CN106729726A - 纳米载体材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米载体材料,该纳米载体材料是由半胱氨酸还原裂解硫辛酸后,硫辛酸自身交联形成的聚合物。本发明还公开了该纳米载体材料的制备方法及其应用。本发明的纳米载体材料,不仅可降解、细胞毒性小,而且具有肿瘤细胞环境响应的优势,能够实现肿瘤细胞靶向给药,提高抗肿瘤药物的药效,减轻患者的痛苦,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种纳米载体材料及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤的主要特征是异常细胞以不受控制的速度生长,目前肿瘤疾病仍然是世界第二大死亡的原因。当前治疗肿瘤的方法包括手术、放疗、激素疗法和化疗等,而化疗是其中的主要手段。传统的化疗不能特异性地靶向给药,这使得正常的健康细胞也受到药物的攻击而损伤,限定了最大容许计量,甚者,快速地消除以及靶器官组织非特异性分布使得患者常常需要加大药量而导致经济负担增大和毒性反应增强。因此提供一种毒性小的靶向给药系统是解决化疗缺陷的关键。
发明内容
本发明要解决目前缺乏毒性小的靶向给药系统的技术问题,提供一种纳米载体材料,该纳米载体材料不仅可降解、细胞毒性小,而且具有肿瘤细胞环境响应的优势,能够实现肿瘤细胞靶向给药,提高抗肿瘤药物的药效,减轻患者的痛苦。
为了解决上述技术问题,本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面,提供了一种纳米载体材料,该纳米载体材料为包含以下结构单元的聚合物,
其中n为3191~3572的整数。该n值的取值范围是根据GPC法测定结果所得。
所述纳米载体材料是由半胱氨酸还原裂解硫辛酸后,硫辛酸自身交联形成的聚合物。
所述半胱氨酸与硫辛酸的摩尔比为1:4~6,且所述半胱氨酸与硫辛酸的最佳摩尔比为1:5。
所述纳米载体材料的粒径为85~119nm,Zeta电位为-30~-38mV。
在本发明的另一方面,提供了一种纳米载体材料的制备方法,包括以下步骤:
(1)硫辛酸溶于甲醇,加入半胱氨酸盐酸盐反应1~24小时;
(2)去除多余的甲醇后,分别用稀盐酸和水洗涤若干次,进一步去除杂质;
(3)溶于氯仿,加入1%的胆酸钠溶液超声乳化得纳米粒,分散至蒸馏水中,得纳米载体材料。
优选的,在步骤(3)之后,还包括下述步骤(4):
离心除去大颗粒物质,再超滤除去胆酸钠,得纯化的纳米载体材料。
优选的,所述步骤(1)中,硫辛酸与半胱氨酸的反应时间为8小时。
在本发明的另一方面,还提供了一种药物组合物,包含上述纳米载体材料和药物。
在本发明的另一方面,还提供了上述纳米载体材料的应用,用于制备药物的转运载体。
本发明的纳米载体材料,是一种采用半胱氨酸还原裂解、硫辛酸自身交联成二硫键形成的纳米级载体材料,其中的二硫键在还原性条件下能够快速裂解,尤其在谷胱甘肽的作用下,释放药物,而肿瘤细胞中谷胱甘肽的浓度是正常细胞的7倍,因此由本发明材料形成的载药纳米粒具有肿瘤细胞环境响应性,且性质稳定,可细胞内降解,毒性小,为抗肿瘤药的广泛应用提供强有力的技术支持。此外,本发明纳米载体材料的制备方法操作简单,反应试剂及裂解产物毒性非常小,成本低廉,利于大规模的推广应用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1制备纳米载体材料的反应结构式示意图;
图2是本发明实施例1新型空白纳米粒的粒径图;
图3是本发明实施例1新型空白纳米粒的电位图;
图4是本发明实施例1载药纳米粒的粒径图;
图5是本发明实施例1载药纳米粒的电位图;
图6是本发明实施例1空白和载药纳米粒的透射电镜图;
图7是本发明实施例2纳米载体材料的紫外特征吸收峰变化图;
图8是本发明实施例2纳米载体材料的GPC分子量测定图;
图9是本发明实施例3纳米粒体外释药曲线图;
图10是本发明实施例4纳米粒摄取荧光图;
图11是本发明实施例4纳米粒摄取的流式图;
图12是本发明实施例5纳米粒入胞机制考察流式细胞检测图;
图13是本发明实施例6纳米载体材料的毒性结果图;
图14是本发明实施例6载多西他赛纳米粒的药效结果图;
图15是本发明实施例7载药纳米粒药效的凋亡流式图;
图16是本发明实施例7载药纳米粒药效的周期流式图。
具体实施方式
本发明研制了一种由半胱氨酸还原裂解硫辛酸后,硫辛酸自身交联形成的纳米载体材料,半胱氨酸与硫辛酸的摩尔比为1:4~6,最佳摩尔比为1:5,反应时间为1~24小时,最佳反应时间为8小时。
本发明生物可降解的纳米载体材料及载药纳米粒的制备方法,具体步骤包括:
(1)材料的制备:硫辛酸溶于甲醇,加入半胱氨酸盐酸盐反应1~24小时;
(2)洗涤去杂质:去除多余的甲醇后,稀盐酸洗涤2-3次,水洗涤3次,进一步去除杂
质;
(3)纳米粒的制备:溶于氯仿,1%的胆酸钠溶液超声乳化得纳米粒,分散到蒸馏水中;
(4)离心除去大颗粒物质(3000r,10min);
(5)纯化:超滤除胆酸钠(100000分子量,1500r,3min);
(6)载药:步骤(4)所得溶液冻干后溶于氯仿,加入抗肿瘤药(或荧光素)、水,超声乳化所得溶液加入纯净水中搅拌,挥尽氯仿得最终溶液。
下面通过具体实施例进一步详细阐述本发明。
实施例1 空白纳米粒(即纳米载体材料)及载药纳米粒的合成
(1)100mg硫辛酸溶于1ml甲醇中,加入170mg的半胱氨酸盐酸盐,避光搅拌8小时,其反应结构式见图1。
(2)风干或用氮气吹干甲醇,稀盐酸洗涤步骤(1)所得溶液2-3次,去除未反应的半胱氨酸盐酸盐,再蒸馏水洗涤3次3遍,除去多余的盐酸后干燥。
(3)将步骤(2)所得材料溶于2ml氯仿,再加入8ml的1%胆酸钠,超声30s,间隔10s。重复超声2次。
(4)将步骤(3)所得溶液加入到10ml蒸馏水中,搅拌12h,挥发尽氯仿。
(5)将步骤(4)所得纳米粒离心(3000r,10分钟)除去大的颗粒。
(6)将步骤(5)所得溶液置于10万级的超滤管中,800r超滤3分钟,除去多余的胆酸钠,纯化得最终的纳米级载体材料。
(7)载药:将步骤(5)所得纳米粒溶液冻干,取20mg的冻干后材料溶于1ml的氯仿,加入1mg多西他赛(或香豆素6),加入4ml的水,超声30s,间隔10s,重复步骤(4)、(5)、(6)。
(8)粒径电位测定:取20ul纳米粒溶液加入到1ml的纯净水中,采用粒径-电位仪(Zetasizer ZS90电位粒径分析仪,英国Malvern公司)。其结果如图2-5所示。图2、3为本发明新型空白纳米粒的粒径、电位图,由图2和3可知,本发明新型空白纳米粒的粒径为85~119nm,Zeta电位为-30~-38mv。图4、5为载药纳米粒的粒径、电位图,由图4和5可知,实施例1载药纳米粒的粒径为100nm~180nm,Zeta电位为-30~-38mv。
采用透射电镜观察纳米粒形态,结果如图6所示,纳米粒分散较均匀,有少许聚集,纳米粒基本呈球形或近球形,说明制备的载药纳米粒形态良好。
实施例2 硫辛酸纳米粒制备处方筛选
硫辛酸甲醇溶液中,分别加入10%、20%、30%、40%、50%的半胱氨酸,反应24小时后测定不同反应时间的载体材料的330nm处紫外吸收值,纳米粒的粒径,结果当加入20%的半胱氨酸时,特征紫外吸收值最低,交联最完全,且粒径最低;硫辛酸与20%半胱氨酸反应1、2、4、8、12、24小时,测定载体材料的330nm处紫外吸收值,纳米粒的粒径,结果8小时,特征紫外吸收值最低,交联最完全,且粒径最低,且将制得的纳米粒置于4℃保存一个月,8小时、12小时、24小时的纳米粒未有析出,故筛选出最优处方为20%的半胱氨酸,反应8小时。其紫外吸收对比图如图7所示,图7结果显示,反应前后硫辛酸五元环紫外特征吸收峰明显减少,表明交联成功。且将最佳处方所制得载体材料进行GPC分子测定,重复3次,得交联度范围。其结果如图8所示。
实施例3 体外释药特性
采用透析袋法进行体外释药实验,将2ml的载多西他赛纳米粒溶液置于分子量为8000~14000的透析袋,置于200ml,0.5%吐温80的PBS溶液中(调节PH为5.5或7.4),以100r的速度进行搅拌,分别在2、4、8、12、24、36、48、64、72、96、120h取样3mL,同时补液3mL,经O.45p.m微孔滤膜过滤后,进液相色谱仪检测。其释药曲线图如图9所示,结果证实本发明载药纳米粒溶液具有缓释作用,且在PH为5.5的释放率高于PH为7.4时的释放率。
实施例4 摄取的考察
将对数生长期的A549细胞按照20万个/孔铺12孔板,置于37℃、5%CO2的孵箱中培育24小时使细胞贴壁。将培养基更换为预热至37℃的无血清1640培养基,将制备好的包载香豆素6的纳米粒溶液加入各孔中,培养板放入孵箱中3h。采用荧光显微镜观察摄取情况,其结果为图10。细胞摄取荧光物质,于荧光显微镜下观看视野明亮,且荧光物质分布于细胞质中,说明肿瘤细胞摄取载体明显,且载体分布细胞质中释放药物。将细胞消化,离心后PBS重悬至500ul,利用流式细胞仪检测细胞对纳米复合物的摄取情况,其结果为图11。根据流式计数结果,硫辛酸纳米粒的摄取率明显高于单纯香豆素6,且与PLGA纳米粒摄取率相当。图11中,LANP为硫辛酸纳米粒,PLGANP为PLGA纳米粒。
实施例5 入胞机制的考察
利用氯丙嗪、菲律平、阿米洛利3种不同入胞途径的抑制剂对细胞进行处理。氯丙嗪(CPZ)阻断网格蛋白介导的内吞途径,菲律平(Filip)可以通过选择性的阻止质膜微囊的形成,从而阻断质膜微囊介导的内吞途径,阿米洛利(Amil)可以阻断大胞饮入胞途径。细胞铺板12孔,将A549细胞先用氯丙嗪30um/非律平1ug/ml/阿米利洛30um预处理1小时,载体加入进去孵化2小时。PBS洗涤,消化,收集细胞,进行流式检测。氯丙嗪预处理后细胞摄取降幅最大,而阿迷洛利预处理后细胞摄取基本不受影响。
结果(见图12):入胞机制为网格蛋白介导的内吞途径,质膜微囊介导的内吞途径共同作用。
实施例6 细胞毒性及药效的考察
1.纳米载体的细胞毒性试验
将空白纳米载体溶液以不同浓度梯度加入A549细胞的96孔板中,培养24h、48h后,采用CCK8法测定细胞毒性。具体步骤如下:
A549细胞,1万/孔,100ul的培养液,96孔板,孵化24h。细胞用预热至37℃的培养基(无血清)润洗2次,将新鲜的硫辛酸载体及PLGA载体,配成不同的浓度,加入A549细胞的96孔板中。3小时后,换成预热好的含有血清的培养液,培养24小时。取出培养板,每孔加入10ul的CCK-8溶液,孵化1.5h,用酶标仪振荡30S,测定450nm处的吸光度。以未经处理的细胞作为对照组,未接种细胞的孔为空白组(空白组:96孔板铺板,不同浓度的培养液24小时,加入CCK-8)。计算各孔的活力:活力={A(加纳米载体)-A(空白)}/{A(对照)-A(空白)}*100%,每组重复3次。结果显示,空白载体细胞毒性很小(见图13,图13中LANP为硫辛酸纳米粒,PLGANP为PLGA纳米粒)。
2.纳米载体材料载药的药效试验
将载有多西他赛的纳米粒以不同浓度梯度加入A549细胞的96孔板中,培养24h、48h后,采用CCK8法测定细胞存活率。具体步骤同上述细胞毒性试验。
结果显示,载多西他赛纳米粒释药顺利,药效明显提高(见图14,图14中,DTX指多西他赛,LA-DTX为硫辛酸载多西他赛,PLGA-DTX为PLGA载多西他赛)。
实施例7 凋亡和周期的考察
将载药纳米粒以不同的浓度梯度加入A549细胞的12孔板中,培养24h后,收集细胞进行细胞凋亡检测及周期分析。具体步骤如下:
A549细胞,20万/孔,12孔板,1ml培养液/孔,孵化24小时后,每孔给药1ug/ml,分为四组(control/DTX/PLGA-DTX/LA-DTX),给药24小时后,流式细胞仪测定凋亡及周期。凋亡结果为图15,由图15可知,control组早期凋亡及晚期凋亡的总和即凋亡细胞总比例为6.6%,DTX组为11%,PLGA-DTX组为20%,LA-DTX组为30%,凋亡明显增加。周期结果图为图16,由图16可知,相对于control组,给药组的G2期细胞明显增多,且以LA-DTX组增多最为明显,说明药物作用于细胞的G2期,药效明显。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种纳米载体材料,其特征在于,该纳米载体材料为包含以下结构单元的聚合物,
其中n为3191~3572的整数。
2.根据权利要求1所述的纳米载体材料,其特征在于,所述纳米载体材料是由半胱氨酸还原裂解硫辛酸后,硫辛酸自身交联形成的聚合物。
3.根据权利要求2所述的纳米载体材料,其特征在于,所述半胱氨酸与硫辛酸的摩尔比为1:4~6。
4.根据权利要求1所述的纳米载体材料,其特征在于,所述纳米载体材料的粒径为85~119nm。
5.根据权利要求1所述的纳米载体材料,其特征在于,所述纳米载体材料的Zeta电位为-30~-38mV。
6.一种纳米载体材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)硫辛酸溶于甲醇,加入半胱氨酸盐酸盐反应1~24小时;
(2)去除多余的甲醇后,分别用稀盐酸和水洗涤若干次,进一步去除杂质;
(3)溶于氯仿,加入1%的胆酸钠溶液超声乳化得纳米粒,分散至蒸馏水中,得纳米载体材料。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,在步骤(3)之后,还包括下述步骤(4):
离心除去大颗粒物质,再超滤除去胆酸钠,得纯化的纳米载体材料。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,硫辛酸与半胱氨酸的反应时间为8小时。
9.一种药物组合物,其特征在于,包含权利要求1所述纳米载体材料和药物。
10.权利要求1所述纳米载体材料的应用,其特征在于,用于制备药物的转运载体。
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