CN107090082B

CN107090082B - 一种具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物、其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107090082B
Application number: CN201710229689.9A
Authority: CN
Inventors: 宋仕永; 秦本凯; 刘蕾; 潘洋洋; 吴晓贺; 朱迎春
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2017-04-10
Filing date: 2017-04-10
Publication date: 2018-11-20
Anticipated expiration: 2037-04-10
Also published as: CN107090082A

Abstract

一种具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物，所述衍生物结构如下：本发明茄尼醇衍生物作为载药胶束时有如下特点：(1)纳米级粒径<100nm，粒径分布均一稳定；(2)聚乙二醇亲水外壳及纳米级的粒径，可实现纳米粒子的长循环及EPR被动靶向性；(3)还原敏感的主动靶向性，可利用肿瘤细胞质中高富含还原性物质GSH，实现肿瘤组织部位的触发型释药；(4)具有很好的负载疏水性抗癌药物的能力，载药量高，稳定性好；(5)高度的肿瘤靶向性，使药物在肿瘤组织中释放较多，在正常组织分布较少，减少药物对正常组织的毒副作用；(6)疏水段茄尼醇具有肿瘤细胞抑制作用和抗癌药物增敏作用，可增强抗癌药物的肿瘤细胞抑制效应。

Description

一种具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物、其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药用高分子材料和生物医药领域，具体涉及一种具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物、其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤是在各种致癌因素的作用下，某些细胞在基因水平上发生改变，产生异常无限增殖的病变。其已成为威胁人类生命健康的主要原因。目前，肿瘤治疗仍以传统的三大方式为主，即放射治疗法、外科手术切除法及小分子抗癌药物化学疗法。放射疗法及外科手术疗法由于毒副作用大及易出现复发结果，临床应用受到一定限制。抗癌药物化学疗法是利用小分子抗癌药物对肿瘤细胞产生抑制作用，为临床应用最普遍的主要及辅助治疗手段。目前，临床常用的化疗药物主要为小分子药物，如：阿霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、喜树碱等。多数小分子抗癌药物均存在水溶性差、生物利用度低等问题。其作用的最终结果是，化疗效果不明显，产生多药耐药性(MDR)。此类药物直接给药时，对肿瘤组织及细胞的选择性差，往往出现在肝脏、脾脏、心脏及肾脏等正常组织器官的蓄积，而对正常组织产生不可逆转的损害。如临床一线广谱抗癌药阿霉素(DOX)，其具有较强的肿瘤细胞杀灭能力，可有效延长癌症患者生存时间。但由于故有的低选择性和高毒性，导致了其有明显的严重毒副作用，主要包括骨髓抑制、心脏损害及易产生耐药性等。

纳米技术的发展，为肿瘤靶向治疗提供了一条新的路径。利用纳米技术制备的纳米载药体系可用于增加难溶性药物的溶解度，改变其药代动力学性质等，使药物对肿瘤细胞有更强的目标特异性。将药物靶向于目标肿瘤细胞，提高抗癌效果，同时减少药物的使用剂量，减少于正常组织或细胞中的分布，从而显著降低了抗癌药物的毒副作用。与传统药物相比纳米载药体系的主要优势如：(1)解决传统药物极低的水溶性及稳定性问题，利用纳米载体材料将药物负载于水溶性载体中，一方面可能会改变药物的存在形态而改变药物溶解性质及释放问题；另一方面将药物与外界环境隔绝，提高了其物理化学稳定性。(2)利用载体的长循环特性，延长药物的体内循环时间，提高生物利用度，从而较小的使用剂量可达到较高的血药浓度。(3)纳米载体利用其自身的粒径大小，可利用肿瘤的病理特点实现被动靶向，提高药物肿瘤蓄积能力。(4)载体材料表面存在较多的位点，可用于其他生物配体(如叶酸、半乳糖、细胞穿透肽等)的修饰及改造，利用肿瘤部位高表达的受体实现主动靶向。(5)利用肿瘤组织微环境差异于正常组织可以实现敏感性释放药物(如pH触发型、氧化还原敏感型、热敏性、超声波激化型等)，能够在肿瘤组织中快速且大量释药；而在正常组织中基本没有药物释放。(6)对抗肿瘤多药耐药性(MDR)的发生。一方面，利用纳米载体使药物到达有效抑制肿瘤和杀灭肿瘤的有效浓度，而不是长期处于低浓度状态，可有效避免耐药性的产生。另一方面，可对抗已经产生耐药性的情况，通过载体的表面修饰，增加细胞对药物的摄取，减弱多药耐药性的发生和发展。

茄尼醇(all-trans-nonaprenol)为45碳原子的九异戊二烯，可由烟叶中提取而来，为重要的天然提取产物，主要用于作为合成含有异戊二烯结构的复杂化合物，如CoQ10、Vk等。其药理活性主要包括：抗肿瘤、抗溃疡、抗炎症、抗病毒、细菌等。有研究表明异戊二烯类似物(SDB)可明显降低肿瘤细胞的多药耐药性，增强药物对癌细胞的杀灭作用。有研究人员将寡聚异戊二烯结构的反，反法尼基硫代水杨酸引入，作为聚合物疏水段材料，用于靶向传递及协同提高抗肿瘤药(DOX、PTX)的药理活性。

因此，综合肿瘤组织病理特点及茄尼醇药理作用，特将还原敏感的双硫键引入到聚合物主链，并将茄尼醇作为疏水段，赋予两亲性聚合物的还原敏感性及疏水段协同抗肿瘤作用，基于断裂-解离-释放(意即：化学键断裂-胶束解离-药物释放，Cleave-Disassociate-Release，简称CDR)药物释放机理，设计还原敏感的聚合物胶束并考察其药物释放特性具有十分的必要性、可行性和创新意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物、其制备方法和应用。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一种具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物，所述衍生物为下述结构的化合物：

所述茄尼醇衍生物的合成路线如下：

(1)将茄尼醇(SOL)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)和DCC(N,N'-二环己基碳酰亚胺)溶于二氯甲烷中，N₂保护下滴入3,3'-二硫代二丙酸的DMF液中，N₂保护下室温反应至少48h，反应结束后，经后处理即得化合物茄琥酯1；其中以摩尔比计：茄尼醇︰DMAP︰DCC︰3,3'-二硫代二丙酸＝1:0.5:2:2；

(2)将化合物1与聚乙二醇单甲醚(当聚乙二醇单甲醚的n值为114时，Mn＝5000Da)溶于二氯甲烷中，在DCC、DMAP催化下，室温搅拌反应至少48h，反应结束后，经后处理即得目标产物化合物2；其中以摩尔比计：聚乙二醇单甲醚︰化合物1︰DMAP︰DCC＝1:2:1:2。

所述具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物作为载药胶束的应用。

本发明中的具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物，其中GSH敏感基团为含双硫键结构基团

本发明中具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物，属于A-B型聚合物。

本发明还原敏感茄尼醇衍生物作为载药胶束时，装载药物并无限制，只要能增溶或包裹在聚合物内部即可。具体地，装载药物选自脂溶性药物。优选的是抗肿瘤药物。抗肿瘤药物选羟喜树碱、紫杉醇、多西他赛、他莫昔芬、氨鲁米特、来曲唑、甲羟孕酮、甲地孕酮、顺铂、卡铂、奥沙利铂，优选自氮甲、甘磷酰芥、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、苯丁酸氮芥、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、替加氟、阿糖胞苷、吉西他滨、卡培他滨、羟基脲、阿霉,更优选阿霉素、紫杉醇、多西他赛、他莫昔芬，进一步选自阿霉素、紫杉醇、多西他赛。

装载药物的还原敏感性茄尼醇衍生物载药胶束的制备方法有多种方式。具体地，将具有肿瘤组织GSH敏感性的茄尼醇衍生物与脂溶性药物共同溶解于有机溶剂，如丙酮，乙醇、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，加入适量水或水溶液，搅拌，透析除去有机溶剂后即得装载药物的GSH敏感载药胶束(当仅仅将GSH敏感茄尼醇衍生物溶于上述溶剂中得到空白胶束)。

本发明设计的具有肿瘤组织还原敏感性茄尼醇衍生物作为载药胶束时，可核壳分离，具有载药量大，药物在体外和体内循环时不渗漏，当达到肿瘤部位后，由于肿瘤组织细胞质中含有大量还原性谷胱甘肽(GSH)，两亲性茄尼醇衍生物材料可发生断裂，载药胶束结构解离，抗肿瘤药物将迅速释放到肿瘤组织内。将天然提取物茄尼醇通过GSH敏感的双硫键与亲水性长链(如PEG)连接。

本发明还原敏感性茄尼醇衍生物作为载药胶束时，由于茄尼醇本身具有：抗肿瘤、抗溃疡、抗炎症、抗病毒、细菌等药理活性，将其作为疏水段材料可实现一定协同作用，增加抗肿瘤药物的药效，减少肿瘤细胞耐药性的产生。

本发明还原敏感茄尼醇衍生物作为载药胶束时有如下特点：(1)纳米级粒径<100nm，粒径分布均一稳定；(2)聚乙二醇亲水外壳及纳米级的粒径，可实现纳米粒子的长循环及EPR被动靶向性；(3)还原敏感的主动靶向性，可利用肿瘤细胞质中高富含还原性物质谷胱甘肽(GSH)，实现肿瘤组织部位的触发型释药；(4)具有很好的负载疏水性抗癌药物的能力，载药量高，稳定性好；(5)高度的肿瘤靶向性，使药物在肿瘤组织中释放较多，在正常组织分布较少，减少药物对正常组织的毒副作用；(6)疏水段茄尼醇具有肿瘤细胞抑制作用和抗癌药物增敏作用，可增强抗癌药物的肿瘤细胞抑制效应。

附图说明

图1为实例1中目标化合物2及其中间产物1的¹H NMR谱图；

图2为实例1中目标产物2包载阿霉素时的GSH触发性药物释放，其中，SPGS-DOX代表不含双硫键的载DOX聚合物胶束，SPSGS-DOX代表含双硫键的载DOX聚合物胶束；

图3为空白胶束对HepG-2细胞、MCF-7细胞及HL-7702细胞的细胞毒性；其中，SPGS代表不含双硫键的聚合物胶束，SPSGS代表含双硫键的聚合物胶束(即实例1中目标化合物胶束)；

图4为实例1中目标产物1包载阿霉素时对HepG-2细胞、MCF-7细胞及HL-7702细胞的细胞毒性；其中，SPGS-DOX代表不含双硫键的载DOX聚合物胶束，SPSGS-DOX代表含双硫键的载DOX聚合物胶束，DOX代表游离的阿霉素原料药。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

一种具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物，所述茄尼醇衍生物为下述结构的化合物：

所述茄尼醇衍生物的合成路线如下：

(1)具体合成步骤如下：

称取1.31g 3,3'-二硫代二丙酸(6.4mmol)、1.32g DCC(6.4mmol)及0.2g DMAP(1.6mmol)于100mL圆底烧瓶中，加入15mL无水DMF溶解得a液，称取2.00g茄尼醇(3.2mmol)溶于25mL无水二氯甲烷中，N₂保护下经恒压滴液漏斗缓缓滴入a液中，室温反应48h。反应结束后，加入15mL蒸馏水经恒压分液漏斗萃取，取二氯甲烷层，重复操作两次，旋蒸除去溶剂。用石油醚:乙酸乙酯＝1︰1(v/v)的流动相体系过硅胶柱，TLC监测产物流出，旋干流动相，30℃真空干燥24h，得淡黄色中间化合物1，产率约：62.3wt％。

称取4.00g聚乙二醇单甲醚(Mn＝5000Da，0.8mmol)、1.14g中间化合物1(1.6mmol)、0.33g N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC,1.6mmol)、0.049g 4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.8mmol) 溶于30mL二氯甲烷中，室温搅拌48h。反应结束后，常压过滤除去沉淀。随后，加入20mL蒸馏水，取二氯甲烷层，减压旋干。甲醇:三氯甲烷＝2:1(v/v)的流动相复溶，过0.22μm有机滤膜，而后过葡聚糖LH-20色谱柱凝胶柱，TLC监测产物流出，旋干流动相，30℃真空干燥24h。得淡黄色产物2，产率：60.6wt％。

图1中核磁1中出现了如下特征峰：δ＝1.60ppm(s,3；CH ₃-C＝C-)、δ＝5.42ppm(t,1,J＝8.8Hz；-CH₂C＝C-H)、δ＝2.10ppm(m,4,J＝8.8Hz；-C＝CCH ₂CH ₂C＝C-)、δ＝1.70ppm(d,6；CH ₃CH ₃C＝C-)、δ＝5.11ppm(t,1,J＝8.4Hz；CH₃CH₃C＝C-H)处的均为SOL结构中质子峰。δ＝4.6ppm(d,2,J＝9.2Hz；-COOCH ₂-)处出现了酯键旁的亚甲基质子峰；δ＝2.92ppm，2.80ppm，2.74ppm三处亚甲基特征峰归属于3,3’-二硫代二丙酸，它的出现证明已完成单酯化反应，成功合成与分离得到了中间产物化合物1。

图1中核磁2可知：δ＝3.38-3.82(s,4,-CH ₂CH ₂-O-)范围内为mPEG骨架亚甲基质子峰；δ＝4.25ppm(t,2,J＝4.4Hz,-CH ₂OOC-)为化合物1与mPEG形成的酯键旁的亚甲基质子峰，由于酯键的作用而处于相对较低场；在化合物1中δ＝2.92ppm，2.80ppm，2.74ppm三处亚甲基特征峰，且峰面积比为2︰1︰1，由于与mPEG酯键的形成，而变为两处峰分别为：δ＝2.92ppm，2.74ppm，且面积比变为1︰1。综合δ＝4.25ppm酯键旁的亚甲基质子峰的出现及三重峰变为两重峰，可知目标产物化合物2的成功合成。

(2)空白胶束的制备：采用自乳化溶剂挥发法制备空白胶束，取30.00mg聚合物材料溶于1mL丙酮中，缓慢滴于20mL去离子水(或PBS液)中，常温或减压挥发24h，经0.45μm及0.22μm水系滤膜过滤即得空白胶束溶液。

(3)载阿霉素胶束的制备：

精密称取30.00mg聚合物材料和5.00mg脱盐后的游离阿霉素分别溶于2mL丙酮-四氢呋喃混合液(1mL丙酮+1mL四氢呋喃)和2mL二甲基亚砜。温水超声助溶，将两液混合均匀，缓慢滴加于20mL去离子水中，滴加完毕后，装于截留分子量为5.0KDa的透析袋中。避光，去离子水透析除去有机溶剂，开始时每3h更换一次去离子，10h后，每5h更换一次。30h左右，依次经0.45μm及0.22μm滤膜过滤即得载药胶束液。取4mL左右采用激光粒度仪测定胶束粒径及粒径分布。

(4)载阿霉素聚合物胶束的药物释放特性：

取PBS液90mL，通氮气排氧，加入138.24mg GSH作为释放介质，密封待用。取载药胶束液1.0mL装于截留分子量为5.0KDa的透析袋中，加入30mL上述释放介质中。于37℃、120rpm恒温振荡箱中孵育48h，分别于0.5h、1.0h、3.0h、6.0h、9.0h、12h、24h、48h时取样3mL，并补加3mL新鲜释放介质。取样的样品用荧光分光光度计测定强度，计算累积释放量。

图2中可发现GSH敏感茄尼醇醇衍生物SPSGS-DOX胶束，在GSH浓度为10mM时可实现DOX的快速释放；而在GSH浓度为0mM时，释放较慢且最终释放量也较少；同时无GSH敏感的SPGS-DOX茄尼醇衍生物胶束释放较慢且较少。

(5)茄尼醇衍生物空白胶束的细胞毒性测试：

MTT实验使用人正常肝细胞(L-02)、人肝癌细胞(HepG-2)及人乳腺癌细胞(MCF-7)用于评价聚合物材料的生物相容性。具体操作如下：取处于指数生长期的L-02细胞(或HepG-2，或MCF-7)接种到96孔板上，每孔细胞数为4×10⁴。培养12h后(37℃、5％CO₂)，分别加入浓度梯度为：0.0024mg/mL、0.024mg/mL、0.12mg/mL、0.24mg/mL、0.36mg/mL、0.48mg/mL、0.6mg/mL的聚合物空白胶束培养基稀释液100μL。每个浓度均设3个复孔，同时用未经空白胶束液处理的细胞作为对照。加入样品以后继续培养48h(37℃、5％CO₂)，弃去培养液，进行MTT检测：每孔加MTT溶液(0.5g/L，基础培养基溶解)100μL。继续孵育4h后，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加100μL DMSO，轻轻振荡5min，使甲臜结晶物充分溶解提取。在酶联免疫监测仪上测定各孔在检测波长：570nm处光吸收值以空白对照组吸光度平均值为基础，根据实验组吸光度平均值计算细胞存活率，结果如图3所示。

由图3可发现含有还原敏感的双硫键的茄尼醇衍生物SPSGS和不含双硫键的茄尼醇衍生物SPGS均在浓度低于0.24mg/mL时，有较好的生物相容性，基本无毒。当浓度较高时，对肿瘤细胞有一定抑制作用，对正常细胞毒性较小，说明茄尼醇衍生物的疏水嵌段对肿瘤细胞有一定抑制作用。

(6)载阿霉素(DOX)胶束的细胞毒性测试：

载DOX胶束对细胞的抑制作用实验同样采用：人正常肝细胞(L-02)、人肝癌细胞(HepG-2)及人乳腺癌细胞(MCF-7)进行评价。

操作同“(5)茄尼醇衍生物空白胶束的细胞毒性测试”，其中使阿霉素或载药胶束所含阿霉素的最终浓度为：0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL，结果如图4所示。

由图4可知载阿霉素的胶束对两种细胞产生了不同程度的抑制，双硫键的引入，利用肿瘤细胞内的高浓度GSH可实现快速释药杀灭肿瘤细胞。具有GSH敏感性的双硫键的载DOX聚合物胶束SPSGS-DOX，肿瘤细胞抑制效果明显好于无双硫键、对GSH不敏感的载DOX聚合物胶束SPGS-DOX。

载药胶束对人正常肝细胞(L-02细胞)的毒性实验表明：游离阿霉素对人正常肝细胞(L-02)毒性较强。而载药胶束对L-02毒性明显减小，证明了经聚合物胶束的包载后，可降低阿霉素的肝细胞毒副作用。

Claims

1.一种具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物，其特征在于，所述衍生物的结构如下：

。

2.一种权利要求1所述的具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物的制备方法，其特征在于，所述衍生物的合成路线如下：

；

具体合成步骤如下：

将3,3'-二硫代二丙酸、DMAP和DCC溶于DMF中，N₂保护下滴加茄尼醇的二氯甲烷溶液，室温反应至少48h，反应结束后，经后处理即得化合物1；其中以摩尔比计：茄尼醇︰DMAP︰DCC︰3,3'-二硫代二丙酸 = 1 : 0.5 : 2 : 2；

将化合物1与聚乙二醇单甲醚溶于二氯甲烷中，在DCC、DMAP催化下，室温搅拌反应至少48h，反应结束后，经后处理即得目标产物化合物 2；其中以摩尔比计：聚乙二醇单甲醚︰化合物1︰DMAP︰DCC= 1 : 2: 1 : 2。

3.权利要求1所述具有肿瘤组织还原敏感性的茄尼醇衍生物在药物制备中作为载药胶束的应用。