CN105688226B - 一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体及制备方法和应用 - Google Patents

一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体及制备方法和应用，将羧基化金刚烷胺溶于二氯甲烷中，然后加入EDC和NHS，搅拌后，得到溶液；将胱胺溶于二氯甲烷中，加入至溶液中，得到含二硫键金刚烷胺，将EDC溶于水中，然后加入至GO‑COOH混悬液中，超声后，加入NH2‑SS‑PEG‑Ad，搅拌后透析，得到含二硫键金刚烷胺修饰的氧化石墨烯；将NGO‑SS‑Ad与环糊精混悬液混合，振荡后，得到环糊精修饰氧化石墨烯。本发明合成的超分子功能化氧化石墨烯核壳纳米药物载体通过π‑π相互作用和疏水作用，负载含有大π共轭结构的疏水性药物，双硫键可在肿瘤细胞内环境下快速裂解，实现超分子脱落，智能释放药物的功能。

Description

一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体及制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及一种纳米载体的制备方法，尤其涉及一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体及制备方法和应用。
背景技术
纳米氧化石墨烯(NGO)是一种价格低廉的纳米材料，具有独特的二维纳米结构和丰富的含氧官能团，可通过非共价作用负载水溶性或难溶性药物用于药物递释系统研究，且其装载率远超其他纳米材料，可高达200％。所以目前基于氧化石墨烯药物载体的研究备受众多研究者的关注(Z.Liu,J.T.Robinson,X.M.Sun,H.J.Dai,J.Am.Chem.Soc.2008,130,10876；L.M.Zhang,Z.X.Lu,Q.H.Zhao,J.Huang,H.Shen,Z.J.Zhang,Small 2011,7,460.)。
但是当分散介质为生理溶液，如磷酸盐缓冲溶液，DMEM细胞培养基时，溶液中的含盐组分会破坏NGO的水化层，使其片层的疏水区域暴露而发生聚集沉淀，妨碍了其在药物递释领域的研究与应用。采用侧链分子对氧化石墨烯进行功能化修饰，降低其表面电势，是改善其在生理溶液中分散稳定性的重要途径之一。同时，功能化氧化石墨烯的在增加溶解度和生理溶液稳定性的同时能够提高其生物相容性，延长药物的半衰期，提高药物的利用率。
环糊精(cyclodextrin，简称CD)，是廉价易得的多糖分子，其特殊的空腔结构具有良好的包合作用，推进了其在自组装、分子识别、药物递释等领域的应用研究。其中，α-CD、β-CD、γ-CD均可与金刚烷胺结合形成“主-客体”分子，通过实验测得结合常数Kaa:α-CD(183)＜γ-CD(306)＜＜β-CD(5150)(Liscieplak A.,Sitkowski J.,Kolodziejski W.,Journal of Phamaceutical Sciences,2014,103,272-284)。近年来，开发以环糊精为主体的超分子体系，成为医药领域的研究热点。但是环糊精的超分子作用比较强，会引起材料刚性作用的增强。结合超分子和氧化石墨烯各自的优势，将二者结合，一方面利用超分子侧链提高氧化石墨烯的生理稳定性，一方面利用氧化石墨烯来分散超分子的刚性作用，设计超分子可脱落的智能敏感的药物释放系统，达到肿瘤靶向治疗的作用。将超分子引入到氧化石墨烯作为药物载体上，目前科学界这方面的研究工作刚刚起步，研究报道甚少。目前极少量文献报导超分子修饰氧化石墨烯并用于药物载体的可能性，且报导中超分子修饰氧化石墨烯后不能敏感脱落，阻碍了药物的快速释放(H.Dong,Y.Li,J.Yu,Y.Song,X.Cai,J.Liu,J.zhang,R.C.Ewing,D.Shi,Small,2013,9,446-456.)。
发明内容
为解决现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体及制备方法和应用，此药物载体可根据肿瘤细胞内环境选择性敏感脱落，从而加速药物释放，该药物载体制备和装载药物方法简单，抗癌药物载药率高。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：
一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体，结构式为：
式中，-SS-为二硫键，R为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。
一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体，所述的药物载体粒径为50-300nm，其中，氧化石墨烯为单层氧化石墨烯。
一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)含二硫键金刚烷胺的制备
将羧基化金刚烷胺溶于二氯甲烷中，然后加入EDC和NHS，室温下氮气保护搅拌5h，得到溶液；将胱胺溶于二氯甲烷中，逐滴加入至溶液中，室温搅拌12-24h，然后加入到乙醚溶液中，出现沉淀，得到含二硫键金刚烷胺，记为NH2-SS-PEG-Ad，其中，羧基化金刚烷胺、EDC、NHS、胱胺的比为0.2mmol：0.65mmol：0.25mmol：1mmol；
(2)环糊精修饰氧化石墨烯的制备
将EDC溶于水中，然后加入至GO-COOH混悬液中，超声后，得到混合溶液，将NH2-SS-PEG-Ad加入混合溶液中，室温下搅拌均匀，然后透析除去未反应的物质，得到含二硫键金刚烷胺修饰的氧化石墨烯，记为NGO-SS-Ad；其中，EDC、水与GO-COOH混悬液的比为0.05mmol：2mL：10mL，EDC与GO-COOH混悬液中GO-COOH的比为0.05mmol：10mg；NH2-SS-PEG-Ad与GO-COOH混悬液的比为100mg：10mL；
将NGO-SS-Ad与环糊精混悬液混合，置于摇床内150rpm下振荡2-4h后，透析48-72h，然后干燥，得到环糊精修饰氧化石墨烯，记为NGO-SS-CD，其中NGO-SS-Ad与环糊精的质量比为(12～18):1；其中，环糊精为α-CD、β-CD或γ-CD。
步骤(1)中胱胺通过以下方法制得：将胱胺盐酸盐和NaOH溶解在水中，在室温下反应0.5h-2h，得到胱胺；其中，胱胺盐酸盐与NaOH的摩尔比为1：2。
GO-COOH混悬液通过以下方法制得：将GO-COOH加入到水中，形成1mg/mL的GO-COOH混悬液。
CD混悬液通过以下方法制得：将CD加入到水中，得到2mg/mL的CD混悬液。
羧基化金刚烷胺通过以下方法制得：
(1)聚乙二醇羧基化
将聚乙二醇加入到容器中，然后加入二甲基亚砜使聚乙二醇溶解，再加入无机碱溶液和氯乙酸，室温搅拌反应10-15h后，减压蒸馏除去溶剂，随后加入无水二氯甲烷，过滤除盐后将所得滤液进行旋转蒸发浓缩，得到浓缩液，将浓缩液加入到冷乙醚中，抽滤得到白色固状物，将所得白色固状物干燥，得羧基化聚乙二醇，记为PEG-COOH；其中，聚乙二醇、二甲基亚砜、氯乙酸、无水二氯甲烷的比为2.0mmol：(25-35)mL：20mmol：(100-150)mL；
(2)金刚烷胺的制备
将金刚烷胺盐酸盐和无机碱溶解在水中，室温下搅拌反应1-4h；然后用无水二氯甲烷进行萃取，收集有机相，旋转蒸发除去无水二氯甲烷后真空干燥，得到金刚烷胺；其中，金刚烷胺盐酸盐与无机碱的摩尔比为0.66：5；
(3)聚乙二醇羧基化金刚烷胺的制备
将金刚烷胺溶解在无水二氯甲烷中，得到含金刚烷胺的二氯甲烷溶液；将PEG-COOH和4-二甲氨基吡啶混合均匀，在50℃下真空干燥12-24h后，加入到含金刚烷胺的二氯甲烷溶液中，在氮气保护下，室温搅拌24-36h，得到含活化羧基的PEG-金刚烷胺溶液，随后将N,N'-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液在冰浴条件下逐滴滴加到含活化羧基的PEG-金刚烷胺溶液中进行酰胺缩合反应24-48h后，过滤，收集滤液并加入到冷乙醚中沉淀，将沉淀物真空干燥，得到白色粉末状的羧基化金刚烷胺，记为HOOC-PEG-Ad，其中，金刚烷胺与无水二氯甲烷的比为0.5mmol：(40-80)mL；PEG-COOH与4-二甲氨基吡啶的比为1.5mmol：(4.0-5.0)mmol。
所述步骤(1)中聚乙二醇羧基化中聚乙二醇的Mw＝2000，纯度为99％；无机碱溶液为NaOH溶液或KOH溶液；无机碱溶液的质量分数为40％，加入量与聚乙二醇的比为(10-15)mL：2.0mmol；干燥是在真空下于30℃下进行的。
所述步骤(2)中金刚烷胺的制备中无机碱为NaOH或KOH；金刚烷胺盐酸盐与水的比为0.66mmol：(20-30)mL。
一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体在负载抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：本发明通过先制备含二硫键金刚烷胺，再制备环糊精修饰氧化石墨烯，本发明合成的超分子功能化氧化石墨烯核壳纳米药物载体通过π-π相互作用和疏水作用，负载含有大π共轭结构的疏水性药物，双硫键可在肿瘤细胞内环境下快速裂解，实现超分子脱落，智能释放药物的功能。本发明较其他药物载体，如脂质体，聚合物胶束的载药率有很大提高，高达81.47％。在本发明中，该氧化石墨烯药物载体经超分子修饰后可大幅提高药物释放率，本发明的难点为含NGO-SS-Ad的合成，氧化石墨烯上链接金刚烷胺的多少决定了后续超分子的含量，决定了氧化石墨烯在水中稳定性。本发明中合成步骤中含二硫键金刚烷胺修饰的氧化石墨烯(NGO-SS-Ad)与超分子与的最佳质量比为(12-18):1。
进一步的，本发明中合成步骤中含二硫键金刚烷胺修饰的氧化石墨烯(NGO-SS-Ad)与超分子与的最佳质量比为15:1。
附图说明
图1为本发明实施例1中环糊精修饰的氧化石墨烯NGO-SS-CD药物载体的合成路线图；
图2是本发明实施例1制备的聚乙二醇PEG、羧基化聚乙二醇PEG-COOH、聚乙二醇接金刚烷胺PEG-Ad的红外吸收图谱；
图3是本发明实施例1制备的环糊精修饰的氧化石墨烯NGO-SS-CD的红外吸收图谱；
图4是本发明实施例1制备的NGO-SS-CD的TEM图；
图5是本发明实施例1制备的NGO-SS-CD的SEM图；
图6是本发明实施例1制备的抗癌药物和载药后的超分子修饰氧化石墨烯药物载体的荧光图谱；
图7是本发明实施例1制备的药物载体载药后的超分子修饰氧化石墨烯药物载体，在加入不同量的乙醇后的荧光光谱。
图8是本发明实施例1制备的药物载体在模拟肿瘤细胞内谷胱甘肽环境下，不同PH中的药物释放曲线。
图9是本发明实施例1制备的NGO-SS-CD药物载体在不同浓度谷胱甘肽条件下的肝癌(HepG2)细胞增殖图。
具体实施方式
以下通过结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于这些实施例。
为了提高纳米载体在生理溶液中的稳定性，并有效地应用于药物载体治疗，本发明首先设计富含双硫键的氧化石墨烯纳米粒子，再对其进行环糊精超分子修饰，最后负载抗肿瘤药物，制备的药物载体在EPR效应下进入肿瘤细胞内，在肿瘤细胞内还原敏感环境下双硫键断裂，超分子敏感脱落，达到药物从载体上快速释放的目的。
以下利用β-环糊精为亲水性超分子修饰氧化石墨烯纳米材料为例，对本发明超分子可敏感脱落的氧化石墨烯药物载体的制备，功能发挥及效果作全面而详细的介绍，合成路线图如附图1所示。
本发明的超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体，结构式为：
式中，-SS-为二硫键，R为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。
所述的药物载体粒径为50-300nm，其中，氧化石墨烯为单层氧化石墨烯。
实施例1
参见图1，一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)聚乙二醇羧基化
将聚乙二醇(PEG，Mw＝2000，纯度为99％，2.0mmol)置于圆底烧瓶中，然后向圆底烧瓶中加入30mL二甲基亚砜使聚乙二醇溶解。再加入10mL质量分数为40％的NaOH溶液和氯乙酸20mmol。室温搅拌反应10h后，减压蒸馏除去溶剂，随后向其中加入100mL无水二氯甲烷。过滤除盐，旋转蒸发浓缩滤液，得到浓缩液，将浓缩液加入到冷乙醚中，出现沉淀，抽滤得到白色固状物，将所得白色固状物于30℃下真空干燥，即得羧基化聚乙二醇(PEG-COOH)。
(2)金刚烷胺的制备
将金刚烷胺盐酸盐0.66mmol和NaOH 5mmol溶解在20mL的水中，室温下搅拌反应1h；然后用100mL的无水二氯甲烷(DCM)进行萃取，收集有机相，旋转蒸发除去无水二氯甲烷后真空干燥，得到金刚烷胺。产率为78.6％。
(3)聚乙二醇羧基化金刚烷胺的制备
将金刚烷胺0.5mmol溶解在40mL无水二氯甲烷中，得到含金刚烷胺的二氯甲烷溶液；将PEG-COOH(1.5mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP；5.0mmol)混合均匀，在50℃下真空干燥12h后，加入到含金刚烷胺的二氯甲烷溶液中，在氮气保护下，室温搅拌30h，得到含活化羧基的PEG-金刚烷胺溶液；随后将N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)的二氯甲烷溶液(5mL，1mol/L)于冰浴条件下，5分钟内逐滴滴加到含活化羧基的PEG-金刚烷胺溶液中进行酰胺缩合反应，具体是在室温下搅拌反应24h后，过滤除去不溶的副产物二环己基脲，收集滤液并加入到冷乙醚中沉淀，将沉淀物真空干燥，得到白色粉末状的羧基化金刚烷胺，记为HOOC-PEG-Ad，产率为83.76％。
(4)含二硫键金刚烷胺的制备
将胱胺盐酸盐1mmol和NaOH 2mmol溶解在水中，在室温下反应2h，然后减压蒸馏除水，再加入无水DCM震荡，过滤除盐，将滤液旋蒸除去二氯甲烷后真空干燥10h，得到胱胺。
称取HOOC-PEG-Ad(羧基化金刚烷胺)0.2mmol溶于20mLDCM(二氯甲烷)后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)0.65mmol和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.25mmol，室温下氮气保护搅拌5h，得到溶液。将胱胺1mmol溶于DCM后，逐滴加入至上述溶液，室温下搅拌12h，然后加入到乙醚溶液中，出现沉淀，得到终产物含二硫键金刚烷胺(NH2-SS-PEG-Ad)，真空干燥备用。
(5)β-环糊精修饰氧化石墨烯的制备
将GO-COOH(氧化石墨烯)加入到水中，形成1mg/mL的GO-COOH混悬液中；
将EDC 0.05mmol溶于2mL水中，然后加入至10mL GO-COOH混悬液中，超声5-10min，得到混合溶液，向混合溶液中加入NH2-SS-PEG-Ad 100mg，室温下搅拌24h，然后透析除去未反应的物质，得到含二硫键金刚烷胺修饰的氧化石墨烯，记为NGO-SS-Ad。
将β-CD加入到水中，得到2mg/mL的β-CD混悬液；将NGO-SS-Ad与β-CD混悬液混合，置于摇床内150rpm下振荡2h后，透析48h，然后冷冻干燥，得到终产物β-环糊精修饰氧化石墨烯(记为：NGO-SS-CD)，其中NGO-SS-Ad与β-CD的质量比为15:1。
实施例2
一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)聚乙二醇羧基化
将聚乙二醇(PEG，Mw＝2000，纯度为99％，2.0mmol)置于圆底烧瓶中，然后向圆底烧瓶中加入25mL二甲基亚砜使聚乙二醇溶解。再加入15mL质量分数为40％的KOH溶液和氯乙酸20mmol。室温搅拌反应12h后，减压蒸馏除去溶剂，随后向其中加入150mL无水二氯甲烷。过滤除盐，旋转蒸发浓缩滤液，得到浓缩液，将浓缩液加入到冷乙醚中，出现沉淀，抽滤得到白色固状物，将所得白色固状物于30℃下真空干燥，即得羧基化聚乙二醇(PEG-COOH)。
(2)金刚烷胺的制备
将金刚烷胺盐酸盐0.66mmol和KOH 5mmol溶解在30mL的水中，室温下搅拌反应4h；然后用200mL的无水二氯甲烷(DCM)进行萃取，收集有机相，旋转蒸发除去无水二氯甲烷后真空干燥，得到金刚烷胺。产率为75％。
(3)聚乙二醇羧基化金刚烷胺的制备
将金刚烷胺0.5mmol溶解在60mL无水二氯甲烷中，得到含金刚烷胺的二氯甲烷溶液；将PEG-COOH(1.5mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP；4.0mmol)混合均匀，在50℃下真空干燥24h后，加入到含金刚烷胺的二氯甲烷溶液中，在氮气保护下，室温搅拌24h，得到含活化羧基的PEG-金刚烷胺溶液；随后将N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)的二氯甲烷溶液(5mL，1mol/L)于冰浴条件下，5分钟内逐滴滴加到含活化羧基的PEG-金刚烷胺溶液中进行酰胺缩合反应，具体是在室温下搅拌反应32h后，过滤除去不溶的副产物二环己基脲，收集滤液并加入到冷乙醚中沉淀，将沉淀物真空干燥，得到白色粉末状的羧基化金刚烷胺，记为HOOC-PEG-Ad，产率为85％。
(4)含二硫键金刚烷胺的制备
将胱胺盐酸盐1mmol和NaOH 2mmol溶解在水中，在室温下反应0.5h，然后减压蒸馏除水，再加入无水DCM震荡，过滤除盐，将滤液旋蒸除去二氯甲烷后真空干燥12h，得到胱胺。
称取HOOC-PEG-Ad(羧基化金刚烷胺)0.2mmol溶于25mL的DCM(二氯甲烷)后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)0.65mmol和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.25mmol，室温下氮气保护搅拌5h，得到溶液。将胱胺1mmol溶于DCM后，逐滴加入至上述溶液，室温下搅拌24h，然后加入到乙醚溶液中，出现沉淀，得到终产物含二硫键金刚烷胺(NH2-SS-PEG-Ad)，真空干燥备用。
(5)α-环糊精修饰氧化石墨烯的制备
将GO-COOH(氧化石墨烯)加入到水中，形成1mg/mL的GO-COOH混悬液中；
将EDC 0.05mmol溶于2mL水中，然后加入至10mL GO-COOH混悬液中，超声5-10min，得到混合溶液，向混合溶液中加入NH2-SS-PEG-Ad 100mg，室温下搅拌24h，然后透析除去未反应的物质，得到含二硫键金刚烷胺修饰的氧化石墨烯，记为NGO-SS-Ad。
将α-CD加入到水中，得到2mg/mL的α-CD混悬液；将NGO-SS-Ad与α-CD混悬液混合，置于摇床内150rpm下振荡4h后，透析72h，冷冻干燥，得到终产物α-环糊精修饰氧化石墨烯(NGO-SS-CD)，其中NGO-SS-Ad与α-CD的质量比为18:1。
实施例2所制得的药物载体(即α-环糊精修饰氧化石墨烯)粒径为50-300nm，其中，氧化石墨烯为单层氧化石墨烯。
实施例3
一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)聚乙二醇羧基化
将聚乙二醇(PEG，Mw＝2000，纯度为99％，2.0mmol)置于圆底烧瓶中，然后向圆底烧瓶中加入35mL二甲基亚砜使聚乙二醇溶解。再加入10mL质量分数为40％的NaOH溶液和氯乙酸20mmol。室温搅拌反应15h后，减压蒸馏除去溶剂，随后向其中加入120mL无水二氯甲烷。过滤除盐，旋转蒸发浓缩滤液，得到浓缩液，将浓缩液加入到冷乙醚中，出现沉淀，抽滤得到白色固状物，将所得白色固状物于30℃下真空干燥，即得羧基化聚乙二醇(PEG-COOH)。
(2)金刚烷胺的制备
将金刚烷胺盐酸盐0.66mmol和NaOH 5mmol溶解在20mL的水中，室温下搅拌反应2h；然后用100mL的无水二氯甲烷(DCM)进行萃取，收集有机相，旋转蒸发除去无水二氯甲烷后真空干燥，得到金刚烷胺。产率为76％。
(3)聚乙二醇羧基化金刚烷胺的制备
将金刚烷胺0.5mmol溶解在80mL无水二氯甲烷中，得到含金刚烷胺的二氯甲烷溶液；将PEG-COOH(1.5mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP；4.5mmol)混合均匀，在50℃下真空干燥17h后，加入到含金刚烷胺的二氯甲烷溶液中，在氮气保护下，室温搅拌36h，得到含活化羧基的PEG-金刚烷胺溶液；随后将N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)的二氯甲烷溶液(5mL,1mol/L)于冰浴条件下，5分钟内逐滴滴加到含活化羧基的PEG-金刚烷胺溶液中进行酰胺缩合反应，具体是在室温下搅拌反应48h后，过滤除去不溶的副产物二环己基脲，收集滤液并加入到冷乙醚中沉淀，将沉淀物真空干燥，得到白色粉末状的羧基化金刚烷胺，记为HOOC-PEG-Ad，产率为82％。
(4)含二硫键金刚烷胺的制备
将胱胺盐酸盐1mmol和NaOH 2mmol溶解在水中，在室温下反应1h，然后减压蒸馏除水，再加入无水DCM震荡，过滤除盐，将滤液旋蒸除去二氯甲烷后真空干燥8h，得到胱胺。
称取HOOC-PEG-Ad(羧基化金刚烷胺)0.2mmol溶于30mL DCM(二氯甲烷)后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)0.65mmol和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.25mmol，室温下氮气保护搅拌5h，得到溶液。将胱胺1mmol溶于DCM后，逐滴加入至上述溶液，室温下搅拌20h，然后加入到乙醚溶液中，出现沉淀，得到终产物含二硫键金刚烷胺(NH2-SS-PEG-Ad)，真空干燥备用。
(5)γ-环糊精修饰氧化石墨烯的制备
将GO-COOH(氧化石墨烯)加入到水中，形成1mg/mL的GO-COOH混悬液中；
将EDC 0.05mmol溶于2mL水中，然后加入至10mL GO-COOH混悬液中，超声5-10min，得到混合溶液，向混合溶液中加入NH2-SS-PEG-Ad 100mg，室温下搅拌24h，然后透析除去未反应的物质，得到含二硫键金刚烷胺修饰的氧化石墨烯，记为NGO-SS-Ad。
将γ-CD加入到水中，得到2mg/mL的γ-CD混悬液；将NGO-SS-Ad与γ-CD混悬液混合，置于摇床内150rpm下振荡3h后，透析60h，冷冻干燥，得到终产物γ-环糊精修饰氧化石墨烯(NGO-SS-CD)，其中NGO-SS-Ad与γ-CD的质量比为12:1。
实施例3所制得的药物载体(即γ-环糊精修饰氧化石墨烯)粒径为50-300nm，其中，氧化石墨烯为单层氧化石墨烯。
实施例1所得产物经DLS分析，粒径为243nm。
红外分析连接金刚烷胺后的PEG-Ad在1627.84cm-1处出现了较强的酰胺键的特征吸收Ⅰ带，且在1480cm-1处出现了的-HN-C＝O的吸收Ⅱ带(图2)。图3为NGO-SS-CD的红外谱图，从图中可以看出1618cm-1处的酰胺键的特征吸收Ⅰ带且1400cm-1处出现了较强的-HN-C＝O吸收Ⅱ带，属于NGO-SS-CD中酰胺键的特征吸收峰，说明超分子环糊精与NGO成功连接。
所得产物NGO-SS-CD进行TEM和SEM分析，图4所示TEM可见NGO-SS-CD明显的薄片层结构，说明环糊精的超分子作用力克服了NGO片层间的范德华作用力。图5所示SEM可以看出，超分子功能化后的NGO-SS-CD片层透明呈薄纱状，整体片层翘曲明显，在片层边缘存在褶皱。这是由于NGO中sp3杂化碳原子的引入导致平面状sp2结构出现扰动，而自发形成的堆垛和翘曲。大部分视野范围内均可见良好的单片层结构，且片层的弯曲褶皱明显，说明NGO-SS-CD的成功制备，且其片层较薄，比表面积大，可作为载体负载药物用于药物递释研究。
下面是本发明制得的β-环糊精修饰氧化石墨烯的性能测试：
1.β-环糊精修饰氧化石墨烯对抗肿瘤药物盐酸阿霉素(DOX·HCl)的负载
按照实施例1的方法制备环糊精修饰的氧化石墨烯，然后在氧化石墨烯表面负载药物。
将抗肿瘤药物阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)通过π-π作用和疏水作用负载于NGO-SS-CD药物载体上，操作步骤如下：向NGO-SS-CD(5mL,0.05mg/mL)加入DOX·HCl(1mL,250μg/ml)，将此混合物超声0.5h。在避光条件下，室温搅拌24h。所得溶液经MW:10～12kDa透析袋透析除去未负载的DOX·HCl即得终产物NGO-SS-CD/DOX·HCl。
阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)和负载盐酸阿霉素的氧化石墨烯(NGO-SS-CD/DOX·HCl)的荧光光谱如图6所示。阿霉素盐酸盐可以看出明显的荧光特性，而载药体系NGO-SS-CD/DOX·HCl则会出现明显的荧光淬灭。此过程有两种解释，一种是荧光共振能量转移(FRET)现象。另一种是电子转移猝灭机理。向载药体系中加入不同量的乙醇后的荧光光谱图如图7所示。当向水相体系中逐渐加入乙醇时，载药体系出现荧光复活现象。阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)和负载盐酸阿霉素的氧化石墨烯(NGO-SS-CD/DOX·HCl)的荧光光谱以及加入乙醇前后药物载体的荧光光谱吸收变化证实DOX·HCl成功负载在载体NGO-SS-CD表面。
2.超分子敏感脱落智能释药行为研究
NGO-SS-CD/DOX·HCl载药系统具有肿瘤细胞内高谷胱甘肽(GSH)响应性，本发明探究了在不同GSH环境与pH条件下的药物释放行为。
如图8所示，DOX·HCl的释放曲线因pH条件及有无GSH的不同而不同。在pH＝7.4，无GSH条件下，72h内仅有12.13％的DOX·HCl从载体NGO-SS-CD上释放，且过程平缓无突释。这是由于NGO-SS-CD在pH＝7.4，无GSH条件下能稳定存在，故药物DOX·HCl很难从载体上脱落释放。而在pH＝7.4，10mM GSH条件下，72h内也仅有19.18％的DOX·HCl从载体NGO-SS-CD上释放，说明当双硫键断裂后由于外环境pH＝7.4，所以DOX·HCl的释放没有出现很大的增加。在pH＝5.5，无GSH条件下，72h内DOX·HCl的释放量可达42.43％；而在pH＝5.5，10mMGSH条件下，72h内DOX·HCl的释放量高达80.71％，这说明谷胱甘肽和pH值同时敏感调控药物释放。
3.肿瘤细胞毒性分析
按照上述β-环糊精修饰氧化石墨烯对抗肿瘤药物盐酸阿霉素(DOX·HCl)的负载中合成药物载体，以人肝癌细胞HepG2为肿瘤细胞模型来做初步研究，采用MTT法考察NGO-SS-CD与NGO-SS-CD/DOX·HCl对HepG2细胞的增殖抑制作用。如图9所示，在2mM GSH条件下，可看到随着药物浓度的增大，载药体系使肝癌细胞的增殖率降低至26.38％。说明在谷胱甘肽条件下，载体上双硫键断裂，超分子修饰链与NGO分离，使得GO与DOX·HCl之间的作用减弱，药物从GO上脱落，释放速度加快，细胞存活率降低。
本发明制备的超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体在负载抗肿瘤药物中的应用。
本发明的超分子修饰氧化石墨烯药物载体是由双硫键桥连氧化石墨烯和亲水性高分子的智能敏感型药物载体。其中，亲水性高分子为超分子，聚乙二醇或亲水性天然高分子(亲水性天然高分子包括透明质酸、环糊精、壳聚糖、果胶或海藻酸)。氧化石墨烯连接包埋客体之后，再将其与包埋主体结合。包埋客体包括有机分子、无机离子和过渡金属配合物等。有机分子包括金刚烷胺、二茂铁等。具体的包埋体为α-环糊精，β-环糊精等。药物选自紫杉醇、喜树碱、酞菁、盐酸阿霉素、顺铂、卡铂中的一种或多种混合物。智能敏感为谷胱甘肽敏感，二硫苏糖醇敏感中的一种。此载药的超分子氧化石墨烯药物载体，在肿瘤细胞内高还原环境下，双硫键断裂，可快速释放抗癌药。此肿瘤细胞包括HepG2细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞等。
本发明公开了一种基于双硫键构筑的超分子包覆氧化石墨烯的功能化纳米药物载体及其制备方法，该功能化氧化石墨烯纳米药物载体是一种超分子可敏感脱落的智能药物载体。制备过程主要包括氧化石墨烯的制备、含双硫键包埋客体的制备和超分子功能化氧化石墨烯纳米药物载体的制备三个步骤。本发明合成的超分子功能化氧化石墨烯纳米药物载体通过π-π相互作用和疏水作用，负载含有大π共轭结构的疏水性药物，双硫键可在肿瘤细胞内环境下快速裂解，实现超分子脱落，智能释放药物的功能。本发明较其他药物载体，如脂质体，聚合物胶束的药物载药率有很大提高，高达81.47％。在本发明中，该氧化石墨烯药物载体经超分子修饰后可大幅提高药物释放率，本发明的难点为含NGO-SS-Ad的合成，氧化石墨烯上链接金刚烷胺的多少决定了后续超分子的含量，决定了氧化石墨烯在水中稳定性。本发明中合成步骤中含二硫键金刚烷胺修饰的氧化石墨烯(NGO-SS-Ad)与超分子与的最佳质量比为15:1。本发明材料成本低廉，合成步骤简单、高效，尤其适用于作为药物载体材料。

Claims (7)

1.一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体，其特征在于，结构式为：
式中，-SS-为二硫键，R为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精；
所述的药物载体粒径为50-300nm，其中，氧化石墨烯为单层氧化石墨烯。
2.一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)含二硫键金刚烷胺的制备
将羧基化金刚烷胺溶于二氯甲烷中，然后加入EDC和NHS，室温下氮气保护搅拌5h，得到溶液；将胱胺溶于二氯甲烷中，逐滴加入至溶液中，室温搅拌12-24h，然后加入到乙醚溶液中，出现沉淀，得到含二硫键金刚烷胺，记为NH2-SS-PEG-Ad，其中，羧基化金刚烷胺、EDC、NHS、胱胺的比为0.2mmol：0.65mmol：0.25mmol：1mmol；
步骤(1)中胱胺通过以下方法制得：将胱胺盐酸盐和NaOH溶解在水中，在室温下反应0.5h-2h，得到胱胺；其中，胱胺盐酸盐与NaOH的摩尔比为1：2；
(2)环糊精修饰氧化石墨烯的制备
将EDC溶于水中，然后加入至GO-COOH混悬液中，超声后，得到混合溶液，将NH2-SS-PEG-Ad加入混合溶液中，室温下搅拌均匀，然后透析除去未反应的物质，得到含二硫键金刚烷胺修饰的氧化石墨烯，记为NGO-SS-Ad；其中，EDC、水与GO-COOH混悬液的比为0.05mmol：2mL：10mL，EDC与GO-COOH混悬液中GO-COOH的比为0.05mmol：10mg；NH2-SS-PEG-Ad与GO-COOH混悬液的比为100mg：10mL；其中，GO-COOH混悬液通过以下方法制得：将GO-COOH加入到水中，形成1mg/mL的GO-COOH混悬液；
将NGO-SS-Ad与环糊精混悬液混合，置于摇床内150rpm下振荡2-4h后，透析48-72h，然后干燥，得到环糊精修饰氧化石墨烯，记为NGO-SS-CD，其中NGO-SS-Ad与环糊精的质量比为(12～18):1；其中，环糊精为α-CD、β-CD或γ-CD。
3.根据权利要求2所述的一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体的制备方法，其特征在于，环糊精混悬液通过以下方法制得：将环糊精加入到水中，得到2mg/mL的环糊精混悬液。
4.根据权利要求2所述的一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体的制备方法，其特征在于，羧基化金刚烷胺通过以下方法制得：
(a)聚乙二醇羧基化
将聚乙二醇加入到容器中，然后加入二甲基亚砜使聚乙二醇溶解，再加入无机碱溶液和氯乙酸，室温搅拌反应10-15h后，减压蒸馏除去溶剂，随后加入无水二氯甲烷，过滤除盐后将所得滤液进行旋转蒸发浓缩，得到浓缩液，将浓缩液加入到冷乙醚中，抽滤得到白色固状物，将所得白色固状物干燥，得羧基化聚乙二醇，记为PEG-COOH；其中，聚乙二醇、二甲基亚砜、氯乙酸、无水二氯甲烷的比为2.0mmol：(25-35)mL：20mmol：(100-150)mL；
(b)金刚烷胺的制备
将金刚烷胺盐酸盐和无机碱溶解在水中，室温下搅拌反应1-4h；然后用无水二氯甲烷进行萃取，收集有机相，旋转蒸发除去无水二氯甲烷后真空干燥，得到金刚烷胺；其中，金刚烷胺盐酸盐与无机碱的摩尔比为0.66：5；
(c)聚乙二醇羧基化金刚烷胺的制备
将金刚烷胺溶解在无水二氯甲烷中，得到含金刚烷胺的二氯甲烷溶液；将PEG-COOH和4-二甲氨基吡啶混合均匀，在50℃下真空干燥12-24h后，加入到含金刚烷胺的二氯甲烷溶液中，在氮气保护下，室温搅拌24-36h，得到含活化羧基的PEG-金刚烷胺溶液，随后将N,N'-二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液在冰浴条件下逐滴滴加到含活化羧基的PEG-金刚烷胺溶液中进行酰胺缩合反应24-48h后，过滤，收集滤液并加入到冷乙醚中沉淀，将沉淀物真空干燥，得到白色粉末状的羧基化金刚烷胺，记为HOOC-PEG-Ad，其中，金刚烷胺与无水二氯甲烷的比为0.5mmol：(40-80)mL；PEG-COOH与4-二甲氨基吡啶的比为1.5mmol：(4.0-5.0)mmol。
5.根据权利要求4所述的一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中聚乙二醇羧基化中聚乙二醇的Mw＝2000，纯度为99％；无机碱溶液为NaOH溶液或KOH溶液；无机碱溶液的质量分数为40％，加入量与聚乙二醇的比为(10-15)mL：2.0mmol；干燥是在真空下于30℃下进行的。
6.根据权利要求4所述的一种超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中金刚烷胺的制备中无机碱为NaOH或KOH；金刚烷胺盐酸盐与水的比为0.66mmol：(20-30)mL。
7.一种如权利要求1所的超分子可敏感脱落的氧化石墨烯智能药物载体在负载抗肿瘤药物中的应用。
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