CN113101278B - 具有gsh和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医用材料技术领域，具体提供一种具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒及其制备方法和应用。所述靶向纳米粒含有载药基材和稳定剂；所述靶向纳米粒具有核壳结构，所述载药基材为核，所述稳定剂为壳，其中，所述载药基材具有如式(I)所示的结构式。本发明的靶向纳米粒可以作为治疗癌症的纳米靶向递药系统以可控释放治癌药物，从而高效抑制肿瘤细胞的增殖以达到肿瘤治疗的目的。

Description

具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于医用材料技术领域，尤其涉及一种具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤组织与人体正常组织在物理结构、化学性质等方面具有差异性，这主要是由于肿瘤组织具有生物特异性，在人体内会形成异于正常组织的微环境，如，肿瘤细胞内具有较高的谷胱甘肽(GSH)浓度：肿瘤细胞内的浓度约为2mM～20mM，是正常细胞的500到1000倍。此外，在正常的人体组织中，pH值约为7.4；而肿瘤细胞所处的微环境呈微酸性，pH值可低至6.5左右。并且在肿瘤细胞的不同阶段，其内涵体/溶酶体所具的pH值亦不相同：早期肿瘤细胞中内涵体及溶酶体的pH值约为6.0，晚期pH值则约为5.0。
利用肿瘤微环境中具有高GSH浓度及低pH值的特性，人们设计了许多刺激响应型纳米载体及刺激响应型纳米递药系统。理想情况下，刺激响应型纳米递药系统进入体内后能够保持较好的稳定性，靶向聚集在肿瘤组织形成的特殊微环境中，并且释放出负载的药物，特异性地作用于肿瘤细胞，达到肿瘤抑制的效能，而对正常组织不产生影响。但目前的刺激响应型纳米载体存在稳定性较差、释放效能低、具有毒副作用等缺点。
因此，选择更为合适的载药体系进行肿瘤药物的递送，是人们急需解决的问题。
发明内容
本发明提供一种具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒及其制备方法和应用，以解决现有刺激相应型纳米载体存在稳定性较差、释放效能低且具有毒副作用等问题。
为实现本发明的目的，采用的技术方案如下：
具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒，所述靶向纳米粒含有载药基材和稳定剂；所述靶向纳米粒具有核壳结构，所述载药基材为核，所述稳定剂为壳；
其中，所述载药基材具有如式(I)所示的结构式：
Figure BDA0003020814570000021
x＝2～20，n＝5～1000。
可选地，所述靶向纳米粒还含有药物；所述药物包埋于所述核内。
可选地，所述药物包括多西他赛类、紫杉醇类、喜树碱、甲氨蝶呤、阿霉素、L-天门冬氨酸盐中的至少一种。
可选地，所述药物占所述靶向纳米粒的量为3.0wt％～15.0wt％；
和/或，所述稳定剂为所述载料基的5wt％～20wt％。
可选地，所述载药基材由二(巯基乙酸)脂肪二酯和氧化剂经氧化聚合反应获得。
可选地，所述二(巯基乙酸)脂肪二酯包括二(巯基乙酸)乙二酯、二(巯基乙酸)-1,3-丙二酯、二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯中的至少一种；
所述氧化剂包括二甲基亚砜、过氧化氢中的至少一种；
所述稳定剂包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、聚乙烯醇、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯中的至少一种。
可选地，所述二(巯基乙酸)脂肪二酯与所述氧化剂投料的摩尔比为5～20：1；
和/或，所述氧化聚合反应的时间为6h～12h。
相应地，一种具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
将所述载药基材溶于有机溶剂中，得到第一物料；
采用纳米沉淀法将所述第一物料和稳定剂加入去离子水中，混料并过滤分离处理，从而获得靶向纳米粒。
可选地，还包括将药物溶于所述有机溶剂中的步骤；
和/或，所述有机溶剂包括二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的至少一种；
所述稳定剂包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、聚乙烯醇、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯中的至少一种。
可选地，所述药物包括多西他赛类、紫杉醇类、喜树碱、甲氨蝶呤、阿霉素、L-天门冬氨酸盐中的至少一种；
和/或，以所述药物占所述靶向纳米粒的量为3.0wt％～15.0wt％向所述有机溶剂中添加所述药物。
可选地，所述稳定剂的投料量为所述载料基的5wt％～20wt％。
以及，上述的靶向纳米粒作为治疗肿瘤的纳米靶向递药系统的应用。
本发明的有益效果：
相对于现有技术，本发明实施例提供的具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒及其制备方法，以载药基材为核、稳定剂为壳，将疏水性药物尤其是疏水性的治癌药物与靶向纳米粒混合时，药物能被稳定地包埋于核结构中。由于载药基材料是含有二硫键及酯键的聚合物，靶向纳米粒被肿瘤细胞摄取后，可利用肿瘤组织内异常高GSH浓度的微环境发生氧化还原反应，二硫键发生断裂；同时可利用肿瘤组织内的微酸性环境发生水解反应，使靶向纳米粒中的酯键发生断裂而瓦解，从而具有GSH和酯酶双响应特性，在肿瘤微环境中借助靶向纳米粒的特性缓慢释放包载的药物。本发明提供的靶向纳米粒可以借助EPR效应被动靶向肿瘤组织并蓄积在肿瘤组织中，以达到杀死癌细胞的目的，可以作为治疗癌症的纳米靶向递药系统以可控释放治癌药物，从而高效抑制肿瘤细胞增殖，达到肿瘤治疗的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的包裹多西他赛(DTX)的靶向纳米粒(DTX@NPs)从合成、自组装、靶向输送至肿瘤组织到在肿瘤细胞内药物释放递送及作用结局的全程示意图。
图2是本发明实施例1制备的聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]的1H NMR核磁共振谱图。
图3是本发明实施例1制备的聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]的红外光谱图。
图4是本发明应用例1制备的聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯与DSP-PEG形成的靶向纳米粒的动态光散射(DLS)结果图；其中，a图是靶向纳米粒的动态光散射结果图；b图是靶向纳米粒DTX@NPs的动态光散射结果图。
图5是本发明应用例2提供的靶向纳米粒37℃时在不同浓度GSH、不同浓度GSH联合酯酶作用下的DTX释放结果图。
图6是本发明应用例2提供的靶向纳米粒37℃时在酯酶作用下的DTX释放结果图。
图7是本发明实施例1提供的聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]、应用例1提供的靶向纳米粒、DTX单药、应用例2提供的靶向纳米粒分别作用于体外小鼠乳腺肿瘤细胞(4T1cells)48h后的细胞毒性结果图。
图8是本发明应用例1提供的靶向纳米粒用香豆素6(Coumarin 6，C6)标记(C6@NPs)后与游离C6分别作用于体外小鼠乳腺肿瘤细胞(4T1 cells)，6h内细胞摄取C6的浓度变化结果图；其中，a图是C6@NPs纳米粒作用于体外小鼠乳腺肿瘤细胞(4T1 cells)，6h内细胞摄取C6的浓度变化结果图；b图是游离C6作用于体外小鼠乳腺肿瘤细胞(4T1 cells)，6h内细胞摄取C6的浓度变化结果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1显示了由本发明载药基材合成、自组装、靶向输送至肿瘤组织，到在肿瘤细胞内药物释放递送及作用结局的全程示意。
请参阅图1，本发明涉及至少多个方面的发明内容，其中，第一方面，本发明提供一种载药基材，所述载药基材具有如式(I)所示的结构式：
Figure BDA0003020814570000051
其中，x＝2～20，n＝5～1000。
在一些实施方式中，所述载药基材由二(巯基乙酸)脂肪二酯和氧化剂经氧化聚合反应获得。
在一些实施方式中，所述二(巯基乙酸)脂肪二酯包括二(巯基乙酸)乙二酯、二(巯基乙酸)-1,3-丙二酯、二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯中的至少一种；所述氧化剂包括二甲基亚砜(DMSO)、过氧化氢(H2O2)中的至少一种。在一些实施方式中，所述二(巯基乙酸)脂肪二酯与所述氧化剂投料的摩尔比为5～20：1；所述氧化聚合反应的时间为6h～12h。
本发明第一方面提供的载药基材，具有自组装成靶向纳米粒及生物安全性及生物相容性好的特点，且自组装成的靶向纳米粒具备纳米粒壳核结构形态，可作为载药体系的优势载体，能够利用EPR效应增强药物在肿瘤部位的靶向性。因此，所述的载药基材可以作为药物递送材料或者用于制备药物输送载体或者用于制备具有输送功能的药物。
第二方面，本发明提供一种靶向纳米粒，所述靶向纳米粒包含有上述所述的载药基材和稳定剂。
在一些实施方式中，稳定剂包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(如DSPE-PEG3400、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG500等)、聚乙烯醇(PVA，polyvinyl alcohol)、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS，Tocofersolan)等的至少一种。
本发明第二方面提供的靶向纳米粒，粒径集中在100～200nm，其粒径较小，粒径分布均一稳定，体内稳定性好，有利于其利用EPR效应被动靶向肿瘤组织。
第三方面，本发明还提供了所述的靶向纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
将所述载药基材溶于有机溶剂中，得到第一物料；
采用纳米沉淀法将所述第一物料与稳定剂置于去离子水进行混料，从而获得靶向纳米粒。
在一些实施方式中，还包括将药物(尤其是疏水性的药物)也溶于有机溶剂中，使得第一物料中含有载药基材和药物，从而有利于将药物包埋在载药基材里，当载药基材与稳定剂通过纳米沉淀法形成核壳结构时，药物则被包埋在核内，从而可以起到缓释效果。
在一些实施方式中，所述药物包括多西他赛类(DTX)、紫杉醇类、喜树碱、甲氨蝶呤、阿霉素、L-天门冬氨酸盐中的至少一种。
在一些实施方式中，所述有机溶剂包括二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)中的至少一种；所述稳定剂包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、聚乙烯醇中的至少一种。在一些实施方式中，所述稳定剂的投料量为所述载料基的5wt％～20wt％。以所述药物占所述靶向纳米粒的量为3.0wt％～15.0wt％向所述有机溶剂中添加所述药物。
本发明第三方面提供的靶向纳米粒的制备方法制备的得到的靶向纳米粒子，具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的特性，因此可以将该制备方法得到的靶向纳米粒作为治疗肿瘤的纳米靶向递药系统。
从图1中可以看出，本发明提供的技术方案具有反应过程简单、反应步骤少、反应周期短、重复性好等优势，在医药领域具有良好的应用前景和广阔的发展空间。
为了更好的说明本发明的技术方案，下面结合若干具体实施例进行说明。
实施例1
本实施例提供一种载药基材及载药基材的制备方法，其中，该载药基材为聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]。
所述聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]的制备方法包括以下步骤：
S11.在良好的通风环境下，先将3mL(46.77mmol)二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯溶液加入到洁净干燥的38mL厚壁耐压瓶中，再加入DMSO，DMSO与二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯投料的摩尔比为5：1，在室温下使用恒温磁力搅拌器搅拌1min，转速设置为660rpm；
S12.待上述二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯与DMSO的反应液充分接触、混匀后，使用液氮让反应液迅速冷却形成固态，再使用冻抽法让反应容器内保持高度真空的负压状态；移除液氮及负压装置，待固态反应物恢复至室温并几乎完全融化为液态后，继续使用液氮冷却并冻抽，如此反复3次；
S13.冻抽结束并恢复至室温融化后，将液态反应物升温至95℃，同时使用恒温磁力搅拌器让反应物保持转速为660rpm的搅拌状态，反应12h后得到白色的固态反应物，通过负压抽滤去除反应物中残余的DMSO和反应产物水，得到白色的固态粗产物；
S14.向步骤S13得到的固态粗产物中加入甲醇，加热使所述固态粗产物充分溶解，在室温和-30℃环境中逐步冷却，析出白色固体；
S15.负压抽滤去除白色固体中残留的甲醇及其他液性成分后，将所得白色固体收集于25mL的圆底烧瓶中，旋蒸干燥，得到白色固体，共2.934g。
为验证获得的白色固体为目标产物聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]，对白色固体进行核磁共振和红外光谱分析。其中，核磁共振分析为在核磁共振仪上对获得的白色固体进行1H-NMR测定以获取核磁共振谱图，具体如图2所示；红外光谱如图3所示。
结合图2和图3可知，白色固体即为聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]，说明本实施例由二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯已经成功聚合得到聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]。进一步地，本实施例的反应式如下：
Figure BDA0003020814570000081
其中，n＝5～1000。
实施例2
本实施例提供一种载药基材及载药基材的制备方法，其中，该载药基材为聚[二(巯基乙酸)-1,3-丙二酯]。
所述聚[二(巯基乙酸)-1,3-丙二酯]的制备方法包括以下步骤：
S21.在良好的通风环境下，先将8.0mL(49.2mmol)二(巯基乙酸)-1,3-丙二酯溶液加入到洁净干燥的38mL厚壁耐压瓶中，再加入二甲基亚砜(DMSO)溶液，DMSO与二(巯基乙酸)-1,3-丙二酯投料的摩尔比为5：1，在室温下使用恒温磁力搅拌器搅拌1min，转速设置为660rpm；
S22.待上述二(巯基乙酸)-1,3-丙二酯与DMSO的反应液充分接触、混匀后，使用液氮让反应液迅速冷却形成固态，再使用冻抽法让反应容器内保持高度真空的负压状态；移除液氮及负压装置，待固态反应物恢复至室温并几乎完全融化为液态后，继续使用液氮冷却并冻抽，如此反复3次；
S23.冻抽结束并恢复至室温融化后，将液态反应物升温至95℃，同时使用恒温磁力搅拌器让反应物保持转速为660rpm的搅拌状态，反应12h后得到白色的固态反应物，通过负压抽滤去除反应物中残余的DMSO和反应产物水，得到白色的固态粗产物；
S24.向步骤S23得到的固态粗产物中加入甲醇，加热使所述固态粗产物充分溶解，在室温和-30℃环境中逐步冷却，析出白色固体；
S25.负压抽滤去除白色固体中残留的甲醇及其他液性成分后，将所得白色固体收集于25mL的圆底烧瓶中，旋蒸干燥，得到聚[二(巯基乙酸)-1,3-丙二酯]，共2.873g。
实施例3
本实施例提供一种载药基材及载药基材的制备方法，其中，该载药基材为聚[二(巯基乙酸)乙二酯]。
所述聚[二(巯基乙酸)乙二酯]的制备方法包括以下步骤：
S31.在良好的通风环境下，先将7.5mL(46.8mmol)二(巯基乙酸)乙二酯溶液加入到洁净干燥的38mL厚壁耐压瓶中，再加入二甲基亚砜(DMSO)溶液，DMSO与二(巯基乙酸)乙二酯投料的摩尔比为5：1，在室温下使用恒温磁力搅拌器搅拌1min，转速设置为660rpm；
S32.待上述二(巯基乙酸)乙二酯与DMSO的反应液充分接触、混匀后，使用液氮让反应液迅速冷却形成固态，再使用冻抽法让反应容器内保持高度真空的负压状态；移除液氮及负压装置，待固态反应物恢复至室温并几乎完全融化为液态后，继续使用液氮冷却并冻抽，如此反复3次；
S33.冻抽结束并恢复至室温融化后，将液态反应物升温至95℃，同时使用恒温磁力搅拌器让反应物保持转速为660rpm的搅拌状态，反应12h后得到白色的固态反应物，通过负压抽滤去除反应物中残余的DMSO和反应产物水，得到白色的固态粗产物；
S34.向步骤S13得到的固态粗产物中加入甲醇，加热使所述固态粗产物充分溶解，在室温和-30℃环境中逐步冷却，析出白色固体；
S35.负压抽滤去除白色固体中残留的甲醇及其他液性成分后，将所得白色固体收集于25mL的圆底烧瓶中，旋蒸干燥，得到聚[二(巯基乙酸)-1,3-丙二酯]，共3.074g。
应用例1
一种靶向纳米粒及靶向纳米粒的制备方法。
其中，靶向纳米粒采用纳米沉淀法制备，具体包括以下步骤：
Y11.将实施例1中得到的载料基材聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(即DSPE-PEG3400)溶解于0.1mL的DMSO溶液中，并各自超声波溶解、涡旋混合，得到混合液；其中，聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]的加入量以得到的混合液中聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]的浓度20mg/mL为准，DSPE-PEG3400的用量为聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]用量的20wt％；
Y12.在搅拌速度为800～1000rpm的状态下，取200μL步骤S16获得的混合液逐滴滴加到10mL的去离子水中，滴加完毕后继续搅拌30s，得到稳定的纳米粒溶液；
Y13.将上述纳米粒溶液用超滤离心管(15mL/1000D)超滤，在2500rpm转速下离心超滤5min，得到浓缩液后添加5mL去离子水重新分散纳米粒，继续在2500rpm转速下离心超滤5min，共超滤3次后，得到靶向纳米粒的浓缩液。
应用例2
一种靶向纳米粒及靶向纳米粒的制备方法。
该靶向纳米粒采用纳米沉淀法制备，具体制备方法包括以下步骤：
Y21.用1mL的DMSO溶解实施例1获得的聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]、多西他赛(DTX)、DSPE-PEG3400并涡旋，得到混合液，所述混合液中聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]终浓度为6.7mg/mL，DTX终浓度为1.7mg/mL，且在所述混合液中，DSPE-PEG3400相对聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]的含量为20wt％；
Y22.在搅拌速度为800～1000rpm状态下，从上述混合液中取300μL逐滴滴加到10mL去离子水中，滴加完毕后继续搅拌30s，得到稳定的靶向纳米粒溶液；
Y23.将上述靶向纳米粒溶液用超滤离心管(15mL/1000D)超滤，在2500rpm转速下离心超滤5min，除去DMSO以及游离的DTX，得到浓缩液后添加5mL的去离子水重新分散纳米粒，继续在2500rpm转速下离心超滤5min，共超滤3次后，得到靶向纳米粒浓缩液，并且DTX的负载量为14.6wt％。
本实施例得到的靶向纳米粒中，包括聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]、稳定剂和多西他赛，并且靶向纳米粒为核壳结构，聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]为核，稳定剂为壳，且多西他赛包埋于载药基材内，即DTX@NPs。
应用例3
一种靶向纳米粒及其制备方法，其中该靶向纳米粒采用纳米沉淀法制备，具体制备方法包括以下步骤：
Y31.用1mL DMSO溶解于实施例1得到的聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]、DTX、DSPE-PEG3400，并涡旋，所得的混合液中聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]终浓度为6.7mg/mL，DTX终浓度为0.4mg/mL，且在所述混合液中，DSPE-PEG3400相对聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]的含量为20wt％；
Y32.在搅拌速度为800～1000rpm状态下，从步骤S21得到的混合液中取300μL逐滴滴加到10mL去离子水中，滴加完毕后继续搅拌30s，得到稳定的靶向纳米粒溶液；
Y33.将上述靶向纳米粒溶液用超滤离心管(15mL/1000D)超滤，在2500rpm转速下离心超滤5min，除去DMSO以及游离的DTX，得到浓缩液后添加5mL的去离子水重新分散纳米粒，继续在2500rpm转速下离心超滤5min，共超滤3次后，得到靶向纳米粒浓缩液，并且DTX的负载量为3.65wt％。
应用例4
一种靶向纳米粒及其制备方法，其中该靶向纳米粒采用纳米沉淀法制备，具体制备方法包括以下步骤：
Y41.将聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]、DTX、DSPE-PEG3400溶解在1mL DMSO中，充分涡旋后得到混合液，其中聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]终浓度为6.7mg/mL，DTX终浓度为2mg/mL，且在所述混合液中，DSPE-PEG3400相对聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]的含量为20wt％；
Y42.在搅拌速度为800～1000rpm状态下，从上述混合液中取300μL逐滴滴加到10mL去离子水中，滴加完毕后继续搅拌30s，得到稳定的靶向纳米粒溶液；
Y43.将上述靶向纳米粒溶液用超滤离心管(15mL/1000D)超滤，在2500rpm转速下离心超滤5min，除去DMSO以及游离的DTX，得到浓缩液后添加5mL去离子水重新分散纳米粒，继续在2500rpm转速下离心超滤5min，共超滤3次后，得到靶向纳米粒浓缩液，并且DTX的负载量为11.9wt％。
性能测试：
为验证应用例1至应用例4得到的产物的性能，分别做如下的验证性试验：
1、粒径表征
包括粒径及粒径分布表征，具体包括以下步骤：
(1)在25℃下，将应用例1得到的产物分散于水中，然后采用动态光散射粒度分析仪(DLS)进行测量，结果如图4中a所示，从图中可知，分散在水中形成的平均尺寸为188nm。
(2)在25℃下，将应用例2得到的产物分散于水中，然后采用动态光散射粒度分析仪进行测量，结果如图4中b所示，从图中可知，分散在水中形成的平均尺寸为183nm。
以上结果说明，不管是包埋了药物的靶向纳米粒还是没有包埋药物的靶向纳米粒的粒径都集中在100～200nm，粒径小，能够满足其利用EPR效应向靶细胞部位集中。
2、GSH/酯酶双响应靶向纳米粒的响应性评价
使用透析法来分析靶向纳米粒中抗癌药的体外释放。
将应用例2制备的靶向纳米粒分别置于含有不同浓度谷胱甘肽(2μM、10mM)、酯酶、不同浓度的谷胱甘肽联合酯酶(2μM GSH+酯酶、10mM GSH+酯酶)的透析液中，pH为7.4，在37℃条件下置于摇床上孵育，并于预设的时间点逐一取样，使用高效液相色谱法(HPLC)检测对应透析液中靶向纳米粒包载DTX的量以计算累积释放量，结果如图5和图6所示。
从图5和图6可以看出，在GSH浓度在2μM以下及磷酸缓冲盐溶液(PBS)环境中，靶向纳米粒的稳定性良好；而肿瘤微环境在GSH浓度在10μM以上或含有酯酶的肿瘤微环境中，靶向纳米粒的累积释放量和释药速率都显著增加。特别是在高GSH浓度联合酯酶的环境下，靶向纳米粒的累积释放量和释药速率增加的更为显著，证明该靶向纳米粒具有显著的GSH/酯酶双敏感性和优秀的缓释控释作用。
3、体外细胞毒性实验
通过四唑盐(MTT)比色法，在小鼠乳腺癌细胞(4T1 cells)上探究本实施例1制得的载体材料聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯](Material)、游离DTX、应用例1制备得到的靶向纳米粒(NPs)、以及应用例2制备得到的靶向纳米粒(DTX@NPs)的体外细胞毒性实验，结果如图7所示。
从图7可知，聚[二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯]及空白纳米粒在较低浓度时对4T1细胞的生长无明显抑制，只有在较高浓度下，对4T1细胞的生长才有抑制作用，说明二(巯基乙酸)-1,4-丁二酯及空白纳米粒有较好的生物安全性及生物相容性。而DTX组及靶向纳米粒组无论是在高浓度下还是低浓度下，均表现出对4T1细胞有杀伤效果。而与DTX相比，靶向纳米粒组对4T1细胞的杀伤效果更为显著，发挥出优于DTX的肿瘤抑制效能。
4、体外肿瘤细胞摄取情况
将标记的纳米粒C6@NPs与游离C6分别作用于4T1肿瘤细胞，得到6h内细胞的摄取浓度的变化情况，结果如图8所示。
从图8可以看出，由于EPR效应，纳米粒能够进入到体外肿瘤细胞中，且进入细胞内的量随时间增加，呈现出时间依赖性。与游离C6组相比，纳米粒C6@NPs在第1h内进入的量较少，但6h后，进入细胞的量与对照组相似。说明NPs能够较为顺利地进入到体外肿瘤细胞中。
5、DTX的用量对靶向纳米粒载药量和包封率的影响
考察DTX不同用量对靶向纳米粒载药量的影响，测试结果如表1所示。
表1 DTX的用量对靶向纳米粒载药量和包封率的影响
Figure BDA0003020814570000141
由表1可知，DTX的用量为NPs用量的5wt％～20wt％时，载药量为3.65wt％～14.60wt％。其中当DTX的用量为纳米粒(NPs)用量的20wt％时，载药量最高。
综合上述多方面的性能表征，可以看出，以载药基材、稳定剂和药物制成的靶向纳米粒，粒径小且粒径分布均匀，载药量较高且能够稳定存在于体内，并且可以通过EPR效应被动靶向肿瘤组织并蓄积在肿瘤组织中，靶向纳米粒被肿瘤细胞获取后，在瘤组织内异常高GSH浓度的微环境下发生氧化还原反应，从而释放药物以作用于肿瘤细胞，具有GSH和酯酶双响应的释药效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒，其特征在于，所述靶向纳米粒包括载药基材、稳定剂和药物；所述靶向纳米粒具有核壳结构，所述载药基材为核，所述稳定剂为壳，所述药物包埋于所述核内；所述药物占所述靶向纳米粒的量为3.0wt%~15.0wt%；所述稳定剂为所述载药基材的20wt%；
其中，所述载药基材具有如式（I）所示的结构式：
Figure QLYQS_1
……（I）；
其中，x=2~20，n=5~1000；
所述稳定剂包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；
所述靶向纳米粒按照以下的方法制备：
将所述载药基材和所述药物溶于有机溶剂中，得到第一物料；
采用纳米沉淀法将所述第一物料和稳定剂加入去离子水中，混料并过滤分离处理，从而获得靶向纳米粒。
2.如权利要求1所述的具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒，其特征在于，所述药物包括多西他赛类、紫杉醇类、喜树碱、甲氨蝶呤、阿霉素、L-天门冬氨酸盐中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒，其特征在于，所述载药基材由二（巯基乙酸）脂肪二酯和氧化剂经氧化聚合反应获得。
4.如权利要求3所述的具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒，其特征在于，所述二（巯基乙酸）脂肪二酯包括二（巯基乙酸）乙二酯、二（巯基乙酸）-1,3-丙二酯、二（巯基乙酸）-1,4-丁二酯中的至少一种；
所述氧化剂包括二甲基亚砜、过氧化氢中的至少一种。
5.如权利要求4所述的具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒，其特征在于，所述二（巯基乙酸）脂肪二酯与所述氧化剂投料的摩尔比为5~20:1；
和/或，所述氧化聚合反应的时间为6h~12h。
6.如权利要求1所述的具有GSH和酯酶肿瘤微环境双响应的靶向纳米粒，其特征在于，所述有机溶剂包括二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的至少一种。
7.如权利要求1至6任一项所述的靶向纳米粒在制备治疗肿瘤的靶向纳米递药系统药物的应用。
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