CN105832676B - 一种三氧化二砷白蛋白纳米药物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三氧化二砷纳米给药系统的制备方法，包括以下步骤：（1）将三氧化二砷粉末溶解于氢氧化钠溶液，然后用稀盐酸调pH，配成三氧化二砷溶液，备用于白蛋白载药；将标记叶酸分子的人血清白蛋白溶解于不含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液中，得人血清白蛋白溶液，向人血清白蛋白溶液中加入二硫键还原剂于水浴锅中轻柔搅拌反应，得二硫键还原剂处理过的白蛋白溶液；（2）向二硫键还原剂处理过的白蛋白溶液中加入三氧化二砷溶液，室温搅拌，得三氧化二砷白蛋白混合溶液；（3）将三氧化二砷白蛋白混合溶液放入透析袋，并于低温D‑PBS溶液透析除去多余的三氧化二砷和二硫键还原剂及其副产物，得三氧化二砷白蛋白纳米药物。

Description

一种三氧化二砷白蛋白纳米药物的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种三氧化二砷的白蛋白载药纳米系统的构建及抗癌应用。
背景技术
三氧化二砷(As2O3，ATO)是中药砒霜的主要成分，在现代医学和中医药领域中，已经被广泛用于治疗恶性肿瘤等多种疾病，尤其是对急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocytic leukemia，APL)的治疗取得了完全缓解的显著疗效，诱导APL分化和凋亡。天然砷剂化合物作为药物应用已有2400多年的临床应用。最近研究表明，ATO对慢性骨髓性白血病和恶性实体瘤亦具有强大的抗肿瘤作用，但是单纯ATO对非APL的治疗存在一些问题：(1)ATO的水溶液形式为亚砷酸(As(OH)3)，易于透过磷脂双分子层，严重制约了ATO在细胞内滞留；(2)ATO在生物体有85％～95％先与血液中的血红蛋白结合再分布到其他组织中，故在生物体内分布快，血浆中砷的半衰期短(约35分钟)，给药后短时间内就会被迅速清除,同时引起毒副作用；(3)现有ATO抗癌给药途径为静脉滴注，由于血液循环可使ATO弥散至周围组织,这样不仅使到达肿瘤部位的药物浓度相对较低,而且还会给患者带来严重的不良反应；(4)ATO发挥抗癌效应依赖于其很强的毒性，故局限于其直接使用时剂量要保持比较低，这随之限制了ATO的抗癌疗效指数低；对针对慢性随性白血病和其他恶性肿瘤需当治疗剂量比较高时，单纯的ATO带来的毒副作用更加显著，严格限制了其临床治疗的推广使用。
针对这些问题，提高ATO的血液循环时间，降低其毒性，已成为国内外研究者重点关注解决的科学问题。近年来，广大科研工作者提出将砷化合物制备成缓释制剂，以延长其在体内的半衰期，其中尤以脂质体研究最为广泛。但脂质体稳定性不够好，包封药物后容易泄露，会带来一定的毒副作用，且对离子型ATO的包裹技术难度比常规的有机小分子药物要求更高。另外，传统缓释制剂没有靶向性，给药后分布全身各个器官，很大程度上减弱了药物的抗癌疗效；同时，脂质体的纳米尺寸比有机小分子或蛋白质的要大许多(通常在100～200nm)，脂质体载药系统进入人体后，难以逃避机体免疫系统中巨噬细胞对异物的吞噬作用，导致最终达到病变部位发挥药效的剂量远远降低。此外，脂质体的制备工艺相对比较复杂，需要根据药物分子性质调整脂质体组成的比例和有机溶剂溶媒等。鉴于上述因素，构建一种可以简单、高效、稳定地装载ATO的靶向抗肿瘤纳米给药系统，提高其抗癌效果，降低毒副作用，拓展临床使用范围，具有十分重大的科学意义和临床价值。
发明内容
本发明针对现有三氧化二砷在非急性早幼粒细胞白血病癌症临床治疗中存在严重毒副作用、没有靶向性及半衰期短等不足，构建了一种新型、操作简单及具有靶向的三氧化二砷纳米载药系统的制备方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述三氧化二砷白蛋白纳米药物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将三氧化二砷(As2O3，ATO)粉末溶解于氢氧化钠溶液，然后用浓度为1M的稀盐酸调pH至5.0—6.5，配成浓度为5—10mg/mL的三氧化二砷储备溶液，备用于白蛋白载药；将标记叶酸分子的人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)溶解于不含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，D-PBS，50mg/mL)中，得白蛋白浓度为30—100mg/mL，优选为50mg/mL的人血清白蛋白溶液，向人血清白蛋白溶液中加入二硫键还原剂谷胱甘肽(GSH)于37℃水浴锅中轻柔搅拌反应0.5—2h，优选1h，二硫键还原剂加入到人血清白蛋白溶液中的终浓度为30—100mM，得二硫键还原剂处理过的白蛋白溶液；
(2)向二硫键还原剂处理过的白蛋白溶液中加入三氧化二砷溶液，三氧化二砷加入到白蛋白溶液中的终浓度为0.5—5mg/mL，室温搅拌1—6h，优选2h，得三氧化二砷白蛋白混合溶液；
(3)将三氧化二砷白蛋白混合溶液放入透析袋(分子量为8-14KD)，并于低温D-PBS溶液透析除去多余的三氧化二砷和二硫键还原剂及其副产物后(数次，24h)，得三氧化二砷白蛋白纳米药物。
优选地，步骤(1)所述二硫键还原剂GSH的浓度为30—100mM，优选60mM的谷胱甘肽(GSH)。步骤(2)所述三氧化二砷溶液中三氧化二砷浓度为0.5—5mg/mL。步骤(3)所述三氧化二砷白蛋白纳米药物中三氧化二砷与人血清白蛋白的摩尔分子比为(3—8)：1。
下面对本发明作进一步说明：
本发明步骤(1)中所用氢氧化钠浓度不低于1M为好，利于充分溶解ATO，具体取决于ATO配备的浓度；所用稀盐酸浓度为1M，但不局限于1M；ATO的储备用浓度不局限于5—10mg/mL；pH值为5.0—6.5。步骤(1)中所用D-PBS可用PBS等缓冲溶液替代，白蛋白浓度可为30—100mg/mL，最优化50mg/mL；GSH终浓度为30—100mM，最优化60mM；于37℃水浴锅中轻柔搅拌反应时间可为0.5—2h，最优为1小时。
步骤(2)中所加入ATO的终浓度可为0.5—5mg/mL，最优化2.5mg/mL；室温轻柔搅拌反应时间可为1—6小时，最优为2小时。
步骤(3)中所用透析袋可用透析管或其他替代装置，分子截留大小不低于1000即可。
本发明采用机体需要的人血清白蛋白和肿瘤细胞异常高表达的叶酸受体的配体叶酸(Folate,FA)作为载药载体和靶向介导，利用人血清白蛋白可生物吸收降解，完全生物相容，良好溶解性，低维纳米尺寸，长半衰期，癌症被动靶向及其富含二硫键等特点，通过GSH还原人血清白蛋白内部分二硫键，利用亚砷酸的三价砷-硫键亲和作用，成功构建了一种尺寸均一，分散性好的三氧化二砷白蛋白纳米靶向给药系统，有望应用于癌症尤其叶酸受体高表达肿瘤的靶向治疗。
附图说明
图1为三氧化二砷白蛋白纳米给药系统的制备方法示意图；
图2为三氧化二砷白蛋白纳米给药系统的UV-Vis图；
图3为三氧化二砷白蛋白纳米给药系统的TEM图；
图4为三氧化二砷白蛋白纳米给药系统的DLS图；
图5为三氧化二砷白蛋白纳米给药系统的-SH检测图；
图6为三氧化二砷白蛋白纳米给药系统的CD图；
图7为三氧化二砷白蛋白纳米给药系统的稳定性；
图8为三氧化二砷白蛋白纳米给药系统的释放情况。
具体实施方式
以下通过实施案例对本发明做进一步的阐述，但本发明不限于此。实验者可根据实际需要选择性在人血清白蛋白表明单独修饰靶向分子FA及同时标记荧光监测分子FITC，CY5等，从而可以获得三氧化二砷白蛋白纳米给药系统。
本发明使用的载体为人血清白蛋白HSA，示范为叶酸FA修饰的HSA(FA-HSA)及同时标记FITC的FA/FITC-HSA，也可以为其他靶向分子修饰的HSA，如核酸适配体、靶向肽或其他靶向配体及同时标记荧光监测分子FITC，CY5等。
实施例1三氧化二砷白蛋白纳米给药系统的制备(FA-HSA-ATO)，如图1所示：
(1)将三氧化二砷(As2O3，ATO)粉末10mg溶解于少量体积氢氧化钠溶液，然后用1M的稀盐酸调pH至5.0-6.5左右，配成ATO浓度为5mg/mL的砷溶液，备用于白蛋白载药；将标记叶酸分子的人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)100mg(见图2)溶解于2ml不含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，D-PBS)中(50mg/mL)，加入谷胱甘肽(GSH)于37℃水浴锅中轻柔搅拌反应1h，谷胱甘肽(GSH)加入到人血清白蛋白溶液中的终浓度为50mM；
(2)取含5mg ATO的水溶液加入GSH处理过的白蛋白溶液中，室温搅拌2小时；
(3)将ATO白蛋白混合溶液放入透析袋(分子量为8-14KD)于低温D-PBS溶液透析除去多余的ATO、GSH及其氧化产物GSSG后(数次，24小时)，即得ATO的白蛋白纳米载药颗粒，经ICP-OES测定，ATO与HSA的摩尔分子比为3.5:1。
得到的FA-HSA-ATO纳米颗粒纳米尺寸均一，分布均匀(见图3和图4)，平均粒径约10nm；游离巯基检测和圆二色谱(CD)测定发现HSA与ATO是通过砷-硫键结合装载，且没有明显改变人血清白蛋白的二级结构(图5和图6)；在含10％胎牛血清的1640培养基和人血清中24h内稳定(图6)。当体外模拟肿瘤细胞内强还原(GSH 1-10mM)和弱酸环境(pH 5-6)时，该载药系统具有良好释放率。
实施例2三氧化二砷白蛋白纳米给药系统的制备(FA-HSA-ATO)，如图1所示：
(1)将三氧化二砷(As2O3，ATO)粉末20mg溶解于少量体积氢氧化钠溶液，然后用1M的稀盐酸调pH至5.0-6.5左右，配成ATO浓度为10mg/mL的砷溶液，备用于白蛋白载药；将标记叶酸分子的人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)160mg(见图2)溶解于2ml不含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，D-PBS)中(80mg/mL)，加入谷胱甘肽(GSH)于37℃水浴锅中轻柔搅拌反应1小时，谷胱甘肽(GSH)加入到人血清白蛋白溶液中的终浓度为80mM；
(2)取含10mg ATO的水溶液加入GSH处理过的白蛋白溶液中，室温搅拌2小时；
(3)将ATO白蛋白混合溶液放入透析袋(分子量为8-14KD)于低温D-PBS溶液透析除去多余的ATO、GSH及其氧化产物GSSG后(数次，24小时)，即得ATO的白蛋白纳米载药颗粒，经ICP-OES测定，ATO与HSA的摩尔分子比为5.5:1。
得到的FA-HSA-ATO纳米颗粒纳米尺寸均一，分布均匀(见图3和图4)，平均粒径约10nm；游离巯基检测和圆二色谱(CD)测定发现HSA与ATO是通过砷-硫键结合装载，且没有明显改变人血清白蛋白的二级结构(图5和图6)；在含10％胎牛血清的1640培养基和人血清中24小时内稳定(图6)。当体外模拟肿瘤细胞内强还原(GSH 1-10mM)和弱酸环境(pH 5-6)时，该载药系统具有良好释放率。

Claims (4)

1.一种三氧化二砷白蛋白纳米药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将三氧化二砷粉末溶解于氢氧化钠溶液，然后用稀盐酸调pH至5.0—6.5，配成浓度为5—10mg/mL的三氧化二砷溶液，备用于白蛋白载药；将标记叶酸分子的人血清白蛋白溶解于不含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液中，得白蛋白浓度为30—100mg/mL的人血清白蛋白溶液，向人血清白蛋白溶液中加入二硫键还原剂于37℃水浴锅中轻柔搅拌反应0.5—2h，二硫键还原剂加入到人血清白蛋白溶液中的终浓度为30—100mM，得二硫键还原剂处理过的白蛋白溶液；
(2)向二硫键还原剂处理过的白蛋白溶液中加入三氧化二砷溶液，三氧化二砷加入到白蛋白溶液中的终浓度为0.5—5mg/mL，室温搅拌1—6h，得三氧化二砷白蛋白混合溶液；
(3)将三氧化二砷白蛋白混合溶液放入透析袋，并于低温D-PBS溶液透析除去多余的三氧化二砷和二硫键还原剂及其副产物，得三氧化二砷白蛋白纳米药物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述二硫键还原剂为谷胱甘肽。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述三氧化二砷溶液中三氧化二砷浓度为0.5—5mg/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述三氧化二砷白蛋白纳米药物中三氧化二砷与人血清白蛋白的摩尔分子比为(3—8)：1。
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