CN108704144B - 多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法 - Google Patents

多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，利用多肽分子中存在氨基基团，可以与经过活化的金纳米棒表面的羧基发生酰胺反应，前驱液的的pH值为9‑10，当酰胺反应发生时，溶液的pH值下降至6，多肽分子开始发生自组装，沉积在金纳米棒的表面，从而合成了金纳米棒基杂化纳米凝胶。与现有技术相比，本发明拓展了制备纳米凝胶的方法，同时，纳米凝胶既可以作为超声成像的造影剂，又可以增强在超声引导下的高强度聚焦超声治疗的治疗效果，为生物医学中合成新型生物诊疗剂提供了一种新的可能性。

Description

多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法
技术领域
本发明属于高分子生物医学材料技术领域，涉及一种多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法。
背景技术
水凝胶是具有交联三维网络结构的聚合物，具有亲水基团，在水中会发生溶胀，但是不溶于水。因为它在水中可以溶胀，所以能吸收大量的水，含水量很高，并且性能柔软，能保持一定的形状。
纳米凝胶是指粒径是纳米尺寸的水凝胶，是一种新型的纳米材料，结合了纳米材料和水凝胶的功能，所以称为近年来生物医学领域的科研热点。纳米凝胶属于纳米材料，因此具备小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应等性能，又属于水凝胶，因此具备稳定性和高含水性等性能。纳米凝胶的这些性能，让其在生物医学领域有着巨大的应用潜力。
同时，近年来，有机无机杂化纳米复合材料受到了广泛关注。无机单元可以是纳米颗粒、碳纳米管、纳米棒、量子点等等。通常纳米复合材料的核为无机颗粒，然后把它们掺入有机聚合物中。金纳米材料提供了一个多功能的平台，适用于广泛的生物医学应用。研究已经验证了其在许多技术中可以用于癌症诊断和治疗。比如，它们可以作为光谱方法中检测生物标记物的底物，它们可以作光学成像造影剂，它们可以携载药物传输和控制药物释放，它们可以作为光热转换器杀死肿瘤细胞。
中国专利ZL201310461228.6公开了一种用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶及其制备方法与应用，其以肝素钠为合成模板，通过与聚乙烯亚胺结合形成纳米凝胶，并在表面进行硫辛酸修饰，得到用于负载贵金属颗粒的纳米凝胶。上述专利制备的纳米凝胶可以应用于环境监测、医学诊断学或肿瘤光热治疗等技术领域中。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法。
金纳米棒通过晶种生长法来合成，长度～60nm，宽度～15nm，纳米尺寸适合于进行超声成像和超声引导的高强度聚焦超声治疗(HIFU)等应用。下一步，加入巯基-聚乙二醇-羧基分子，使金纳米棒的表面修饰上羧基。
多肽分子NapGFFK是通过固相合成法合成的。多肽分子中存在氨基基团，可以与经过活化的金纳米棒表面的羧基发生酰胺反应。前驱液的的pH值为9-10，当酰胺反应发生时，溶液的pH值下降至6，多肽分子开始发生自组装，沉积在金纳米棒的表面，从而合成了金纳米棒基杂化纳米凝胶，参见图1所示。
本发明还通过一系列的仪器金纳米棒基杂化纳米凝胶的性能进行测试与表征，例如扫描透射电镜(STEM)、透射电镜(TEM)、马尔文粒径分析仪、紫外分光光度计(UV)、红外光谱仪(FT-IR)等。通过合成这种纳米凝胶，拓展了制备纳米凝胶的方法，同时，纳米凝胶既可以作为超声成像的造影剂，又可以增强在超声引导下的高强度聚焦超声治疗的治疗效果，为生物医学中合成新型生物诊疗剂提供了一种新的可能性。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，在金纳米棒表面修饰羧基并活化后，加入多肽分子发生酰胺反应，使得多肽分子自组装并沉积在金纳米棒表面，得到金纳米棒杂化纳米凝胶。
进一步的，其方法具体包括以下步骤：
(1)取羧基修饰的Au NRs溶于MES缓冲溶液中，再加入EDC·HCl和NHS，搅拌，调节pH至9-10，得到活化Au NRs溶液；
(2)配制pH为9-10的多肽分子水溶液，并将其加入步骤(1)所得的活化Au NRs溶液中，搅拌反应，即得到金纳米棒基杂化纳米凝胶。
进一步的，所述的羧基修饰的Au NRs通过以下步骤制成：
(a)制备Au晶种溶液：
配制十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液，加入HAuCl4溶液和超纯水，再往其中加入NaBH4溶液，搅拌反应；
(b)制备Au生长溶液：
称取CTAB粉末溶于超纯水中，依次加入HAuCl4溶液、AgNO3溶液、H2SO4溶液和抗坏血酸溶液，搅拌至溶液从黄色变为无色；
(c)Au NRs生长：
将步骤(b)制得的Au生长溶液保持30℃恒温，加入步骤(a)制得的Au晶种溶液，搅拌至溶液从无色变为紫红色，再继续搅拌50min后，停止搅拌并静置，得到Au NRs溶液；
(d)羧基修饰：
去除步骤(c)中得到的Au NRs溶液中过量CTAB，依次加入SH-PEG2000-COOH溶液和十二烷基硫酸钠溶液，震荡，搅拌，制得羧基改性的Au NRs溶液，去除过量SH-PEG2000-COOH后备用。
更进一步的，步骤(a)中：
十六烷基三甲基溴化铵水溶液、HAuCl4溶液、超纯水和NaBH4溶液的添加量比为7.5ml：250μl：1650μl：600μl，其中，
十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为0.1mol/L，HAuCl4溶液的浓度为0.01mol/L，NaBH4溶液的浓度为0.01mol/L；
步骤(b)中：
CTAB粉末、超纯水、HAuCl4溶液、AgNO3溶液、H2SO4溶液和抗坏血酸溶液的添加量比为：3.644g：100ml：5ml：800μl：2ml：800μl，其中，
HAuCl4溶液浓度为0.01mol/L，AgNO3溶液的浓度为0.01mol/L，H2SO4溶液浓度为0.5mol/L，抗坏血酸溶液浓度为0.1mol/L；
步骤(c)中：
以制备Au生长溶液所需的AgNO3溶液计，每800μl AgNO3溶液对应的Au生长溶液中加入240μl Au晶种溶液；
步骤(d)中：
以制备Au NRs溶液所需的Au晶种溶液计，每240μl Au晶种溶液对应的Au NRs溶液中分别加入10ml SH-PEG2000-COOH溶液和500μl十二烷基硫酸钠溶液，其中，SH-PEG2000-COOH溶液的浓度为4mg/ml，十二烷基硫酸钠溶液的浓度为1wt％。
更优选的，步骤(a)中，搅拌反应的时间为2min，反应后保持30℃恒温2h；
步骤(c)中，静置条件为：在30℃恒温条件下静置18小时；
步骤(d)中，震荡时间为10s，随后在20℃下搅拌24h。
更进一步的，所述的多肽分子通过固相合成法合成，其具体步骤为：
(A)：取2-氯三苯甲基氯树脂，加入DMF，6min后除去DMF，得到预处理2-氯三苯甲基氯树脂；
(B)：将Fmoc-lys(Boc)-OH溶于DMF中，加入DIEA，随后加入到步骤(1)所得预处理2-氯三苯甲基氯树脂中，摇动，再加入甲醇溶液，继续摇动；
(C)：将步骤(B)所得产物洗涤后，加入20％哌啶DMF溶液，震荡反应，以脱除Fmoc-保护基；
(D)：取Fmoc-Phe-OH、HOBt、HBTU溶于DMF中，加入DIEA，所得混合液再加入步骤(C)所得产物中，在摇床上震荡，以接上Fmoc-Phe-OH；
(E)：重复步骤(C)-(D)，再继续加入苯丙氨酸Fmoc-Phe-OH(F)、甘氨酸Fmoc-Gly-OH(G)和2-萘乙酸(Nap)，最终得到多肽分子NapGFFK，洗涤，再继续加入95％三氟乙酸溶液，使多肽分子从树脂上脱除，从而进入三氟乙酸溶液中，反应，洗涤，再继续加入95％三氟乙酸，震荡，旋蒸，所得粘稠液体滴入稀盐酸中，析出白色沉淀，离心、干燥、纯化后，即得目的产物。
更优选的，以0.3g 2-氯三苯甲基氯树脂计：
步骤(A)中，加入的DMF为2ml；
步骤(B)中，Fmoc-lys(Boc)-OH为380.2mg，DMF为2ml，DIEA为145μl，无水甲醇为130μl；
步骤(C)中，20％哌啶DMF溶液为2.5ml；
步骤(D)中，Fmoc-Phe-OH为260.84mg，HOBt为91mg，HBTU为255.34mg，DMF为3ml，DIEA为120μl；
步骤(E)中，Fmoc-Phe-OH为260.84mg，Fmoc-Gly-OH为200mg，2-萘乙酸为125.36mg，95％三氟乙酸为3ml。
更优选的，步骤(B)中，加入甲醇溶液前的摇动时间为2h，加入甲醇溶液后的摇动时间为5min；
步骤(C)中，震荡的时间为15min；
步骤(D)中，震荡时间为2h；
步骤(E)中，震荡时间为30min。
更进一步的，羧基修饰的Au NRs、EDC·HCl、NHS和多肽分子的添加量之比5mg：10mg：10mg：5mg。
更进一步的，步骤(1)中搅拌时间为30min；
步骤(2)中，活化Au NRs溶液与多肽分子水溶液混合后，搅拌时间为12h。
本发明中，原料用量(抗坏血酸、硝酸银)、溶液pH、反应条件(温度和时间)都会影响金纳米棒的生长。在制备金晶种溶液时，原理时以NaBH4作为还原剂，把Au3+还原到金纳米颗粒，由于颗粒容易团聚，所以采用阳离子表面活性剂CTAB作为稳定剂。当NaBH4的量增加时，金颗粒的浓度也会增加。在金生长溶液中，原理是以抗坏血酸作为还原剂，将Au3+还原为纳米金，抗坏血酸的还原性比NaBH4弱，可以更稳定地控制金纳米棒的定向生长，当抗坏血酸用量过多，定向生长速率难以控制，就会生长出其他形状的金纳米材料；以CTAB为模板剂，辅助金纳米棒的生长；加入AgNO3，Ag+会引导晶种纵向生长，会影响金纳米棒的长径比，AgNO3用量不足会导致晶种无法纵向生长；pH也会影响金纳米棒的形状，所以加入H2SO4调节pH。
本发明选取了600μl浓度是0.01mol/L的NaBH4溶液、800μl浓度是0.1mol/L的抗坏血酸溶液、800μl浓度是0.01mol/L的AgNO3溶液、2ml浓度为0.5mol/L的H2SO4溶液。反应条件：本发明选取温度为30℃，生长溶液的静置时间是18小时。温度过低时，模板剂CTAB会从溶液中析出，无法合成金纳米棒，温度过高时，定向生长速率难以控制。时间不足时，金纳米棒无法充分生长，时间过长时，生长形状难以控制。当多肽进行自组装沉积时，经过实验，本发明将用量控制为羧基修饰的Au NRs和多肽分子的添加量之比5mg：5mg，当多肽用量不足时，胶层厚度不明显，而用量过多时，多肽分子自身会发生自组装，成为多肽凝胶颗粒，无法得到本发明的结构。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
(1)与传统的成胶方法相比，本发明将多肽小分子作为凝胶因子，直接自组装在纳米材料的表面，成为超分子纳米凝胶的过程简洁高效。
(2)与传统的超声造影剂相比，可以在更为简单的结构下产生同样的效果。材料利用纳米颗粒的聚集效应产生超声成像的效果，弹性凝胶层的存在对增强了超声信号，使成像出现较高的灰度值。
(3)本发明所制备的是一种多功能的生物诊疗剂，通过多肽分子自组装的方法合成超分子纳米凝胶，以金纳米棒为核，多肽自组装的凝胶层为壳。此纳米凝胶的单分散性良好，粒径均一稳定，在透射电子显微镜下可以看到明显的核壳结构。功能多样，在光声成像、近红外成像、超声成像等成像领域有较好的应用；在光热治疗、光动力治疗、高强度聚焦超声治疗等领域有较好的治疗效果。
附图说明
图1为本发明的金纳米棒基杂化纳米凝胶的合成示意图；
图2为本发明的前驱体多肽分子NapGFFK的合成示意图；
图3为本发明的金纳米棒的投射电子显微镜形貌表征图；
图4为本发明的金纳米棒修饰前后电位表征图；
图5为本发明的前驱体多肽分子NapGFFK的TOF图；
图6为本发明的金纳米棒基杂化纳米凝胶的投射电子显微镜形貌表征图；
图7为本发明的金纳米棒基杂化纳米凝胶的体外超声成像示意图；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明提供了一种多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，在金纳米棒表面修饰羧基并活化后，加入多肽分子发生酰胺反应，使得多肽分子自组装并沉积在金纳米棒表面，得到金纳米棒杂化纳米凝胶。
在本发明的一种优选的实施方式中，其方法具体包括以下步骤：
(1)取羧基修饰的Au NRs溶于MES缓冲溶液中，再加入EDC·HCl和NHS，搅拌，调节pH至9-10，得到活化Au NRs溶液；
(2)配制pH为9-10的多肽分子水溶液，并将其加入步骤(1)所得的活化Au NRs溶液中，搅拌反应，即得到金纳米棒基杂化纳米凝胶。
上述实施方式中，羧基修饰的Au NRs可以采用常规已制备的商品，但是，在本发明的一种更优选的实施方式中，所述的羧基修饰的Au NRs通过以下步骤制成：
(a)制备Au晶种溶液：
配制十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液，加入HAuCl4溶液和超纯水，再往其中加入NaBH4溶液，搅拌反应；
(b)制备Au生长溶液：
称取CTAB粉末溶于超纯水中，依次加入HAuCl4溶液、AgNO3溶液、H2SO4溶液和抗坏血酸溶液，搅拌至溶液从黄色变为无色；
(c)Au NRs生长：
将步骤(b)制得的Au生长溶液保持30℃恒温，加入步骤(a)制得的Au晶种溶液，搅拌至溶液从无色变为紫红色，再继续搅拌50min后，停止搅拌并静置，得到Au NRs溶液；
(d)羧基修饰：
去除步骤(c)中得到的Au NRs溶液中过量CTAB，依次加入SH-PEG2000-COOH溶液和十二烷基硫酸钠溶液，震荡，搅拌，制得羧基改性的Au NRs溶液，去除过量SH-PEG2000-COOH后备用。
上述羧基修饰的Au NRs制备方法中，优选的，步骤(a)中：
十六烷基三甲基溴化铵水溶液、HAuCl4溶液、超纯水和NaBH4溶液的添加量比为7.5ml：250μl：1650μl：600μl，其中，
十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为0.1mol/L，HAuCl4溶液的浓度为0.01mol/L，NaBH4溶液的浓度为0.01mol/L。
上述羧基修饰的Au NRs制备方法中，优选的，步骤(b)中：
CTAB粉末、超纯水、HAuCl4溶液、AgNO3溶液、H2SO4溶液和抗坏血酸溶液的添加量比为：3.644g：100ml：5ml：800μl：2ml：800μl，其中，
HAuCl4溶液浓度为0.01mol/L，AgNO3溶液的浓度为0.01mol/L，H2SO4溶液浓度为0.5mol/L，抗坏血酸溶液浓度为0.1mol/L。
上述羧基修饰的Au NRs制备方法中，优选的，步骤(c)中：
以制备Au生长溶液所需的AgNO3溶液计，每800μl AgNO3溶液对应的Au生长溶液中加入240μl Au晶种溶液。
上述羧基修饰的Au NRs制备方法中，优选的，步骤(d)中：
以制备Au NRs溶液所需的Au晶种溶液计，每240μl Au晶种溶液对应的Au NRs溶液中分别加入10ml SH-PEG2000-COOH溶液和500μl十二烷基硫酸钠溶液，其中，SH-PEG2000-COOH溶液的浓度为4mg/ml，十二烷基硫酸钠溶液的浓度为1wt％。
上述羧基修饰的Au NRs制备方法中，优选的，步骤(a)中，搅拌反应的时间为2min，反应后保持30℃恒温2h。
上述羧基修饰的Au NRs制备方法中，优选的，步骤(c)中，静置条件为：在30℃恒温条件下静置18小时。
上述羧基修饰的Au NRs制备方法中，优选的，步骤(d)中，震荡时间为10s，随后在20℃下搅拌24h。
上述实施方式中，多肽分子可以采用现有商品，但是，在本发明的一种更优选的实施方式中，所述的多肽分子通过固相合成法合成，其具体步骤为：
(A)：取2-氯三苯甲基氯树脂，加入DMF，6min后除去DMF，得到预处理2-氯三苯甲基氯树脂；
(B)：将Fmoc-lys(Boc)-OH溶于DMF中，加入DIEA，随后加入到步骤(1)所得预处理2-氯三苯甲基氯树脂中，摇动，再加入甲醇溶液，继续摇动；
(C)：将步骤(B)所得产物洗涤后，加入20％哌啶DMF溶液，震荡反应，以脱除Fmoc-保护基；
(D)：取Fmoc-Phe-OH、HOBt、HBTU溶于DMF中，加入DIEA，所得混合液再加入步骤(C)所得产物中，在摇床上震荡，以接上Fmoc-Phe-OH；
(E)：重复步骤(C)-(D)，再继续加入苯丙氨酸Fmoc-Phe-OH(F)、甘氨酸Fmoc-Gly-OH(G)和2-萘乙酸(Nap)，最终得到多肽分子NapGFFK，洗涤，再继续加入95％三氟乙酸溶液，使多肽分子从树脂上脱除，从而进入三氟乙酸溶液中，反应，洗涤，再继续加入95％三氟乙酸，震荡，旋蒸，所得粘稠液体滴入稀盐酸中，析出白色沉淀，离心、干燥、纯化后，即得目的产物。
上述多肽分子的合成方法中，更进一步优选的，以0.3g 2-氯三苯甲基氯树脂计：
步骤(A)中，加入的DMF为2ml；
步骤(B)中，Fmoc-lys(Boc)-OH为380.2mg，DMF为2ml，DIEA为145μl，无水甲醇为130μl；
步骤(C)中，20％哌啶DMF溶液为2.5ml；
步骤(D)中，Fmoc-Phe-OH为260.84mg，HOBt为91mg，HBTU为255.34mg，DMF为3ml，DIEA为120μl；
步骤(E)中，Fmoc-Phe-OH为260.84mg，Fmoc-Gly-OH为200mg，2-萘乙酸为125.36mg，95％三氟乙酸为3ml。
上述多肽分子的合成方法中，更进一步优选的，步骤(B)中，加入甲醇溶液前的摇动时间为2h，加入甲醇溶液后的摇动时间为5min；
步骤(C)中，震荡的时间为15min；
步骤(D)中，震荡时间为2h；
步骤(E)中，震荡时间为30min。
在本发明的一种更优选的实施方式中，羧基修饰的Au NRs、EDC·HCl、NHS和多肽分子的添加量之比5mg：10mg：10mg：5mg。
在本发明的一种更优选的实施方式中，步骤(1)中搅拌时间为30min；
步骤(2)中，活化Au NRs溶液与多肽分子水溶液混合后，搅拌时间为12h。
下面以更具体的实施例来对本发明进行进一步的说明。
以下各实施例中，所用的各种试剂均为购买的市售产品，具体商家型号如下：
Figure BDA0001641261030000091
Figure BDA0001641261030000101
实施例1
Au NRs的合成：
(1-1)Au NRs纳米颗粒的合成：
制备Au晶种溶液：首先取45ml超纯水放入4℃冰箱保存备用，然后配制7.5ml的十六烷基三甲基溴化铵CTAB水溶液(0.1mol/L)，加入250μl HAuCl4溶液(0.01mol/L)、1650μl超纯水。取出备用冰水，配置0.01mol/L的NaBH4溶液30ml，取600μl NaBH4溶液快速滴加进快速搅拌的CTAB和HAuCl4的混合溶液中，搅拌2min后，溶液的颜色会由无色变为棕色的Au纳米颗粒，保持30℃恒温2小时。
(1-2)制备Au生长溶液：
称取CTAB粉末3.6440g，溶解于100ml的超纯水中，接着依次加入5ml HAuCl4溶液(0.01mol/L)、800μl AgNO3溶液(0.01mol/L)、2ml H2SO4溶液(0.5mol/L)、800μl抗坏血酸溶液(0.1mol/L)，溶液从黄色变为无色。
(1-3)Au NRs生长过程：
生长溶液继续保持30℃恒温，加入晶种溶液240μl，搅拌约10分钟后，溶液从无色变为紫红色，再继续搅拌50min之后，停止搅拌，在30℃恒温条件下静置18小时。
如图3所示，通过透射电子显微镜观察Au NRs的形貌，可以看到粒径大小为13×46nm的Au NRs，分散性良好，粒径均一。
实施例2
金纳米棒表面羧基修饰：
将实施例1静置18h后的Au NRs生长溶液洗涤，用高速离心机高速(10000rpm)离心三次，除去溶液中过量的CTAB。把得到的高浓度的Au NRs溶液用超纯水稀释到5ml，然后加入10ml的SH-PEG2000-COOH溶液(4mg/ml)，接着加入500μl十二烷基硫酸钠(SDS)溶液(1％)，把混合溶液快速震荡10s，在20℃下缓慢搅拌24h，从而制备得到羧基改性的Au NRs溶液。将产物用高速离心机高速(9000rpm)离心三次，除去溶液中过量的SH-PEG2000-COOH，并重新分散于5ml的超纯水中。
如图4所示，通过电位测试可以发现，Au NRs由于表面CTAB分子的存在，电位为正值，而修饰上羧基之后，电位下降为负值，可以证明羧基分子已经被成功修饰。
实施例3
多肽分子NapGFFK的固相合成，具体参见图2所示，包括以下步骤：
(3-1)取0.3g的2-氯三苯甲基氯树脂于多肽合成管中，加入2mlDMF，6分钟后除去DMF。
(3-2)将380.2mg Fmoc-lys(Boc)-OH溶于2ml DMF，加入145μl DIEA，加入含有树脂的多肽合成管中，在摇床下摇动2h后，加入130μl甲醇溶液，摇动5分钟。
(3-3)将产物用DMF洗涤三次后，加入2.5ml 20％的哌啶DMF溶液，震荡15分钟。
(3-4)将产物用DMF洗涤三次后，用Kaiser试剂进行检测氨基，如果显蓝色，说明氨基基团已经暴露，Fmoc-保护基已经脱除。
(3-5)将260.84mg Fmoc-Phe-OH、91mg HOBt、255.34mg HBTU溶于3ml DMF，加入120μl DIEA，加入多肽合成管中，在摇床上震荡2小时。
(3-6)将产物用DMF洗涤三次后，用Kaiser试剂进行检测氨基，如果显淡黄色，说明Fmoc-Phe-OH成功接上。
(3-7)重复上述(3-3)-(3-6)步反应后，再依次加入260.84mg Fmoc-Phe-OH、200mgFmoc-Gly-OH、125.36mg 2-萘乙酸。接上2-萘乙酸之后，分别用异丙醇和环己烷溶液洗涤三次，然后加入3ml 95％三氟乙酸(在二氯甲烷中)，震荡30min，将产物进行旋蒸，将旋蒸得到的粘稠液体滴入稀盐酸(1mol/L)中，析出白色沉淀，离心后真空干燥，最后将粗产物通过HPLC纯化。
图5为上述纯化后的产物TOF图，从图中可以看出，多肽分子的实际分子量显示为666，与多肽分子NapGFFK的理论分子量匹配。
实施例4
多肽自组装纳米凝胶制备，参见图1所示，具体步骤：
(4-1)将实施例2中制得的羧基改性后的Au NRs溶液溶于10mlMES缓冲溶液中(0.1mol/L)(pH＝5.5)，接着加入10mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳酰化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和10mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，缓慢搅拌30min，得到活化的Au NRs溶液。将活化的Au NRs溶液用高速离心机高速(9000rpm)离心之后，重新分散在2.5ml超纯水中，通过NaOH溶液将pH值调至9-10的状态。
(4-2)称取5mg多肽分子NapGFFK，加入2.5ml超纯水中溶解，也通过NaOH溶液将pH值调至9-10的状态，加入上一步(4-1)得到的Au NRs溶液中，缓慢搅拌12小时，得到金纳米棒基杂化纳米凝胶(Au NRs-Gel)。最后，通过高速离心机将溶液进行洗涤，高速(8000rpm)离心三次，得到Au NRs-Gel溶液，即为目的产物。
如图6所示，Au NRs-Gel与Au NRs相比，可以看到明显的凝胶层，呈现核壳结构。如图7所示，在生物应用中，通过体外超声成像实验，可以发现，分别通过PBS溶液、Au NRs溶液、Au NRs-Gel溶液作为造影剂进行超声成像，Au NRs-Gel溶液的成像效果明显。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，其特征在于，在金纳米棒表面修饰羧基并活化后，加入多肽分子发生酰胺反应，使得多肽分子自组装并沉积在金纳米棒表面，得到金纳米棒杂化纳米凝胶；所述的多肽分子为多肽分子NapGFFK。
2.根据权利要求1所述的多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，其特征在于，其具体包括以下步骤：
(1)取羧基修饰的Au NRs溶于MES缓冲溶液中，再加入EDC·HCl和NHS，搅拌，调节pH至9-10，得到活化Au NRs溶液；
(2)配制pH为9-10的多肽分子水溶液，并将其加入步骤(1)所得的活化Au NRs溶液中，搅拌反应，即得到金纳米棒基杂化纳米凝胶。
3.根据权利要求1或2所述的多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，其特征在于，所述的羧基修饰的Au NRs通过以下步骤制成：
(a)制备Au晶种溶液：
配制十六烷基三甲基溴化铵水溶液，加入HAuCl4溶液和超纯水，再往其中加入NaBH4溶液，搅拌反应；
(b)制备Au生长溶液：
称取CTAB粉末溶于超纯水中，依次加入HAuCl4溶液、AgNO3溶液、H2SO4溶液和抗坏血酸溶液，搅拌至溶液从黄色变为无色；
(c)Au NRs生长：
将步骤(b)制得的Au生长溶液保持30℃恒温，加入步骤(a)制得的Au晶种溶液，搅拌至溶液从无色变为紫红色，再继续搅拌50min后，停止搅拌并静置，得到Au NRs溶液；
(d)羧基修饰：
去除步骤(c)中得到的Au NRs溶液中过量CTAB，依次加入SH-PEG2000-COOH溶液和十二烷基硫酸钠溶液，震荡，搅拌，制得羧基改性的Au NRs溶液，去除过量SH-PEG2000-COOH后备用。
4.根据权利要求3所述的多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，其特征在于，步骤(a)中：
十六烷基三甲基溴化铵水溶液、HAuCl4溶液、超纯水和NaBH4溶液的添加量比为7.5ml：250μl：1650μl：600μl，其中，
十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为0.1mol/L，HAuCl4溶液的浓度为0.01mol/L，NaBH4溶液的浓度为0.01mol/L；
步骤(b)中：
CTAB粉末、超纯水、HAuCl4溶液、AgNO3溶液、H2SO4溶液和抗坏血酸溶液的添加量比为：3.644g：100ml：5ml：800μl：2ml：800μl，其中，
HAuCl4溶液浓度为0.01mol/L，AgNO3溶液的浓度为0.01mol/L，H2SO4溶液浓度为0.5mol/L，抗坏血酸溶液浓度为0.1mol/L；
步骤(c)中：
以制备Au生长溶液所需的AgNO3溶液计，每800μl AgNO3溶液对应的Au生长溶液中加入240μl Au晶种溶液；
步骤(d)中：
以制备Au NRs溶液所需的Au晶种溶液计，每240μl Au晶种溶液对应的Au NRs溶液中分别加入10ml SH-PEG2000-COOH溶液和500μl十二烷基硫酸钠溶液，其中，SH-PEG2000-COOH溶液的浓度为4mg/ml，十二烷基硫酸钠溶液的浓度为1wt％。
5.根据权利要求4所述的多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，其特征在于，步骤(a)中，搅拌反应的时间为2min，反应后保持30℃恒温2h；
步骤(c)中，静置条件为：在30℃恒温条件下静置18小时；
步骤(d)中，震荡时间为10s，随后在20℃下搅拌24h。
6.根据权利要求1或2所述的多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，其特征在于，所述的多肽分子通过固相合成法合成，其具体步骤为：
(A)：取2-氯三苯甲基氯树脂，加入DMF，6min后除去DMF，得到预处理2-氯三苯甲基氯树脂；
(B)：将赖氨酸Fmoc-lys(Boc)-OH(K)溶于DMF中，加入DIEA，随后加入到步骤(A)所得预处理2-氯三苯甲基氯树脂中，摇动，再加入无水甲醇，继续摇动；
(C)：将步骤(B)所得产物洗涤后，加入20％哌啶DMF溶液，震荡反应，以脱除Fmoc-保护基；
(D)：取苯丙氨酸Fmoc-Phe-OH(F)、HOBt、HBTU溶于DMF中，加入DIEA，所得混合液再加入步骤(C)所得产物中，在摇床上震荡，以接上苯丙氨酸Fmoc-Phe-OH(F)；
(E)：再往步骤(D)所得产物中加入Fmoc-Phe-OH(F)、Fmoc-Gly-OH(G)、2-萘乙酸(Nap)，反应得到多肽分子，洗涤，再继续加入95％三氟乙酸溶液，震荡，旋蒸，所得粘稠液体滴入稀盐酸中，析出白色沉淀，离心、干燥、纯化后，即得目的产物。
7.根据权利要求6所述的多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，其特征在于，以0.3g 2-氯三苯甲基氯树脂计：
步骤(A)中，加入的DMF为2ml；
步骤(B)中，Fmoc-lys(Boc)-OH为380.2mg，DMF为2ml，DIEA为145μl，无水甲醇为130μl；
步骤(C)中，20％哌啶DMF溶液为2.5ml；
步骤(D)中，Fmoc-Phe-OH为260.84mg，HOBt为91mg，HBTU为255.34mg，DMF为3ml，DIEA为120μl；
步骤(E)中，Fmoc-Phe-OH为260.84mg，Fmoc-Gly-OH为200mg，2-萘乙酸为125.36mg，95％三氟乙酸为3ml。
8.根据权利要求6所述的多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，其特征在于，步骤(B)中，加入甲醇溶液前的摇动时间为2h，加入甲醇溶液后的摇动时间为5min；
步骤(C)中，震荡的时间为15min；
步骤(D)中，震荡时间为2h；
步骤(E)中，震荡时间为30min。
9.根据权利要求2所述的多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，其特征在于，羧基修饰的Au NRs、EDC·HCl、NHS和多肽分子的添加量之比5mg：10mg：10mg：5mg。
10.根据权利要求2所述的多肽自组装合成金纳米棒基杂化纳米凝胶的方法，其特征在于，步骤(1)中搅拌时间为30min；
步骤(2)中，活化Au NRs溶液与多肽分子水溶液混合后，搅拌时间为12h。
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