KR20130024254A - 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 이용한 나노입자 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 1 내지 10 KDa의 키토산에 폴리에틸렌 글리콜과 소수성 담즙산이 결합되어 수중에서 자기 집합체(self-aggregation)를 형성하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체, 상기 복합체 내부에 소수성 약물이 봉입된 나노입자, 그 나노입자를 포함하는 주사제 및 그 나노입자의 제조방법을 제공한다.
Description
본 발명은 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 이용한 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 키토산에 친수성기로서 폴리에틸렌 글리콜(poly(ethylene glycol))과 소수성기로서 담즙산을 도입하여 제조된 복합체의 내부에 약물을 봉입시킴으로써 높은 효율로 약물을 봉입시킬 수 있으며, 독성이 감소되고, 멸균 여과가 용이하며, 또한, 혈액 내 순환시간을 연장시키며, 암세포에 대한 약물 축적 효과가 우수한 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
양친성 고분자는 친수성과 소수성 구획을 동시에 가지므로 수용액 상에서 계면 에너지의 안정화를 위해 자가집합체(self-aggregate) 또는 미셀(micelle)을 형성하게 된다. 양친성 고분자에 의해 형성된 자가집합체 또는 미셀은 친수성 및 소수성의 정도에 따라 입자의 크기, 분포, 유동학적 성질 및 열역학적 안정성 등이 다르게 나타나는 것으로 알려져 있다. 또한, 이러한 자가집합체 내부의 소수성 영역에 여러 가지의 소수성 약물을 봉입하여 표적세포에 대한 약물의 선택적 및 효과적인 전달을 유도할 수 있다고 보고되어 있다(Adv. Drug, Deliv. Rev. 2001. 47, 113-131).
이와 같은 자가집합체 내부에 소수성 약물을 봉입하여 제조된 나노입자는 체내의 순환 시간을 연장시키고, 약물 방출을 조절할 뿐 아니라 암조직 주변의 느슨해진 혈관벽의 높은 투과성으로 인하여 증가된 침투성 및 체류성(Enhanced Permeation and Retention; EPR) 효과에 의해 암조직에 특이적으로 축적되는 성질을 나타낸다. 따라서, 정상세포에의 독성을 현저히 줄이고, 장기간 약물이 지속적으로 방출되도록 하여 약효는 증가시킬 수 있다.
양친성 고분자로 자가집합체를 이루면서 고효율로 약물을 봉입하기 위해서는 수용액상에 친수성과 소수성 구획의 적절한 균형을 유지하는 것이 매우 중요하다. 양친성 고분자의 친수성 물질은 키토산(chitosan), 글리콜키토산(glycol chitosan), 덱스트란(dextran), 헤파린(heparin), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 또는 폴리아스파르트산(poly-aspartic acid)으로부터 선택되는 생체고분자; 또는 폴리(N-2-(하이드록시프로필)메타아크릴아마이드)(poly(N-2-(hydroxypropyl)methacrylamide) 또는 폴리(에틸렌글리콜)(poly(ethylene glycol))로부터 선택되는 합성고분자 등이다. 그리고, 소수성 물질은 담즙산(cholanic acid), 디옥시콜린산(deoxycholic acid), 리소콜린산(lithocholic acid), 타우로디옥시콜린산(taurodeoxycholic acid) 또는 타우로콜린산(taurocholic acid)으로부터 선택되는 담즙산 유도체; 또는 스테아린산(steric acid), 올레인산(olelic acid) 또는 콜레스테롤(cholesterol)로부터 선택되는 지방산 유도체이다.
키토산(chitosan; poly-b(1,4)-D-glucosamine)은 글루코사민(glucosamine)의 피라노스(pyranose) 단위체가 β-1,4 결합된 것으로서, 잔기가 5,000개 이상 결합된 분자량이 100만 이상이고 다가의 양이온을 가진 다당류(polysaccharide) 계열의 생체고분자 물질이며, 게, 새우와 같은 갑각류의 외피, 곤충의 외골격, 버섯이나 균류의 세포벽에 존재하는 키틴(chitin)을 염기성 조건에서 탈아세틸화하여 얻을 수 있다. 이러한 키토산은 생분해성, 무독성 및 생체적합성 등의 우수한 특성을 갖고있으며, 이러한 특성으로 인해 약물 전달체 또는 생체의료용 재료로서 많은 응용이 시도되고 있다. 특히, 수용액 하에서 양이온성을 띄므로 정전기적 결합에 의하여 장내 또는 구강, 비강 등의 기타 점액질 표면에 잘 부착되는 특성을 가지므로 약물의 체류시간을 증가시켜 약물의 흡수 촉진제로서 활발하게 연구되고 있다.
또한, 매 단위마다 한 개의 1차 아민기(-NH2)를 갖고 있기 때문에 화학적 수식이 용이하고, 음이온성을 띄는 유전자 물질과 복합체를 형성할 수 있어 이를 이용한 키토산이나 키토산 유도체의 유전자 전달체로서의 연구도 활발히 진행되고 있다. 기존의 약물 전달체로서의 키토산의 단점은 서로 이웃하는 분자가 강한 수소결합으로 견고하게 결합되어 물에 녹지 않는 불용성 물질이라는 점이었다. 그래서 이러한 키토산을 용해시키기 위해 젖산, 초산, 프로피온산, 포름산, 아스코르브산, 및 주석산을 포함하는 유기산 및 염산, 질산 및 황산으로 구성되는 무기산을 사용하였기 때문에 생체에 응용하는 데 제한이 있었다. 그러나, 최근에는 저분자량의 수용성 키토산 및 이를 가수분해하여 제조한 키토산 올리고당이 시판되어 물에 대한 용해도 문제가 해결되고 이를 약물 전달체로 이용하려는 시도가 많아지고 있다.
특히, 키토산을 약물 전달체로 이용하기 위해서는 고용량이 요구되는데, 약물의 유효 농도에 맞추어 제조하게 되면 용액의 점성이 높아져 주사제로서 이용하기 어려운 경우가 많다. 대한민국 등록특허 10-0762954는 '항암제가 봉입된, 소수성 담즙산이 결합된 키토산 올리고당 나노입자 및 그 제조방법'을 개시하고 있다. 상기 문헌에서는 평균 분자량 1.5 내지 9 KDa의 키토산에 소수성 담즙산이 0.1 내지 0.3 중량배로 결합된 친수성 키토산 올리고당 나노입자는 수계에서 자가응집형태를 형성하며 그 내부에 다양한 종류의 항암제를 포함할 수 있으나, 약물의 봉입률이 35 내지 75%로 높지 않고, 나노입자의 크기는 350 내지 450nm로 0.2μm 공극의 필터로 멸균 여과가 불가능하여 오토클레이빙과 같은 별도의 멸균방법이 필요하다는 문제점이 있다.
또한, 대한민국 등록특허 10-0761411은 '담즙산 키토산 복합체 내부에 소수성 항암제가 봉입된 제형 및 그의 제조방법'을 개시하고 있다. 이는 평균 분자량이 103 내지 106 Da인 친수성 키토산에 소수성 담즙산을 1 내지 70 중량부로 결합시킨 담즙산-키토산 복합체를 형성하는 기술이다. 이때 제조되는 키토산-담즙산 복합체는 약물을 비교적 다량으로 봉입할 수 있는 반면, 입자의 크기가 400㎚이상이 되어 EPR 효과 및 세포내 흡수(internalization) 효율이 낮아지고, 입자 분포도의 범위가 넓어지므로 재현성이 낮아지게 된다. 뿐만 아니라, 공업적 생산이 필요한 경우, 점도의 문제로 인해 제조 및 멸균여과 처리가 용이하지 못해 대량생산이 불가능한 단점이 있다. 이러한 고분자 키토산-담즙산 나노입자는 물에 대한 용해도가 떨어지는 문제점이 있어 상업적 이용에 상당히 제한적이다. 그리고, 키토산의 양이 증가하는 경우 나노 입자를 형성하기 위해서는 결합되는 담즙산의 양도 증가시켜야 하는데, 다량의 담즙산은 인체에 독성을 유발할 수 있으므로 유의하여야 한다.
이에, 본 발명자들은 상기 명시한 문제점들을 해결하기 위해 폴리에틸렌 글리콜, 키토산 및 소수성 담즙산을 사용하여 친수성 및 소수성을 갖는 양친성 복합체를 제조하고, 입자 내에 약물을 봉입시킴으로써 용해성이 개선되고, 독성이 감소하여 주사제로 상품화 가능한 나노입자 제형을 개발하였다. 나아가, 키토산에 폴리에틸렌 글리콜과 담즙산의 결합율을 최적 수준으로 조절한 결과, 약물 봉입 효율 및 약물 담지량 및 입자크기가 개선되었음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은, 페길화된 키토산-담즙산 복합체 및 상기 복합체에 약물이 봉입된 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 페길화된 키토산-담즙산 복합체 및 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 나노입자를 포함하는 주사제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 1 내지 10 KDa의 키토산에 친수성 폴리에틸렌 글리콜과 소수성 5-β-콜란산이 결합된 양친성 복합체로서, 수중에서 자가 집합체를 형성하는 약물 전달용 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 페길화된 키토산-담즙산 복합체 내부에 약물이 봉입된 나노입자를 제공한다. 보다 상세하게는, 상기 나노입자의 직경은 100 내지 300nm이고, 키토산 단량체에 대해 폴리에틸렌 글리콜은 1 내지 15의 치환도(%)로 결합되고, 소수성 5-β-콜란산은 1 내지 40의 치환도(%)로 결합되며, 상기 약물은 복합체 내부에 10 내지 40 중량%의 함량으로 봉입된다.
또한, 본 발명은
(a) 키토산을 수용액에 녹여 키토산 용액을 제조하는 단계;
(b) 폴리에틸렌 글리콜을 수용액에 녹여 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하는 단계;
(c) 상기 단계(a)의 키토산 용액에 상기 단계(b)의 폴리에틸렌 글리콜 용액을 첨가하여 폴리에틸렌 글리콜-키토산 복합체가 형성된 반응액을 제조하는 단계;
(d) 상기 반응액을 유기용매에 석출, 여과, 투석 및 건조하여 페길화된 키토산 복합체를 획득하는 단계;
(e) 상기 획득한 페길화된 키토산 복합체를 유기용매에 용해시키는 단계;
(f) 5-β-콜란산을 촉매제와 함께 유기용매에 용해시키고 반응시켜 담즙산 용액을 제조하여 담즙산을 활성화시키는 단계;
(g) 상기 단계(e)의 페길화된 키토산 복합체 용액에 상기 단계(f)의 활성화된 담즙산 용액을 첨가하고 반응시켜 페길화된 키토산-담즙산 복합체 용액을 제조하는 단계;
(h) 상기 반응액을 유기용매에 석출, 여과, 투석 및 건조하여 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 수득하는 단계; 및
(i) 상기 페길화된 키토산-담즙산 복합체 내부에 약물을 봉입하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 나노입자를 포함하는 주사제를 제공한다.
상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 내부에 소수성 약물이 봉입된 나노입자는 기존 약물 전달체에 비해 물에 대한 용해도가 우수하고, 고효율 및 고용량으로 약물을 봉입할 수 있다. 또한, 나노입자의 크기가 현저히 개선되어, 재현성이 있고 대량생산이 가능한 제조방법에 의해 개발될 수 있다. 이와 같이 제조된 페길화된 키토산-담즙산 복합체 나노입자는 독성이 적고, 생체 내에서 약물을 지속적으로 방출할 수 있으며, 입자크기가 200nm 이하이기 때문에 멸균 여과가 가능하여 주사제로서 상업화할 수 있으므로 암치료를 위한 새로운 약물 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 실험예 2에서 본 발명의 구현예에 따라 제조된 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 표면형태를 TEM(Transmission electron microscope)을 이용하여 측정한 사진이다.
도 2는 제조예 1 및 2에서 본 발명의 구현예에 따라 제조된 페길화된 키토산 복합체의 수소 핵자기 공명법(1H-NMR) 분석 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 1에서 본 발명의 구현예에 따라 제조된 5% 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 수소 핵자기 공명법(1H-NMR) 분석 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 1에서 본 발명의 구현예에 따라 제조된 10% 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 수소 핵자기 공명법(1H-NMR) 분석 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 4에서 본 발명의 구현예에 따라 제조된 도세탁셀이 봉입된 페길화된 키토산-담즙산 복합체 나노입자의 크기를 동적 광산란법(Dynamic light scattering method; DLS)을 이용하여 측정한 그래프이다.
도 2는 제조예 1 및 2에서 본 발명의 구현예에 따라 제조된 페길화된 키토산 복합체의 수소 핵자기 공명법(1H-NMR) 분석 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 1에서 본 발명의 구현예에 따라 제조된 5% 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 수소 핵자기 공명법(1H-NMR) 분석 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 1에서 본 발명의 구현예에 따라 제조된 10% 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 수소 핵자기 공명법(1H-NMR) 분석 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 4에서 본 발명의 구현예에 따라 제조된 도세탁셀이 봉입된 페길화된 키토산-담즙산 복합체 나노입자의 크기를 동적 광산란법(Dynamic light scattering method; DLS)을 이용하여 측정한 그래프이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 평균분자량 1 내지 10 KDa의 키토산에 폴리에틸렌 글리콜과 소수성 담즙산이 결합된 양친성 복합체로서, 수중에서 자가 집합체를 형성하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 제공한다.
본 발명에서는 종래 약물을 봉입한 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 자기집합에 의해 형성된 나노입자의 문제점을 극복하기 위해 연구한 결과, 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 제조시 1 내지 10 KDa의 저분자량 키토산을 사용하는 경우, 용해도가 증가하고 점성이 감소하여 주사용 제제로서의 사용 및 대량생산이 용이하고, 입자크기가 감소하여 암조직으로의 축적이 증가되며, 폴리에틸렌 글리콜의 접합률을 낮추더라도 양친성을 나타낸다는 것을 확인하였다. 담즙산 결합율을 낮추어 복합체를 제조하는 경우, 양친성을 나타내고 독성문제는 해소되는 반면, 약물 봉입효율과 나노입자의 안정성이 떨어지는 것을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 제조하는 경우 나노입자를 형성하기에 적합한 양친성 복합체를 제조하기 위해서 요구되는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 및 담즙산 결합율을 조절하는 것이 중요한 요소이다. 담즙산이 결합되지 않은 순수한 페길화된 키토산 복합체는 5% 및 10% 페길화된 키토산-담즙산 복합체에 비해 점성은 감소한 반면 수용해도는 300 mg/㎖ 이상으로 크게 증가하여(표 4), 주사제로서의 상품화 가능성을 확인하였다. 그러나, 상기 복합체에 도세탁셀을 봉입한 경우에는 나노입자가 형성되지 않았고, 약물이 봉입되지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 복합체에 담즙산을 결합시켜 소수성 핵 및 친수성 껍질의 구조를 갖는 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 제조하고, 약물(도세탁셀)을 봉입하여 나노입자를 제조하였다. 이때 도세탁셀의 봉입량은 나노입자의 크기 및 약물 사용량에 따라 달라지나, 본 발명의 특정한 실시예에서는 최대 약 25%의 약물 담지량을 보여 약물이 고효율 및 고용량으로 봉입된 것을 확인하였다. 상기와 같이 제조된 나노입자의 크기를 측정한 결과, 본 발명에 따른 페길화된 키토산-담즙산 복합체 나노입자의 평균 입경은 160 내지 260 nm의 범위에 분포하였으며(표 6), 이와 같은 입자크기의 감소는 나노입자의 제조 및 약효발현에 있어서의 재현성을 증가시키고, 암조직 및 염증조직 등에 대한 타겟팅 및 세포내 흡수 효율을 향상시키는 효과를 기대할 수 있다.
나노입자와 같은 미립자는 단일 약물 분자에 비해 크기가 크므로 생체 중에서 특이적인 분포 거동을 나타내며, 따라서 약물을 병소 부위로 표적화하기 위한 전달체로서 이용될 수 있다. 미립자의 분포를 좌우하는 가장 중요한 인자는 입자 크기에 따른 모세혈관벽 투과성으로, 이는 장기 또는 병소별로 모세혈관 성상이 다르다는 사실에 기인한다. 일반적으로, 직경 0.3 내지 3 ㎛인 입자의 경우 간장의 세망내피계 조직(RES)에 의해 탐식되거나 신장으로 여과되며, 직경 0.2 ㎛이하의 입자는 암 또는 염증 부위의 혈관으로 누출되므로, 입자 크기를 줄임으로써 암 또는 염증 조직으로의 선택적 축적 효과를 향상시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 페길화된 키토산-담즙산 복합체는 수용액 상태에서 용해도가 향상되고 점도가 감소하여 주사용 제제로서의 사용 및 대량생산이 가능하다, 또한, 키토산의 분자량 및 폴리에틸렌 글리콜과 소수성 담즙산의 농도에 따라 나노입자의 크기, 약물 봉입효율 및 봉입량의 조절이 가능하여, 소수성 약물을 용이하게 봉입하고 암조직 내 축적 및 흡수율을 증가시킬 수 있으므로 새로운 약물전달시스템으로 이용할 수 있다.
본 발명의 복합체에서 사용되는 키토산은 하기 화학식 1로 표시되는 단량체로 이루어진다.
전술된 바와 같이, 키토산은 천연에 존재하는 다당류 고분자 물질로서 최근에 천연 기능성 소재로 주목을 받고 있는 재료이다. 생체 내 효소에 의해 단량체인 글루코사민(glucosamine)으로 분해되는 생분해성 고분자이며, 매 고분자의 단위마다 한 개의 1차 아민기를 갖고 있어 화학적 수식이 용이한 장점을 갖는다. 또한, 양이온성 고분자로서 폴리(L-리신)(poly(L-lysine), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine) 등의 대표적 양이온성 고분자에 비해 매우 낮거나 무시할 수 있는 정도의 세포독성을 나타내므로, 본 발명에서 약물전달용 복합체의 재료로서 안전하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 복합체의 제조에 사용된 폴리에틸렌 글리콜은 HO-(-CH2CH2O-)n-H의 구조를 갖는 고분자 화합물로, 친수성이 강하기 때문에 의료용 고분자에 결합시켜 그 용해도를 증가시킬 수 있다. 또한, 적절하게 결합시키면 효소활성 및 수용체 결합과 같은 주요 생물학적 기능 등을 유지하면서, 결합된 고분자의 분자량을 증가시키는 것에 의해 신장여과를 감소시킬 수 있다. 이와 같이, 고분자에 결합가능한 PEG의 분자량 범위는 대략 1,000 내지 100,000 Da으로, PEG 분자량이 1,000 Da 이상일 경우에는 독성이 상당히 낮은 편으로 알려져 있다. 또한, 상기 PEG 또는 PEG 유도체는 직선형 또는 가지형에서 선택될 수 있으며, 가지의 형태는 2 이상의 다중 가지일 수 있다. PEG 유도체는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-석시니미딜 프로피오네이트(methoxy polyethylene glycol-succinimidyl), 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-N-하이드록시석시니미드(methoxy polyethylene glycol-N-hydroxysuccinimide), 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-알데하이드(methoxy polyethylene glycol-aldehyde) 및 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-석시니미딜 카보네이트(methoxy polyethylene glycol-succinimidyl carbonate) 및 다중 가지형 PEG 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 하기 화학식 2로 표시되는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-석시니미딜 카보네이트가 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서 소수성 담즙산은 친수성 키토산에 소수성을 부여하여, 수중에서 자가집합체를 형성할 수 있는 양친성 복합체를 제조하기 위해 사용된다. 소수성 담즙산은 콜란산(cholanic acid)을 기본 골격으로 갖는 1차, 2차 및 3차 담즙산 또는 그의 유도체를 포함할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 소수성 담즙산은 5-β-콜란산(5-β-cholanic acid), 콜린산(cholic acid), 케노데옥시콜린산(chenodeoxycholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid), 타우로콜린산(taurocholic acid), 데옥시콜린산(deoxycholic acid), 리소콜린산(lithocholic acid) 및 7-옥소-리소콜린산(7-oxo-lithocholic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 하기 화학식 3으로 표시되는 5-β-콜란산이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기 페길화된 키토산-담즙산 복합체 내부에 약물이 봉입된 나노입자이다. 상기 나노입자의 직경은 100 내지 300nm인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 100 내지 250nm, 가장 바람직하게는 100 내지 200nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 키토산 단량체에 대해 폴리에틸렌 글리콜은 1 내지 15의 치환도(%)로 결합될 수 있고, 소수성 담즙산은 1 내지 40의 치환도(%)로 결합될 수 있으며, 상기 약물은 복합체 내부에 10 내지 40 중량%의 함량으로 봉입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
키토산 단량체에 대해 폴리에틸렌 글리콜의 치환도가 상기 범위를 벗어나는 경우, 소수성 물질이 결합할 수 있는 부위가 적어지므로 소수성 담즙산의 치환도가 감소되어 결과적으로 약물 담지 효율이 저하되는 문제가 있다. 또한, 약물이 봉입된 경우에도 수용액 상에서의 재분산이 곤란한 문제가 있다.
수용액 상에서 안정적인 나노입자를 형성하기 위해서는, 키토산 단량체에 메톡시 폴리에틸렌 글리콜을 결합하는 정도에 따라 소수성 담즙산의 사용량을 달리하여야 한다. 그러나, 담즙산의 치환도가 40 %를 초과하는 경우, 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 수용해도가 매우 낮아지게 되어 주사제로 부적합하며, 치환도가 1% 미만인 경우에는 소수성 부분의 응집력이 적어 나노입자의 형성이 어려울 수 있다.
본 발명의 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 내부는 소수성 담즙산으로 이루어져 있으며, 담즙산의 일부 친수성 부분은 키토산과 결합된 상태이므로, 상기 복합체의 내부는 소수성이 매우 강하다. 따라서, 본 발명의 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 내부에는 소수성 약물이 봉입되기가 용이하며, 이는 복합체의 내부 물질과 약물이 모두 소수성을 나타내는 것에 기인한 물리적 포함이므로, 화학적 결합으로는 제한되어 있는 약물 함유량을 늘릴 수 있다.
상기 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 내부에 봉입되는 소수성 약물은, 수불용성 약물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 "소수성" 약물은 물과 혼화되지 않는 비극성 또는 저극성 물질에 한할 필요는 없으며, 본 발명에 따른 복합체 내부에 물리적으로 포함되어 담즙산으로 이루어진 소수성 내부 환경에서 안정하게 존재할 수 있는 물질을 모두 포함한다. 또한, 상기 "약물"은 치료 목적의 약물학적 활성제뿐만 아니라, 진단 등의 목적으로 인체에 투여될 수 있는 모든 시약 기타 의료용 제제를 포함할 수 있다. 상기 소수성 약물은 특별하게는, 항신생물제(antineoplastic), 마취제, 항염증제, 면역억제제 또는 호르몬일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 상기 소수성 약물은 항신생물제일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "항신생물제(antineoplastic)"는 종양성 질환의 치료, 개선, 또는 그 진행의 둔화를 위해 사용되는 모든 약학적 활성제를 지칭하는 광범위한 의미로 사용된다. 따라서, 통상적인 "항종양제" 또는 "항암제"의 개념을 포함하며, 이들과 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 항신생물제는 종양성 질환 치료에 일반적으로 사용되는 알킬화제, 항생제, 항대사제, 호르몬, 및 핵분열 저해제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들면, 본 발명의 나노입자에 봉입될 수 있는 항신생물제는 아드리아마이신(adriamycin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 악티노마이신(actinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 미토마이신(mitomycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 플루오로우라실(fluorouracil), 카르보플라틴(carboplatin), 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴(cisplatin), 시스플라틴 에토포사이드(cisplatin etiposide), 인터페론(interferon), 캄포테신(camptothecin) 및 그의 유도체, 파클리탁셀(paclitaxel) 및 그의 유도체, 탁소테레(Taxotere) 및 그의 유도체, 빈블라스틴(vinblastin), 빈크리스틴(vincristin), 타목시펜(tamoxifen), 에토포사이드(etoposide), 피포술판(piposulfan), 도세탁셀(docetaxel), 아나스테로졸(anasterozole), 글리벡(gleevec), 플록수리딘(floxuridine), 류프롤리드(leuprolide), 플루타미드(flutamide), 졸레드로네이트(zoledronate), 젬시타빈(gemcitabine), 스트렙토조신(streptozocin), 카보플라틴(carboplatin), 토포테칸(topotecan), 벨로테칸(Belotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(valrubicin), 레티노익산(retinoic acid) 계열, 메클로레타민(mechlorethamine), 클로람부실(chlorambucil), 부술판(busulfan), 독시플루리딘(Doxifluridine), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(testosterone), 미토산트론(mito-xantrone), 아스피린(Aspirin), 살리실레이트(Salicylate), 이부프로펜(Ibuprofen), 나프록센(naproxen), 페노프로펜(Fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenylbutazone), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 메클로에타민(mechloroethamine), 덱사메타손(Dexamethasone), 프레드니솔론(Prednisolone), 셀레콕시브(Celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메술리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 또는 코르티코스테로이드(corticosteroid)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 이용한 나노입자의 제조 방법을 제공한다:
(a) 키토산을 수용액에 녹여 키토산 용액을 제조하는 단계;
(b) 폴리에틸렌 글리콜을 수용액에 녹여 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하는 단계;
(c) 상기 단계(a)의 키토산 용액에 상기 단계(b)의 폴리에틸렌 글리콜 용액을 첨가하여 폴리에틸렌 글리콜-키토산 복합체가 형성된 반응액을 제조하는 단계;
(d) 상기 반응액을 유기용매에 석출, 여과, 투석 및 건조하여 페길화된 키토산 복합체를 획득하는 단계;
(e) 상기 획득한 페길화된 키토산 복합체를 유기용매에 용해시키는 단계;
(f) 5-β-콜란산을 촉매제와 함께 유기용매에 용해시키고 반응시켜 담즙산 용액을 제조하여 담즙산을 활성화시키는 단계;
(g) 상기 단계(e)의 페길화된 키토산 복합체 용액에 상기 단계(f)의 활성화된 담즙산 용액을 첨가하고 반응시켜 페길화된 키토산-담즙산 복합체 용액을 제조하는 단계;
(h) 상기 반응액을 유기용매에 석출, 여과, 투석 및 건조하여 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 수득하는 단계; 및
(i) 상기 페길화된 키토산-담즙산 복합체 내부에 약물을 봉입하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 단계 (a)에서 사용되는 키토산은 평균 분자량 1 내지 10 KDa이며, 바람직하게는 3 내지 5 KDa이다. 본 발명의 바람직한 구현에서는 탈아세틸화도가 80 내지 99%인 키토라이프(Kittolife, Korea)의 키토산올리고당을 구입하여 사용하였으며, 수용성 용액에 용해시켜 키토산 용액을 제조하였다. 상기 수용성 용액은 키토산을 녹일 수 있는 모든 수용성 용액이 가능하며, 바람직하게는 PBS 완충용액을 사용할 수 있다. 이때, 수용성 용액의 pH는 7.0 내지 9.0이 바람직하며, 보다 바람직하게는 pH 7.5 내지 8.5를 제조하여 사용할 수 있다.
상기 단계 (b)에서 사용되는 폴리에틸렌 글리콜은 HO-(-CH2CH2O-)n-H의 구조를 갖는 고분자 화합물이다. 본 발명의 바람직한 구현에서는 평균 분자량 2 KDa의 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-석시니미딜 카보네이트(mPEG-SC)로 시그마(sigma, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 유리 아민기를 갖는 키토산의 사슬에 친수성기로서 폴리에틸렌 글리콜을 결합시키고, 수용성 용액에 용해시켜 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하였다. 상기 수용성 용액은 키토산을 녹일 수 있는 모든 수용성 용액이 가능하며, 바람직하게는 PBS 완충용액을 사용할 수 있다. 이때 수용성 용액의 pH는 7.0 내지 9.0이 바람직하며, 보다 바람직하게는 pH 7.5 내지 8.5를 제조하여 사용할 수 있다.
상기 단계 (c)의 반응은 키토산 용액에 폴리에틸렌 글리콜 용액을 첨가하여 이를 교반하는 방법으로 수행될 수 있다. 키토산 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액의 혼합 후 반응시간은 24시간 내지 3일이 적당하며, 바람직하게는 혼합액을 24시간 교반하여 반응시킬 수 있다. 이때, 반응온도는 상온 내지 40℃ 범위일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 상온 내지 30℃에서 반응시키는 것이 적합하다.
상기 단계 (d)는 반응이 완료된 혼합액을 유기용매에 점적하면서 파우더 형태로 페길화된 키토산 복합체를 수득하고, 이 복합체를 투석 및 동결건조하는 추가적인 단계가 수반될 수 있다. 이때 상기 반응용액의 석출에 사용되는 유기 용매는 페길화된 키토산 복합체를 석출해 낼 수 있는 임의의 유기용매일 수 있으며, 예를 들면 아세톤, n-헥산, 이소프로필알콜, 이소프로필에테르, 및 디메틸에테르로부터 선택되는 단일용매 혹은 이들의 혼합용매가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 아세톤과 n-헥산을 2:1(v/v)로 혼합하여 사용할 수 있다. 이때, 석출 후 수득된 복합체는 동일한 석출 용매로 수 회 세척하고, 진공건조에 의해 파우더 형태로 건조될 수 있다. 이러한 석출법은 통상적으로 사용되는 투석 및 동결건조 방법에 비해 시간 및 비용을 절약할 수 있다는 장점이 있으나, 불순물 및 잔류용매를 제거하기 위해서는 투석(투석막 MWCO: 3500 Da)과 동결건조 과정을 통해 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-키토산 복합체를 획득하는 것이 바람직하다. 이때, 투석과정은 증류수에서 24시간 이상이 바람직하나 이에 제한되지 않으며, 증류수는 유기용매 제거를 위해 수회 교환해주는 것이 바람직하다.
상기 단계 (e)에서는 수득된 복합체를 유기용매에 용해시켜 페길화된 키토산 복합체 용액을 제조하는데, 이때 사용가능한 유기용매는 페길화된 키토산 복합체를 용해시킬 수 있는 모든 유기용매가 가능하다. 바람직하게는, 디메틸포름아마이드, 디메틸설폭사이드, 메탄올 등 물과 혼합이 가능한 용매가 적합하나 이에 제한되지 않으며, 보다 바람직하게는 디메틸설폭사이드를 사용할 수 있다. 또한, 페길화된 키토산에 결합되어 있을 수 있는 염산을 제거하여 반응을 용이하도록 하기 위해 염기를 부가할 수 있는데, 예를 들면, 트리에틸아민, 트리헥실아민, 트리에탄올아민 및 트리옥틸아민으로 구성되는 3차 아민군; 디시클로헥실아민, 디데실아민, 피페리딘 및 1-피페리딘 에탄올로 구성되는 2차 아민군; 1-헥사데실아민, 옥타데실아민 및 4-(2-아미노에틸)페놀로 구성되는 1차 아민군에서 선택된 화합물 등이 이용될 수 있다.
상기 단계 (f)의 반응은 소수성 담즙산을 유기용매에 용해시킨 후, 담즙산을 활성화시키기 위한 촉매제를 첨가하는 단계를 수반한다. 상기 소수성 담즙산은 5-β-콜란산, 콜린산, 케노데옥시콜린산, 글리콜콜린산, 타우로콜린산, 데옥시콜린산, 리소콜린산 및 7-옥소-리소콜린산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 담즙산이 바람직하며, 보다 바람직하게는 5-β-콜란산을 이용할 수 있다. 또한, 상기 촉매제로서 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 하이드록시벤조트리아졸(HoBt)을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 이때 EDC 및 HoBt는 담즙산의 카르복시기를 전환함으로써 페길화된 키토산의 아민기와 아미드 결합을 유도하는 역할을 한다. 상기 유기용매는 담즙산을 녹일 수 있는 모든 유기용매가 사용 가능하며, 바람직하게는 디메틸아세트아미드를 사용할 수 있다.
상기 단계 (g)의 반응은 활성화된 담즙산 용액을 페길화된 키토산 용액에 천천히 적가한 후 이를 교반하는 방법으로 수행될 수 있다. 페길화된 키토산 용액과 담즙산 용액의 혼합 후 반응시간은 24시간 내지 3일이 적당하며, 바람직하게는 반응액을 3일 동안 교반하여 반응시킬 수 있다. 반응온도는 상온 내지 40℃ 범위일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 상온 내지 30℃에서 반응시키는 것이 적합하며, 보다 바람직하게는 상온에서 반응시키는 것이 결합율을 높이는 것으로 나타났다.
상기 단계 (h)에서는 반응이 완료되어 페길화된 키토산-담즙산 복합체가 형성된 반응액을 유기용매 중에서 석출하여 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 수득한다. 상기 석출에 사용되는 유기용매는 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 석출해 낼 수 있는 임의의 유기 용매일 수 있으며, 예를 들면 아세톤, n-헥산, 이소프로필알콜, 이소프로필에테르, 및 디메틸에테르로부터 선택되는 단일용매 혹은 이들의 혼합용매가 이용될 수 있다. 석출 후 수득된 복합체는 동일한 석출 용매로 수 회 세척하고, 멤브레인 필터로 여과하여 진공건조에 의해 파우더 형태로 건조될 수 있다.
또한, 상기 복합체는 정제하는 추가적인 단계가 수반될 수 있다. 이는 반응액 중 발생하는 부가 생성물, 잔류용매 및 미반응 담즙산을 제거하여 의약품 기준 및 시험에 적합한 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 제조하기 위한 것이다. 상기 정제는 투석방법을 포함한, 통상적으로 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기의 페길화된 키토산-담즙산 복합체는 이를 증류수에 용해한 후, 투석(투석막 MWCO: 3500 Da)과 동결건조 과정을 통해 획득하는 것이 바람직하다. 이때 투석과정은 증류수에서 24시간 이상이 바람직하나 이에 제한되지 않으며, 증류수는 유기용매 제거를 위해 수회 교환해주는 것이 바람직하다.
상기 단계 (i)는 소수성 약물을 페길화된 키토산-답즙산 복합체에 봉입하는 단계로서, 상기 봉입방법은 약물의 종류 및 봉입량에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 대표적인 방법으로는 필름 수화법 (film hydration method), 용매증발법 (solvent evaporation method)이 있으며, 그 외에도 기중 현탁피복법(예를들면, Wurster 법 등), 계면중합법, 분무건조법, 상분리법 등의 방법이 이용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예에서, 봉입되는 약물이 도세탁셀인 경우, 필름 수화법을 이용할 수 있다. 이 경우 봉입 효율은 90% 이상이고 200㎚ 정도 크기의 나노 입자가 형성된다. 구체적으로, 유기용매에 항암제를 용해하고 페길화된 키토산-담즙산 복합체는 수용액에 녹여 서로 혼합한다. 이때 유기용매의 종류 및 수용액과의 혼합비는 나노입자의 크기 및 봉입효율을 조절하는 중요한 요소이다. 상기 항암제를 녹일 수 있는 유기용매는 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 디메틸클로로메탄, 디메틸포름아마이드, 디메틸설폭사이드로 및 이들의 혼합물부터 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 항암제 용액과 페길화된 키토산-담즙산 복합체 용액을 혼합후 증류농축장치(rotary evaporator)를 이용하여 용매를 증발시키면서 필름을 생성시킨다. 용매가 증발된 후, 생성된 필름에 증류수, 주사용수, 생리 식염수 등을 이용하여 필름을 완전히 수화시켜 나노입자를 형성한다.
본 발명의 또 다른 구체예로서, 소수성 약물은 용매 증발법에 의해 페길화된 키토산-담즙산 복합체에 봉입될 수 있다. 용매 증발법은 대량생산이 가능한 장점이 있지만 필름 수화법에 비해 약물 간 봉입 효율의 격차가 심하다. 구체적으로, 항암제는 유기용매에, 페길화된 키토산-담즙산 복합체는 수용액 상에 용해시키는데, 상기 유기용매는 수용액과 혼합되지 않고 에멀젼을 형성할 수 있는 것으로 선택한다. 예를 들면, 상기 유기용매는 디메틸클로로메탄 또는 클로로포름일 수 있다. 유기 용매와 수용액의 혼합 비율은 1:50 내지 1:1 범위일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:10인 경우 가장 봉입 효율이 우수하다.
본 발명의 추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 페길화된 키토산-담즙산 복합체 나노입자를 포함하는 주사제를 제공한다.
상기 약물이 봉입된 복합체를 포함하는 주사제는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 주사제 제조 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수 있으며, 투여시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 후 투여하는 형태일 수도 있다.
상기와 같은 본 발명의 주사제는 고분자량의 키토산을 사용하여 제조된 나노입자를 포함하는 주사제와는 달리, 나노입자의 수용해도가 향상되어 약물의 다양한 투여 용량에 적합한 농도로 제조될 수 있다. 또한, 저분자량의 키토산을 사용함으로써 점성이 현저히 저하되어, 주사제의 제조 및 여과와 같은 멸균 처리 과정의 효율을 향상시키며, 임상적 투여단계에서도 환자에게 보다 용이한 투여가 가능하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
Ⅰ.
페길화된
키토산 복합체의 제조
하기 표 1의 조성에 따라 키토산에 폴리에틸렌 글리콜을 결합시킨 페길화된 키토산 복합체를 제조하였다. 페길화된 키토산 복합체 제조에 사용된 메톡시 폴리에틸렌 글리콜-석시니미딜 카보네이트(methoxy poly(ethylene glycol)-succinimidyl carbonate; mPEG-SC)은 분자량 2KDa으로 IDB사(USA)에서 구입하였고, 키토산은 키토라이프(Kittolife co. Korea)의 평균 분자량 3 내지 5 KDa 키토산올리고당을 구입하여 사용하였다. 그 외에 실험에 사용된 용매인 아세톤, n-헥산 등은 일급 및 특급시약을 이용하여 정제 없이 사용하였다. 폴리에틸렌 글리콜 사용량은 중량 기준으로 측정하였다.
| 제조예 | 키토산 평균분자량( KDa ) | 키토산 단량체에 대한 mPEG 사용량(%) |
| 제조예 1 | 3-5 | 5 |
| 제조예 2 | 3-5 | 10 |
제조예
1: 5%
페길화된
키토산 복합체 제조
30 g의 키토산을 130 ㎖ PBS 완충용액에 첨가하고 교반하여 용해시켰다. 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 15 g을 80 ㎖ PBS 완충용액에 첨가하고 교반하여 용해시키고, 상기 용액에 점적하면서 교반시킨다. 이때 PBS 완충용액은 pH 8.0으로 맞추어 사용하였으며, 24시간동안 상온에서 반응시켰다.
반응이 완료된 혼합액을 석출용매에 점적하면서 파우더 형태로 페길화된 키토산 복합체를 수득하였다. 아세톤과 n-헥산을 2:1(v/v)로 혼합하여 석출용매로 사용하였으며, 석출용매에 반응액을 점적하면서 교반시킨 후, 석출용매와 동일한 용매로 3회 이상 세척하고 진공건조하였다. 진공건조 후 수득된 페길화된 키토산 복합체를 정제하였다. 200 ㎖ 증류수에 복합체를 녹인 후 24시간동안 투석(투석막 MWCO: 3500 Da)을 통하여 불순물 및 잔류용매를 제거하였다. 최종적으로 상기 용액의 동결건조를 통해 순수한 5% 페길화된 키토산 복합체를 획득하였다.
제조예
2: 10%
페길화된
키토산 복합체 제조
20 g의 키토산을 100 ㎖ PBS 완충용액에 첨가하고 교반하여 용해시켰다. 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 20 g을 110 ㎖ PBS 완충용액에 첨가하고 교반하여 용해시키고, 상기 용액에 점적하면서 교반시킨다. 이때 PBS 완충용액은 pH 8.0으로 맞추어 사용하였으며, 24시간동안 상온에서 반응시켰다. 이후 제조 단계는 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
Ⅱ.
페길화된
키토산-
담즙산
복합체 제조
표 2의 조성에 따라 상기 제조예 1 및 제조예 2 에서 얻은 페길화된 키토산에 담즙산을 결합시켜 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 제조하였으며, 이에 사용된 담즙산인 5-β-콜란산(5-β-cholanic acid; 5-β-CA) 및 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드(EDC), 하이드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole; HoBt), 테트라에틸아민(TEA) 등은 Sigma사(USA)에서 구입하여 사용하였다. 그 외에 실험에 사용된 용매인 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸아세트아미드(DMAc), 아세톤, n-헥산 등은 일급 및 특급시약을 이용하여 정제 없이 사용하였다.
| 제조예 | 키토산 단량체에 대한 mPEG 사용량(%) |
담즙산 사용량(%) |
| 제조예 3 | 5 | 20 |
| 제조예 4 | 10 | 20 |
| 제조예 5 | 5 | 40 |
| 제조예 6 | 10 | 40 |
제조예
3: 5%
페길화된
키토산-20%
담즙산
복합체 제조
4.8 g의 상기 5% 페길화된 키토산 복합체(제조예 1)를 20 ㎖ DMSO에서 첨가하고, TEA 0.29 g을 넣어 1시간동안 교반하여 용해시켰다. 페길화된 키토산-담즙산 복합체 제조는 5-β-콜란산의 카르복시산과 키토산의 1차 아민과의 반응을 통하여 이루어지는데, 이 반응효율을 증가시키기 위해 5-β-콜란산 내의 카르복시산을 HoBt를 이용하여 활성화한 후 반응에 사용하였다. 5-β-콜란산의 활성화 반응은 다음과 같이 수행하였다. 1.01 g의 5-β-콜란산을 20 ㎖ DMAc에 첨가하여 교반하여 용해시키고, 1.64 g의 EDC와 0.58 g의 HoBt를 상기 용액에 가하여 교반시켰다. 이 때 상기 촉매를 가한 후에는 1시간동안 교반하여 카르복시기를 활성화시켰다. 그런 다음, 상기 제조된 5-β-콜란산 용액을 페길화된 키토산 용액에 첨가한 후, 3일동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 혼합액을 석출용매에 점적하면서 파우더 형태로 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 수득하였다. 아세톤과 n-헥산을 1:1(v/v)로 혼합하여 석출용매로 사용하였으며, 석출용매에 반응액을 점적하면서 교반시킨 후 여과하는데, 이때 아세톤으로 3회 이상 세척하고 진공건조하였다. 진공건조 후 수득된 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 정제하였다. 200 ㎖ 증류수에 복합체를 녹인 후 24시간 이상 투석(투석막 MWCO: 3500 Da)을 통하여 불순물 및 잔류용매를 제거하였다. 최종적으로 상기 용액의 동결건조를 통해 5% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체를 획득하였다.
제조예
4: 10%
페길화된
키토산-20%
담즙산
복합체 제조
4.8 g의 상기 10% 페길화된 키토산 복합체(제조예 2)를 20 ㎖ DMSO에서 첨가하고, TEA 0.2 g을 넣어 1시간동안 교반하여 용해시켰다. 0.73 g의 5-β-콜란산을 20 ㎖ DMAc에 첨가하여 교반하여 용해시키고, 1.16 g의 EDC와 0.41 g의 HoBt를 상기 용액에 가하여 교반시켰다. 이 때 상기 촉매를 가한 후에는 1시간 동안 교반하여 카르복시기를 활성화시켰다. 그런 다음, 상기 제조된 5-β-콜란산 용액을 페길화된 키토산 용액에 첨가한 후, 3일 동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 혼합액을 석출용매에 점적하면서 파우더 형태로 10% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체를 수득하였다. 이후 제조 단계는 제조예 3과 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예
5: 5%
페길화된
키토산-40%
담즙산
복합체 제조
4.8 g의 상기 5% 페길화된 키토산 복합체(제조예 1)를 30 ㎖ DMSO에서 첨가하고, TEA 0.58 g을 넣어 1시간동안 교반하여 용해시켰다. 2.05 g의 5-β-콜란산을 30 ㎖ DMAc에 첨가하여 교반하여 용해시키고, 3.28 g의 EDC와 1.16 g의 HoBt를 상기 용액에 가하여 교반시켰다. 이 때 상기 촉매를 가한 후에는 1시간 동안 교반하여 카르복시기를 활성화시켰다. 그런 다음, 상기 제조된 5-β-콜란산 용액을 페길화된 키토산 용액에 첨가한 후, 3일 동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 혼합액을 석출용매에 점적하면서 파우더 형태로 5% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체를 수득하였다. 이후 제조 단계는 제조예 3-4와 동일한 방법으로 수행하였다.
제조예
6: 10%
페길화된
키토산-40%
담즙산
복합체 제조
4.8 g의 상기 10% 페길화된 키토산 복합체(제조예 2)를 30 ㎖ DMSO에서 첨가하고, TEA 0.41 g을 넣어 1시간동안 교반하여 용해시켰다. 1.45 g의 5-β-콜란산을 30 ㎖ DMAc에 첨가하여 교반하여 용해시키고, 2.32 g의 EDC와 0.82 g의 HoBt를 상기 용액에 가하여 교반시켰다. 이 때 상기 촉매를 가한 후에는 1시간 동안 교반하여 카르복시기를 활성화시켰다. 그런 다음, 상기 제조된 5-β-콜란산 용액을 페길화된 키토산 용액에 첨가한 후, 3일 동안 상온에서 교반하였다. 반응 종료 후 혼합액을 석출용매에 점적하면서 파우더 형태로 10% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체를 수득하였다. 이후 제조 단계는 제조예 3-5와 동일한 방법으로 수행하였다.
Ⅲ. 약물이
봉입된
페길화된
키토산-
담즙산
복합체 나노입자의 제조
하기 표 3의 조성에 따라 페길화된 키토산-담즙산 복합체 내부에 소수성 약물인 도세탁셀이 봉입된 나노입자를 제조하였으며, 후술되는 실험예에서 그 나노입자의 크기 및 약물 봉입률 등을 측정하였다. 도세탁셀을 복합체 내부에 봉입하기 위해 필름 수화법(film hydration method)을 이용하였다.
| 키토산 단량체에 대한 mPEG 사용량(%) | 담즙산 사용량(%) |
복합체 제조예 | 도세탁셀 봉입량 (중량%) |
|
| 비교예1 | 5 | - | 제조예 1 | 10 |
| 비교예 2 | 10 | - | 제조예 2 | 10 |
| 실시예 1 | 5 | 20 | 제조예 3 | 10 |
| 실시예 2 | 10 | 20 | 제조예 4 | 10 |
| 실시예 3 | 5 | 40 | 제조예 5 | 10 |
| 실시예 4 | 10 | 40 | 제조예 6 | 10 |
| 실시예 5 | 5 | 20 | 제조예 3 | 15 |
| 실시예 6 | 10 | 20 | 제조예 4 | 15 |
| 실시예 7 | 5 | 40 | 제조예 5 | 15 |
| 실시예 8 | 10 | 40 | 제조예 6 | 15 |
| 실시예 9 | 5 | 20 | 제조예 3 | 20 |
| 실시예 10 | 10 | 20 | 제조예 4 | 20 |
| 실시예 11 | 5 | 40 | 제조예 5 | 20 |
| 실시예 12 | 10 | 40 | 제조예 6 | 20 |
| 실시예 13 | 5 | 20 | 제조예 3 | 25 |
| 실시예 14 | 10 | 20 | 제조예 4 | 25 |
| 실시예 15 | 5 | 40 | 제조예 5 | 25 |
| 실시예 16 | 10 | 40 | 제조예 6 | 25 |
| 실시예 17 | 5 | 20 | 제조예 3 | 30 |
| 실시예 18 | 10 | 20 | 제조예 4 | 30 |
| 실시예 19 | 5 | 40 | 제조예 5 | 30 |
| 실시예 20 | 10 | 40 | 제조예 6 | 30 |
비교예
1-2:
페길화된
키토산 복합체에 10 중량%
도세탁셀
봉입
키토산에 각각 메톡시 폴리에틸렌 글리콜을 5% 및 10% 사용하여 결합시킨 상기 제조예 1 및 2의 복합체를 18 ㎎씩 칭량하여 2 ㎖ 증류수에 용해시켰다. 2 ㎎ 도세탁셀을 6 ㎖ 에탄올에 용해시킨 후 상기 복합체 수용액과 혼합하여 둥근 플라스크에서 교반하였다. 이후 초음파 분쇄기에서 분산시키고, 증류농축장치(rotary evaporator)를 이용하여 용매를 증발시켜 둥근플라스크 내벽에 필름을 형성시켰다. 필름이 완전히 형성된 것을 확인한 후 10 ㎖ 증류수를 첨가하여 수화시켰다. 필름이 완전히 수화된 것을 확인한 후 0.2 마이크로 필터를 통과시켜 도세탁셀이 봉입된 페길화된 키토산-담즙산 나노입자를 제조하였다.
비교예 1은 5% 페길화된 키토산 복합체에 10% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이며, 비교예 2는 10% 페길화된 키토산 복합체에 10% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이다.
실시예
1-4:
페길화된
키토산-
담즙산
복합체에 10 중량%
도세탁셀
봉입
5% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체(제조예 3), 10% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체(제조예 4), 5% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체(제조예 5) 및 10% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체(제조예 6)를 각각 18 mg씩 칭량하여 2 ㎖ 증류수에 용해시켰다. 2 mg 도세탁셀을 6 ㎖ 에탄올에 용해시킨 후 상기 복합체 수용액과 혼합하여 둥근 플라스크에서 교반하였다. 이후 제조 단계는 비교예 1-2와 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 1은 5% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체에 10% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이며, 실시예 2는 10% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체에 10% 도세탁셀을 봉입한 나노입자, 실시예 3은 5% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체에 10% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이며, 실시예 4는 10% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체에 10% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이다.
실시예
5-8:
페길화된
키토산-
담즙산
복합체에 15 중량%
도세탁셀
봉입
5% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체(제조예 3), 10% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체(제조예 4), 5% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체(제조예 5) 및 10% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체(제조예 6)를 각각 17 mg씩 칭량하여 2 ㎖ 증류수에 용해시켰다. 3 mg 도세탁셀을 6 ㎖ 에탄올에 용해시킨 후 상기 복합체 수용액과 혼합하여 둥근 플라스크에서 교반하였다. 이후 제조 단계는 실시예 1-4와 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 5는 5% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체에 15% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이며, 실시예 6은 10% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체에 15% 도세탁셀을 봉입한 나노입자, 실시예 7은 5% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체에 15% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이며, 실시예 8은 10% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체에 15% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이다.
실시예
9-12:
페길화된
키토산-
담즙산
복합체에 20 중량%
도세탁셀
봉입
5% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체(제조예 3), 10% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체(제조예 4), 5% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체(제조예 5) 및 10% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체(제조예 6)를 각각 16 mg씩 칭량하여 2 ㎖ 증류수에 용해시켰다. 4 mg 도세탁셀을 6 ㎖ 에탄올에 용해시킨 후 상기 복합체 수용액과 혼합하여 둥근 플라스크에서 교반하였다. 이후 제조 단계는 실시예 1-8과 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 9는 5% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체에 20% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이며, 실시예 10은 10% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체에 20% 도세탁셀을 봉입한 나노입자, 실시예 11은 5% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체에 20% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이며, 실시예 12는 10% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체에 20% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이다.
실시예
13-16:
페길화된
키토산-
담즙산
복합체에 25 중량%
도세탁셀
봉입
5% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체(제조예 3), 10% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체(제조예 4), 5% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체(제조예 5) 및 10% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체(제조예 6)를 각각 15 mg씩 칭량하여 2 ㎖ 증류수에 용해시켰다. 5 mg 도세탁셀을 6 ㎖ 에탄올에 용해시킨 후 상기 복합체 수용액과 혼합하여 둥근 플라스크에서 교반하였다. 이후 제조 단계는 실시예 1-12와 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 13은 5% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체에 25% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이며, 실시예 14는 10% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체에 25% 도세탁셀을 봉입한 나노입자, 실시예 15는 5% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체에 25% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이며, 실시예 16은 10% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체에 25% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이다.
실시예
17-20:
페길화된
키토산-
담즙산
복합체에 30 중량%
도세탁셀
봉입
5% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체(제조예 3), 10% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체(제조예 4), 5% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체(제조예 5) 및 10% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체(제조예 6)를 각각 14 mg씩 칭량하여 2 ㎖ 증류수에 용해시켰다. 6 mg 도세탁셀을 6 ㎖ 에탄올에 용해시킨 후 상기 복합체 수용액과 혼합하여 둥근 플라스크에서 교반하였다. 이후 제조 단계는 실시예 1-16과 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 17은 5% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체에 30% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이며, 실시예 18은 10% 페길화된 키토산-20% 담즙산 복합체에 30% 도세탁셀을 봉입한 나노입자, 실시예 19는 5% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체에 30% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이며, 실시예 20은 10% 페길화된 키토산-40% 담즙산 복합체에 30% 도세탁셀을 봉입한 나노입자이다.
실험예
1: 제조조건에 따른
페길화된
키토산-
담즙산
복합체 내의
담즙산
치환도 측정
본 실험예 1에서는 주사제로서 사용하기에 적합한 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 최적의 제조 조건을 찾기 위해 폴리에틸렌 글리콜과 담즙산 사용량에 따른 각각의 치환도를 측정하였다. 이를 위해, 페길화된 키토산-담즙산 복합체 내의 폴리에틸렌 글리콜과 담즙산 함량을 수소 핵자기 공명법(1H-NMR)을 이용하여 분석하였다.
방법
제조예 1-6에 따라 제조된 페길화된 키토산-담즙산 복합체를, D2O/DMSO의 혼합물(1:1, v/v)을 NMR 용매로 하여 1H-NMR 스펙트로미터(spectrometer; Bruker, 400 MHz)로 분석하였다. 도 2-4에 나타난 바와 같이, NMR 스펙트럼상에서 폴리에틸렌 글리콜과 담즙산이 결합된 키토산의 메틸기 면적을 이용하여 담즙산의 치환도를 확인하였다. 페길화된 키토산에 대한 담즙산의 치환도(DS, degree of substitution)를 하기식에 따라 계산하였다.
담즙산 치환도(%) = (담즙산 결합 개수/키토산 분자당 반응기 개수) × 100
결과
도 3-4로 대표되는 1H-NMR 분석 스펙트럼에 따르면 페길화된 키토산-담즙산 복합체가 제조되었음을 확인할 수 있었다. 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 담즙산 치환도는 키토산에 결합된 폴리에틸렌 글리콜의 사용량 및 담즙산의 사용량에 따라 다르게 나타났다. 제조예 3-6 에 따르면 담즙산을 20% 첨가한 경우, 폴리에틸렌 글리콜의 사용량이 증가하더라도 반응에 사용한 모든 담즙산이 치환되었고, 또한, 담즙산을 40% 첨가한 경우에도 반응에 사용한 모든 담즙산이 치환되었음을 확인할 수 있었다.
실험예
2:
페길화된
키토산-
담즙산
복합체의 수용해도 측정
약물을 봉입한 나노입자의 용해도는 주사제로서 약물의 임상 용량에 적합한 농도를 달성해야 한다는 점에서 중요하며, 약물의 전임상 시험 단계에서 독성시험 및 불용성 이물시험 등의 기준에 따라 제제를 받지 않을 정도로 충분히 높아야 한다. 본 실험예 2에서는 증류수를 용매로 하여 폴리에틸렌 글리콜 및 담즙산의 사용량에 따른 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 용해도를 측정하였다.
방법
상기 제조예 1-6에 따라 제조된 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 증류수에 용해시켜 포화 용액에 도달하기까지 필요한 용질의 양을 구하여 농도로 나타내었다. 구체적으로, 10 ㎖ 증류수에 분말상태로 건조시킨 페길화된 키토산-담즙산 복합체 10 mg을 첨가하고, 포화 상태까지 녹인 후 필터를 통과시켰다. 여과액을 동결건조하여 수득된 복합체의 중량을 측정하여, 첨가량과 필터 및 건조 후 수득량이 동일한 때를 포화 용액으로 정의하였다. 상기 수득된 복합체의 양을 이용하여 용해도(mg/㎖)를 구하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
결과
표 4에 나타난 바와 같이, 페길화된 키토산 복합체인 제조예 1 및 2의 경우 수용해도가 각각 300 mg/㎖이고, 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 경우에는 담즙산 사용량이 20 중량%인 제조예 3 및 4의 수용해도는 50 내지 75 mg/㎖로 담즙산 사용량이 40 중량%인 제조예 5 및 6의 수용해도 20 내지 30 mg/㎖에 비해 현저하게 개선된 것을 확인하였다. 그러나, 페길화된 키토산에 20 중량%의 담즙산이 결합된 페길화된 키토산-담즙산 복합체는 점성은 낮으나 소수성 부분인 담즙산의 양이 소수성 핵(hydrophobic core)을 형성하기에 충분하지 못해서 불안정한 나노입자를 형성하였다.
임상 용량은 도세탁셀의 경우 봉입량 20 중량%를 기준으로 했을 때, 복합체 제제의 전체 농도가 30 ㎎/㎖ 이상이 되어야 한다. 상기 제조예 6의 경우, 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 최대 용해도가 20 ㎎/㎖로서 임상 용량 기준에 미치지 못하므로 약물을 봉입하는데 제약이 많으며, 특히, 치료적 유효량이 높은 약물의 경우 제제화하기 어렵다. 반면, 상기 제조예 5의 경우, 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 최대 용해도가 30 ㎎/㎖ 이상인 것으로 나타나 임상적 용도에 적합함을 확인하였다.
| 제조예 | mPEG 사용량(%) | 담즙산 사용량(%) | 수용해도(mg/㎖) |
| 제조예 1 | 5 | - | 300 |
| 제조예 2 | 10 | - | 300 |
| 제조예 3 | 5 | 20 | 50 |
| 제조예 4 | 10 | 20 | 75 |
| 제조예 5 | 5 | 40 | 30 |
| 제조예 6 | 10 | 40 | 20 |
실험예
3:
페길화된
키토산-
담즙산
복합체의 표면형태 및
pH
측정
암조직은 주위의 정상조직에 비해 낮은 pH 분포를 보이는데, 이러한 암조직으로의 표적성을 부여하여 나노입자가 더 많이 축적될 수 있도록 하는 것이 중요하다. 키토산은 pKa가 6.5 정도로 약간 산성에서 더 안정화되므로, 키토산에 폴리에틸렌 글리콜 및 담즙산을 적정농도로 결합시켜 pH를 감소시킴으로서 암조직으로의 약물 축적효과를 기대할 수 있다. 본 실험예 3에서는 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 표면형태를 TEM(Transmission electron microscope)을 이용하여 관찰하고, 키토산에 결합된 폴리에틸렌 글리콜 및 담즙산 사용량에 따른 복합체의 pH를 측정하였다.
방법
TEM의 측정을 위해 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 표면형태를 0.01%의 PTA(phosphotungstic acid)에 분산시킨 후 이 용액 한 방울을 탄소 필름이 코팅된 동 그리드(copper grid)위에 떨어뜨리고 실온에서 건조하였다. 또한, 제조예 1-6에 따라 제조된 페길화된 키토산-담즙산 복합체 1 mg를 1 ㎖ 증류수에 용해시켜 1 mg/㎖ 농도로 pH 미터기를 이용하여 측정하였다. 상기의 결과를 도 1 및 하기 표 5에 나타내었다.
결과
도 1에 나타난 바와 같이, TEM에 의해 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 표면형태를 관찰한 결과, 표면이 매끄러운 둥근 형태를 가진 나노입자를 형성함을 확인할 수 있었고, 나노입자의 크기는 100 내지 300 nm 정도임을 알 수 있었다.
또한, 표 5에 나타난 바와 같이, 담즙산을 사용하지 않은 제조예 1 및 2의 경우 pH는 각각 8.15와 8.04이고, 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 경우에는 담즙산 사용량이 40 중량%인 제조예 5의 pH 5.63, 제조예 6의 pH 5.82로 이는 담즙산 사용량이 20 중량%인 제조예 3의 pH 6.32, 제조예 4의 pH 6.45에 비해 pH가 더 감소되었음을 확인하였다. 따라서, 페길화된 키토산에 담즙산의 사용량이 증가할수록 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 pH는 감소됨을 알 수 있었다.
| 제조예 | mPEG 사용량(%) | 담즙산 사용량(%) | pH |
| 제조예 1 | 5 | - | 8.15 |
| 제조예 2 | 10 | - | 8.04 |
| 제조예 3 | 5 | 20 | 6.32 |
| 제조예 4 | 10 | 20 | 6.45 |
| 제조예 5 | 5 | 40 | 5.63 |
| 제조예 6 | 10 | 40 | 5.82 |
실험예
4:
도세탁셀이
봉입된
페길화된
키토산-
담즙산
복합체의 입자크기 측정
약물의 타겟팅 전략에 있어서, 약물의 입자크기는 흡수 후 입자크기에 따라 분포 및 축적되는 조직이 달라진다는 점에서 중요하다. 입자의 크기가 400 ㎚ 이상일 경우는 암조직에 축적되기 보다는 비장 및 신장으로 가는 경우가 많고, 세포 내로의 나노입자의 흡수(uptake) 효율도 매우 낮아진다. 또한, 입자 크기가 큰 경우, 필터상의 어려움으로 인해 산업적 규모의 생산이 어렵다. 본 실험예 4에서는 본 발명에 따른 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 사용하여 제조된 나노입자의 크기를 DLS를 이용하여 측정하고, 약물 사용량에 따른 입자 크기의 변화를 분석하였다.
방법
실시예 9 내지 20에서 얻어진 나노입자를 2 ㎎/㎖의 농도로 증류수에 균질하게 분산시켰다. NICOMP 380ZLS를 이용하여 동적 광산란법(Dynamic light scattering method; DLS)에 의해 입자 크기를 측정하고, 그 결과를 표 6에 나타내었다.
결과
표 6 및 도 5에서 나타난 바와 같이, 도세탁셀을 봉입한 경우 전반적으로 페길화된 키토산-담즙산 복합체 나노입자의 크기는 160 내지 260㎚의 범위에 분포하는 것으로 나타났다. 약물 봉입량에 따른 입자크기를 분석하면, 실시예 9-20의 결과에 의하면 도세탁셀 사용량이 20 중량%인 경우, 실시예 10 및 11에 따라 제조된 나노입자의 크기는 200 내지 215 nm 정도이고, 도세탁셀 사용량이 25 중량%인 경우에는, 실시예 13-15에 따라 제조된 나노입자의 크기가 160 내지 230 nm 정도로 평균 입자크기는 감소되었다. 또한, 도세탁셀 사용량이 30 중량%인 경우, 실시예 17-19에 따라 제조된 나노입자의 크기는 220 내지 260 nm로 평균 입자크기가 증가함을 확인하였다. 반면에, 실시예 12, 16 및 20에 따라 제조된 나노입자의 경우에는 동일농도에서 나노입자가 형성되지 않아 입자크기를 측정할 수 없었다.
| 실시예 | 키토산 단량체에 대한 mPEG 사용량(%) | 담즙산 사용량(%) | 복합체 제조예 |
도세탁셀 봉입량(중량%) | 입자크기(nm) |
| 실시예 9 | 5 | 20 | 제조예 3 | 20 | - |
| 실시예 10 | 10 | 20 | 제조예 4 | 20 | 200 |
| 실시예 11 | 5 | 40 | 제조예 5 | 20 | 215 |
| 실시예 12 | 10 | 40 | 제조예 6 | 20 | - |
| 실시예 13 | 5 | 20 | 제조예 3 | 25 | 180 |
| 실시예 14 | 10 | 20 | 제조예 4 | 25 | 230 |
| 실시예 15 | 5 | 40 | 제조예 5 | 25 | 160 |
| 실시예 16 | 10 | 40 | 제조예 6 | 25 | - |
| 실시예 17 | 5 | 20 | 제조예 3 | 30 | 220 |
| 실시예 18 | 10 | 20 | 제조예 4 | 30 | 220 |
| 실시예 19 | 5 | 40 | 제조예 5 | 30 | 260 |
| 실시예 20 | 10 | 40 | 제조예 6 | 30 | - |
실험예
5:
페길화된
키토산-
담즙산
복합체의 약물
봉입효율
및
담지량
측정
상기 실험예 4의 결과를 바탕으로, 실험된 약물량 범위 전체에서 적절한 나노입자 크기를 갖는 것으로 나타난 실시예 3, 7, 11, 15 및 19을 선택하여 도세탁셀의 사용량에 따른 약물의 봉입효율 및 담지량을 측정하였다.
방법
실시예 3, 7, 11, 15 및 19에 따라 페길화된 키토산-담즙산 복합체에 각각 10 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량% 및 30 중량%이 되도록 도세탁셀을 첨가한 경우, 나노입자 내에 실제 봉입된 도세탁셀의 양을 HPLC(High performance liquid chromatography, Waters, USA)를 이용하여 측정하였다. HPLC 분석을 위해 Waters의 Xbridge C18 컬럼(150 mm L. ⅹ 4.6 mm I.D. 5μm)과 Phenomenex의 Gemini-NX C18 컬럼(4.0 mm L. x 3.0 mm I.D.)을 사용하였다. 시료의 용매 및 이동상은 50% 아세트니트릴(ACN) 용액을 사용하였으며, 분석은 1 ㎖/분의 유속으로 35 ℃에서 진행하였다. 약물의 검출은 UV 검출기를 이용하여 232 ㎚ 파장에서 측정하였다.
정량화를 위해 도세탁셀의 농도와 그에 따른 특성 피크의 면적 변화를 이용하여 검량선을 작성한 후, 이를 이용하여 시료 내 도세탁셀의 농도를 계산하였다. 하기 식에 의해 약물의 봉입 효율 및 약물 담지량을 구하고, 그 결과를 표 7에 나타내었다.
봉입 효율(%) = (나노입자내 약물량)/(초기 약물 사용량) × 100
약물 담지량(%) = (나노입자내 약물량)/(전체 나노입자 중량) × 100
결과
표 7에서 나타난 바와 같이, 도세탁셀을 10 중량%, 15 중량%, 20 중량% 및 25 중량%이 되도록 봉입한 경우, 봉입 효율은 전반적으로 90% 이상으로서 실제 사용된 도세탁셀이 거의 봉입됨을 확인할 수 있었다. 그러나, 도세탁셀 30 중량%를 봉입한 경우에는 페길화된 키토산-담즙산 복합체가 나노입자를 형성하고, 약물을 봉입할 수 있지만 약물이 수초 내지 수분내에 빠져나오는 것을 확인할 수 있었다.
| 실시예 | 복합체 제조예 | 도세탁셀 사용량 (중량%) |
봉입효율 (%) |
약물 담지량 (%) |
| 실시예 3 | 제조예 5 | 10 | 100.0 | 10 |
| 실시예 7 | 제조예 5 | 15 | 93.3 | 14 |
| 실시예 11 | 제조예 5 | 20 | 90.0 | 18 |
| 실시예 15 | 제조예 5 | 25 | 96.0 | 24 |
| 실시예 19 | 제조예 5 | 30 | - | - |
Claims (20)
1 이상 10 KDa 미만의 키토산에 폴리에틸렌 글리콜과 소수성 담즙산이 결합된 양친성 복합체로서, 수중에서 자가 집합체(self-aggregate)를 형성하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체.
제1항에 있어서,
상기 폴리에틸렌 글리콜은 PEG 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체.
상기 폴리에틸렌 글리콜은 PEG 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체.
제1항에 있어서,
상기 폴리에틸렌 글리콜은 1 내지 15의 치환도(%)로 결합되는 것을 특징으로 하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체.
상기 폴리에틸렌 글리콜은 1 내지 15의 치환도(%)로 결합되는 것을 특징으로 하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체.
제1항에 있어서,
상기 소수성 담즙산은 5-β 콜란산(5-β-cholanic acid), 콜린산(cholic acid), 케노데옥시콜린산(chenodeoxycholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid), 타우로콜린산(taurocholic acid), 데옥시콜린산(deoxycholic acid), 리소콜린산(lithocholic acid) 및 7-옥소-리소콜린산(7-oxo-lithocholic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체.
상기 소수성 담즙산은 5-β 콜란산(5-β-cholanic acid), 콜린산(cholic acid), 케노데옥시콜린산(chenodeoxycholic acid), 글리코콜린산(glycocholic acid), 타우로콜린산(taurocholic acid), 데옥시콜린산(deoxycholic acid), 리소콜린산(lithocholic acid) 및 7-옥소-리소콜린산(7-oxo-lithocholic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체.
제4항에 있어서,
상기 소수성 담즙산은 5-β 콜란산인 것을 특징으로 하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체.
상기 소수성 담즙산은 5-β 콜란산인 것을 특징으로 하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체.
제1항에 있어서,
상기 소수성 담즙산은 1 내지 40의 치환도(%)로 결합되는 것을 특징으로 하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체.
상기 소수성 담즙산은 1 내지 40의 치환도(%)로 결합되는 것을 특징으로 하는 페길화된 키토산-담즙산 복합체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 내부에 소수성 약물이 봉입된 나노입자.
제7항에 있어서,
상기 나노입자의 직경은 100 내지 300 nm이고, 상기 소수성 약물은 복합체 내부에 10 내지 40 중량%의 함량으로 봉입되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
상기 나노입자의 직경은 100 내지 300 nm이고, 상기 소수성 약물은 복합체 내부에 10 내지 40 중량%의 함량으로 봉입되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
제7항에 있어서,
상기 소수성 약물은 항신생물제, 마취제, 항염증약, 면역억제제 및 항호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
상기 소수성 약물은 항신생물제, 마취제, 항염증약, 면역억제제 및 항호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
제9항에 있어서,
상기 소수성 약물은 항신생물제인 것을 특징으로 하는 나노입자.
상기 소수성 약물은 항신생물제인 것을 특징으로 하는 나노입자.
제10항에 있어서,
상기 항신생물제는 아드리아마이신, 시클로포스파미드, 악티노마이신, 블레오마이신, 두아노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 카르보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴, 시스플라틴 에토포사이드, 인터페론, 캄포테신 및 그의 유도체, 파클리탁셀 및 그의 유도체, 탁소테레 및 그의 유도체, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 에토포사이드, 피포술판, 도세탁셀, 아나스테로졸, 글리벡, 플록수리딘, 류프롤리드, 플루타미드, 졸레드로네이트, 젬시타빈, 스트렙토조신, 카보플라틴, 토포테칸, 벨로테칸, 이리노테칸, 비노렐빈, 히드록시우레아, 발루비신, 레티노익산 계열, 메클로레타민, 클로람부실, 부술판, 독시플루리딘, 프레드니손, 테스토스테론, 미토산트론, 아스피린, 살리실레이트, 이부프로펜, 나프록센, 페노프로펜, 인도메타신, 페닐부타존, 시클로포스파미드, 메클로에타민, 덱사메타손, 프레드니솔론, 셀레콕시브, 발데콕시브, 니메술리드, 코르티손 및 코르티코스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
상기 항신생물제는 아드리아마이신, 시클로포스파미드, 악티노마이신, 블레오마이신, 두아노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 미토마이신, 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 카르보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 메틸-CCNU, 시스플라틴, 시스플라틴 에토포사이드, 인터페론, 캄포테신 및 그의 유도체, 파클리탁셀 및 그의 유도체, 탁소테레 및 그의 유도체, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 타목시펜, 에토포사이드, 피포술판, 도세탁셀, 아나스테로졸, 글리벡, 플록수리딘, 류프롤리드, 플루타미드, 졸레드로네이트, 젬시타빈, 스트렙토조신, 카보플라틴, 토포테칸, 벨로테칸, 이리노테칸, 비노렐빈, 히드록시우레아, 발루비신, 레티노익산 계열, 메클로레타민, 클로람부실, 부술판, 독시플루리딘, 프레드니손, 테스토스테론, 미토산트론, 아스피린, 살리실레이트, 이부프로펜, 나프록센, 페노프로펜, 인도메타신, 페닐부타존, 시클로포스파미드, 메클로에타민, 덱사메타손, 프레드니솔론, 셀레콕시브, 발데콕시브, 니메술리드, 코르티손 및 코르티코스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
제7항에 따른 나노입자를 포함하는 주사제.
(a) 키토산을 수용액에 녹여 키토산 용액을 제조하는 단계;
(b) 폴리에틸렌 글리콜을 수용액에 녹여 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하는 단계;
(c) 상기 단계(a)의 키토산 용액에 상기 단계(b)의 폴리에틸렌 글리콜 용액을 첨가하여 폴리에틸렌 글리콜-키토산 복합체가 형성된 반응액을 제조하는 단계;
(d) 상기 반응액을 유기용매에 석출, 여과, 투석 및 건조하여 페길화된 키토산 복합체를 획득하는 단계;
(e) 상기 획득한 페길화된 키토산 복합체를 유기용매에 용해시키는 단계;
(f) 소수성 담즙산을 촉매제와 함께 유기용매에 용해시키고 반응시켜 담즙산 용액을 제조하여 담즙산을 활성화시키는 단계;
(g) 상기 단계(e)의 페길화된 키토산 복합체 용액에 상기 단계(f)의 활성화된 담즙산 용액을 첨가하고 반응시켜 페길화된 키토산-담즙산 복합체 용액을 제조하는 단계;
(h) 상기 반응액을 유기용매에 석출 및 여과, 투석, 건조하여 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 수득하는 단계; 및
(i) 상기 페길화된 키토산-담즙산 복합체 내부에 약물을 봉입하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 나노입자의 제조방법.
(b) 폴리에틸렌 글리콜을 수용액에 녹여 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하는 단계;
(c) 상기 단계(a)의 키토산 용액에 상기 단계(b)의 폴리에틸렌 글리콜 용액을 첨가하여 폴리에틸렌 글리콜-키토산 복합체가 형성된 반응액을 제조하는 단계;
(d) 상기 반응액을 유기용매에 석출, 여과, 투석 및 건조하여 페길화된 키토산 복합체를 획득하는 단계;
(e) 상기 획득한 페길화된 키토산 복합체를 유기용매에 용해시키는 단계;
(f) 소수성 담즙산을 촉매제와 함께 유기용매에 용해시키고 반응시켜 담즙산 용액을 제조하여 담즙산을 활성화시키는 단계;
(g) 상기 단계(e)의 페길화된 키토산 복합체 용액에 상기 단계(f)의 활성화된 담즙산 용액을 첨가하고 반응시켜 페길화된 키토산-담즙산 복합체 용액을 제조하는 단계;
(h) 상기 반응액을 유기용매에 석출 및 여과, 투석, 건조하여 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 수득하는 단계; 및
(i) 상기 페길화된 키토산-담즙산 복합체 내부에 약물을 봉입하는 단계를 포함하는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 나노입자의 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 소수성 담즙산은 5-β-콜란산인 것을 특징으로 하는 제조방법.
상기 소수성 담즙산은 5-β-콜란산인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 단계 (f)의 소수성 담즙산에 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드(EDC) 또는 하이드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole; HoBt)가 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
상기 단계 (f)의 소수성 담즙산에 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드(EDC) 또는 하이드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole; HoBt)가 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 단계 (e) 및 (f)의 유기용매는 디메틸아세트아미드, 디메틸설폭사이드 및 메탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
상기 단계 (e) 및 (f)의 유기용매는 디메틸아세트아미드, 디메틸설폭사이드 및 메탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 단계 (h)의 석출용매는 아세톤, 이소프로필 알코올, 이소프로필 에테르, 디메틸 에테르, 헥산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
상기 단계 (h)의 석출용매는 아세톤, 이소프로필 알코올, 이소프로필 에테르, 디메틸 에테르, 헥산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 단계 (h) 후에, 잔류용매 및 불순물을 제거하여 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
상기 단계 (h) 후에, 잔류용매 및 불순물을 제거하여 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 정제하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제13항에 있어서,
상기 단계 (i)는 상기 약물을 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 디메틸설폭사이드 및 디메틸아세트아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기용매에 용해시킨 용액과, 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 수용액을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
상기 단계 (i)는 상기 약물을 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 디메틸설폭사이드 및 디메틸아세트아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기용매에 용해시킨 용액과, 페길화된 키토산-담즙산 복합체의 수용액을 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제19항에 있어서,
상기 유기용매에 용해시킨 용액과 페길화된 키토산-담즙산 복합체 수용액의 혼합비율은 1:50 내지 1:1의 범위인 것을 특징으로 하는 제조방법.
상기 유기용매에 용해시킨 용액과 페길화된 키토산-담즙산 복합체 수용액의 혼합비율은 1:50 내지 1:1의 범위인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110087581A KR20130024254A (ko) | 2011-08-31 | 2011-08-31 | 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 이용한 나노입자 및 그 제조방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110087581A KR20130024254A (ko) | 2011-08-31 | 2011-08-31 | 페길화된 키토산-담즙산 복합체를 이용한 나노입자 및 그 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130024254A true KR20130024254A (ko) | 2013-03-08 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| KR (1) | KR20130024254A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114504565A (zh) * | 2022-03-15 | 2022-05-17 | 扬州大学 | 肿瘤微环境响应性智能壳聚糖载砷纳米颗粒及其制备方法 |
| CN116807996A (zh) * | 2023-07-05 | 2023-09-29 | 宁夏医科大学总医院 | 负载β-酸的壳聚糖纳米材料及其制备方法和应用 |
-
2011
- 2011-08-31 KR KR1020110087581A patent/KR20130024254A/ko not_active Application Discontinuation
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