CN105968373A

CN105968373A - 一种含两性离子的多重酸敏感抗肿瘤载药胶束及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105968373A
Application number: CN201610320480.9A
Authority: CN
Inventors: 顾忠伟; 马瑾; 易强英; 康珂
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2016-09-28
Anticipated expiration: 2036-05-16
Also published as: CN105968373B

Abstract

本发明公开了一种含两性离子的多重酸敏感抗肿瘤载药胶束及其制备方法和应用，属于生物材料领域。所述含两性离子的多重酸敏感抗肿瘤载药胶束包括两性离子的亲水外壳，含两个酸敏感键的疏水内核。所述方法利用醇交换法将丙烯酸羟乙酯和2，2‑二甲氧基丙烷脱甲醇，合成2,2‑二（丙烯酰氧基‑1‑乙氧基）丙烷；利用开环β‑丙内酯连接2‑(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯合成羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯；利用原子转移自由基聚合法，得到羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体聚合物；利用原子转移自由基聚合法和迈克尔加成一锅法，合成了三嵌段的两亲性聚合物，再采用超声滴入法及透析法制备纳米载药胶束。所述载药胶束可提高化疗药物的抗肿瘤效果。

Description

一种含两性离子的多重酸敏感抗肿瘤载药胶束及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物材料领域，特别涉及一种含两性离子的多重酸敏感抗肿瘤载药胶束及其制备方法和应用。

技术背景

据2013年世界卫生组织统计，肿瘤目前已经成为威胁人类健康的主要疾病之一。当前化疗是临床用于治疗肿瘤最常用且最有效而的手段之一，但由于化疗药物缺乏在肿瘤细胞及正常细胞之间的特异性选择，同时具有较强毒性，导致了治疗过程中严重的毒副作用。纳米载药系统的出现很好的解决了这些问题。一定粒径范围内的纳米粒子利用肿瘤部位增强的渗透与滞留效应（EPR效应），可以通过被动靶向作用可以实体瘤部位的富集；同时纳米载体表面可以进行各种功能化修饰，提高了化疗药物的抗肿瘤效果，同时明显减少了治疗过程中的毒副作用。胶束是一种由两亲性的材料在水中由于亲疏水作用形成的纳米载体，其疏水核部分为疏水性的药物提供了巨大的包载空间，使胶束具有相较其他纳米粒子较高的载药量；同时亲水的外壳部分可以进行各种功能化修饰。这些优良的特性使纳米胶束在临床上有巨大的应用潜力。

随着纳米载体的不断发展，有研究表明纳米粒子在血液循环过程中会被蛋白质或者细胞粘附，导致人体网状内皮系统将其清除，不能发挥应有的作用。因此，抵抗生物分子的吸附作用，提高纳米粒子在循环中的稳定性是一项急需解决的难题。目前研究及临床运用较多且有效的策略是在粒子外围修饰亲水性的PEG或者PEG化，可以实现较好的抗蛋白吸附效果。然而，Ishida等的研究表明，PEG在多次运用之后，人体会对其产生明显的体液免疫反应，产生anti-PEG IgM，加速对PEG的清除作用（ABC效应）；同时二次注射进入体内的PEG化纳米粒子会成为anti-PEG IgM的免疫原性抗原表位和结合位点，加速被清除速率。所以发展一种可替代PEG的物质来实现纳米粒子的抗非特异性蛋白吸附非常有必要且有重要意义。

当载药纳米胶束经过稳定长循环后经被动靶向作用富集于肿瘤部位，能否被肿瘤细胞摄取，以及进入细胞之后能否快速的将药物释放出来发挥药效，是载药纳米胶束发挥抗肿瘤效果的重要前提。目前研究者们通过利用肿瘤部位与正常组织的差异，使纳米粒子实现对肿瘤部位特异性的响应性，如利用肿瘤部位相对较低的pH值、较高浓度的谷胱甘肽、较高浓度的某些蛋白酶等设计成pH敏感、氧化还原敏感、酶敏感的纳米粒子等。目前大部分纳米材料中仅有一个敏感键，纳米粒子在肿瘤微环境中不能高敏感的快速响应，实现药物突释，难以达到药物治疗浓度，实现抗肿瘤作用。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种含两性离子的多重酸敏感的抗肿瘤纳米胶束载药系统，其生物相容性好；可以在血液中实现稳定长循环；同时具有对肿瘤部位的被动靶向性（EPR效应）；载药量高；在进入肿瘤细胞后可以高敏感的快速释放药物，提高化疗药物的抗肿瘤效果，同时降低对正常组织的毒副作用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种含两性离子的多重酸敏感两亲性分子，包括含两性离子(如聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯pCBMA、聚甲基丙稀酰氧基乙基磷酰胆碱pMPC、聚磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯pSBMA，等)的亲水端和含两个酸敏感键的疏水端。两性离子化合物不仅具备抗非特异性蛋白吸附能力，同时还具有良好的生物相容性，避免PEG的诸多弊端。由于两性离子具有较强的亲水性，可以通过与水的溶剂化作用在粒子的外围形成一层较为稳定的水化膜，降低粒子表面的界面能，从而可以有效抵抗蛋白吸附；同时，由于两性离子与水之间的氢键作用，也使其具有超低污染的性质，达到抗蛋白吸附的效果，有利于实现所述两亲性分子自组装形成的纳米粒子在血液中的长循环。

作为可选方式，在上述两亲性分子中，所述亲水部分的两性离子为中间含季胺、末端为羧基的物质。在偏酸性的环境中，羧基中不带电，季胺部分带正电，使整个纳米粒子外围呈正电性；在偏碱性环境中，外围的羧基电离带负电荷，使整个纳米粒子外围呈负电性。且外围为羧基时有利于进一步化学修饰。

作为可选方式，在上述两亲性分子中，所述两性离子为羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体聚合物。

作为可选方式，在上述两亲性分子中，所述两个酸敏感键的具有梯度酸敏感特性，其中一个可在pH 6.8左右发生断裂，另一个可在pH 4.5-6.0环境下发生断裂。进一步的，所述酸敏感键分别为缩酮键或叔胺键。

作为可选方式，在上述两亲性分子中，所述亲水端包括含缩酮键的2,2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷和含叔胺键的4,4-丙基哌啶基哌啶。为了使通过被动靶向作用富集于肿瘤部位的载药纳米胶束,被摄取进入肿瘤细胞后可以将包裹的药物高选择的较快速释放出来，本发明利用了肿瘤微环境的酸度（pH 6.8）与正常体液（pH 7.4-7.2）的微小差异，同时利用胞内溶酶体较强的酸性（pH 4.5-6.0），在聚合物中加入多重酸敏感片段，使载药胶束可以对肿瘤环境更加敏感，在细胞内实现药物突释，有效发挥药效。在疏水内核片段中运用两种具有酸敏感键的物质，包括含缩酮键的2,2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷和含叔胺键的4,4-丙基哌啶基哌啶。当通过EPR效应进入肿瘤部位后（pH 6.8），胶束由于外围的羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯末端羧基的水解作用，使胶束表面发生电荷翻转，由之前的电负性变成电正性，增强与电负性的肿瘤细胞膜相互作用，促进肿瘤细胞的摄取；载药胶束进入溶酶体后，在强酸性条件下，疏水部分ADA的缩酮键发生断裂，破坏载药胶束；同时4,4-丙基哌啶基哌啶的叔胺发生质子化作用，其由疏水性转变为亲水性，促使更多的酸性液体进入胶束内部，加速胶束的解体，实现胶束的溶酶体逃逸，快速释放药物。

作为可选方式，上述两亲性分子结构式为：

其中n、 m为聚合度。作为可选，在上述两亲性分子中最终合成的该聚合物分子量为15KD。作为优选，所述n:m=2:3。

本发明还提供了一种制备上述的含两性离子的多重酸敏感两亲性分子的方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

(1)利用醇交换法制备2,2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷（ADA）

；

(2)利用2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和β-丙内酯开环反应制备羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯（CBMA）

；

(3)利用步骤（2）所制备的羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯，经原子转移自由基聚合法合成羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体聚合物（pCBMA）

；

(4)利用步骤（3）所制备的单体聚合物（pCBMA）、步骤（1）所制备的2,2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷（ADA）和4,4—丙基哌啶基哌啶（TMDP），经原子转移自由基聚合法和迈克尔加成一锅法合成两亲性的聚合物pCBMA-p(ADA-TMDP)

。

作为可选方式，在上述制备方法中，步骤（1）中醇交换后产生的甲醇-苯共沸物应及时蒸出。

作为可选方式，在上述制备方法中，步骤（4）中所合成的聚合物中，其组成成分羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体聚合物、2，2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷、4,4—丙基哌啶基哌啶的摩尔比例约为2:3:3。

本发明还提供了一种含两性离子的多重酸敏感抗肿瘤载药胶束，由上述任意一种两亲性分子自组装形成纳米载药胶束，包括含两性离子的亲水外壳和含两个酸敏感键的疏水内核，所述疏水内核中包载有药物。所述载药胶束中外围是亲水性的两性离子，可以有效抗非特异性蛋白吸附，使载药胶束在血液中实现稳定长循环；具有较高的载药量；在肿瘤进入肿瘤微环境后发生电荷翻转，促进入胞；对酸性环境的高敏感响应性，肿瘤细胞内高选择性的快速释药；抗肿瘤效率高，对正常组织毒副作用小。

作为可选方式，所述纳米载药胶束粒径为50-100纳米。粒径在EPR效应范围内，可实现被动靶向。

作为可选方式，在上述纳米载药胶束中，所述疏水内核中包载的药物为疏水性抗肿瘤药物、光敏剂、荧光分子中的一种或其组合。优选为阿霉素或紫杉醇。

作为可选方式，在上述纳米载药胶束中，其载药量范围为12%-16%。

本发明还提供了上述含两性离子的多重酸敏感抗肿瘤载药胶束的制备方法：

取本发明所述的至少一种两亲性分子与疏水药物混合，采用超声滴入法及透析法制备纳米载药胶束。

作为可选方式，所述方法具体为将该两亲性聚合物和抗肿瘤药阿霉素同时溶于DMF溶液中，在超声条件下缓慢滴入水中，装入透析袋用去离子水透析，得到载药胶束。

本发明还提供了上述两亲性分子的应用，将其用于包载抗肿瘤药物。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本发明的有益效果：

本发明所述的载药胶束粒径在EPR效应范围内，可实现被动靶向；外围是亲水性的两性离子，可以有效抗非特异性蛋白吸附，使载药胶束在血液中实现稳定长循环；具有较高的载药量；在肿瘤进入肿瘤微环境后发生电荷翻转，促进入胞；对酸性环境的高敏感响应性，肿瘤细胞内高选择性的快速释药；抗肿瘤效率高，对正常组织毒副作用小。

附图说明：

图1为本发明高分子胶束载体的¹H-NMR(CDCl₃)。

图2为本发明载药胶束示意图。

图3为本发明包载和不包载抗肿瘤药物阿霉素形成胶束后的粒径分布图。

图4为本发明载药胶束的透射电镜照片。

图5为本发明空白胶束在不同pH的缓冲溶液中放置4 h后的粒径分布图。

图6为本发明空白胶束在不同pH的缓冲溶液中放置4 h后的电位变化图。

图7为本发明空白胶束在pH 7.4 缓冲溶液中对胎牛血清蛋白的吸附图。

图8为本发明载药胶束在不同pH 缓冲溶液中的药物释放曲线。

图9为本发明空白胶束对人源肝肿瘤细胞及小鼠成纤维细胞的毒性作用。

图10为本发明载药胶束抑制人源的肝肿瘤细胞及小鼠成纤维细胞的存活率图。

图11为本发明载药胶束体外细胞摄取及胞内释放药物入核实验的激光共聚焦照片。

图12为本发明载药胶束体外细胞摄取及胞内载药胶束溶酶体逃逸实验的激光共聚焦照片。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。

实施例1：2,2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷的制备

首先将丙烯酸羟乙酯、2，2-二甲氧基丙烷按摩尔比例2:1混合，加入苯和对甲基苯磺酸，在58℃的反应条件下，将苯-甲醇共沸物蒸出，得到初产物。将得到的初产物用硅胶柱色谱法进行纯化，以正己烷和二氯乙烷（1：1）的混合溶剂进行洗脱，旋蒸除掉洗脱剂，得到无色的油状液体，为纯化后的产物ADA。

实施例2：羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯（CBMA）的制备

将0.11 mmol 的2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯在剧烈搅拌下溶于50 mL无水丙酮，在氮气保护下，将0.14 mmol β-丙内酯的10 mL无水丙酮溶液缓慢的滴加到上述溶液中。在氮气保护下，该反应在4℃反应5h，得到白色粉末。之后将得到的白色粉末依次用无水丙酮和无水乙醚洗涤，在真空干燥箱中干燥，得到白色粉末状产物。

实施例3：聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯（pCBMA）的制备

运用ATRP法（原子转移自由基聚合法）反应来制备聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯，以实施例2中合成所得产物作为反应单体，以2-溴代异丁酸乙酯为引发剂，以1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺为配体，以单体：引发剂：配体=16.6:1:2 的摩尔比投入干燥的支口瓶中，做三个真空-氮气的循环来保证反应体系的无氧环境。将甲醇：N,N-二甲基甲酰胺（1：1）为溶剂用注射器注入反应体系中，在三个真空-氮气的循环后加入溴化亚铜。将反应体系密封，在60℃反应24 h。反应体系与空气连通，终止反应。得到的反应初产物，用500-1000截留分子量的透析袋在中性水中透析除去未反应的单体、引发剂、配体、溴化铜、反应溶剂等小分析物质。冻干后得到产物聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯。

实施例4：pCBMA-p(ADA-TMDP)的制备

本发明的两亲性的高分子材料是利用ATRP和迈克尔加成反应一锅法合成。将实施例3中合成的聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯（0.057 mmol）、实施例1中合成的ADA(1.476 mmol)投入到20 ml的甲醇：N,N-二甲基甲酰胺（1：1）溶剂中搅拌溶解。经过三个真空-氮气的循环后加入溴化亚铜（0.1 mmol）和4,4—丙基哌啶基哌啶（1.476 mmol），在氮气保护下，70℃反应48 ，与空气连通以结束反应。将反应产物转移到3500截留分子量的透析袋中进行透析，除去未反应的单体以及溶剂等小分子物质。之后将透析后的产物在1000转/分钟下离心，除去不溶于水的组分。最后冷冻干燥得到产物。

将得到的高分子材料pCBMA-p(ADA-TMDP) 溶于氘代CDCl₃中，做 600 MHz氢谱扫描，核磁图谱如图1所示。

实施例5：空白胶束以及载药胶束的制备

将1 mg两亲性材料pCBMA-p(ADA-TMDP) 与0.2 mg 阿霉素共同溶解于0.5 mL的DMF溶液中，在超声条件下将其缓慢滴加到水中。两亲性材料通过亲疏水作用进行自组装，形成中间疏水，外围亲水的球状纳米胶束。同时，疏水性的抗肿瘤药物被稳定包裹于胶束疏水的内腔，形成载药胶束。之后用透析法除去有机溶剂及未包载的游离药物，冷冻干燥后备用。

通过马尔文激光粒度仪测定其粒径大小及分布，图3显示空白胶束的粒径为69±20纳米，载药胶束的粒径为77±19纳米。同时用透射电子显微镜观察载药粒子的尺寸及形态，如图4所示，载药粒子呈现较规则的球形，粒径分布为75 ±13纳米。所得载药胶束的载药量为12%-16%

实施例6：在不同pH的缓冲溶液中粒径分布及表面电位的变化

将该纳米胶束分别分散于pH 7.4、6.8、6.0、5.0的缓冲溶液中，静置4 h，通过马尔文激光粒度仪分别测定其粒径分布及表面电位。如图5所示，在类生理条件的pH下，胶束粒径分布较窄且均一；当在pH 6.8(肿瘤微环境的pH)时，粒径保持均一，但分布变宽；当pH继续降低到6.0时，粒径分布开始不均一，出现两个峰；pH 5.0时（接近溶酶体酸度），粒径分布的两个峰更加明显。这一结果验证了该纳米胶束的pH响应性。

同时，不同pH缓冲液中胶束表面点位的变化趋势（如图6所示）也与理论相符。在pH7.4时，表面呈现轻微负电性（-2.4 mV），是由于两性粒子部分的羧基离子化，有利于胶束在循环的过程中减少蛋白质吸附，保持稳定，增加长循环时间；在pH 6.8时，由于两性离子的胶束表面发生了电荷翻转，呈现轻微电正性(+4.41 mV)，有利于胶束离子与电负性的肿瘤细胞膜接触，促进胶束入胞；pH 6.0-5.0,电正性明显增强，证明了胶束的酸响应性。

实施例7：抗非特异性蛋白吸附能力

以胎牛血清为模型蛋白来研究该多重酸敏感的两性粒子胶束抗蛋白吸附能力。将纳米胶束与胎牛血清溶液共孵育，在pH 7.4条件下共孵育不同时间，在13000 g的转速下离心除去被胶束吸附的蛋白，取上清，用BCA法检测未被吸附的蛋白含量。如图7所示，在pH 7.4时，2 h内，仅有10.0%的蛋白被吸附；随着时间的增加，在4h时，仅有15.6%吸附量，吸附量没有明显增加。证明外围为两性离子的纳米胶束确实可以抗非特异性蛋白吸附，在长循环过程中保持稳定。

实施例8：载药量及不同pH条件下的药物释放曲线

通过荧光色谱法检测载药胶束的载药量。称取适量实施例5中的冻干载药胶束，重新溶解于二甲基亚砜，用标准曲线法测定阿霉素的包载量。测量结果显示，有35.0%的药物被包封在纳米胶束中，其中药物质量占载药粒子总质量的14.0%。

称取包载有0.5 mg阿霉素的载药胶束，溶于1mL水中，转移至截留分子量500-1000的透析袋中，分别将透析袋浸没在25 mL不同pH值的缓冲溶液，将其置于37℃恒温摇床水浴中。每隔一段时间，取出1 mL透析袋外部的溶液用于测量时间点处药物的释放量，同时补充1mL相同pH值的新鲜缓冲溶液。每个pH条件重复三个平行样，测定并计算每个时间点的累积释放的药物量，绘制释放曲线。如图8所示，在pH 5.0条件下，刚开始药物迅速释放，之后释药速率逐渐变缓，最终基本达到稳定，在96 h内，有72.7%的药物释放。而在pH 7.4和6.8的条件下，96 h时释药量均不足28%。说明该载药胶束可以高选择性的在较低pH条件下迅速释放包载的药物，具有较敏感的pH响应性。

实施例8：生物学评价

通过CCK-8法测定本发明中纳米胶束的体外毒性。将肝肿瘤细胞和成纤维细胞以一定数量分别接种于96孔板中，培养24 h后，加入不同浓度的空白胶束，继续培养24 h和48 h,弃去含有胶束的培养基，用PBS缓冲溶液（pH 7.4）冲洗三遍，加入CCK-8（每孔10 μL），在37℃下避光孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光值，计算细胞存活率，每个实验组设置5个平行样。实验结果如图9所示，空白胶束无论是对肿瘤细胞还是对正常细胞，都无明显毒性，证明其具有良好的生物相容性。

以上述同样的方法将不同浓度载药胶束，盐酸阿霉素分别与肝肿瘤细胞和成纤维细胞共孵育36 h后，用CCK-8法测定细胞存活率。结果如图10所示，与盐酸阿霉素相比，载药胶束的IC₅₀值有轻微增加，是由于载药胶束对药物的包封作用，减缓了药物进入细胞核发挥作用的速率。

细胞摄取及胞内溶酶体逃逸实验。将肝肿瘤细胞按适当浓度在玻底皿中培养，控制阿霉素的浓度在5 mg/mL，将载药胶束与细胞共培养不同的时间。用DAPI将细胞核染色标记（蓝色荧光），用lysotracker green将酸性的溶酶体标记染色（绿色），用激光共聚焦观察细胞摄取载药胶束后在细胞内的分布和变化情况。实验结果表明，随着共孵育时间的延长，载药胶束被细胞摄取的量不断增加，且药物逐渐释放进入细胞核发挥作用（如图11所示），同时可以很好的实现溶酶体逃逸（如图12所示），证明了载药胶束良好的的pH敏感解体释药。

动物体内抗肿瘤实验。选取BALB/c雌性裸鼠（3周，18-20 g）建立皮下肿瘤模型，待肿瘤长至150cm3时，将裸鼠随机分组，每组5只。将载药胶束或盐酸阿霉素分散于生理盐水中，控制药物阿霉素的浓度进行尾静脉注射，以生理盐水作空白对照，每只200μL，每隔三天或四天给药一次，共给药七次，同时监测裸鼠的肿瘤大小及体重的变化，观察期为35天。在第35天将裸鼠解剖，收集各组肿瘤及各脏器（心、肝、脾、肺、肾），制成HE染色的病理切片。结果表明，载药胶束组裸鼠肿瘤体积相对生理盐水组明显减小，有明显的治疗效果，同时与盐酸阿霉素组相比，不仅抗肿瘤效果更明显，体重及精神状态良好，而且脏器的病理切片显示了较阿霉素更低的毒性。证明这种多重酸敏感的两性离子载药胶束非常良好的生物相容性以及有效的抗肿瘤效果。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言，仅仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明专利要求所限定的范围内，可对其进行许多改变、修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种含两性离子的多重酸敏感两亲性分子，其特征在于，包括含两性离子的亲水端和含两个酸敏感键的疏水端。

2.根据权利要求1所述的两亲性分子，其特征在于，所述两性离子为中间含季胺、末端为羧基的物质；作为优选，所述两性离子为羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体聚合物。

3.根据权利要求1所述的两亲性分子，其特征在于，所述酸敏感键分别为缩酮键或叔胺键；作为优选，所述亲水端包括含缩酮键的2,2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷和含叔胺键的4,4-丙基哌啶基哌啶。

4.根据权利要求1所述的两亲性分子，其特征在于，其结构式为：

。

5.一种如权利要求1所述的含两性离子的多重酸敏感两亲性分子的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

(1)利用醇交换法制备2,2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷；

(2)利用2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和β-丙内酯开环反应制备羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯；

(3)利用步骤（2）所制备的羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯，经原子转移自由基聚合法合成羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体聚合物；

(4)利用步骤（3）所制备的单体聚合物、步骤（1）所制备的2,2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷和4,4—丙基哌啶基哌啶，经原子转移自由基聚合法和迈克尔加成一锅法合成两亲性的聚合物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中醇交换后产生的甲醇-苯共沸物应及时蒸出。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所合成的聚合物中，其组成成分羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单体聚合物、2，2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷、4,4—丙基哌啶基哌啶的摩尔比例约为2:3:3。

8.一种含两性离子的多重酸敏感抗肿瘤载药胶束，其特征在于，由权利要求1-4中任意一个所述的两亲性分子自组装形成纳米载药胶束，包括含两性离子的亲水外壳和含两个酸敏感键的疏水内核，所述疏水内核中包载有药物。

9.一种如权利要求8所述含两性离子的多重酸敏感抗肿瘤载药胶束的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

(1)利用醇交换法制备2,2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷；

(4)利用步骤（3）所制备的单体聚合物、步骤（1）所制备的2,2-二（丙烯酰氧基-1-乙氧基）丙烷和4,4—丙基哌啶基哌啶，经原子转移自由基聚合法和迈克尔加成一锅法合成两亲性的聚合物；

（5）采用超声滴入法及透析法制备纳米载药胶束。

10.一种如权利要1所述的两亲性分子的应用，其特征在于，将其用于制备抗肿瘤药物。