CN107432936A - 一种改性壳聚糖的用途和包含该改性壳聚糖的纳米复合物 - Google Patents

一种改性壳聚糖的用途和包含该改性壳聚糖的纳米复合物 Download PDF

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CN107432936A CN201610364716.9A CN201610364716A CN107432936A CN 107432936 A CN107432936 A CN 107432936A CN 201610364716 A CN201610364716 A CN 201610364716A CN 107432936 A CN107432936 A CN 107432936A
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Abstract

本发明涉及具有下式所示的结构单元的改性壳聚糖作为蛋白多肽类药物的载体的用途：

Description

一种改性壳聚糖的用途和包含该改性壳聚糖的纳米复合物
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地说，涉及一种改性壳聚糖的用途，包含该改性壳聚糖的纳米复合物、其制备方法和用途。本发明所述的纳米复合物主要用于促进蛋白多肽类药物的口服吸收，具有较好的提高蛋白多肽类药物生物疗效的作用。
技术背景
随着生物技术的发展，具有特定药理活性的蛋白多肽类药物在临床应用中发挥着与日俱增的作用，迄今为止已有几十种蛋白多肽类药物在全球上市。作为最为方便的一种给药方式，蛋白多肽类药物口服给药途径的研究日益显示出了其迫切性与紧要性。
但由于蛋白多肽类药物易受胃内酸性环境降解、胃肠道内蛋白水解酶降解，同时药物分子量大，脂溶性差，不易透过生物膜，难被机体吸收，蛋白多肽类药物的口服给药面临着巨大的挑战。
目前蛋白多肽类药物口服给药途径的研究主要包括以下五个方面：酶抑制剂、吸收促进剂、生物粘附给药系统、微粒载体给药系统和结肠靶向给药系统。
蛋白多肽类药物纳米载体属于微粒载体给药系统，其作为药物载体具有许多优越性，如具有缓释特性，延长药物作用时间，在保证药物作用的前提下减少给药剂量，减少药物的毒副作用，有助于提高药物的作用稳定性，便于药物储存等。更深入地，由于纳米载体具有超小的体积和较高的载药量，有利于提高局部药物浓度，能促进难透膜性蛋白多肽类药物的吸收，进而提高疗效。
壳聚糖是一种天然高分子碱性多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性，被广泛用做药物载体材料。以壳聚糖为基础的纳米给药系统由于具有较高的负载蛋白多肽类药物的能力并且能在一定程度上提高蛋白多肽类药物的跨膜吸收，而逐渐成为蛋白多肽类药物的热门给药载体之一。通过对壳聚糖进行结构修饰来优化纳米载体的性质，进一步提高跨膜转运能力以提高蛋白多肽类药物的口服吸收，有望实现蛋白多肽类药物的口服给药，该类载体成了近年来的研究热点之一。
CN 102614498A公开了一种胰岛素-阴离子表面活性剂纳米复合物，以提高胰岛素在胃肠道内的稳定性，促进药物透过生物膜，但该纳米复合物制备过程中涉及有机溶剂，对胰岛素的稳定性造成一定影响。CN 102120781A公开了一种以壳聚糖为基质的纳米载体，通过对壳聚糖进行精氨酸和赖氨酸修饰以提高壳聚糖的水溶性和促吸收效果，但由于蛋白多肽类药物的强亲水性和大分子量，该类药物极难以被动扩散形式透过小肠上皮细胞单层，普通的纳米载体并不能将蛋白多肽类药物的口服吸收提高至理想水平。
因此，设计出制备方法简易、温和，性质稳定，能够长期保存，并能有效地改善蛋白多肽类药物透膜性，提高蛋白多肽类药物口服吸收的纳米载体始终是制剂工作者面临的一个难题。
发明内容
本发明的发明人经过深入细致的研究发现，通过用胆酸类化合物(例如顶端钠离子依赖性胆酸转运体ASBT的底物脱氧胆酸、牛磺胆酸等)修饰壳聚糖得到的改性壳聚糖能够作为蛋白多肽类药物的载体，有助于保持所载蛋白多肽类药物的性质稳定，促进蛋白多肽类药物跨膜，有效促进其吸收，进而提高蛋白多肽类药物的生物疗效。所述改性壳聚糖能够与蛋白多肽类药物自组装制成一种纳米复合物。所述纳米复合物可以有效地保护蛋白多肽类药物免受肠道内的蛋白酶降解，提高药物在肠道内的稳定性。此外，所述纳米复合物干燥成粉末后可长期保存。此外，该制备方法简易、温和。
本发明的一个目的是提供用胆酸类化合物修饰的壳聚糖作为蛋白多肽类药物的载体的用途。
本发明的另一目的在于提供一种纳米复合物、其制备方法和用途。
本发明的一个方面涉及一种具有下式1所示的结构单元的改性壳聚糖作为蛋白多肽类药物的载体的用途，
其中，各结构单元中的R相同或不同，并且各自独立地为：氢、乙酰基、或胆酸类化合物与原料壳聚糖中的氨基经酰胺化反应后得到的残基，
其中，所述原料壳聚糖的重均分子量为约1,000～约1,000,000，优选为约10,000～约500,000，特别是为约50,000～约300,000，脱乙酰度为：约70％～约95％，例如约75％，约80％，约85％，约90％，约95％等。
所述原料壳聚糖在20℃时的动力黏度为20mpa·s～300mpa·s，该动力粘度的测试方法参照2015版中国药典中药用辅料壳聚糖的黏度测定方法进行：精密称取原料壳聚糖1.0g，加1％冰醋酸100ml，搅拌使完全溶解，用Brookfield LVDV-III Ultra型旋转式黏度计进行测定。
其中，在改性壳聚糖中的胆酸类化合物取代度为约0.5％～约20％，优选为约1％～约10％。
所述脱乙酰度表示原料壳聚糖分子中脱除乙酰基的结构单元数(即脱除乙酰基的糖基数)占原料壳聚糖分子中的总结构单元数(即总糖基数)的平均百分比。所述胆酸类化合物取代度表示所述改性壳聚糖分子中被胆酸类化合物取代的结构单元占总结构单元数(即总糖基数)的平均百分比。
所述胆酸类化合物优选选自下式2所示的化合物或其盐：
其中，R1选自-OH、羧甲基氨基和磺酸乙基氨基；R2为-OH；R3为-H或-OH；R4为-H或-OH。
优选地，所述胆酸类化合物选自胆酸、鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊去氧胆酸、异熊去氧胆酸、Lago脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸和它们的盐。各胆酸衍生物的结构如下所示：
其中，各胆酸类化合物的名称和相对应的R1、R2、R3和R4基团如下列表：
最优选地，所述胆酸类化合物选自胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸和它们的盐。
所述盐可以为碱金属盐、碱土金属盐或铵盐，优选为钾盐、钠盐和铵盐。
在所述胆酸类化合物选自胆酸、脱氧胆酸、牛磺胆酸和它们的盐的情况下，所述胆酸类化合物与原料壳聚糖中的氨基经酰胺化反应后得到的残基为如下式3、式4或式5所示的残基：
其中，*表示结合到壳聚糖骨架中的位置。
所述改性壳聚糖可以通过用胆酸类化合物经酰胺化反应修饰原料壳聚糖而制备。所述酰胺化反应可以在催化剂存在下进行。所述催化剂可以为本领域中常规使用的用于促进羧酸或磺酸与氨基的酰胺化反应的催化剂。例如，所述催化剂可以选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯等。所述酰胺化反应的时间没有特殊限制，只要能够生成符合要求的用胆酸类化合物修饰的壳聚糖即可，例如可以为1小时以上，2小时以上，5小时以上，或10小时以上，以及40小时以下，30小时以下，25小时以下等。所述酰胺化反应的温度没有特殊限制，只要能够进行该反应即可，例如，可以在室温下进行。
在所述酰胺化反应中，所述催化剂与原料壳聚糖的摩尔比可以选为约2:1～约1:2，胆酸类化合物与原料壳聚糖的质量比可以为约1:10～约1:2。在所述酰胺化反应中，对反应混合物的pH没有特殊要求，只要能够进行酰胺化反应即可，优选地，反应混合物的pH在约4～约7，优选在约4.5～约6.5的范围内。
在一个实例中，所述酰胺化反应如下进行：将原料壳聚糖完全溶解在约1％(v/v)醋酸水溶液中后，再加入一种胆酸类化合物和催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的二甲亚砜溶液，调节pH至约4.5～约6.5，反应约16～约24小时后，生成改性壳聚糖，用碱水溶液调节pH至约8.0～约10.0，离心分离沉淀，干燥得到改性壳聚糖固体。所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与原料壳聚糖的摩尔比优选为约2:1～约1:2，胆酸类化合物与原料壳聚糖的质量比优选为约1:10～约1:2。
所述原料壳聚糖具有下述式6所示的结构单元：
其中，各结构单元中的R相同或不同，并且各自独立地为：氢或乙酰基；
所述原料壳聚糖的重均分子量(Mw)为约1,000～约1,000,000，优选为约10,000～约500,000，特别是为约50,000～约300,000，脱乙酰度为：约70％～约95％，例如约75％，约80％，约85％，约90％，约95％等。
所述原料壳聚糖在20℃时的动力黏度为20mpa·s～300mpa·s，该动力粘度的测试方法参照2015版中国药典中药用辅料壳聚糖的黏度测定方法进行：精密称取原料壳聚糖1.0g，加1％冰醋酸100ml，搅拌使完全溶解，用Brookfield LVDV-III Ultra型旋转式黏度计进行测定。
根据本发明的另一方面，提供了一种纳米复合物，以重量百分比计，其包括：
约0.5％～约90％，优选约5％～约80％的如上所述的改性壳聚糖；
约0.5％～约90％，优选约5％～约90％，更优选约20％～约50％的蛋白多肽类药物；
约0％～约25％，优选约0.5％～约15％的阴离子型交联剂；和
约0％～约25％，优选约0％～约20％的骨架型聚合物。
所述纳米复合物的平均粒径优选不超过800nm，更优选为约100～约500nm。优选地，所述纳米复合物的90％颗粒的粒径不超过2μm，优选在约200～约1,000nm的范围内。优选地，所述纳米复合物的Zeta电位不超过+65mV，优选为约+15mV～约+45mV。
所述蛋白多肽类药物可以为任何具有药理活性的蛋白多肽类药物，优选选自降钙素、胰岛素、重组人甲状旁腺激素、表皮生长因子、GLP-1(人胰高血糖样肽-1)类似物和干扰素等。
所述阴离子型交联剂可以为任何能够用于交联改性壳聚糖和蛋白多肽类药物的阴离子型化合物，例如，其可以为溶解后带负电荷的水溶性化合物。在本发明的纳米复合物中加入阴离子型交联剂可以进一步提高该纳米复合物在生理环境中的稳定性。优选地，所述阴离子型交联剂可以选自聚谷氨酸和多聚磷酸钠。
所述骨架型聚合物可以为任何能够用于包裹并压缩纳米复合物的高分子材料，例如，其可以为水溶性高分子材料。在本发明的纳米复合物中加入骨架型聚合物可以进一步提高纳米复合物的稳定性。优选地，所述骨架型聚合物选自聚丙烯酰胺、聚(β-氨基酯)和聚乙烯醇。
除了上述组分以外，根据实际需要，本发明的纳米复合物还可以包括尤特奇Eudragit、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚乳酸(PLA)等药剂中常用的辅料。
另一方面，本发明提供了一种制备所述纳米复合物的方法，其制备机理在于，当体系pH小于改性壳聚糖的等电点时，改性壳聚糖带正电荷，且当体系pH大于蛋白多肽类药物等电点时，蛋白多肽类药物带负电荷，改性壳聚糖与蛋白多肽类药物能通过静电吸附作用形成纳米复合物，从而制得功能性纳米复合物。在额外加入阴离子型交联剂和/或骨架型聚合物的情况下，可以进一步稳定该纳米复合物。
根据本发明的制备方法可以如下进行：将蛋白多肽类药物的溶液与上述改性壳聚糖的溶液均匀混合，调节pH至约4.0～约7.0，然后非必需地加入阴离子型交联剂和骨架型聚合物水溶液，自组装形成纳米复合物。
所述蛋白多肽类药物的溶液可以通过将蛋白多肽类药物溶解于药学上可接受的溶剂中制备。所述改性壳聚糖的溶液可以通过将改性壳聚糖溶于醋酸水溶液，例如约1％醋酸的水溶液中而制备。
在一个实例中，根据本发明的制备方法可以如下进行：
将蛋白多肽类药物溶解于药学上可接受的溶剂中，将改性壳聚糖溶于约1％醋酸的水溶液，再将两者混合，用酸水溶液或碱水溶液调节pH至约4.0～约7.0，涡旋混匀后加入阴离子型交联剂和骨架型聚合物水溶液，经搅拌，自组装形成平均粒径不超过800nm、90％颗粒粒径不超过2μm的功能性纳米复合物。
其中，所述药学上可接受的溶剂优选为水、磷酸盐缓冲液、乙醇、稀盐酸溶液或稀氢氧化钠水溶液；所述碱优选为氢氧化钠、氢氧化钾或氨水；所述酸优选为盐酸、磷酸或醋酸。
其中，改性壳聚糖与蛋白多肽类药物的投量比(质量比)为约1:10～约10:1。
再一方面，本发明提供上述纳米复合物用于制备药物的用途。
再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含上述根据本发明的纳米复合物。此外，根据需要，所述药物组合物还可以包括药学上可接受的辅料，例如干燥保护剂、着色剂、包衣剂、甜味剂、风味剂、防腐剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、溶剂、填充剂和助流剂等。
所述药物组合物可以为固体制剂或液体制剂，所述固体制剂例如可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂和散剂等，所述液体制剂例如可以为溶液剂、酊剂、糖浆剂、混悬剂和溶胶剂等。
再一方面，本发明提供了一种制备包含本发明的纳米复合物的固体制剂的方法，其包括如下步骤：
a)将本发明的纳米复合物制成粉末；
b)将步骤a)中得到的粉末与药用添加剂混合后制成固体制剂；
c)非必需地将步骤b)中得到的固体制剂进行包衣得到包衣固体制剂。
在步骤a)中，对于制成粉末的方法没有限制，例如可以为湿法造粒或干法造粒，也可以通过干燥技术将本发明的纳米复合物制成粉末。所述的干燥技术可以为冷冻干燥法和喷雾干燥法。
在步骤b)中，所述的固体剂型优选选自胶囊剂、片剂和颗粒剂；所述药用添加剂优选选自微晶纤维素、淀粉、聚维酮和硬脂酸镁。
在步骤c)中，所述包衣可以为肠溶包衣。所述肠溶包衣可以使用所有的肠溶包衣材料而没有限制，优选肠溶包衣材料选自Eudragit L100、Eudragit S100、Eudragit L100-55、HPMCP和醋酸纤维素酞酸酯。
在本说明书中，“约”指的是所述数值可以在本领域技术人员能够接受的误差范围内变动，例如可以在±20％，±15％，±10％，或±5％范围内变动。
有益效果
本发明所述的改性壳聚糖作为蛋白多肽类药物的载体可以通过与ASBT及细胞膜上负电荷蛋白结合，促进蛋白多肽类药物跨膜，有效促进其吸收，进而提高蛋白多肽类药物的口服生物疗效。
此外，本发明所述的改性壳聚糖能有效地与蛋白多肽类药物自组装形成纳米复合物，制备条件温和，粒度分布均一，具有较高的包封率和载药量。该纳米复合物能够有效地保护蛋白多肽类药物免受肠道内的蛋白酶降解，提高药物在肠道内的稳定性。
本发明所述的载有功能性纳米复合物的固体剂型，可以长期保存，并维持蛋白多肽类药物在保存过程中的稳定性和生理活性。
附图说明
图1为壳聚糖和制备实施例1中制备的改性壳聚糖的H-NMR谱图；
图2为在制备实施例4中制备的改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的透射电子显微镜(Tecnai G2Spirit，FEI，美国)图；
图3为在制备实施例4中制备的改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的粒径分布图(a)和Zeta电位图(b)；
图4显示在制备实施例7中制备的装有改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊的体外释放结果线形图；
图5显示在制备实施例7中制备的装有改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊的体内降血糖效果线形图；
图6显示在制备实施例7中制备的装有改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊的体内促吸收效果线形图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，旨在说明本发明的具体配方组成、制备方法及其功能和效果，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
本发明中，所用试剂、设备的来源和商品名，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同，常规未标注试剂购自国药集团化学试剂有限公司。其中，原料壳聚糖为购自浙江金壳药业有限公司的药用辅料专用壳聚糖，脱氧胆酸钠和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸购自Sigma-Aldrich公司，胰岛素购自徐州万邦金桥制药有限公司，γ-聚谷氨酸购自上海久谦化工有限公司，Eudragit L100购自赢创工业集团，重组人表皮生长因子购自大连美仑生物技术有限公司。
实验动物：健康SD大鼠24只，雄性，体重200-220g，来源为上海药物研究所实验动物中心。受试动物在试验日前1-2周在试验场所进行适应性饲养。所有动物实验均得到上海药物研究所IACUC委员会的批准。
动力粘度是在20℃下，精密称取1.0g待测产品，加1％冰醋酸100ml，搅拌使完全溶解，用Brookfield LVDV-III Ultra型旋转式黏度计进行测定。
制备实施例
制备实施例1改性壳聚糖的制备
取原料壳聚糖(Mw为100,000，动力黏度为65mpa·s，浙江金壳，脱乙酰度为90％)3g加入1％(v/v)醋酸水溶液在室温下搅拌，依次加入脱氧胆酸钠(900mg)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)(528mg)，用氢氧化钠水溶液调节pH至5.5，反应24小时后，用氢氧化钠水溶液调节pH至9.0，离心分离沉淀，透析袋(MWCO 50,000)透析，冷冻干燥，干燥后得黄色絮状物2.5g，即为改性壳聚糖。
将制备的改性壳聚糖与原料壳聚糖分别溶于氘代醋酸后进行氢核磁共振分析(Varian-MERCURY Plus-300，美国)。
对比图1中原料壳聚糖(CS)和脱氧胆酸偶联壳聚糖(即改性壳聚糖DCS)的核磁图谱可见，脱氧胆酸偶联壳聚糖中于0-1.5ppm处出现了脱氧胆酸的特征峰，由此可见，脱氧胆酸已经成功地嫁接到了壳聚糖骨架上。
脱氧胆酸取代度测定方法：用Vario EL III型全自动元素分析仪测定壳聚糖与脱氧胆酸偶联壳聚糖的C、H和N元素的百分含量按下式计算脱氧胆酸取代度。
脱氧胆酸取代度为每个壳聚糖结构单元所含脱氧胆酸的平均数目，其计算方法为：
脱氧胆酸取代度为约1.3％。
制备实施例2改性壳聚糖的制备
取原料壳聚糖(Mw为200,000，动力粘度为140mpa·s，浙江金壳，脱乙酰度为85％)3g加入1％(v/v)醋酸水溶液在室温下搅拌，依次加入脱氧胆酸钠(1800mg)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)(1056mg)，用氢氧化钠水溶液调节pH至5.5，反应24小时后，用氢氧化钠水溶液调节pH至9.0，离心分离沉淀，透析袋(MWCO 100,000)透析，冷冻干燥，干燥后得黄色絮状物2.5g，即为改性壳聚糖。
用元素分析仪测得脱氧胆酸取代度为约3.2％。
制备实施例3改性壳聚糖的制备
取原料壳聚糖(Mw为100,000，动力粘度为65mpa·s，浙江金壳，脱乙酰度为90％)3g加入1％(v/v)醋酸水溶液在室温下搅拌，依次加入牛磺胆酸钠(900mg)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)(528mg)，用氢氧化钠水溶液调节pH至5.5，反应24小时后，用氢氧化钠水溶液调节pH至9.0，离心分离沉淀，透析袋(MWCO 50,000)透析，冷冻干燥，干燥后得黄色絮状物2.4g，即为改性壳聚糖。
用元素分析仪测得牛磺胆酸钠的取代度为约1.5％。
制备实施例4改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的制备
取在制备实施例1中制备的改性壳聚糖20mg，溶于10mL 1％(v/v)醋酸水溶液中，称取γ-聚谷氨酸(γ-PGA)1mg，溶于5mL水，称取胰岛素20mg，溶于10mL的0.01M NaOH中。取壳聚糖溶液和胰岛素溶液各10mL、γ-PGA(γ-聚谷氨酸)溶液5mL，混合，用NaOH水溶液调节pH至6.5，室温搅拌10min，得有淡蓝色乳光的透明溶液为改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物。
制备实施例5改性壳聚糖/重组人表皮生长因子纳米复合物的制备
取在制备实施例2中制备的改性壳聚糖2mg，溶于1mL 1％(v/v)醋酸水溶液中，称取γ-聚谷氨酸(γ-PGA)1mg，溶于10mL水，称取重组人表皮生长因子2mg，溶于1mL水中。取改性壳聚糖溶液和重组人表皮生长因子溶液各1mL、γ-PGA溶液0.5mL，混合，用NaOH水溶液调节pH至5.5，室温搅拌10min得到改性壳聚糖/重组人表皮生长因子纳米复合物。
制备实施例6改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的制备
取在制备实施例3中制备的改性壳聚糖10mg，溶于5mL 1％(v/v)醋酸水溶液中，称取γ-聚谷氨酸(γ-PGA)1mg，溶于5mL水，称取胰岛素10mg，溶于5mL的0.01M NaOH中，称取聚(β-氨基酯)1mg，溶于1mL水中。取壳聚糖溶液和胰岛素溶液各10mL、γ-PGA(γ-聚谷氨酸)溶液5mL、聚(β-氨基酯)溶液1mL，混合，用NaOH水溶液调节pH至6.0，室温搅拌10min，得有淡蓝色乳光的透明溶液为改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物。
制备实施例7装有改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊的制备
取制备实施例4中制备的改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物10mL与等体积的2.5％海藻糖水溶液混合均匀后冷冻干燥得到白色粉末。称取冻干粉末灌装9号Pccaps临床前胶囊(Capsugel，美国)，随后将胶囊放入包衣锅用15％的Eudragit L100乙醇溶液进行包衣。
制备实施例8改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物肠溶片的制备
取制备实施例4中制备的改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物10mL与等体积的2.5％海藻糖水溶液混合均匀后冷冻干燥得到白色粉末。称取冻干粉末与淀粉、微晶纤维素和硬脂酸镁混合后用压片机压制成片剂，随后将片剂放入包衣锅用15％的Eudragit L100乙醇溶液进行包衣。
实验实施例
实验实施例1
改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物形态及粒径观察
取制备实施例4中制备的改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物20μL溶液(DNC)对其进行醋酸铀负染后用透射电镜(Tecnai G2Spirit,FEI,美国)观察发现纳米复合物呈现类球形形态，大小为200nm左右，具体结果请参见图2。
改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物粒径和电位测定
取制备实施例4中制备的改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物100μL溶液用ZetasizerZS粒径仪(Malvern Instruments,Malvern,英国)测定纳米复合物平均粒径为231.4nm，Zeta电位为+21.8mV，具体粒径分布图参见图3a，分析结果见表1，具体Zeta电位图参见图3b，分析结果见表2。
表1
表2
改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物中药物的包封率和载药量测定
1、仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；高速离心机(Allegra64R，Beckman Coulter，美国)。试剂：改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物(根据本申请所述方法制备)；乙腈(色谱纯，sigma，美国)；水为Milli-Q超纯水，磷酸等其它试剂均为分析纯。
2、色谱条件：色谱柱：Grace Vydac 218TP C18柱(250mm×4.6mm，5μm，美国格雷斯公司)；流动相：0.1M磷酸氢二钠缓冲液(磷酸调pH＝3.0):乙腈(72:28，v/v)；流速：1mL/min；柱温:40℃；检测波长：214nm。
3、测定方法：取本发明制备实施例4中制得的改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物溶液1.5mL，16,000g离心30min后取上清液，利用高效液相色谱法测定其中游离药物的浓度，通过比较测定的游离药物量与加入的胰岛素总质量计算出纳米复合物溶液中胰岛素的包封率；
测定结果：制备实施例4中制备的改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物中药物的包封率为约73.5％，载药量为约33.0％。
实验实施例2
将制备实施例7中制备的肠溶胶囊放入10mL的pH值分别为2.5和6.6的磷酸盐缓冲液中，将缓冲液于37℃条件下以100rpm振荡。分别在0、30、60、90和120min时取200μL缓冲液以实验实施例1中所述的HPLC方法测定缓冲液中的胰岛素含量。
结果示于图4，结果表明本发明的装有改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊能够保护胰岛素制剂抵抗胃内的酸性环境，在胃内不释放出纳米复合物，而在进入小肠后开始释放纳米复合物，并于2小时释放完全。
实验实施例3
将12只Sprgue-dawley大鼠称体重后，按65mg/kg的剂量称取STZ(链脲佐菌素)，用0.1M枸橼酸缓冲液(pH＝4.5)溶解，立即腹腔注射到大鼠体内。饲养一周后，测血糖，血糖值高于16.67mM的大鼠用于后续实验。实验动物被随机分成4组，给药前禁食12h，不禁水。第一组为口服胰岛素对照组(30IU/kg)(缩写为S组)，给予装有胰岛素和海藻糖粉末的肠溶胶囊；第二组为皮下注射胰岛素溶液组(5IU/kg)(缩写为S-SC组)；第三组为装有普通壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊(30IU/kg)(缩写为NC组)；第四组为在制备实施例7中制备的装有改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊(30IU/kg)(缩写为DNC组)。分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12h时尾静脉取血，用血糖仪测定血糖水平，统计胰岛素的降血糖效果。
结果示于图5，结果表明本发明的装有改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊能够产生显著的降血糖效果，口服给药1h后血糖开始下降，4小时后下降至50％，并且这种降血糖的效果可持续10小时。
实验实施例4
将12只Sprgue-dawley大鼠称体重后，按65mg/kg的剂量称取STZ(链脲佐菌素)，用0.1M枸橼酸缓冲液(pH＝4.5)溶解，立即腹腔注射到大鼠体内。饲养一周后，测血糖，血糖值高于16.67mM的大鼠用于后续实验。实验动物被随机分成4组，给药前禁食12h，不禁水。第一组为口服胰岛素对照组(30IU/kg)(S组)，给予装有胰岛素和海藻糖粉末的肠溶胶囊；第二组为皮下注射胰岛素溶液组(5IU/kg)(S-SC组)；第三组为装有普通壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊(30IU/kg)(NC组)；第四组为在制备实施例7中制备的装有改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊(30IU/kg)(DNC组)。分别在0、1、2、4、6、8、10和12h时眼眶静脉丛取血，用胰岛素ELISA试剂盒检测血浆中胰岛素的浓度，绘制药代动力学曲线。
结果示于图6，结果表明本发明的装有改性壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊能够显著提高胰岛素的口服吸收。口服给药后2h起血药浓度显著上升，于4h达到峰值，在2-8小时内胰岛素浓度均高于装有普通壳聚糖/胰岛素纳米复合物的肠溶胶囊组。

Claims (10)

1.一种具有下式1所示的结构单元的改性壳聚糖作为蛋白多肽类药物的载体的用途，
其中，各结构单元中的R相同或不同，并且各自独立地为：氢、乙酰基、或胆酸类化合物与原料壳聚糖中的氨基经酰胺化反应后得到的残基，
其中，所述原料壳聚糖的重均分子量为1,000～1,000,000，优选为10,000～500,000，特别是为约50,000～约300,000，脱乙酰度为：70％～95％，
其中，在改性壳聚糖中的胆酸类化合物取代度为0.5％～20％，优选为1％～10％。
2.根据权利要求1所述的用途，所述胆酸类化合物选自下式2所示的化合物或其盐：
其中，R1选自-OH、羧甲基氨基和磺酸乙基氨基；
R2为-OH；
R3为-H或-OH；
R4为-H或-OH，
优选地，所述胆酸类化合物选自胆酸、鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、熊去氧胆酸、异熊去氧胆酸、Lago脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸和它们的盐，更优选地，所述胆酸类化合物选自脱氧胆酸、牛磺胆酸、胆酸和它们的盐。
3.一种纳米复合物，以重量百分比计，其包括：
0.5％～90％，优选5％～80％的权利要求1或2中所述的改性壳聚糖；
0.5％～90％，优选5％～90％，更优选20％～50％的蛋白多肽类药物；
0％～25％，优选0.5％～15％的阴离子型交联剂；和
0％～25％，优选0％～20％的骨架型聚合物。
4.根据权利要求3所述的纳米复合物，
所述纳米复合物的平均粒径不超过800nm，优选为100～500nm；和/或
所述纳米复合物的90％颗粒的粒径不超过2μm，优选在200～1,000nm的范围内；和/或
所述纳米复合物的Zeta电位不超过+65mV，优选为+15mV～+45mV。
5.根据权利要求3或4所述的纳米复合物，其中，
所述蛋白多肽类药物为具有药理活性的蛋白多肽类药物，优选选自降钙素、胰岛素、重组人甲状旁腺激素、表皮生长因子、人胰高血糖样肽-1类似物和干扰素；和/或
所述阴离子型交联剂为溶解后带负电荷的水溶性化合物，优选选自聚谷氨酸和多聚磷酸钠；和/或
所述骨架型聚合物为水溶性高分子材料，优选选自聚丙烯酰胺、聚(β-氨基酯)和聚乙烯醇。
6.一种制备权利要求3-5中任一项所述的纳米复合物的方法，其包括如下步骤：将蛋白多肽类药物的溶液与所述改性壳聚糖的溶液均匀混合，调节pH至4.0～7.0，然后非必需地加入阴离子型交联剂和骨架型聚合物水溶液，自组装形成纳米复合物。
7.权利要求3-5中任一项所述的纳米复合物用于制备药物的用途。
8.一种药物组合物，其包含权利要求3-5中任一项所述的纳米复合物及药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，所述药物组合物为固体制剂或液体制剂，优选地，所述固体制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂和散剂，所述液体制剂选自溶液剂、酊剂、糖浆剂、混悬剂和溶胶剂。
10.一种制备固体制剂的方法，其包括如下步骤：
a)将权利要求3-5中任一项所述的纳米复合物制成粉末，优选通过干燥技术将所述纳米复合物制成粉末；
b)将步骤a)中得到的粉末与药用添加剂混合后制成固体制剂，优选地，所述药用添加剂选自微晶纤维素、淀粉、聚维酮和硬脂酸镁，所述固体剂型选自胶囊剂、片剂和颗粒剂；
c)非必需地将步骤b)中得到的固体制剂进行包衣得到包衣固体制剂，优选所述包衣为肠溶包衣。
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