CN102861334B - 肿瘤信号响应的主动治疗纳米光动力药物载体及制法 - Google Patents
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Abstract
一种肿瘤信号响应的主动治疗光动力药物纳米载体，对体内肿瘤信号过氧化氢产生响应，启动光动力治疗药物的载体，药物纳米载体粒径在50-300nm范围内；所述药物纳米载体是包括两亲性的高分子嵌段共聚物和过氧草酸酯制备而成，所述的对体内肿瘤信号响应是基于过氧化氢和过氧草酸酯类的化学反应，激发特征染料产生化学发光的光动力治疗过程；所述的光动力治疗的药物是在光激发下产生毒性活性自由基的抗肿瘤药物，包括原卟啉、血卟啉、竹红素类或酞氰类。本发明结合了纳米技术、化学发光检测和光动力疗法，制备出同时负载有过氧草酸酯聚合物和光动力药物的纳米微粒，适用于肿瘤的早期诊断和治疗。本发明公开了其制法。
Description
技术领域
本发明涉及过氧草酸酯，染料和光动力药物的负载载体，总体而言，是涉及高分子纳米微球和多种药物组合物及制备和用途。
发明背景
光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）是利用药物的光动力效应进行疾病治疗的一种新技术，它采用特定波长的激光激发光敏剂（光动力药物），激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单线态氧，单线态氧一方面能造成癌瘤中的微血管急性损伤,引起血管阻塞造成局部缺血；另一方面能直接导致肿瘤细胞死亡，从而达到局部治疗肿瘤的目的。而且，只有将外源光聚焦在肿瘤部位，才能使光动力药物对肿瘤细胞产生毒杀作用；对于没有被光照到的部位，如正常的组织和细胞，则不产生毒害作用。因此，光动力治疗的毒副作用很小，并且它不会损害人体造血系统和免疫系统的功能。尽管光动力治疗在肿瘤的治疗中有很多优势，但取得广泛的应用是还面临很多的问题：（1）大部分的光动力药物都是疏水性的，需要用一定的有机溶剂溶解后才能使用，因此很难直接注射到患者的体内；（2）光动力药物在体内的代谢较快，因此很难在病灶部位快速、有效的聚集；并且光动力药物在皮肤、肾脏、脾、肝脏等部位的富集容易导致患者出现较强的光过敏反应；（3）外源激光的波长较短（一般小于700纳米），难于深入照射到患者身体内部和深层肿瘤的病灶内部。因此，光动力治疗的方法一般只能治疗浅层的肿瘤，如：皮肤癌，或者光纤能够直接介入的部位，限制了光动力治疗技术的临床应用。
近年来，科学家们将光动力治疗手段和纳米药物载体结合，制备了负载了光动力药物的纳米药物载体。与传统的光动力药物治疗体系相比，纳米光动力药物载体能将脂溶性的光动力药物负载在载体内，并能有效的提高药物在肿瘤部位的浓度，提高了光动力治疗的效果。然而，光动力药物要发挥作用，依然离不开外源激发光源。常规所采用的激发光的波长范围在600nm到700nm之间，这种光源所产生的激光对组织的穿透能力小于10mm，因此还是无法解决光动力药物无法治疗深层肿瘤的问题。此外，进行光动力治疗前，还必须对肿瘤的位置进行精确的定位，才能使激发光尽可能在只照射肿瘤组织，因此需要采用光学手段或者外加磁场的方式精确定位肿瘤位置，这对实际操作带来不少的难题。
活性氧(reactive oxygen species ROS)是生物体内广泛存在的物质，通过参与信号途径来促进细胞表达多种参与生理、病理过程所需要的分子。过氧化氢是一种非常重要的活性氧，对肿瘤细胞的生长发挥作用。有研究报道黑色素瘤、乳腺癌及胰腺癌等肿瘤细胞能自发生成大量的过氧化氢，而体内的组织如果长时间的暴露在富含过氧化氢的环境中，会导致组织机能的衰退，最终发展为癌变。因此，过氧化氢是一种非常重要的肿瘤信号分子。
近年来，关于细胞和组织内的过氧化氢的检测已有很多的研究，主要采用荧光技术，通过检测荧光强度就可以了解过氧化氢在各个组织中的分布和相应的浓度，从而有助于我们理解过氧化氢在生理和病理条件下对机体的作用。稠环类硼化合物是一种过氧化氢检测试剂，但是，这些含硼的稠环类化合物和过氧化氢反应后，只产生一定的荧光，并不具有抗肿瘤效应。而且，它们对肿瘤组织没有特定的富集作用，对过氧化氢也没有专一的显影功能，易受背景的干扰。
综上所述，尽管在肿瘤信号分子过氧化氢的检测和光动力药物治疗过程中取得了一定的研究成果，但都存在一些问题，而且至今没有一种能够将过氧化氢快速检测与光动力治疗结合的技术。
发明内容
本发明的目的是提供可用于注射，静脉滴注或者口服的载有对肿瘤信号响应并主动激发光动力治疗的药物载体及制备方法。
本发明的技术方案如下：一种肿瘤信号响应的主动治疗光动力药物纳米载体，其特征是：能对体内肿瘤信号过氧化氢产生响应，启动光动力治疗药物的载体，其粒径在50-300nm范围内；所述药物纳米载体是包括两亲性的高分子嵌段共聚物和过氧草酸酯制备而成，所述的对体内肿瘤信号响应是基于过氧化氢和过氧草酸酯类的化学反应，激发特征染料产生化学发光的过程；所述的光动力治疗药物是在光激发下产生毒性活性自由基的抗肿瘤药物，如原卟啉，血卟啉，竹红素类，酞氰类。
过氧草酸酯类是具备过氧草酰结构的小分子（如二苯基草酸酯，1，3，5三氯二苯基草酸酯，2,4-二硝基二苯基草酸酯）低聚物或高聚物酯类。
所述特征染料是能够将化学能转变为光能的包括红荧烯，二苯基蒽，罗丹明等的染料。
所述的两亲性高分子嵌段共聚物是聚己内酯-聚乙二醇（PEG-PCL），聚丙交酯-聚乙二醇（PLA-PEG），聚丙交酯-聚乙交酯-聚乙二醇（PLGA-PEG），聚己内酯-聚乙烯基吡咯烷酮（PCL-PVP），聚丙交酯-聚乙烯基吡咯烷酮（PLA-PVP），聚丙交酯-聚乙交酯-聚乙烯基吡咯烷酮（PLGA-PVP）等；聚合物的分子量：聚己内酯（PCL）：2000-50000；聚丙交酯（PLA）：2000-100000；聚丙交酯-聚乙交酯（PLGA）；聚乙二醇（PEG）：2000-20000；聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）：500-20000。
制备肿瘤信号响应的主动治疗纳米光动力药物载体的方法，由下列步骤组成：步骤1：将两亲性高分子聚合物和过氧草酸酯按质量比10:1的比例溶解于丙酮或四氢呋喃溶液中，可适度加热，制成1mg/mL~100mg/mL的澄清透明溶液。
步骤2：将染料分子和光动力药物按质量比1:1的比例加入按步骤1配制的溶液中，使药物浓度在0.01mg/mL~1mg/mL之间。
步骤3：将步骤2配制的丙酮或四氢呋喃溶液缓慢滴加到水溶液中，在滴加的同时通过磁力搅拌混合均匀。所述的水溶液可以是蒸馏水，生理盐水，磷酸缓冲液。
步骤4：将步骤3制得的溶液通过旋转蒸发或透析的方法，除去溶液中残留的有机溶剂。
步骤5：将步骤4制得水分散液通过滤纸过滤，除去少量高分子聚合体，即制得对过氧化氢响应的负载有动力药物的纳米载体的水分散液。
上述步骤3中丙酮或四氢呋喃溶液和水溶液的体积比为1:10~1:100。
两亲性高分子聚合物PVP-PCL的制备：在装有适量端羟基聚乙烯吡咯烷酮（PVP-OH）的聚合管中加入计算量的己内酯和0.1%（w/w）的辛酸亚锡，其中PVP的数均分子量为2000±400，在真空下封管并放入100°C反应，反应时间24h-72h，得到的粗产物用二氯甲烷溶解后沉淀于大量冷乙醚中，除去未反应的单体和其他低分子量的物质，然后将沉淀物收集用甲醇洗涤数次后干燥，得到PVPPCL二嵌段聚合物。
上述的肿瘤信号响应的主动治疗光动力药物纳米载体，所述的对体内肿瘤信号响应是基于过氧化氢和过氧草酸酯类的化学反应，激发特征染料化学发光的过程。上述的肿瘤信号响应的主动治疗光动力药物纳米载体，所述的光动力药物是一种在光激发下产生毒性活性自由基的抗肿瘤药物，如四苯基卟啉。所述的主动治疗是光动力药物的药物作用发生于体系内化学发光，不借助外部光源激发。
本发明有益效果是：充分利用了过氧草酸酯和过氧化氢作用，可以生成能量较高的过氧草酰中间体。而过氧草酰中间体是一种不稳定的中间化合物，它将会降解生成二氧化碳，同时将能量传递给附近的分子，能在很宽的能量范围内激发多种不同荧光染料，发出不同的荧光，用于检测体系中的过氧化氢的存在（参见图1）。过氧草酸酯反应敏感性高，可用于检测生理条件下较低浓度的过氧化氢，并且发光强度和过氧化氢浓度直接相关含量（图2）。由于发光和化学反应进行中能量转移有关，光强会伴随反应的结束而衰减。
将光动力抗肿瘤药物同时包裹在载体内部，当过氧化氢和过氧草酸酯聚合物发生反应，其产生的高能量中间物将能量传递给光动力药物，激发光动力药物产生抗肿瘤效应（参见图3）。由于这种激发是内源性的，不需要外加激光光源，可以部分解决外加激光光源波长短，难于照射到病灶内部的缺点。
附图说明
图1为过氧草酸酯和过氧化氢反应后激发染料分子的示意图；
图2为过氧草酸酯纳米微粒与不同浓度过氧化氢反应的化学发光图片；
图3为光动力药物受到对过氧化氢响应的化学发光激发的示意图。
具体实施方式
下面结合实例进一步阐明本发明的内容，但是这些实施例并不限制本发明的保护范围。
制备例1：聚乙烯吡咯烷酮-聚己内酯两亲嵌段共聚物（PVPPCL）的制备
在装有适量端羟基聚乙烯吡咯烷酮（PVP-OH）的聚合管中加入计算量的己内酯（CL，Aldrich）和0.1%（w/w）的辛酸亚锡，其中PVP的数均分子量为2000，但并不仅限于这种分子量。在真空下封管并放入100°C反应，反应时间24h-72h，得到的粗产物用二氯甲烷溶解后沉淀于大量冷乙醚中以除去未反应的单体和其他低分子量的物质，然后将沉淀物收集用甲醇洗涤数次后干燥，得到PVPPCL二嵌段聚合物。
制备例2：聚乙二醇-聚己内酯两亲嵌段共聚物（PEG-PCL）的制备
在装有适量端羟基聚乙二醇（PEG-OH）的聚合管中加入计算量的己内酯（CL，Aldrich）和0.1%（w/w）的辛酸亚锡，其中PEG的数均分子量根据对产物的要求不同，分别为2000,5000不等，但是并不仅限于这种分子量。在真空下封管并放入130°C反应，反应时间24h，得到的粗产物用氯仿溶解后沉淀于大量冷乙醚中以除去未反应的单体和其他低分子量的物质，然后将沉淀物收集用水洗涤数次后减压干燥，得到PVP-PCL二嵌段聚合物。
制备例3：过氧聚草酸酯的制备
在三颈烧瓶中用干燥的四氢呋喃溶解计算量的对羟基苯甲醇和1,8-辛二醇，再加入一定量的三乙氨。然后0°C真空下用注射器加入稍过量的草酰氯，室温反应过夜，用饱和盐水终止。得到的粗产物用乙酸乙酯提取三次，合并有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩后用二氯甲烷/正己烷（V：V=1：1）沉淀，收集并洗涤数次后真空干燥。
实施例1：负载聚草酸酯，红荧烯的高分子纳米微球的制备
将50mgPEG-PCL和5mg聚草酸酯同时溶解于2mL的丙酮中，加入1mg的红荧烯，得到澄清透明的醇溶液，将醇溶液慢慢滴加到20mL水溶液中，适度搅拌混合均匀，得到散射淡蓝色光的纳米微粒分散液，减压蒸馏除去丙酮，用滤纸过滤除去未包裹的药物沉淀和高分子聚集物，即得到负载聚酯，红荧烯的高分子纳米微球的水分散液。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为119nm。纳米微粒分散液和过氧化氢反应的混合液用荧光仪检测发射波长在560nm。（以下实施例中如无特别说明，则对载药微球的基本性质表征于此实施例中相同。）
实施例2：负载小分子草酸酯，红荧烯的高分子纳米微球的制备
将50mgPEG-PCL和5mg联苯草酸酯同时溶解于2mL的丙酮中，加入1mg的红荧烯，得到澄清透明的醇溶液O，其余过程同实施例1。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为105nm。荧光仪发射波长在560nm。
实施例3：负载聚草酸酯，二苯基蒽的高分子纳米微球的制备
将50mgPEG-PCL和5mg聚草酸酯同时溶解于2mL的丙酮中，加入1mg的二苯基蒽，得到澄清透明的醇溶液，其余过程同实施例1。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为122nm。荧光仪发射波长在433nm。
实施例4：负载小分子草酸酯，二苯基蒽的高分子纳米微球的制备
将50mgPEG-PCL和5mg联苯草酸酯同时溶解于2mL的丙酮中，加入1mg的二苯基蒽，得到澄清透明的醇溶液，其余过程同实施例1。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为109nm。荧光仪发射波长在433nm。
实施例5：负载聚草酸酯，红荧烯，四苯基卟啉的高分子纳米微球的制备
将50mgPEG-PECL和5mg联苯草酸酯同时溶解于2mL的丙酮中，加入1mg的红荧烯和1mg四苯基卟啉，得到澄清透明的醇溶液，其余过程同实施例1。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为119nm。
实施例6：负载小分子草酸酯，红荧烯，四苯基卟啉的高分子纳米微球的制备
将50mgPEG-PECL和5mg联苯草酸酯同时溶解于2mL的丙酮中，加入1mg的红荧烯和1mg四苯基卟啉，得到澄清透明的醇溶液，其余过程同实施例1。通过动态光散射技术测得微球平均粒径为122nm。
实施例7：负载聚草酸酯，红荧烯的高分子纳米微球水分散液的化学发光特性
向96孔板中加入200μL的2.5mg/mL的负载聚酯，红荧烯的高分子纳米微球的水分散液，再加入50μL不同浓度的过氧化氢的磷酸盐水溶液（0.1M），立即用化学发光成像仪记录下，并统计出发光强度。动力学数据由同一浓度下不同时间点的发光强度构成。
实施例8：负载聚草酸酯，红荧烯，四苯基卟啉的高分子纳米微球的抗肿瘤特性
细胞株为神经胶质瘤C6和肠癌LoVo,通过MTT法测定了实施例1中制备的纳米微球对癌细胞的杀伤效果（如表一所示）。
可以看出，采用本发明公布的方法，可以将溶解性很差的光动力药物四苯基卟啉负载于生物相容的高分子分子纳米微球当中，由此得到的药物组合物能够在过氧化氢存在下利用药物载体的自身发光特性，产生细胞杀伤能力，获得抗肿瘤效果。
表一：不同种纳米微球对C6和LoVo体外细胞毒性实验结果
Claims (2)
1.制备肿瘤信号响应的主动治疗纳米光动力药物载体的方法，其特征是：由下列步骤组成：
步骤1：将两亲性高分子聚合物和过氧草酸酯按质量比10:1的比例溶解于丙酮或四氢呋喃溶液中，适度加热，制成1mg/mL～100mg/mL的澄清透明溶液；
步骤2：将染料分子和光动力药物按质量比1:1的比例加入按步骤1配制的溶液中，使药物浓度在0.01mg/mL～1mg/mL之间；
步骤3：将步骤2配制的丙酮或四氢呋喃溶液缓慢滴加到水溶液中，在滴加的同时通过磁力搅拌混合均匀；所述的水溶液是蒸馏水、生理盐水或磷酸缓冲液；
步骤4：将步骤3制得的溶液通过旋转蒸发或透析的方法，除去溶液中残留的有机溶剂；
步骤5：将步骤4制得水分散液通过滤纸过滤，除去少量高分子聚合体，即制得对过氧化氢响应的负载有动力药物的纳米载体的水分散液；步骤3中丙酮或四氢呋喃溶液和水溶液的体积比为1:10～1:100；
两亲性高分子聚合物PVP-PCL的制备：在装有适量端羟基聚乙烯吡咯烷酮（PVP-OH）的聚合管中加入计算量的己内酯和0.1%（w/w）的辛酸亚锡，其中PVP的数均分子量为2000±400，在真空下封管并放入100℃反应，反应时间24h-72h，得到的粗产物用二氯甲烷溶解后沉淀于大量冷乙醚中，除去未反应的单体和其他低分子量的物质，然后将沉淀物收集用甲醇洗涤数次后干燥，得到PVP-PCL二嵌段聚合物；
过氧聚草酸酯的制备：在三颈烧瓶中用干燥的四氢呋喃溶解计算量的对羟基苯甲醇和1,8-辛二醇，再加入一定量的三乙氨；然后0℃真空下用注射器加入稍过量的草酰氯，室温反应过夜，用饱和盐水终止；得到的粗产物用乙酸乙酯提取三次，合并有机层用无水硫酸钠干燥，浓缩后用二氯甲烷/正己烷V：V=1：1沉淀，收集并洗涤数次后真空干燥；
负载聚草酸酯、红荧烯的两亲性高分子纳米微球的制备：将50mgPEG-PCL和5mg聚草酸酯同时溶解于2mL的丙酮中，加入1mg的红荧烯，得到澄清透明的醇溶液，将醇溶液慢慢滴加到20mL水溶液中，适度搅拌混合均匀，得到散射淡蓝色光的纳米微粒分散液，减压蒸馏除去丙酮，用滤纸过滤除去未包裹的药物沉淀和高分子聚集物，即得到负载聚草酸酯、红荧烯的高分子纳米微球的水分散液；通过动态光散射技术测得微球平均粒径为119nm；纳米微粒分散液和过氧化氢反应的混合液用荧光仪检测发射波长在560nm。
2.根据权利要求1所述的制备肿瘤信号响应的主动治疗纳米光动力药物载体的方法，其特征是负载小分子草酸酯、红荧烯的高分子纳米微球的制备，将50mgPEG-PCL和5mg联苯草酸酯同时溶解于2mL的丙酮中，加入1mg的红荧烯，得到澄清透明的醇溶液，通过动态光散射技术测得微球平均粒径为105nm；荧光仪发射波长在560nm。
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