的重要载体材料。其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物，被广泛用于生物医学领域，但其制备方法影响因素多，过程繁琐，不利于载药体系的可控、稳定制备。此外目前的纳米药物载体均以物理包埋的形式负载As₂O₃，不能准确控制砷的含量和释放行为。

研究表明血液循环系统与肿瘤细胞质之间存在着显著的氧化还原电位差异，正常组织和体液的细胞外基质中谷胱甘肽(GSH)的浓度约为2-20μM，而肿瘤细胞中GSH的浓度约为2-10mM，核内体中GSH的浓度甚至高达20mM。As与巯基可以形成As^Ⅲ-S，研究发现As^Ⅲ-S在低GSH浓度下稳定存在，而在高GSH浓度下As^Ⅲ-S断裂，释放砷，因此可以利用As^Ⅲ-S具有GSH响应性，实现砷负载和砷释放，减少砷对正常细胞的毒害作用。Yongbo Peng等人以人血清白蛋白为载体，成功地基于砷硫键负载ATO，该体系在酸性环境和GSH存在下可控释放ATO，提高了ATO在治疗慢性髓系白血病中的抗癌作用。然而，人血清白蛋白只含有一个巯基和17对二硫键，且每个人血清白蛋白只能负载3.8个ATO，载药量相对较低，不利于砷含量的调控([1]Peng Y,Zhao Z, Teng L.Smart human serum albumin-As₂O₃ nanodrugwith self-amplified folate receptor-targeting ability for chronic myeloidleukemia treatment[J].Angew Chem Int Ed Engl,2017,56(36):10845.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒及其制备方法。本发明的载砷纳米颗粒的载砷量可调控，且可防止砷泄露，能够在高谷胱甘肽环境下释放砷，具有肝癌细胞靶向性，有效提高药物的生物利用度。

实现本发明目的的技术方案如下：

肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)脱氧胆酸(DCA)接枝修饰壳聚糖(CS)，得到脱氧胆酸修饰的壳聚糖(CS-DCA)；

(2)聚乙二醇(PEG)与脱氧胆酸修饰的改性壳聚糖反应，得到两亲性壳聚糖衍生物(DCA-CS-PEG)；

(3)两亲性壳聚糖衍生物进行叶酸(FA)修饰，得到叶酸修饰的壳聚糖衍生物(DCA-CS-PEG-FA)；

(4)N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)接枝修饰叶酸修饰的壳聚糖衍生物，得到N-乙酰 -L-半胱氨酸修饰的壳聚糖衍生物(DCA-CS-PEG-FA-NAC)；

(5)三氧化二砷(ATO)通过As^Ⅲ-S接枝修饰N-乙酰-L-半胱氨酸修饰的壳聚糖衍生物，得到肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒(DCA-CS-PEG-FA-NAC-ATO)。

本发明中，步骤(1)的具体步骤如下：在脱氧胆酸的甲醇溶液中依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，活化羧基，将活化后的脱氧胆酸的甲醇溶液滴加到壳聚糖的乙酸溶液中，室温下搅拌反应18～24h，反应产物用NaOH的甲醇溶液沉降后，离心分离沉淀，依次用甲醇、乙醇和水洗涤5次以上，透析，最后冷冻干燥，得到CS-DCA。

优选地，步骤(1)中，透析时间为2d。

优选地，步骤(1)中，每100个壳聚糖结构单元修饰10～40个脱氧胆酸分子。

本发明中，步骤(2)的具体步骤如下：在聚乙二醇的水溶液中加入EDC、NHS，活化后将其滴加到CS-DCA的乙酸溶液中，室温下搅拌反应22～26h，反应产物，冷冻干燥得到DCA-CS-PEG。

优选地，步骤(2)中，聚乙二醇与脱氧胆酸摩尔比为1:1。

优选地，步骤(2)中，透析时间为2～4d。

本发明中，步骤(3)的具体步骤如下：将叶酸、EDC、NHS溶解在无水二甲基亚砜(DMSO)中，活化羧基后，滴加到DCA-CS-PEG的乙酸溶液中，调节pH＝4～6，黑暗中搅拌反应16～20h，调节溶液pH＝9，产物先在PBS中透析，再在去离子水中透析，冷冻干燥得到DCA-CS-PEG-FA。

优选地，步骤(3)中，PBS中的透析时间为3d，去离子水中的透析时间为1d。

本发明中，步骤(4)的具体步骤如下：将N-乙酰-L-半胱氨酸、EDC、1-羟基苯并三唑(HOBt)溶解在无水DMSO中，然后滴加到DCA-CS-PEG-FA的乙酸溶液中，调节溶液pH＝4～5，在黑暗中反应18～22h，将产物在0.5mM HCl中透析2d，再在去离子水中透析3d，冷冻干燥得到DCA-CS-PEG-FA-NAC。

优选地，步骤(4)中，N-乙酰-L-半胱氨酸与壳聚糖的质量比为0.25:1。

优选地，步骤(4)中，0.5mM HCl中的透析时间为2d，去离子水中透析时间为 3d。

本发明中，步骤(5)的具体步骤如下：于35～38℃下，在DCA-CS-PEG-FA-NAC 的乙酸溶液中加入谷胱甘肽(GSH)，使分子内二硫键断裂，然后搅拌下加入三氧化二砷(ATO)溶液，调节溶液pH至5～6，超声5～8min，室温下搅拌反应120～180min后，在4℃下PBS中透析，将透析液用0.45μm滤头过滤，得到DCA-CS-PEG-FA-NAC-ATO。

优选地，步骤(5)中，谷胱甘肽的浓度为60mM，谷胱甘肽的处理时间为1～2h。

优选地，步骤(5)中，三氧化二砷溶液的浓度为5mg/mL，pH为5～6。

优选地，步骤(5)中，透析时间为24h以上。

优选地，步骤(1)、(2)、(3)、(4)或(5)中的乙酸溶液，乙酸的体积含量为2％。

优选地，步骤(3)、(4)或(5)中，采用0.1M NaOH调节溶液pH。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)采用脱氧胆酸和聚乙二醇修饰壳聚糖，得到两亲性壳聚糖衍生物。脱氧胆酸的引入能够增强壳聚糖的疏水性，提高壳聚糖的自组装能力；聚乙二醇具有“隐身衣”的作用，其优良的亲水性和延展性可以减少纳米颗粒与血蛋白的相互作用，降低吞噬细胞的作用，增强纳米颗粒的血液循环时间。两亲性修饰使壳聚糖纳米颗粒有较小的粒径、较好的均一性以及稳定性。

(2)采用N-乙酰-L-半胱氨酸接枝壳聚糖，NAC是一种带有游离巯基的小分子，可以破坏粘液屏障，赋予壳聚糖巯基，通过调控巯基的含量调控砷含量，此外砷通过 As^Ⅲ-S的形式负载到智能壳聚糖纳米颗粒上，可有效防止砷泄露，同时使砷能在癌细胞高GSH环境下释放，而在正常细胞低GSH环境下较少释放，叶酸的靶向性和砷的GSH 响应释放进一步减少了砷对正常组织的毒害作用。

附图说明

表1为壳聚糖衍生物的DCA取代度和总取代度(DS％)；

表2为壳聚糖衍生物的巯基、S＝S含量及载药量；

表3为壳聚糖衍生物的粒径、PDI和Zeta电位；

表4为壳聚糖载砷纳米颗粒处理细胞72h的IC₅₀；

表5为砷在培养液、细胞内、蛋白质中的分布情况；

图1为CS-DCA的红外谱图；

图2为DCA-CS-PEG的红外谱图；

图3为DCA-CS-PEG-FA和DCA-CS-PEG-FA-NAC的红外图谱

图4为不同DCA取代度CS-DCA的临界聚集浓度，a)CS-DCA_5.2，b)CS-DCA_8.1， c)CS-DCA_10.7，d)CS-DCA_9.1；

图5为DCA-CS-PEG的TEM图，a)PEG:DCA＝1:2，b)PEG:DCA＝1:1，c) PEG:DCA＝2:1；

图6为智能壳聚糖载砷纳米颗粒体外砷释放曲线，a) DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_5.6-ATO，b)DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_14.1-ATO，c) DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_20.2-ATO，d)DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_11.4-ATO；

图7为DCA-CS-PEG-FA-NAC-ATO的TEM图像；

图8为DCA-CS-PEG-FA-NAC-ATO的体外悬浮稳定性；

图9为空载智能壳聚糖纳米颗粒的生物相容性，a)DCA_10.7-CS-PEG-FA，b) DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_14.1，c)DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_20.2；

图10为智能壳聚糖载砷纳米颗粒对HepG2细胞的细胞毒性，a)ATO，b) DCA_10.7-CS-PEG-FA-ATO，c)DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_14.1-ATO，d) DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_20.2-ATO；

图11为智能壳聚糖载砷纳米颗粒处理293T细胞不同时间的细胞毒性，a)24h，b)48h，c)72h；

图12为HepG2细胞与智能壳聚糖载砷纳米颗粒孵育24h后的摄取情况；

图13为HepG2细胞凋亡散点图：a)空白对照组；b)ATO；c) DCA_10.7-CS-PEG-FA-ATO；d)DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_14.1-ATO；e) DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_20.2-ATO。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例，对本发明作进一步详述。

下述实施例中，采用的试剂包括：壳聚糖(CS，Mw＝100kDa)；聚乙二醇(PEG，Mw＝2000Da)；脱氧胆酸(DCA)；叶酸(FA)；N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)；As₂O₃； EDC；NHS；HOBt；甲醇；乙醇；DMSO；乙酸；异硫氰酸荧光素(FITC)。

实施例1

1.制备CS-DCA

200mg CS溶解到10mL 2％(v/v)乙酸中，41mg DCA溶解到10mL甲醇中，然后依次加入40mg EDC和24mg NHS，超声15min，活化羧基。将活化后的DCA甲醇溶液滴加到CS溶液中，在室温下搅拌反应24h。反应产物用NaOH/甲醇溶液(pH＝9)沉降后离心分离沉淀，然后用甲醇、乙醇和水至少洗涤5次后用分子量为14000的透析袋在去离子水中透析2d，最后对产物进行冷冻干燥，得到CS-DCA。

2.制备DCA-CS-PEG

取PEG(摩尔比PEG:DCA＝1:1)溶解到去离子水中，逐步加入EDC和NHS(EDC 与氨基的摩尔比为1:1；EDC与NHS摩尔比为1:1)，溶解后将其滴加到CS-DCA乙酸溶液(150mg CS-DCA溶解到30mL 2％(v/v)乙酸)中，室温下搅拌反应24h，反应产物用分子量为14000的透析袋在去离子水中透析2-4d，然后冷冻干燥得到DCA-CS-PEG。

3.FA接枝DCA-CS-PEG

将20mg FA、18mg EDC、10mg NHS溶解到5mL无水DMSO中，羧基活化后滴加到500mgDCA-CS-PEG的乙酸溶液中，用0.1M NaOH调节pH＝4-6，黑暗中搅拌反应 16h，加入0.1MNaOH调节溶液pH＝9，离心得到产物沉淀。然后将产物用分子量为14000 的透析袋在PBS中透析3d，再用去离子水透析1d，冷冻干燥得到DCA-CS-PEG-FA。

4.用NAC修饰DCA-CS-PEG-FA

1g DCA-CS-PEG-FA溶解到25mL 2％乙酸中，150mg NAC、310mg EDC和68mg HOBt溶解到无水DMSO中，然后滴加到DCA-CS-PEG-FA乙酸溶液中，用0.1M NaOH 调节pH＝4-5，在黑暗中反应18h后将产物用分子量为14000的透析袋在0.5mM HCl中透析2d，再用去离子水透析3d，冷冻干燥得到壳聚糖衍生物DCA-CS-PEG-FA-NAC，并在4℃下保存备用。

5.制备智能壳聚糖载砷纳米颗粒的制备方法，包括：

在35℃下，用GSH(60mM)处理DCA-CS-PEG-FA-NAC(2mg/mL)1h，使分子内二硫键断裂，其中GSH与S＝S摩尔比为1:1。然后在磁力搅拌下加入ATO溶液(5mg/mL， pH5-6，ATO与-SH摩尔比为1:1)，用0.1M NaOH调节溶液pH至5-6，超声5-8min，室温搅拌反应150min后，在4℃下用分子量为3500的透析袋在PBS中透析24h，将所得透析液用0.45μm滤头过滤，得到DCA-CS-PEG-FA-NAC-ATO，在4℃中保存备用。

实施例2-实施例4

实施例2-实施例4的制备方法同实施例1，区别仅在于步骤2中PEG与DCA的摩尔比分别为1:2、1:3、2:1，其余与实施例1完全一致。根据表1壳聚糖衍生物总取代度可知PEG的取代度，根据图3的TEM图和表3的粒径和多分散性指数的结果可知，当摩尔比为1:1时可以获得形貌良好，粒径均一、分散性好的自组装纳米颗粒。

表1

实施例5

实施例5的制备方法同实施例1，区别仅在于步骤4中NAC的使用量为200mg，具体为：用NAC修饰DCA-CS-PEG-FA：1g DCA-CS-PEG-FA溶解到25mL 2％乙酸中， 200mg NAC、413mg EDC和91mg HOBt溶解到无水DMSO中，然后滴加到 DCA-CS-PEG-FA乙酸溶液中，用0.1M NaOH调节pH＝4-5，在黑暗中反应18h后将产物用分子量为14000的透析袋在0.5mMHCl中透析2d，再用去离子水透析3d，冷冻干燥得到壳聚糖衍生物DCA-CS-PEG-FA-NAC，并在4℃下保存备用。其余与实施例1完全一致。

实施例6

实施例6的制备方法同实施例1，区别仅在于步骤4中NAC的使用量为250mg，具体为：：1g DCA-CS-PEG-FA溶解到25mL 2％乙酸中，250mg NAC、517mg EDC和 113mg HOBt溶解到无水DMSO中，然后滴加到DCA-CS-PEG-FA乙酸溶液中，用0.1M NaOH调节pH＝4-5，在黑暗中反应18h后将产物用分子量为14000的透析袋在0.5mM HCl中透析2d，再用去离子水透析3d，冷冻干燥得到壳聚糖衍生物 DCA-CS-PEG-FA-NAC，并在4℃下保存备用。其余与实施例1完全一致。

实施例7

实施例7的制备方法同实施例1，区别仅在于步骤4中NAC的使用量为300mg，具体为：：1g DCA-CS-PEG-FA溶解到25mL 2％乙酸中，300mg NAC、620mg EDC和 136mg HOBt溶解到无水DMSO中，然后滴加到DCA-CS-PEG-FA乙酸溶液中，用0.1M NaOH调节pH＝4-5，在黑暗中反应18h后将产物用分子量为14000的透析袋在0.5mM HCl中透析2d，再用去离子水透析3d，冷冻干燥得到壳聚糖衍生物 DCA-CS-PEG-FA-NAC，并在4℃下保存备用。其余与实施例1完全一致。

结合表2壳聚糖衍生物的巯基含量及智能壳聚糖纳米颗粒的载药量结果可知，当巯基含量越高，载砷量越高，说明可以通过调控投入NAC的量调控巯基的含量，从而调控砷负载量。

表2

实施例8-实施例10

实施例2-实施例4的制备方法同实施例1，区别仅在于步骤1中DCA的投入量分别为82、123、164mg，使得每100个壳聚糖结构单元分别修饰20、30、40个脱氧胆酸分子，其余与实施例1完全一致。

对比例

参考文献[1]Yongbo Peng等人的工作使用的HSA分子上含有35个巯基，制备一个壳聚糖分子上含有36个巯基的壳聚糖衍生物，并研究了其载药量和体外药物控制释放情况。表2的数据显示，该壳聚糖衍生物的巯基含量为一个壳聚糖分子具有36个巯基，巯基取代度为6.5％，载药量为每个壳聚糖衍生物分子负载3.8个ATO分子。然而图4a的体外药物控制释放情况显示，该壳聚糖载砷纳米颗粒的砷释放没有GSH响应性，当体系为PBS时，药物释放约为80％，即使体系中GSH浓度增加，ATO释放几乎没有增加，说明ATO大部分都是通过物理作用负载到壳聚糖自组装纳米颗粒上。但是当巯基含量增加后，ATO负载量增加，且ATO释放具有GSH响应性，说明ATO大部分通过 As^Ⅲ-S负载到壳聚糖纳米颗粒上。

测试例

肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒的相关表征和性能测试例，取实施例1 的样品为例：

(1)采用型号为TENSOR27的傅立叶红外谱仪对壳聚糖衍生物进行了红外表征，如图1所示。

FT-IR被用来表征不同材料中的官能团。在EDC和NHS存在的情况下，DCA的羧基与CS的氨基反应形成酰胺键，并接枝到壳聚糖上。在FT-IR光谱中，1640cm^-1和 1550cm^-1处的特征吸收带，分别对应酰胺Ⅱ带的C＝O拉伸和酰胺I带的N-H弯曲振动。与CS的光谱相比，CS-DCA在1367cm^-1处出现了一个新的特征吸收峰，这是DCA的环己烷所致，表明DCA成功接枝到壳聚糖上。DCA-CS-PEG的FT-IR光谱中，1077cm^-1的醚键吸收峰和2878cm^-1的C-H弯曲振动峰均说明聚乙二醇的成功接枝。根据碳二亚胺原理，FA、NAC均与CS生成酰胺键，且红外光谱上C＝O峰变得尖锐，说明FA、 NAC与DCA-CS-PEG成功共轭。

(2)采用型号为Vario EL cube的元素分析仪对壳聚糖衍生物进行了元素分析，如表1所示。

采用元素分析仪测试材料的C、H、N含量，由于N含量不变，故可以根据C/N的变化计算壳聚糖衍生物的取代度。

CS-DCA上DCA的取代度计算公式如下：

以下是DCA-CS-PEG总取代度计算公式：

通过C/N的变化，可以计算出DCA对CS的取代度。如表1所示，随着DCA投入量增加，DCA的取代度从5.2％上升到10.7％，但当DCA与CS结构单位的比例增加到 40％，DCA的取代度为9.1％，不再增加。PEG修饰CS-DCA后总取代度大于DCA取代度，说明PEG与CS-DCA成功共轭，且随着PEG投入量增加，总取代度增加，说明共轭到CS-DCA上的PEG增多。

(3)用Ellman’s试剂分光光度法测定壳聚糖衍生物的巯基和二硫键含量，如表2所示。

将5mg DCA-CS-PEG-FA-NAC溶于5mL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0，含1mM EDTA) 中，取出2mL与1mL Ellman试剂(0.5mg/mL)和2mL磷酸盐缓冲液混合，混合溶液在黑暗中孵育2h，然后在412nm波长下测量吸光度。为了得到总巯基的含量，用NaBH₄打开二硫键。将1mLNaBH₄(4w/v％)加入3mL DCA-CS-PEG-FA-NAC溶液(1mg/mL) 中，在37℃振荡水浴中反应1h。然后用过量的0.1M HCl除去多余的NaBH₄，并调节混合物的pH至8.0。在测量之前，将混合物与Ellman试剂反应2h，然后测量吸光度。根据NAC的磷酸缓冲液(0.1M,pH8.0)标准曲线计算巯基的数量。根据NAC标准曲线 (Y＝9.517X-0.0076,R2＝0.9988)计算得到不同壳聚糖衍生物的巯基含量，如表2所示，随着NAC投入量增加，巯基含量增加，巯基取代度从11.4％上升到20.2％。此外，巯基含量的测定进一步表明NAC与DCA-CS-PEG-FA成功偶联。

(4)采用F4500型荧光光度计考察不同DCA取代度CS-DCA的自组装行为，如图2所示。

以芘为疏水探针，用荧光分光光度计测定了CS-DCA的临界聚集浓度(CMC)。简单地说，在一系列瓶子中加入50μL的丙酮溶液(6×10-5M)，挥发除去丙酮。然后将浓度为0.3×10^-3-1.0mg/mL的共轭悬液加入到不同瓶子中，芘的最终浓度为6×10^-7M。混合液在黑暗中震荡摇匀2h，使芘与纳米颗粒间平衡，然后在室温下过夜。用荧光分光光度计测定芘在340～450nm处的发射光谱。参数：激发波长为320nm，扫描速度为60nm/min，激发和发射狭缝分别设置为5.0nm和2.5nm。

胶束对芘有显著的增溶作用，当形成自聚集时，芘分子较好地位于胶束的疏水微域内部或附近。超过CMC后，溶液的增溶能力会发生突变，I1/I3随浓度变化曲线中突变的浓度为CMC。如图2所示，CS-DCA_5.2、CS-DCA_8.1、CS-DCA_10.7、CS-DCA_9.1的CMC 分别为0.046、0.032、0.024、0.028mg/mL，说明随着DCA取代度的增加，CMC降低。临界胶束浓度结果表明，疏水段越多，共聚物越容易在水中形成聚集体，表明DCA能增强CS的自组装能力。

(5)通过Tecnai-12透射电镜观察CS-DCA-PEG的形貌并且用动态光散射5022F 检测样品的粒径、多分散性指数及Zeta电位，如图3和表3所示。

为了获得更好的壳聚糖自组装纳米粒子，研究了不同摩尔比的DCA和PEG(2:1； 1:1；1:2)，进行TEM和DLS表征。TEM结果表明，当DCA:PEG＝2:1时，DCA-CS-PEG 没有自组装成球，趋于长条状，这可能是由于聚合物的形态随着疏水段的增加而增加，这种形态有利于增加比表面积，从而降低了界面自由能，使体系的能量降低。当 DCA:PEG＝1:1时，纳米颗粒分散良好，呈规则的球形；当DCA:PEG＝1:2时，纳米粒子可以自组装成球形粒子，但容易团聚在一起。从图5和表3可以看出，随着PEG含量的增加，粒径增大。当DCA:PEG＝1:1时，纳米颗粒的粒径约为59.6nm，且多分散性指数较小，粒径分布范围较窄。

表3

(6)体外药物释放研究

研究了肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒在不同浓度GSH(0、0.5、10mM)的PBS(pH7.4)中的砷释放行为，取一定量的DCA-CS-PEG-FA-NAC-ATO溶液放入透析袋(MWCO 3500Da)中，浸泡于20mL不同浓度GSH(0、0.5、10mM)的PBS中。在37℃、170rpm条件下振荡，在一定时间间隔内取出1mL培养基，并且加入等量的新鲜培养基。采用原子荧光光谱法测定壳聚糖载砷纳米颗粒的载砷量以及不同时间点的砷释放情况。

将As₂O₃通过As^Ⅲ-S负载在智能壳聚糖纳米粒上，其载砷量如表2所示。每个DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_14.1、DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_20.2、DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_11.4分别负载13.3、20、11.3个ATO分子，说明可以通过调控巯基的含量来调控载砷量，随着巯基含量的增加，载砷量也随之增加。As^Ⅲ-S键易受还原环境影响，因此研究了不同GSH浓度(0、0.5、10mM)的PBS中砷的释放情况，结果如图4所示。在PBS中， DCA-CS-PEF-FA-NAC-ATO的释放速度较慢，24h时，ATO的释放量仅为25％左右，当加入0.5mM GSH时，ATO的释放量略有增加，约为50％。当GSH浓度增加到5mM时， ATO的释放量可达96％。结果与As^Ⅲ-S键的还原响应一致。故本发明的肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒可在癌细胞高GSH浓度的环境下释放砷，而在正常组织低GSH浓度的环境下释放较少的砷，从而降低ATO对正常组织的毒性。

(7)观察壳聚糖载砷纳米颗粒DCA-CS-PEG-FA-NAC-ATO的形貌。

将1mg/mL DCA-CS-PEG-FA-NAC-ATO水溶液滴加到铜网上，红外灯下干燥2min 后用磷钨酸(PTA)负染，继续干燥之后进行观察。TEM图如图5所示，肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒能自组装成规则分散的球状。

(8)通过DLS检测壳聚糖载砷纳米颗粒DCA-CS-PEG-FA-NAC-ATO的体外悬浮稳定性。

将制备好的DCA-CS-PEG-FA-NAC-ATO PBS溶液放置于4℃冰箱中。每隔一天取出1mL样品，用DLS考察纳米粒的粒径以及分布系数PDI值的变化，研究纳米粒的体外悬浮稳定性。结果如图6所示，显示该载砷纳米颗粒的粒径和PDI在2周内变化不大，整体较为稳定。

(9)生物相容性和细胞毒性研究，结果如图7、图8、图9和表4所示。

将处于生长对数期的HepG2细胞经0.25％的胰酶消化，然后用含10％胎牛血清的DEME培养液制备出单细胞悬浮液，再以1×10⁴的孔密度接种到96孔培养板中，放置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。24h后取出培养板弃去培养液，然后每孔加入100μL 不同浓度的实验样品溶液以及100μL新鲜的培养液(设3个复孔)，然后在37℃，5％CO₂恒温培养箱中分别培养24、48、72h。到达预定的时间后，每孔加入10μL MTT溶液 (5mg/mL)，继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养液，然后每孔加入100μL DMSO，置摇床上低速震荡10min，然后在酶联免疫检测仪波长490nm处测吸光值。

细胞活性大于90％认为材料没有细胞毒性，如图7所示，本发明空载壳聚糖纳米颗粒对HepG2细胞没有细胞毒性。如图8所示，壳聚糖载砷纳米颗粒对HepG2细胞有较强的抑制作用，且随着作用时间的增长和浓度的增加，抑制作用增强。结果表明在相同的砷浓度和相同的处理时间下，智能壳聚糖载砷纳米颗粒对HepG2细胞的抑制作用比游离砷的抑制作用要强，这主要是因为壳聚糖载砷纳米颗粒的靶向性导致更多的砷作用于HepG2细胞；而通过As^Ⅲ-S负载的纳米颗粒比通过物理吸附负载的纳米颗粒对HepG2 细胞的毒性强，是因为As^Ⅲ-S减少了砷在培养液中的释放，FA的靶向作用和As^Ⅲ-S稳定负载砷共同提高了砷的药物利用度。此外研究了智能壳聚糖载砷纳米颗粒对293T细胞的细胞毒性，如图9，结果表明智能壳聚糖载砷纳米颗粒对293T细胞的毒性小于游离砷，主要是由于正常细胞的FA受体表达和GSH浓度都比癌细胞少得多。载砷纳米颗粒与细胞作用72h时，对于HepG2细胞，ATO、DCA_10.7-CS-PEG-FA-ATO、 DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_14.1-ATO、DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_20.2-ATO的IC₅₀分别是1.59、 1.1、0.95、0.88μg/mL，对于293T细胞，其IC₅₀分别是3.19、5.54、6.71、6.62μg/mL。结果显示对于HepG2细胞载砷纳米颗粒的IC₅₀小于游离砷，而对于293T细胞，结果相反，说明载砷纳米颗粒对癌细胞有较高的毒害作用，而对正常细胞的毒副作用较小。

表4

(10)细胞摄取及细胞内分布。

将HepG2细胞接种到24孔板中，在37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养24h。弃去培养液，每孔加入100μL FITC标记的壳聚糖载砷纳米颗粒以及1mL新鲜的培养液(设 3个复孔)，继续在37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养24h，然后用PBS洗涤细胞3-5次，去除未结合的药物，立即用倒置荧光显微镜观察细胞的吸收情况。如图10， DCA_10.7-CS-PEG-FA-ATO、DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_14.1-ATO、 DCA_10.7-CS-PEG-FA-NAC_20.2-ATO均可以观察到很强的绿色荧光，而DCA_10.7-CS-PEG-NAC_20.2-ATO只有微弱的绿色荧光，证明FA可以赋予纳米颗粒对靶向 HepG2细胞能力，从而提高砷的生物利用度。当往孔里加入1mM FA时，在显微镜下几乎看不到绿色荧光，进一步证明了FA的靶向作用。

(11)细胞、细胞培养基和细胞外纳米药物中砷的定量分析。

将HepG2细胞接种到24孔板中，在37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养24h。弃去培养液，每孔加入100μL壳聚糖载砷纳米颗粒以及1mL新鲜的培养液(设3个复孔)，继续在37℃，5％CO₂恒温培养箱中分别培养6h和24h。在预定时间离心(900rpm，5min) 收集细胞培养液，细胞用PBS洗涤后，用0.25胰酶分离贴壁细胞，离心(900rpm，5min) 收集细胞和蛋白质(上清液)。收集的样品用1mL 10％硝酸消化后，用AFS测砷量。表 5显示，与ATO孵育6或24h相比，壳聚糖载砷纳米颗粒可使HepG2细胞中砷积累更多，细胞培养基中游离砷含量更少。结果还表明，细胞内砷的积累与药物的培养时间密切相关。这些数据表明，壳聚糖载砷纳米颗粒可以促进砷在细胞内的积累，同时减少细胞外的残留。

表5

(12)Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡。

HepG2细胞接种到12孔板的中，培养24h后继续与智能多功能壳聚糖载砷纳米颗粒(3μg/mL砷当量)孵育48h。收集细胞，用Annexin V-FITC与PI染色细胞，同时分别设置Annexin V-FITC与PI单染色组调节补偿，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果如图11所示，显示HepG2细胞的凋亡率可达75％，说明纳米颗粒有很强的诱导 HepG2细胞凋亡能力。

Claims

1.肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），在脱氧胆酸的甲醇溶液中依次加入EDC、NHS，活化羧基，将活化后的脱氧胆酸的甲醇溶液滴加到壳聚糖的乙酸溶液中，室温下搅拌反应18~24h，反应产物用NaOH的甲醇溶液沉降后，离心分离沉淀，依次用甲醇、乙醇和水洗涤5次以上，透析，最后冷冻干燥，得到脱氧胆酸修饰的壳聚糖，每100个壳聚糖结构单元修饰10~40个脱氧胆酸分子；

步骤（2），在聚乙二醇的水溶液中加入EDC、NHS，活化后将其滴加到脱氧胆酸修饰的壳聚糖的乙酸溶液中，室温下搅拌反应22~26h，反应产物，冷冻干燥得到两亲性壳聚糖衍生物DCA-CS-PEG，聚乙二醇与脱氧胆酸摩尔比为1:1；

步骤（3），将叶酸、EDC、NHS溶解在无水DMSO中，活化羧基后，滴加到DCA-CS-PEG的乙酸溶液中，调节pH=4~6，黑暗中搅拌反应16~20h，调节溶液pH=9，产物先在PBS中透析，再在去离子水中透析，冷冻干燥得到叶酸修饰的壳聚糖衍生物DCA-CS-PEG-FA；

步骤（4），将N-乙酰-L-半胱氨酸、EDC、HOBt溶解在无水DMSO中，然后滴加到DCA-CS-PEG-FA的乙酸溶液中，调节溶液pH=4~5，在黑暗中反应18~22h，将产物在0.5 mM HCl中透析2d，再在去离子水中透析3d，冷冻干燥得到N-乙酰-L-半胱氨酸修饰的壳聚糖衍生物DCA-CS-PEG-FA-NAC，N-乙酰-L-半胱氨酸与壳聚糖的质量比为0.15~0.3:1；

步骤（5），于35~38℃下，在DCA-CS-PEG-FA-NAC的乙酸溶液中加入谷胱甘肽，使分子内二硫键断裂，然后搅拌下加入三氧化二砷溶液，调节溶液pH至5~6，超声5~8min，室温下搅拌反应120~180min后，在4℃下PBS中透析，将透析液用0.45μm滤头过滤，得到智能壳聚糖载砷纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，透析时间为2d。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，PBS中的透析时间为3d，去离子水中的透析时间为1d。

4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，0.5 mM HCl中的透析时间为2d，去离子水中透析时间为3d。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，谷胱甘肽的浓度为60mM，谷胱甘肽的处理时间为1~2h；三氧化二砷溶液的浓度为5mg/mL，pH为5~6；透析时间为24h以上。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）、（2）、（3）、（4）或（5）中的乙酸溶液，乙酸的体积含量为2%。

7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）、（4）或（5）中，采用0.1MNaOH调节溶液pH。

8.权利要求1至7任一所述的制备方法制得的智能壳聚糖载砷纳米颗粒。

9.权利要求8所述的智能壳聚糖载砷纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。