CN105017510A - 一种具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物，所述聚合物为下述结构的化合物：

Description

一种具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药用高分子材料和生物医药领域，具体涉及一种具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物、其制备方法和应用。

背景技术

近年来，聚合物胶束（polymeric micelles）作为最具应用前景的药物载体材料之一而受到越来越多的关注。已有一大批聚合物胶束类抗癌药物新剂型被研制出来，有的已经进入临床前应用阶段，如NK911^®，SP1049C ^®，NK105 ^® 和Genexol-PM ^®等。聚合物胶束载药系统尺寸一般都在200纳米以下，能够通过EPR（enhanced permeability and retention）效应在癌变细胞周围选择性富集。随着聚合物合成化学的不断进步，灵活的分子学设计赋予了聚合物胶束丰富多样的微观结构以及不断优化的优良载药性能，这使得聚合物胶束载药技术日益走向成熟，并促使其早日应用于临床成为可能。

药物的控制释放，不仅是指对药物释放地点的控制（即将药物运达特定的病理部位），更重要的，还要实现对药物释放时间的控制（即当载药体系到达目的地后，控制所承载的药物及时、快速地释放出来，使局部达到一定的有效浓度）。基于这个概念，对刺激响应型聚合物胶束（Stimuli-Responsive Micelles）愈来愈多地被应用到药物传递系统中。这类胶束在物理或是化学的刺激下（如pH，温度，还原物质等）物理化学性能或胶束结构应激发生改变，从而使药物释放发生的时间以及释放的速率得到了控制。

相对于其他刺激-响应型聚合物胶束，对pH刺激-响应或者说pH敏感型胶束更适用于抗癌类药物的传递。相对于正常组织细胞而言，癌细胞表面呈弱酸性（pH在6.8左右），当pH敏感胶束通过EPR效应选择性富集在癌细胞表面后，表面的酸性环境能够促发药物的释放。当胶束经细胞内吞作用进入细胞以后，细胞内部的溶酶体和内涵体以更强的酸性（pH在5.0左右）刺激pH敏感胶束加速释放药物。根据响应机理不同，pH敏感聚合物大致分为两大类：一类是含聚离子型嵌段的，另一类是主链或侧链含酸可裂解官能团的。前者通过质子化或去质子化过程来减弱胶束内核与包载药物的相互作用力而实现药物的快速释放；后者则是在酸催化下导致药物与胶束之间化学键断裂或胶束解离而实现药物的快速释放。相对而言，适合的聚离子型pH敏感型嵌段聚合物种类偏少，主要是以胺基和羧基作为响应基团，而且其pKa值可调节范围小。而含酸可裂解官能团的pH敏感型嵌段聚合物更具结构-性能调节的灵活性。

近年来研究表明肿瘤多药耐药性（multidrug resistance，MDR）已成为肿瘤成功化疗的重要障碍之一。因此克服MDR 就成为肿瘤成功化疗的当务之急。许多研究已经发现，纳米载药系统可对抗MDR，甚至逆转MDR。

因此，将腙键引入到嵌段聚合物主链，将其作为亲水段和疏水段的连接点，赋予亲水段和疏水段生物相容性和生物可降解性，基于断裂-解离-释放（意即：化学键断裂-胶束解离-药物释放，Cleave-Disassociate-Release，简称CDR）药物释放机理，设计pH敏感的聚合物胶束并考察其药物释放特性具有十分的必要性、可行性和创新意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物、其制备方法和应用。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一种具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物，所述聚合物为下述结构的化合物：

150≤n≤420，且n为整数。

所述聚合物的合成路线如下：

（1）将聚乙二醇单甲醚溶于甲苯，将叔丁醇钾溶于叔丁醇后，加至聚乙二醇单甲醚溶的甲苯溶液中，再将溴代乙酸乙酯的叔丁醇溶液滴入前述溶液中，反应物摩尔比在1:1~1:10,惰性气体保护下进行反应得化合物1；

（2）将化合物1溶于甲醇中，加入过量的水合肼进行反应，反应结束后，经后处理得到化合物2；

（3）化合物2在乙醇中与对羟基苯甲醛反应，反应物摩尔比在1:1~1:10，反应结束经后处理得到化合物3；

（4）以化合物3和丙交酯为原料，摩尔比控制在1:200和1:500之间，甲苯作为溶剂，辛酸亚锡作为催化剂，惰性气体保护下90-100℃反应，反应结束后经后处理得到目标化合物4。

所述具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物作为载药胶束的应用。

本发明中的具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物，其中pH敏感基团为含腙键结构基团()。

本发明中具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物，属于A-B型聚合物。

本发明具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物作为载药胶束时，装载药物并无限制，只要能增溶或包裹在聚合物内部即可。抗肿瘤药物选自氮芥、氮甲、甘磷酰芥、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、苯丁酸氮芥、六甲蜜胺、多潘、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、替加氟、阿糖胞苷、吉西他滨、卡培他滨、羟基脲、阿霉素、放线菌素D、丝裂霉素、长春瑞滨、替尼泊苷、羟喜树碱、紫杉醇、多西他赛、他莫昔芬、氨鲁米特、来曲唑、甲羟孕酮、甲地孕酮、顺铂、卡铂、奥沙利铂，优选自氮甲、甘磷酰芥、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、苯丁酸氮芥、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、替加氟、阿糖胞苷、吉西他滨、卡培他滨、羟基脲、阿霉素、紫杉醇、多西他赛、他莫昔芬、顺铂、卡铂，更优选自卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、卡培他滨、阿霉素、紫杉醇、多西他赛、他莫昔芬，进一步选自阿霉素、紫杉醇、多西他赛。

装载药物的pH敏感型聚合物载药胶束的制备方法可参考许多纳米药物载体的制备。具体地，将具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物与脂溶性药物共同溶解于有机溶剂，如甲醇、丙酮，乙醇、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，加入适量水或水溶液，搅拌，透析除去有机溶剂后即得装载药物的pH敏感树枝状载药胶束（当仅仅将pH敏感可降解聚合物溶于上述溶剂中得到空白胶束）。

本发明设计的具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物作为载药胶束时，可核壳分离，具有载药量大，药物在体外和体内循环时不渗漏，当达到肿瘤部位后，由于肿瘤部位的弱酸性，药物将迅速释放到肿瘤组织内。将聚酯类生物可降解聚合物通过pH敏感的腙键与亲水性长链（如PEG）连接。此可核壳分离的pH敏感型聚合物药物胶束在弱酸性（pH≤6.5，肿瘤细胞外组织液pH6.5、内涵体pH5.5~6.0、溶酶体pH4.5~5.0）下由于pH敏感的腙键结构发生水解而快速断裂，引起亲水嵌段和疏水嵌段分离，从而破坏胶束结构而将包载疏于水内核的药物释放快速出来；而在中性或弱碱性（pH≥7.0）下由于pH敏感的腙键结构基团相对稳定，药物释放速率缓慢。

本发明pH敏感聚合物作为载药胶束时的特点包括：（1）真正纳米级（<200nm），非常均一稳定；（2）多靶向技术（克服单靶向不足），包括长循环纳米粒子的天然靶向，pH敏感的物理化学靶向，充分获得肿瘤靶向性；（3）载药量大、稳定性好，减少了治疗成本和由于游离药物释放产生的副作用；（4）在肿瘤组织内迅速释放药物，获得局部高浓度，快速杀灭癌细胞，不易产生耐药性，（5）高度肿瘤靶向性使其在正常组织分布很少，副作用很小；即使少量到达非肿瘤部位，由于pH敏感，药物几乎不释放或释放速率很小，副作用很小。

附图说明

图1 实例1中目标化合物4及其中间产物的¹H NMR 谱图；

图2实例1中目标产物4包载阿霉素时的pH触发性药物释放；

图3空白胶束对（a）HeLa 细胞和(b)RAW细胞的细胞毒性。其中，PEG-PLA代表不含腙键的聚合物胶束，PEG-HZ-PLA代表含腙键的聚合物胶束（即实例1中目标化合物胶束）。

图4 实例1中目标产物4包载阿霉素时对（a）HeLa 细胞和(b)RAW细胞的细胞毒性。其中，PEG-PLA代表不含腙键的聚合物胶束，PEG-HZ-PLA代表含腙键的聚合物胶束，Free DOX代表游离的阿霉素原料药。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

一种具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物，所述聚合物为下述结构的化合物：

150≤n≤420，且n为整数。

所述聚合物的合成路线如下：

将10.0g聚乙二醇单甲醚（Mn=5000，2mmol）加入250mL圆底烧瓶中，再加入100mL甲苯，将1.2g叔丁醇钾溶于15mL叔丁醇后加入聚乙二醇单甲醚/甲苯溶液中，在氮气保护下，50℃反应20min。将2.22mL溴代乙酸乙酯溶于20mL叔丁醇后在氮气保护下，逐滴加入上述反应液中，立即出现沉淀，温度保持50℃反应36h。反应结束后，离心除去沉淀，上清液旋蒸除去大部分溶剂，冰乙醚（-4℃，50mL）沉淀，过滤得到的固体用20mL二氯甲烷中溶解，之后再用冰乙醚（-4℃，50mL）沉淀，反复操作三次，得到甲氧基聚乙二醇酸甲酯（即化合物1），40℃真空干燥24h。

将4.0g干燥的化合物1溶于30mL无水甲醇中，加入10mL水合肼，60℃回流反应24h，反应结束后，旋蒸除去大部分溶剂，加入冰乙醚（-4℃, 50mL）沉淀，抽滤，滤饼40℃真空干燥24h，得到白色粉末状化合物2。将3.0 g化合物2和0.6 g对羟基苯甲醛溶于30 ml四氢呋喃中，氮气保护下，60 ℃回流反应24 h。反应结束后，反应液用过量的冰乙醚反复沉淀3次，得到化合物3。化合物3和丙交酯反应，mol比控制在1:200和1:500之间，溶剂甲苯（20mL到50mL），催化剂辛酸亚锡(0.3至0.5 mL)，氮气保护，100℃反应24h。得到目标化合物4。再加入冰乙醚（-4℃，50mL）使产物沉淀析出，减压抽滤至干得固体产物，真空干燥。根据聚合物的核磁共振图谱，计算出聚合物物的分子量。根据投料mol比，得到产物中n的值控制在150和420之间。

图1中给出了合成过程中产物的核磁图，确认了结构。

载有阿霉素胶束的制备：称取27mg聚合物溶于1mL丙酮。称取3mg阿霉素溶于1mL二甲亚砜后，将阿霉素的二甲亚砜溶液和聚合物的丙酮溶液混合。将此混合溶液搅拌下缓慢滴入30mL去离子水中，滴加完毕后，装入透析袋（截留分子量：8000-14000）中避光用去离子水透析，每4h更换一次透析介质，36h后用0.22μm滤膜过滤，即制得载阿霉素聚合物胶束。

载阿霉素聚合物胶束的药物释放研究：阿霉素释放研究的释放介质为2种不同pH的醋酸盐缓冲液(0.01M，pH=4.0和pH=5.0)和磷酸缓冲液(0.01M，pH=7.4)。将3mL载阿霉素聚合物胶束平均分为三份，分别加入透析袋中（截留分子量：8000-14000），放入20mL不同pH（即pH为4、5和7.4）的释放介质中，在恒温振荡器中进行释放研究(37℃，100rpm)。在0.5h、1h、3h、6h、9h、12h、24h取样3mL，每次取样后补加入相对应的3mL新鲜释放介质。样品用荧光分光光度计检测阿霉素含量（激发波长481nm，发射波长558nm），得到载药胶束在不同pH条件下的释放曲线，如图2所示，pH敏感性聚合物载药胶束能够在生理条件下（pH7.4）保持稳定，所负载的阿霉素不被释放或者释放量较小。而在酸性环境下（pH4.0或pH5.0）药物快速释放。

聚合物空白胶束及载阿霉素胶束的细胞毒性测试：取处于指数生长期的HeLa细胞、RAW 264.7细胞接种到96孔板上，每孔含1×10⁴个细胞，培养24h后（37℃、5v% CO₂），分别加入不同的聚合物胶束或载药胶束继续培养，聚合物胶束（即空白胶束）的最终浓度梯度为：0.01mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL。载药胶束所含的最终阿霉素浓度梯度为：0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、15μg/mL。每个浓度均设3个复孔，同时用未处理的细胞作为对照。加入样品以后继续培养48h（37℃、5v% CO₂），进行MTT检测：每孔加MTT（噻唑蓝）溶液（5mg/mL， PBS溶解，pH=7.4)20Ul，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μLDMSO，摇床低速振荡（37℃）10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值（检测波长：570nm）。以含样品孔与空白对照孔的吸光度平均值之比作为细胞存活率。空白胶束对HeLa细胞和RAW 264.7细胞的几乎没有毒性（图3），而载阿霉素的胶束对两种细胞产生了不同程度的抑制，腙键的引入、腙键化学环境和胶束核的构建材料对抑制作用有不同程度影响（图4）。

Claims (3)

1.一种具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物，其特征在于，所述聚合物为下述结构的化合物：

150≤n≤420，且n为整数。

2.权利要求1具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物的制备方法，其特征在于，所述聚合物的合成路线如下：

（1）将聚乙二醇单甲醚溶于甲苯，将叔丁醇钾溶于叔丁醇后，加至聚乙二醇单甲醚溶的甲苯溶液中，再将溴代乙酸乙酯的叔丁醇溶液滴入前述溶液中，反应物摩尔比在1:1~1:10，惰性气体保护下进行反应得化合物1；

（2）将化合物1溶于甲醇中，加入水合肼进行反应，反应结束后，经后处理得到化合物2；

（3）化合物2在乙醇中与对羟基苯甲醛反应，反应物摩尔比在1:1~1:10，反应结束经后处理得到化合物3；

（4）以化合物3和丙交酯为原料，摩尔比控制在1:200和1:500之间，甲苯作为溶剂，辛酸亚锡作为催化剂，惰性气体保护下90-100℃反应，反应结束后经后处理得到目标化合物4。

3.权利要求1所述具有肿瘤组织pH敏感性的可降解聚合物作为载药胶束的应用。