CN104031174A - 小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物、其制备方法及载药纳米粒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物、其制备方法及其载药纳米粒，属于纳米技术领域。本发明的壳聚糖衍生物，是将两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物与小肠靶向因子维生素B12在惰性气体保护、于18～38℃下进行化学键合而成；本发明的载药纳米粒是小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物与疏水性药物在水/有机物混合溶剂中通过自组装形成。本发明的壳聚糖衍生物的载药纳米粒含维生素B12小肠靶向因子，能实现小肠上皮细胞跨膜转运吸收，且其具有较好的小肠上皮细胞吸收性能，有望用作一种小肠靶向吸收的口服纳米制剂，在药剂行业具有一定的应用前景。

Description

小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物、其制备方法及载药纳米粒

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖衍生物，具体涉及一种小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物、其制备方法及其载药纳米粒。

背景技术

聚合物纳米粒是由天然或合成高分子材料制成的粒径在10nm～1μm的固态胶体粒子(Singh R.et al.,Experimental and Molecular Pathology,2009,86,215-223)。口服纳米粒作为一种极具潜力的新兴给药技术，能提高患者的顺应性，解决许多制剂技术难题，如防止药物被胃肠道的酸和酶破坏，减少药物对胃肠道的刺激性，并可通过结构修饰达到定向释放的效果。然而，由于肠道上皮细胞的间隙紧密，使得纳米粒很难通过细胞间隙而被大量吸收。据文献报道(WinK.Y.et al.,Biomaterials,2005,2713-2722)，不同尺寸的纳米粒有可能通过以下途径被肠道吸收：(1)细胞旁路吸收：粒径小于50nm的纳米粒穿越肠上皮细胞间隙而被吸收；(2)内吞入胞吸收：粒径为50～500nm的纳米粒被肠上皮细胞胞吞；(3)淋巴组织吸收：粒径为500～1μm的纳米粒被肠淋巴滤泡集结(Peyer'spatches)中的M细胞吸收。此外，纳米粒表面性质也是影响其被肠道吸收的重要因素。例如，疏水性强的纳米粒易被肠道吸收，因它易被生物粘膜粘附并且对M细胞有更强的亲和力。

目前研究发现，壳聚糖及其衍生物的粘膜粘附性及本身带正电荷的氨基能与带负电荷的紧密联结及肠表面细胞相互作用，打开肠表面紧密联结，促进细胞旁路吸收(van der Lubben L.M.et al.,European Journal of PharmaceuticalSciences,2001,14,201-207)。脱氧胆酸((Deoxycholic acid)具有疏水和亲水性，能降低纳米粒与胃肠道黏液的表面张力，促使纳米粒被吸收入肠淋巴滤泡集结(Damge C.et al.,Journal of Pharmacological Sciences,1997,86,1403-1409)。维生素B12(VB12)可与肠道粘膜上的造血内因子能特异性结合，据Francis M.F.等报道(Francis M.F.et al.,Biomacromolecules2005,6,2462-2467)，将其偶联到葡聚糖-聚氧化乙烯石榴烷基醚纳米粒上，利用其对小肠的定位吸收机制可提高肠道对纳米粒的摄取。

在现有技术中，偶联脱氧胆酸的壳聚糖衍生物已有见于报道，例如，周怀胜等在《两亲性壳聚糖衍生物负载及缓释醋酸曲安奈德的性能》中报道了以偶联脱氧胆酸的壳聚糖衍生物负载醋酸曲安奈德(周怀胜等，中国组织工程研究与临床康复，2010，14(29)，5371-5374)。但是，目前尚未见报道有相关偶联脱氧胆酸基团和VB12小肠靶向因子的壳聚糖衍生物及其制备成小肠靶向吸收纳米粒的技术。

发明内容

为克服上述现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种偶联了脱氧胆酸和小肠靶向因子维生素B12的小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物。

与此相应，本发明的另一目的在于提供一种制备偶联了脱氧胆酸和小肠靶向因子维生素B12的小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的方法。

本发明还提供了一种上述壳聚糖衍生物的载药纳米粒，该载药纳米粒能实现小肠上皮细胞跨膜转运吸收，且其小肠上皮细胞跨膜转运吸收的性能较两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物的载药纳米粒更好。

为实现上述目的，本发明提供的小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物在壳聚糖上偶联了脱氧胆酸和维生素B12；其中，壳聚糖的重均分子量为50000～450000，脱乙酰度为70～98％；脱氧胆酸的接枝率为3～15％，VB12的接枝率为5～15％；

所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的结构式为：

作为本发明所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的优选实施方式，所述壳聚糖的脱乙酰度为95％；脱氧胆酸的接枝率为11％，VB12的接枝率为13％。

本发明的小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物中，所述脱氧胆酸与VB12的接枝率是通过核磁共振波谱(¹H NMR)峰面积积分的方法计算所得。

本发明提供的制备上述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的方法包括以下步骤：

(1)称取10～200重量份维生素B12(VB12)，按照每克维生素B12中加入20～50毫升无水二甲亚砜的比例，将维生素B12溶于无水二甲亚砜中；加入5～50重量份N,N'-羰基二咪唑(CD1)，在惰性气体保护下，于18～38℃搅拌反应10～60分钟；

(2)称取20～500重量份两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物(Chit-DC)，按照每克两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物中加入100～500毫升无水二甲亚砜的比例，将两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物置于无水二甲亚砜中，于18～38℃搅拌2～24小时溶解；

(3)将步骤(1)得到的反应液滴加到步骤(2)所得的溶液中，在惰性气体保护下，于18～38℃反应10～24小时；透析反应产物，冷冻干燥6～24小时，得到偶联脱氧胆酸基团和维生素B12的壳聚糖衍生物Chit-DC-VB12。

本发明制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的方法中，所述两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物(Chit-DC)参照《两亲性壳聚糖衍生物负载及缓释醋酸曲安奈德的性能》(周怀胜，蓝育青，程良正，张黎明，杨立群.两亲性壳聚糖衍生物负载及缓释醋酸曲安奈德的性能.中国组织工程研究与临床康复，2010，14(29)，5371-5374。)中的方法制得。

本发明的N,N'-羰基二咪唑对水敏感，易吸水分解，因而有关N,N'-羰基二咪唑的反应必须控制在无水条件下进行，所用到的原料和溶剂均需充分除水干燥；本发明在惰性气体保护下制备壳聚糖衍生物，确保反应体系处于无水、无氧状态，避免N,N'-羰基二咪唑活性下降以及维生素B12被氧化；两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物Chit-DC在溶液中需溶解一定时间才能使得Chit-DC链段充分伸展，为了使Chit-DC充分溶解，提高两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物偶联维生素B12反应的程度，故搅拌溶解时间为2～24小时；本发明透析的目的在于除去溶剂及未反应的原料，采用常规的蒸馏水透析即可；本发明采用冷冻干燥，使得壳聚糖衍生物Chit-DC-VB12在低温下完成干燥，保证维生素B12活性不会发生变化。

作为本发明所述制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的优选实施方式，所述步骤(1)和步骤(2)中无水二甲亚砜的制备方法为：按照每升二甲亚砜中加入2～40克氢化钙的比例，在二甲亚砜中加入氢化钙，于18～38℃搅拌1～7天，静置1～7天，过滤，在滤液中加入分子筛，浸泡1～7天。

作为本发明所述制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的优选实施方式，所述无水二甲亚砜制备中选用的分子筛的型号为在无水二甲亚砜中加入分子筛的作用是持续吸除二甲基亚砜中水分，保证其干燥无水。

作为本发明所述制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的优选实施方式，所述步骤(1)、步骤(3)中惰性气体为氮气、氦气或氩气；所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中搅拌的速度为200～800转/分。

作为本发明所述制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的优选实施方式，所述步骤(3)中透析的条件为：选用截流分子量为500～50000的透析袋，保证除去小分子杂质的同时不会将壳聚糖衍生物Chit-DC-VB12透析出来；透析时间为1～5天。

本发明提供的小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的载药纳米粒，其制备方法为：先称取5～50重量份壳聚糖衍生物，置于圆底烧瓶中，按照每毫克壳聚糖衍生物中加入0.4～0.6毫升蒸馏水的比例，向壳聚糖衍生物中加入蒸馏水，于18～38℃搅拌至壳聚糖衍生物溶解；再称取1～20重量份疏水性药物，按照每毫克疏水性药物中加入0.2～1毫升有机溶剂的比例，将疏水性药物溶于有机溶剂中，所得溶液缓慢滴加到上述壳聚糖衍生物溶液中，于18～38℃持续搅拌5～24小时；最后在40～60℃水浴中搅拌使有机溶剂挥发，以2000～8000转/分钟的速度离心混合液5～30分钟，上层清液即为壳聚糖衍生物的载药纳米粒。

作为本发明所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的载药纳米粒的优选实施方式，所述疏水性药物为姜黄素或灯盏花素。

作为本发明所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的载药纳米粒的优选实施方式，所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。

本发明所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的载药纳米粒是壳聚糖衍生物Chit-DC-VB12中疏水基团与疏水性药物通过非极性相互作用，在水/有机物混合溶剂中自组装形成，透射电镜照片显示载药纳米粒的粒径约为50～100nm。

本发明的有益效果为：本发明制备的壳聚糖衍生物上含有小肠靶向因子维生素B12，使得该壳聚糖纳衍生物的小肠靶向吸收性能增强。本发明制备壳聚糖衍生物Chit-DC-VB12的方法温度较低，且在无水、无氧的状态下进行的，温和的反应条件有利于保持维生素B12的生物活性；此外，本发明的制备工艺简单，操作方便，所需设备及原材料廉价。本发明制备的载药纳米粒能实现小肠上皮细胞跨膜转运吸收，且具有较好的小肠上皮细胞吸收性能，有望用作一种小肠靶向吸收的口服纳米制剂，提高口服药物的安全性和生物利用度，在药剂行业具有一定的应用前景。

附图说明

图1为本发明制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物及其载药纳米粒的工艺流程图；

图2为本发明制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的反应机理图；

图3为本发明制备的小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物及其原料的¹H NMR图；

图4为本发明所述药物/Chit-DC-VB12纳米粒形成的机理图；

图5为本发明所述灯盏花素/Chit-DC-VB12纳米粒的透射电镜图；

图6为本发明所述灯盏花素/Chit-DC-VB12纳米粒与灯盏花素/Chit-DC纳米粒的Caco-2细胞跨膜转运吸收性能图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例中两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物(Chit-DC)参照《两亲性壳聚糖衍生物负载及缓释醋酸曲安奈德的性能》(周怀胜，蓝育青，程良正，张黎明，杨立群.两亲性壳聚糖衍生物负载及缓释醋酸曲安奈德的性能.中国组织工程研究与临床康复，2010，14(29)，5371-5374。)中的方法制得；具体方法为：称取1.0g壳聚糖置于圆底烧瓶中，加入1％醋酸溶液，于室温搅拌下溶解；称取0.85g脱氧胆酸和0.62g EDC·HCl分别溶于3.0mL无水乙醇，依次缓慢地滴加到上述体系，于室温下反应24h；然后用乙醇/氨水溶液条件pH至弱碱性，离心(5000r/min，10min)，将所得沉淀用乙醇洗涤两到三次，离心(5000r/min，10min)，下层沉淀冷冻干燥后得到两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物，命名为Chit-DC，通过红外光谱法(FTIR)分析Chit-DC的化学结构。

实施例中，VB12表示维生素B12，Chit-DC表示两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物，Chit-DC-VB12表示偶联了脱氧胆酸和维生素B12的壳聚糖衍生物，CDI表示N,N'-羰基二咪唑。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂均为本领域常用的试剂。

实施例中所述搅拌均在常压条件下进行，搅拌速度为200～800转/分钟。

实施例中，本发明制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物及其载药纳米粒的工艺流程如图1所示；制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的反应机理图如图2所示，制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的过程中，维生素B12与N,N'-羰基二咪唑反应生成活性中间体，活性中间体再与Chit-DC分子中的-NH₂反应生成Chit-DC-VB12终产物。本发明制备的小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物及其原料的¹H NMR图如图3所示；本发明的药物/Chit-DC-VB12纳米粒形成的机理如图4所示；灯盏花素/Chit-DC-VB12纳米粒的透射电镜图如图5所示，从透射电镜照片中可看出，壳聚糖衍生物的载药纳米粒的粒径约为50～100nm。

实施例中，本发明所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物中脱氧胆酸与VB12的接枝率是通过核磁共振波谱(¹H NMR)峰面积积分的方法计算所得。

实施例1

小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物，在壳聚糖上偶联了脱氧胆酸和VB12；其中，壳聚糖的重均分子量为150000，脱乙酰度为95％；脱氧胆酸的接枝率为11％，VB12的接枝率为13％；

所述Chit-DC-VB12的结构式为：

上述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的制备方法包括如下步骤：

(1)制备无水二甲亚砜：在50毫升二甲亚砜中加入0.1克氢化钙，于25℃搅拌1天，静置1天，过滤，在滤液中加入型号为的分子筛，浸泡1天。

(2)称取50毫克VB12，溶于1毫升无水二甲亚砜，加入10毫克CDI，在氩气保护下，于25℃搅拌反应20分钟，搅拌速度500转/分钟(以下步骤均使用相同搅拌速度)；

(3)称取20毫克Chit-DC，置于10毫升无水二甲亚砜中，于25℃搅拌8小时溶解；

(4)将步骤(1)得到的反应液滴加到步骤(2)得到的溶液，在氩气保护下，于25℃搅拌反应12小时，将反应液用蒸馏水在截流分子量为500的透析袋水透析3天，冷冻干燥10小时，得到偶联脱氧胆酸基团和VB12小肠靶向因子的壳聚糖衍生物Chit-DC-VB12。

Chit-DC-VB12的载药纳米粒，其制备方法为：称取约5毫克Chit-DC-VB12，置于圆底烧瓶中，加入3毫升蒸馏水，于25℃以500转/分钟的速度搅拌至Chit-DC-VB12溶解；再称取1毫克姜黄素，溶于1毫升丙酮，缓慢滴加到上述Chit-DC-VB12溶液中，于25℃持续搅拌24小时；最后在45℃水浴中以500转/分钟的速度搅拌使有机溶剂挥发，以2000转/分钟的速度离心混合液5分钟，上层清液即为负载药物的Chit-DC-VB12纳米粒。

实施例2

小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物，在壳聚糖上偶联了脱氧胆酸和VB12；其中，壳聚糖的重均分子量为50000，脱乙酰度为70％；脱氧胆酸的接枝率为3％，VB12的接枝率为5％，所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的结构式同实施例1。

上述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的制备方法包括如下步骤：

(1)制备无水二甲亚砜：在100毫升二甲亚砜中加入1克氢化钙，于25℃搅拌2天，静置3天，过滤，在滤液中加入型号为的分子筛，浸泡2天。

(2)称取10毫克VB12，溶于0.5毫升无水二甲亚砜，加入5毫克CDI，在氮气保护下，于25℃搅拌反应10分钟，搅拌速度为400转/分钟(以下步骤均使用相同搅拌速度)；

(3)称取50毫克Chit-DC，置于20毫升无水二甲亚砜中，于25℃搅拌2小时溶解；

(4)将步骤(1)得到的反应液滴加到步骤(2)得到的溶液，在氮气保护下，于25℃搅拌反应10小时，将反应液用蒸馏水在截流分子量为2000的透析袋水透析1天，冷冻干燥24小时，得到偶联脱氧胆酸基团和VB12小肠靶向因子的壳聚糖衍生物，命名为Chit-DC-VB12，通过核磁共振波谱法进行结构分析。

Chit-DC-VB12的载药纳米粒，其制备方法为：称取约20毫克Chit-DC-VB12，置于圆底烧瓶中，加入10毫升蒸馏水，于25℃以400转/分钟的速度搅拌至Chit-DC-VB12溶解；再称取10毫克灯盏花素，溶于4毫升甲醇，缓慢滴加到上述Chit-DC-VB12溶液中，于25℃持续搅拌20小时；最后在40℃水浴中以400转/分钟的速度搅拌使有机溶剂挥发，以4000转/分钟的速度离心混合液5分钟，上层清液即为负载药物的Chit-DC-VB12纳米粒。

实施例3

小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物，在壳聚糖上偶联了脱氧胆酸和VB12；其中，壳聚糖的重均分子量为250000，脱乙酰度为95％；脱氧胆酸的接枝率为15％，VB12的接枝率为15％；所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的结构式同实施例1。

上述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的制备方法包括如下步骤：

(1)制备无水二甲亚砜：在200毫升二甲亚砜中加入5克氢化钙，于18℃搅拌3天，静置3天，过滤，在滤液中加入型号为的分子筛，浸泡2天。

(2)称取100毫克VB12，溶于2毫升无水二甲亚砜，加入20毫克CDI，在氮气保护下，于18℃搅拌反应30分钟，搅拌速度800转/分钟(以下步骤均使用相同搅拌速度)；

(3)称取100毫克Chit-DC，置于30毫升无水二甲亚砜中，于18℃搅拌16小时溶解；

(4)将步骤(1)得到的反应液滴加到步骤(2)得到的溶液，在氮气保护下，于18℃搅拌反应16小时，将反应液用蒸馏水在截流分子量为10000的透析袋水透析2天，冷冻干燥6小时，得到偶联脱氧胆酸基团和VB12小肠靶向因子的壳聚糖衍生物Chit-DC-VB12，通过核磁共振波谱法进行结构分析。

Chit-DC-VB12的载药纳米粒，其制备方法为：称取约40毫克Chit-DC-VB12，置于圆底烧瓶中，加入18毫升蒸馏水，于18℃以800转/分钟的速度搅拌至Chit-DC-VB12溶解；再称取20毫克姜黄素，溶于5毫升乙醇，缓慢滴加到上述Chit-DC-VB12溶液中，于18℃持续搅拌5小时；最后在60℃水浴中以800转/分钟的速度搅拌使有机溶剂挥发，以4000转/分钟的速度离心混合液10分钟，上层清液即为负载药物的Chit-DC-VB12纳米粒。

实施例4

小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物，在壳聚糖上偶联了脱氧胆酸和VB12；其中，壳聚糖的重均分子量为450000，脱乙酰度为98％；脱氧胆酸的接枝率为12％，VB12的接枝率为10％；所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的结构式同实施例1。

上述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的制备方法包括如下步骤：

(1)制备无水二甲亚砜：在400毫升二甲亚砜中加入16克氢化钙，于30℃搅拌5天，静置4天，过滤，在滤液中加入型号为的分子筛，浸泡7天。

(2)称取200毫克VB12，溶于5毫升无水二甲亚砜，加入50毫克CDI，在氦气保护下，于30℃搅拌反应50分钟，搅拌速度200转/分钟(以下步骤均使用相同搅拌速度)；

(3)称取300毫克Chit-DC，置于40毫升无水二甲亚砜中，于30℃搅拌20小时溶解；

(4)将步骤(1)得到的反应液滴加到步骤(2)得到的溶液，在氦气保护下，于30℃搅拌反应24小时，将反应液用蒸馏水在截流分子量为35000的透析袋水透析4天，冷冻干燥12小时，得到偶联脱氧胆酸基团和VB12小肠靶向因子的壳聚糖衍生物，命名为Chit-DC-VB12，通过核磁共振波谱法进行结构分析。

Chit-DC-VB12的载药纳米粒，其制备方法为：称取约50毫克Chit-DC-VB12，置于圆底烧瓶中，加入20毫升蒸馏水，于30℃以200转/分钟的速度搅拌至Chit-DC-VB12溶解；再称取18毫克灯盏花素，溶于4毫升乙醇，缓慢滴加到上述Chit-DC-VB12溶液中，于30℃持续搅拌18小时；最后在50℃水浴中以200转/分钟的速度搅拌使有机溶剂挥发，以6000转/分钟的速度离心混合液15分钟，上层清液即为负载药物的Chit-DC-VB12纳米粒。

实施例5

小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物，在壳聚糖上偶联了脱氧胆酸和VB12；其中，壳聚糖的重均分子量为100000，脱乙酰度为87％；脱氧胆酸的接枝率为9％，VB12的接枝率为8％；所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的结构式同实施例1。

上述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的制备方法包括如下步骤：

(1)制备无水二甲亚砜：在500毫升二甲亚砜中加入20克氢化钙，于38℃搅拌7天，静置7天，过滤，在滤液中加入型号为的分子筛，浸泡5天。

(2)称取150毫克VB12，溶于4毫升无水二甲亚砜，加入40毫克CDI，在氩气保护下，于38℃搅拌反应60分钟，搅拌速度300转/分钟(以下步骤均使用相同搅拌速度)；

(3)称取500毫克Chit-DC，置于50毫升无水二甲亚砜中，于38℃搅拌24小时溶解；

(4)将步骤(1)得到的反应液滴加到步骤(2)得到的溶液，在氩气保护下，于38℃搅拌反应20小时，将反应液用蒸馏在截流分子量为50000的透析袋水透析5天，冷冻干燥18小时，得到偶联脱氧胆酸基团和VB12小肠靶向因子的壳聚糖衍生物，命名为Chit-DC-VB12，通过核磁共振波谱法进行结构分析。

Chit-DC-VB12的载药纳米粒，其制备方法为：称取约30毫克Chit-DC-VB12，置于圆底烧瓶中，加入15毫升蒸馏水，于30℃以300转/分钟的速度搅拌至Chit-DC-VB12溶解；再称取15毫克姜黄素，溶于3毫升甲醇，缓慢滴加到上述Chit-DC-VB12溶液中，于38℃持续搅拌15小时；最后在55℃水浴中以300转/分钟的速度搅拌使有机溶剂挥发，以8000转/分钟的速度离心混合液30分钟，上层清液即为负载药物的Chit-DC-VB12纳米粒。

实施例6

采用核磁共振波谱法表征本发明的小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物Chit-DC-VB12及制备Chit-DC-VB12的原料，所得¹H NMR谱图(溶剂：重水)如图3所示。

图3中，(a)表示Chit-DC-VB12，(b)表示原料Chit-DC，(c)表示原料VB12。在Chit-DC-VB12的¹H NMR谱图中(曲线a)，发现同时出现了Chit-DC和VB12质子的特征共振峰，证明合成出Chit-DC-VB12。

实施例7

根据文献(Biomacromolecules,2005,6,2462-2467)报道，Caco-2细胞形态和功能与小肠上皮细胞相似，因而Caco-2细胞模型已成为研究口服药物吸收较为经典的体外细胞培养模型。

我们按照本发明制备Chit-DC-VB12的载药纳米粒的方法，制备负载灯盏花素的Chit-DC纳米粒，具体方法为：先称取5～50毫克两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物Chit-DC，置于圆底烧瓶中，加入3～20毫升蒸馏水，于18～38℃搅拌至Chit-DC溶解；再称取1～20毫克灯盏花素，溶于1～5毫升有机溶剂，将所得溶液缓慢滴加到上述两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物溶液中，于18～38℃持续搅拌5～24小时；最后在40～60℃水浴中搅拌使有机溶剂挥发，以2000～8000转/分钟的速度离心混合液5～30分钟，上层清液即为负载灯盏花素的Chit-DC纳米粒。

通过Caco-2细胞模型研究上述灯盏花素/Chit-DC纳米粒以及本发明所述灯盏花素/Chit-DC-VB12纳米粒的小肠上皮细胞跨膜转运吸收性能(结果如图6所示)。研究发现，灯盏花素组的渗透系数(Papp)值在2小时内约为1.76×10^-7cm/s。相比之下，Chit-DC/灯盏花素纳米粒组的Papp值升高了约5倍，即在2小时内基本维持在(9.25±0.04)×10^-7cm/s至(9.77±0.19)×10^-7cm/s区间。值得注意的是，Chit-DC-VB12/灯盏花素纳米粒组的Papp值明显高于Chit-DC/灯盏花素纳米粒组，在0.5小时至1.5小时期间随着时间的延长，Chit-DC-VB12/灯盏花素纳米粒组的Papp值从(13.52±0.03)×10^-7cm/s增加至(16.59±0.02)×10^-7cm/s，2小时后仍然维持在(14.78±0.01)×10^-7cm/s。这些结果表明虽然Chit-DC纳米粒具有小肠上皮细胞跨膜转运吸收的性能，但是Chit-DC-VB12纳米粒的小肠上皮细胞跨膜转运吸收性能较Chit-DC纳米粒更好，更有利于促进药物在小肠的靶向吸收。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物，其特征在于：所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物在壳聚糖上偶联了脱氧胆酸和维生素B12；其中，壳聚糖的重均分子量为50000～450000，脱乙酰度为70～98％；脱氧胆酸的接枝率为3～15％，VB12的接枝率为5～15％；

所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的结构式为：

2.根据权利要求1所述的小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物，其特征在于：所述壳聚糖的脱乙酰度为95％；脱氧胆酸的接枝率为11％，VB12的接枝率为13％。

3.一种如权利要求1所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖衍生物的制备方法包括以下步骤：

(1)称取10～200重量份维生素B12，按照每克维生素B12中加入20～50毫升无水二甲亚砜的比例，将维生素B12溶于无水二甲亚砜中；加入5～50重量份N,N'-羰基二咪唑，在惰性气体保护下，于18～38℃搅拌反应10～60分钟；

(2)称取20～500重量份两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物，按照每克两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物中加入100～500毫升无水二甲亚砜的比例，将两亲性含脱氧胆酸的壳聚糖衍生物置于无水二甲亚砜中，于18～38℃搅拌2～24小时溶解；

(3)将步骤(1)得到的反应液滴加到步骤(2)所得的溶液中，在惰性气体保护下，于18～38℃反应10～24小时；透析反应产物，冷冻干燥6～24小时，得到偶联脱氧胆酸基团和维生素B12的壳聚糖衍生物。

4.根据权利要求3所述的制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的方法，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)中无水二甲亚砜的制备方法为：按照每升二甲亚砜中加入2～40克氢化钙的比例，在二甲亚砜中加入氢化钙，于18～38℃搅拌1～7天，静置1～7天，过滤，在滤液中加入分子筛，浸泡1～7天。

5.根据权利要求3所述的制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的方法，其特征在于：所述步骤(1)、步骤(3)中惰性气体为氮气、氦气或氩气。

6.根据权利要求3所述的制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的方法，其特征在于：所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中搅拌的速度为200～800转/分。

7.根据权利要求3所述的制备小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的方法，其特征在于：所述步骤(3)中透析的条件为：选用截流分子量为500～50000的透析袋透析1～5天。

8.权利要求1所述小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的载药纳米粒，其特征在于：所述壳聚糖衍生物的载药纳米粒的制备方法为：先称取5～50重量份壳聚糖衍生物，置于圆底烧瓶中，按照每毫克壳聚糖衍生物中加入0.4～0.6毫升蒸馏水的比例，向壳聚糖衍生物中加入蒸馏水，于18～38℃搅拌至壳聚糖衍生物溶解；再称取1～20重量份疏水性药物，按照每毫克疏水性药物中加入0.2～1毫升有机溶剂的比例，将疏水性药物溶于有机溶剂中，所得溶液缓慢滴加到上述壳聚糖衍生物溶液中，于18～38℃持续搅拌5～24小时；最后在40～60℃水浴中搅拌使有机溶剂挥发，以2000～8000转/分钟的速度离心混合液5～30分钟，上层清液即为壳聚糖衍生物的载药纳米粒。

9.根据权利要求8所述的小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的载药纳米粒，其特征在于：所述疏水性药物为姜黄素或灯盏花素。

10.根据权利要求8所述的小肠靶向吸收的壳聚糖衍生物的载药纳米粒，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。