CN108159422B - 一种自组装载药系统及其复合制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含亲水性的光疗药物和疏水性的化疗药物的自组装载药系统，及其应用于肿瘤化疗和光动力的协同治疗，该自组装载药系统不仅解决了疏水性化疗药物的给药问题，而且有效地结合了光疗和化疗，其复合制剂体现出很好的协同治疗效果，是一种具有高抗肿瘤活性的复合制剂。

Description

一种自组装载药系统及其复合制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种自组装载药系统及其复合制剂的制备方法。

背景技术

光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)是利用某些染料(光敏剂)能够吸收光并产生超氧自由基或热而杀死肿瘤细胞、达到抗肿瘤效果，是近二十年来兴起并且不断发展的新技术，在临床医学上应用于癌症的治疗。与手术、化疗和放疗等传统肿瘤治疗方法相比，PDT只在光照射的局部起作用，因而系统毒副作用小，对于一些年老体弱、不能手术的特殊患者尤为适用。

光敏剂的性能直接决定PDT疗效。现有光敏剂根据化学结构和组成可分为：1、卟啉类，如5-氨基酮戊酸(ALA)、二氢卟吩e6和苯并卟啉单酸环等；2、叶绿素类，如二氢卟吩类(chlorins)，紫红素类和菌绿二氢卟吩类；3、染料类，如酞菁类(phthalocyanine)和萘酞菁类(naphthalocyanine)等。其中，吲哚菁绿(ICG)作为一种近红外光吸收药物，是一种两亲性三羰基近红外吸收染料。它已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于人类临床疾病诊断以及医疗成像，并且也已经被中国药典收录用于诊断用药。其最大吸收波长位于800nm左右，具有很好的组织穿透深度，使其成为非常有发展前景的光敏剂。然而ICG遇光和热易变质，在水溶液中不稳定、容易聚集；注射到体内容易和血浆蛋白结合从而在体内呈现快速消除，ICG的这些缺点限制了其作为光敏剂的应用。为解决上述ICG的问题，有研究利用聚丙烯胺，磷硅酸钙和脂质聚合物等制备ICG纳米颗粒，来提高其稳定性；并利用纳米颗粒体内的长循环和肿瘤被动靶向性的特点，提高ICG的血液循环时间和肿瘤富集。如利用叶酸介导PLGA包载ICG制得纳米输送系统可稳定ICG并更好地靶向肿瘤部位。

单一的PDT治疗癌症的疗效往往效果有限，但其光动力抗肿瘤作用的生物学机制除了光化学反应产生一系列氧化反应和产生热量外，还可对肿瘤部位的微血管产生作用，造成血管完全封闭，使肿瘤组织因缺氧和营养枯竭而坏死，此外还可以刺激免疫系统的参与，促进前列腺素、淋巴因子、血栓素等细胞因子的释放等作用。其与传统化疗药物联用，不仅不会增加化疗药物的副作用，而且光动力治疗亦可以通过不同的机制克服化疗带来的耐药现象，因而PDT应用于联合治疗是一种很有前景的策略。有研究表明，PDT联合化疗药物顺铂、阿霉素、CPT11等，具有协同抗肿瘤作用而提高疗效。Tayyaba Hasan等就用卟啉类光敏剂与伊立替康脂质体对胰腺癌模型进行了联合治疗实验，治疗3周后的抑瘤率高达70％，而两种方式单独使用时均仅有25％的抑瘤率。Zheng等人发现共载阿霉素和ICG的PLGA-脂质纳米粒，其光疗和化疗对肿瘤细胞的抑制起到了协同作用，效果显著。因此，光疗和化疗的联合使用将是一种易于临床转化且行之有效的方式。

但是，如何有效地制备临床易转化的光敏剂与化疗药物制剂是实现联合治疗的关键。目前的方法是将化疗药物和光敏剂共负载到脂质体或纳米颗粒等输送载体中。另外一些专利文献例如US2012225017A1中公开了一种PEO-PHB-PEO和PEO-PPO-PEO共聚体材料形成的胶束，所述共聚体材料在水溶液中自装配成胶束，该胶束可含有喜树碱或其衍生物和吲哚菁绿。专利文献CN103951766A中公开了一种聚合物形成的光响应胶束，所述聚合物由透明质酸和邻硝基苄醇衍生物链构成。

但上述同时装载两种药物均是使用共聚物或者负载到脂质体或纳米颗粒等，使载药过程、载药系统、产品质量控制复杂化，导致了其难以临床转化。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种新型自组装载药系统及其复合制剂的制备方法和应用。

本发明的第一发明目的是提供了一种自组装载药系统，本发明提供的技术方案如下：

一种自组装载药系统，包含一种亲水性光疗药物和一种疏水性化疗药物。

作为优选，所述亲水性的光疗药物与疏水性的化疗药物通过相互作用形成溶于水的复合物或者可分散于水的纳米颗粒。

作为优选，所述亲水性的光疗药物与疏水性的化疗药物之间具有不同程度的π-π相互作用或疏水作用。

进一步优选，所述亲水性的光疗药物为具有平面共轭结构的光敏剂。

光敏剂为平面共轭结构的如卟啉类、叶绿素类、酞菁类或吲哚菁绿；

如，卟啉类的维替泊芬结构如下：

叶绿素类的二氢卟吩e6结构如下：

从光照穿透的深度进一步优选，ICG的最大吸收波长在近红外800纳米附近而具有良好的组织穿透能力，且已在临床应用，因此，ICG是优选模型药物，ICG结构如下：

进一步优选，所述疏水性的化疗药物具有苯环结构，可以为喜树碱类、紫杉醇类、姜黄素类、阿霉素、8-羟基喹啉等。

喜树碱类包括：喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、伊立替康、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱等；优选喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)。喜树碱类部分结构为：

紫杉类药物主要包括：紫杉醇(Paclitaxel、PTX)、多西他赛(Docetaxel、DTX)、卡巴他赛(cabazitaxel)、莱龙泰素(larotaxel))等；优选紫杉醇。

姜黄素类包括：姜黄素(Curcumin)、脱甲氧基姜黄素(Demethoxycurcumin)和双脱甲氧基姜黄素(Bisdemethoxycurcumin)。姜黄素类的结构如下：

从化疗药物的角度考虑，本发明利用亲水性光疗药物来直接增溶疏水化疗药物的方法，该方法具有普适性。具有共轭基团的亲水性光疗药物，与化疗药物分子间有较强的相互作用力，尤其适用于含有共轭基团的药物分子，具有不同程度的π-π相互作用或疏水作用，较一般的使用表面活性剂的亲水性来增溶疏水性化疗药物的自组装载药系统而言，亲水性光疗药物添加量较少。另一方面，亲水性光疗药物与疏水性化疗药物形成的自组装载药系统，可同时进行化疗和光动力治疗，达到协同治疗的效果。

进一步，本发明所述的自组装载药系统可无额外添加表面活性剂，可不添加聚合物；甚至可仅包含亲水性光疗药物和疏水性化疗药物两种成分，组成简单，亲水性光疗药物添加量更少，同时在化疗和光动力治疗过程中协同治疗效果更为显著。

能够与光敏剂ICG作用而实现增溶的强疏水性的化疗药物包括：姜黄素类、紫杉醇类、喜树碱类以及8-羟基喹啉等。ICG与姜黄素类和紫杉醇类等结晶性低的药物复合时形成水溶性复合物；ICG与喜树碱类强结晶性药物复合时形成纳米颗粒，其水溶性复合物或纳米颗粒的形成过程都是自组装完成。

本发明的第二发明目的是提供了一种制备含水溶性光疗药物与疏水性化疗药物复合制剂的方法，包括如下步骤：

(1)将水溶性光疗药物和疏水性化疗药物共同溶解于有机溶剂中。

(2)加入含水溶液，形成水溶性复合物或纳米颗粒。

(3)除去有机溶剂得到水溶液型制剂或进一步冷冻干燥制备干粉制剂。

作为优选，所述有机溶剂选自：DMSO、DMF、DHF、甲醇、乙醇或异丙醇。

作为优选，所述含水溶液选自：纯水、生理盐水、5wt％葡萄糖溶液、磷酸缓冲液。

本发明具有如下有益效果：

(1)从水溶性光疗药物的角度考虑，水溶性光疗药物如光敏剂在水溶液中易聚集而导致的淬灭现象是其光敏效果差的主要原因。本发明中由于光敏剂与疏水性化合物混合，增加了光敏剂分子间的距离而抑制了其淬灭、增强其光敏效应，从而增强其光热和光动力治疗的效果；同时可以减少吲哚菁绿的聚集，延长体内循环时间，提高其生物利用度。

(2)水溶性光疗药物多为平面共轭结构，包括叶绿素类、酞菁类染料以及吲哚菁绿，与具有苯环结构的疏水性化疗药物间有不同程度的π-π相互作用及疏水相互作用，本发明的实例说明水溶性光疗药物能够很好地增溶疏水性药物，从而解决疏水药物的给药问题。

(3)本发明中制得的复合制剂可以用于光疗和化疗联合治疗，且在体外和体内均体现出联合治疗的效果和优势。

(4)最为重要的是，本发明的制备过程简单易行，可无表面活性剂的添加，可无聚合物的引入，甚至可仅包含亲水性光疗药物和疏水性化疗药物两种成分。

采用本发明提供的方法：亲水性光疗药物与结构相似的疏水性药物形成水溶性复合物或纳米颗粒，具体为与结晶性低的疏水药物容易形成水溶性复合物，与结晶性强的疏水药物容易形成具有良好分散性的纳米颗粒，水溶性复合物、纳米颗粒的形成为自组装过程，该制备过程简单，其复合制剂可以为复合物的水溶液、复合纳米颗粒或干粉制剂，大量实验证明，复合制剂既能够提高光敏剂的光疗效果，同时又解决了非水溶性化疗药物的给药的问题，实现联合治疗，显示出比单一药物显著提高的疗效。

本发明所述的自组装载药系统及其复合制剂，载药过程、载药系统、产品质量控制较为简单，临床转化较为容易；本发明通过制剂表征、体外和体内的一系列实验证明了本发明所述的复合制剂具有良好联合治疗肿瘤效果，能有效治疗乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肠癌或肺癌等。

本发明的所述的自组装载药系统可通过注射途径给药，可制成冻干粉制剂，另外，本领域技术人员可参照现有抗肿瘤药物的给药剂量确定给药剂量，并根据个体情况的不同上下调整。

附图说明

图1为亲水性光疗药物和疏水性化疗药物形成复合物或复合纳米颗粒的过程示意图。

图2为ICG/SN38的纳米颗粒的原子力显微镜图，从左到右依次为ICG与SN38摩尔比为2∶1，1∶1和1∶2，标尺为200nm。

图3为二氢卟吩e6和SN38共同作用生成的纳米颗粒的动态光散射粒径分布图。

图4为ICG和姜黄素形成的水溶液的原子力显微镜图。

图5为不同ICG制剂在808nm激光持续照射下的光热温度变化图。

图6为DPBF荧光强度的变化检测ICG及其复合制剂的活性氧产生的速率。

图7为不同ICG复合制剂在细胞水平上的发热效果及对应的温度-时间图。

图8为不同ICG复合制剂在BCap37细胞上的活性氧产生的速率。

图9为ICG及其复合制剂对BCap37细胞的细胞毒性实验。(I1S2为ICG与SN38摩尔比为1∶2形成的纳米颗粒；I1P1为ICG与紫杉醇摩尔比为1∶1形成的复合物的水溶液药物。药物作用24h然后洗掉，分别光照和非光照处理后再培养24h。)

图10为不同ICG/SN38摩尔比的一系列纳米颗粒的小鼠血浆清除实验。

图11为不同ICG复合制剂及小分子ICG的小鼠血浆清除实验。

图12为I1S2和I2S1纳米复合制剂的荷瘤裸鼠的活体成像实验。

图13为不同ICG复合制剂及小分子ICG的荷瘤裸鼠的活体成像实验。

图14为非光照情况下的抑瘤实验结果。肿瘤体积变化(A)和裸鼠体重变化图(B)。

图15为光照情况下的抑瘤实验结果。肿瘤体积变化(A)、裸鼠体重变化图(B)以及期间拍摄的裸鼠照片(C)。

图16为ICG/SN38自组装载药系统纳米颗粒的光照前后的原子力显微镜图。

图17为细胞摄取图。

具体实施方式

本发明提供具体实施案例，但本发明不受这些案例的限制，本技术领域的技术人员可以做出若干改进，这些改进也视为本发明的保护范围。

实施例1

一种ICG/SN38复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将吲哚菁绿ICG和化疗药物SN38按照一定的比例共同溶解在有机溶剂中，具体来说，I1S2(ICG和SN38的摩尔比为1∶2，ICG为0.775mg，SN38为0.78mg)、I1S1(ICG和SN38的摩尔比为1∶1，ICG为0.775mg，SN38为0.39mg)、I2S1(ICG和SN38的摩尔比为2∶1，ICG为0.775mg，SN38为0.195mg)、I1S5(ICG和SN38的摩尔比为1∶5，ICG为0.775mg，SN38为1.95mg)以及I1S10(ICG和SN38的摩尔比为1∶10，ICG为0.775mg，SN38为3.9mg)，将上述药物分别溶于20μL的DMSO中。

(2)于上述溶液中分别加入1mL的纯水，得到不同比例的吲哚菁绿/SN38复合纳米颗粒分散液。

(3)将上述纳米颗粒分散液放入超滤离心管(3K)中，用纯水洗三遍，洗去有机溶剂DMSO和小分子ICG、干燥。

除有机溶剂为DMSO外，还可以为DHF、乙腈、DMSO、DMAC的一种或多种。

实施例1制备了一系列不同ICG与SN38比例的纳米颗粒，摩尔比分别为2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10，即I2S1，I1S1、I1S2、I1S5、I1S10。

从图2的DLS粒径分析结果可以看出，当少量的SN38加入时，类似于引入聚集核，此时SN38和ICG形成了较大的颗粒，粒径为130纳米左右；而更多的SN38加入时，与ICG的相互作用力加强，共同形成稳定的纳米颗粒，粒径也更小，I1S1为55纳米左右，I1S2仅为36纳米左右。

除SN38以外，同样地，我们发现吲哚菁绿与喜树碱类其他药物如伊立替康、拓扑替康、喜树碱等也形成复合纳米颗粒；吲哚菁绿与阿霉素、8-羟基喹啉药物也可形成复合纳米颗粒。

实施例2

一种ICG/PTX复合物水溶液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将吲哚菁绿ICG和紫杉醇PTX按照一定的比例共同溶解在有机溶剂中，具体来说，I1P1(ICG和PTX的摩尔比为1∶1，ICG为0.775mg，PTX为0.854mg)、I2P1(ICG和PTX的摩尔比为2∶1，ICG为0.775mg，PTX为0.427mg)，将上述药物分别溶于20μL的乙醇中。

(2)于上述溶液中分别加入1mL的5％葡萄糖溶液，减压旋蒸除去有机溶剂，得到不同的吲哚菁绿/紫杉醇复合制剂。

其有机溶剂除乙醇外，还可以为甲醇、异丙醇、乙腈的一种或多种。

疏水药物除紫杉醇类外，还有姜黄素类、8-羟基喹啉等，其复合制剂均可通过实施2类似方法制备，吲哚菁绿均可以有效得增溶这些疏水物质，分析可能原因为疏水药物填入吲哚菁绿的两爪之间，从而一定程度上形成类似络合物的结构，进而很好地溶解在水中。

实施例3

一种ICG/CCM复合物水溶液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将吲哚菁绿ICG和姜黄素CCM按照一定的比例共同溶解在有机溶剂中，具体来说，I1C2(ICG和CCM的物质的量之比为1∶2，ICG为0.775mg，CCM为1.71mg)、I1C10(ICG和CCM的物质的量之比为1∶10，ICG为0.775mg，CCM为8.55mg)，将上述药物分别溶于20μL的乙醇中。

(2)于上述溶液中分别加入1mL的生理盐水，减压旋蒸除去有机溶剂，得到不同的吲哚菁绿/姜黄素复合制剂。

实验证明，吲哚菁绿和姜黄素等形成的溶液检测不到粒径，在水中呈完全溶解状态，在云母片干燥上后为分散均匀的水渍(图4)。

实施例4

一种二氢卟吩e6/SN38复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

将二氢卟吩e6和化疗药物SN38按照一定的比例共同溶解在有机溶剂中，具体来说，I1E2(二氢卟吩e6和SN38的物质的量之比为1∶2，二氢卟吩e6为1.438mg，SN38为0.784mg)、I1E10(二氢卟吩e6和SN38的物质的量之比为1∶10，ICG为1.438mg，CCM为3.92mg)共同溶解在25μL的DMF中，加入2mL的5％葡萄糖溶液并且超声共沉淀得到纳米颗粒。

由于SN38的结晶性很强，其与二氢卟吩e6的大π环之间的共轭作用也很强，两者一起也可以形成纳米颗粒，如图3所示，测得I1E2的粒径为166纳米左右。申请人通过大量的实验证明，卟啉类结构的其他光敏剂也可以掺入化疗药物如SN38形成纳米颗粒。

图1所示为亲水性光敏剂和疏水性化疗药物形成复合物及复合纳米颗粒的过程示意图，由于亲水性光敏剂如吲哚菁绿、二氢卟吩e6等在水中存在一定程度的聚集体，结构疏松，当加入结晶性强的疏水性的抗癌药物如SN38，容易形成疏水核，从而形成纳米颗粒；当吲哚菁绿与结晶性低的疏水性抗癌药物如紫杉醇或姜黄素混合时，两者层层叠加，形成水溶性复合物，从而可以很好地增溶疏水性药物。

实施例5ICG溶液的制备

(1)将吲哚菁绿ICG0.775mg溶于20μL的乙醇中。

(2)于上述溶液中分别加入1mL的5％葡萄糖溶液，减压旋蒸除去有机溶剂，得到ICG溶液。

以下应用实施例采用实施例1-5所制备的产品进行验证。

应用实施例1：吲哚菁绿复合制剂的溶液水平上的光热效果

用FLTR-S65红外成像相机记录了制剂的体外发热效果。如图5，808nm波长的激光持续照射，ICG溶液从29.7℃升高到53.9℃，ICG/PTX(I1P1)溶液温度从29.4℃升高到56℃，而ICG/SN38(I1S2)纳米颗粒从29.7℃升高到57.2℃，说明形成复合制剂后，ICG的发热效果不但不受影响，而且有一定的提高。

应用实施例2：吲哚菁绿复合制剂的溶液水平上的光动力效果

单线态氧的产生是光动力学治疗的关键步骤。因此我们对比了在808nm激光照射下ICG/SN38纳米颗粒(I1S2)、ICG/PTX复合水溶液(I1P1)与ICG溶液产生活性氧(ROS)的能力。我们采用1，3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为单态氧的捕获剂，其原理是共轭的DPBF在可见光区域有很强的吸收，最大吸收峰在410nm，最大荧光发射峰在460nm处，而在氧化后破坏了其共轭结构而此处的吸收峰会消失，通过测量吸光度或荧光的淬灭可以间接测得活性氧的含量，因此这一反应经常被用于量化光照后光敏剂产生的ROS。将含吲哚菁绿相同浓度的制剂加入DPBF溶液中(10μM)，用功率和波长固定的激光器(1W/cm²)照射，经过固定时间间隔后用酶标仪测定其吸光度，记录后将光照时间作为横坐标与吸光度值作图。

从图6可以看出，ICG与小分子药物相互作用形成溶于水的复合物或者复合纳米颗粒后，较小分子ICG，均可以更快地产生单线态氧。

应用实施例3：吲哚菁绿复合制剂在细胞水平上的光热疗效

对本发明实施例1和例2制备得到的吲哚菁绿复合制剂进行细胞内吞实验，以游离的小分子ICG作为对照，操作步骤如下：

将实验分为ICG/SN38组、ICG/PTX组及ICG原料药组。将处于对数期生长的BCap37细胞按1×10⁵/孔均匀铺于12孔板中，培养24h后，弃去原培养液，加入含上述各组制剂的培养基1mL，在培养箱中培养3h后取出弃去培养液，各加入1mL PBS。用808nm激光分别对3个加药孔照射5min(1W/cm²)，并实时用红外热敏相机拍摄，记录各组温度变化图。

如图7所示，可以看出，ICG/SN38纳米颗粒组的细胞温度迅速升高，而小分子ICG组和ICG/PTX水溶液组均没有明显的温度变化。一方面，形成纳米颗粒后，增加了药物的细胞吞噬，另一方面，ICG形成颗粒后，聚集效应导致其吸收激光后产生更多的热量。

应用实施例4：吲哚菁绿复合制剂的细胞水平上的光动力疗效

类似地，将实验分为ICG/SN38复合制剂组(I2S1、I1S1、I1S2)、ICG/PTX(I1P1)复合制剂组、ICG小分子和SN38简单混合组对照(ICG+SN38)、ICG小分子和PTX简单混合组(ICG+PTX)对照及单独的ICG小分子组对照。将处于对数期生长的BCap37细胞按1×10⁵/孔均匀铺于12孔板中，培养24h后弃去原培养液，加入含上述各组制剂的培养基1mL，在培养箱中培养3h后，取出，弃去培养基，在每孔中加入已经稀释好的10μM DCFH-DA 2mL(取1μL的DCFH-DA用无血清无抗生素培养基按照1∶1000稀释，使终浓度为10μM)，之后用808nm激光分别对加药孔照射5min(1W/cm²)，再放入培养箱中继续培养10min后取出，再用无血无抗的原培养基洗涤3次，去除细胞外残留的DCFH-DA，再用流式细胞仪来检测细胞的ROS生成。

图8-A表明，单纯的化疗药物与ICG的加和，可以在一定程度上增加细胞对于激光的敏感度，而图8-B表明制备成纳米颗粒后可更加显著地提高ROS的生成，较小分子ICG也有非常显著的提高(p＜0.005)。

应用实施例5：吲哚菁绿复合制剂的细胞水平上的毒性试验

在96孔板中均匀加入200μL 4000个/孔细胞悬浮液，在培养箱中培养24小时后，按不同浓度点加入ICG、ICG/SN38(I 1S2)纳米颗粒；ICG/PTX(I 1P1)复合物溶液；ICG/CCM(I1C2)复合物溶液，两块相同的板在培养箱中避光培养3小时，吸干培养基后用PBS洗三遍，加入新鲜培养基。其中光照组在荧光灯下照射30分钟后继续避光培养，而另一块细胞培养板始终避光培养作为避光对照组。加药48小时后900rpm离心、小心吸去培养液，加入含有0.75mg/mL MTT的培养基继续避光培养3小时，3500rpm离心，小心吸去培养液，每孔加入100μL DMSO，震荡5分钟使紫色固体全部溶解，在酶标仪上读取吸光度(OD)值。每个药物浓度点试验重复3次。

MTT实验结果(图9-A)表明，避光的ICG对细胞没有毒性，而在光照后，浓度为20μM的ICG即可使细胞全部死亡，其IC₅₀约为13.5μM；I1S2的纳米颗粒表面带负电，减慢了其细胞的摄取，因此在没有光照时，其细胞毒性(即纳米颗粒中所含的SN38)比SN38分子小十倍左右，但在光照后，毒性有一定的增强；

图9-B表明ICG/PTX复合制剂中紫杉醇(PTX)的毒性没有受到影响，基本和小分子PTX相同；类似地，图9-C表明ICG与姜黄素(CCM)的复合制剂ICG/CCM中，CCM的毒性也没有受到影响，可能与制剂的性质有关，细胞对于两种药物的摄取为分别摄取，不像ICG/SN38纳米颗粒会由于颗粒表面电荷原因影响疏水化疗药物的摄取速度。

应用实施例6：吲哚菁绿复合制剂在小鼠上的血浆清除实验

为了确定动物实验中，ICG/SN38纳米颗粒的合适的药物比例，我们制备了一系列的ICG/SN38纳米颗粒I2S1，I1S1，I1S2，I1S5以及I1S10，其平均粒径依次分别为130nm、55nm、36nm、30nm、26nm，然后以SN38的含量(10mg/kg)为基准，检测纳米颗粒的血浆清除速率。

从图10可以看出，随着SN38比例的提高，纳米颗粒的血浆清除速率减慢，从I1S1到I1S2有明显的变化，之后的趋势不再明显。究其原因，在SN38含量很少时，溶液中存在许多ICG自身的团聚，此时的纳米颗粒粒径也比较大，分布不均匀，很多大颗粒快速被清除；而从原子力显微镜图(图2)可以看出，随着SN38比例的增大，粒径越来越小，越来越均匀。

另外，我们对比了小分子ICG、ICG/PTX溶液和ICG/SN38纳米颗粒的血浆清除速率。

从图11中可以看出，以ICG的浓度为标准，我们可以看到，小分子ICG的血浆清除非常快，刚注射进体内三分钟，其血浆浓度不足1μg/mL，1小时后，血液中就几乎检测不到ICG。而ICG和疏水性的化疗药物形成复合制剂后，大大延长了其血液循环时间。

应用实施例7：不同药物比例的ICG/SN38复合制剂在小鼠上的活体成像实验

在初步做了不同药物比例的ICG/SN38纳米颗粒的血浆清除后，I1S2和I2S1有明显的区别，因此，我们用荷瘤裸鼠进一步对比了这两种纳米颗粒的体内荧光成像情况以及ICG纳米复合制剂与小分子ICG的区别(肿瘤在小鼠右侧腋下两厘米处，为BCap37人乳腺癌细胞系)。

从图12可以明显看出，I1S2组的肿瘤更亮，说明不论从血浆清除速率还是肿瘤富集程度来看，I1S2组都更适合于后期的抑瘤实验。

从图13中可以看出，给药三小时后，ICG几乎代谢出体内，主要分布在肠道中，而ICG/SN38纳米颗粒组和ICG/PTX溶液的小鼠全身都很亮，尤其是肝脏部位，10小时后，药物几乎也清除出体内，说明ICG制剂均可以很快被小鼠代谢，不会出现累积毒性的问题。从肿瘤部位的ICG含量来看，制备成复合制剂后更优。

应用实施例8：吲哚菁绿复合制剂在小鼠上的光热和协同疗效

待接种肿瘤体积长至约100mm³(接种后9天)后，将荷瘤裸鼠随机分成7组，每组5只，其中一组作为空白对照组注射PBS，其余六组给药组分别尾静脉注射ICG剂量为10mg/kg的ICG小分子组，ICG/SN38纳米颗粒组及ICG/PTX水溶液组的光照组和非光照组，每隔一天给药一次，共给药2次，记录肿瘤体积直到实验结束。通过比较治疗组和对照组来评价治疗效果。抑瘤率(IR)通过以下公式计算：IR＝100％×(对照组的平均肿瘤重量-实验组的平均肿瘤重量)/对照组的平均肿瘤重量。

图14为非光照情况下的抑瘤结果。小分子ICG完全没有抑瘤效果，ICG/PTX组优于小分子ICG组，ICG/SN38纳米颗粒组显示出优异的抑瘤效果，肿瘤体积于给药结束四天后下降，肿瘤生长一直处于抑制状态直至给药一个月后开始反弹，说明采用光敏剂增溶SN38，仅化疗药物在该系统中也能够发挥很好的疗效。

图15为光照治疗后的抑瘤结果，ICG组给药两次，ICG/SN38纳米颗粒组给药一次，给药4h后进行光照(808nm激光，强度为1W/cm²，光照2分钟)。小分子ICG在光照后，肿瘤表面有销蚀但深度很浅，仍有残留的肿瘤且在治疗结束后迅速反弹；而纳米颗粒组ICG/SN38的肿瘤对于光照的敏感度大大增加，整个肿瘤完全销蚀，肿瘤完全消除且没有反弹，提示ICG的光动力治疗结合SN38的化疗效果显著提高。

应用实施例9：ICG/SN38自组装载药系统纳米颗粒形态

由图16可以看出，所制得的自组装载药系统ICG/SN38纳米颗粒I1S5形状呈球形，粒径约25纳米左右，这与纳米粒度测定仪测定结果基本一致，光照后，粒径变大两倍左右，说明ICG在形成自组装载药系统纳米颗粒过程中结构式起一定的支撑作用，随着光照分解，颗粒间聚集，导致粒径变大。

应用实施例10.载药量比较

利用激光共聚焦显微镜观察药物作用2h后药物在细胞内的分布，以验证明纳米制剂进入细胞的速度，进而有利于药物发挥治疗作用。如图17所示，由于ICG自身带负电，细胞膜也带负电，因此单独的ICG原料药有很多贴在细胞膜上，很难进入细胞。ICG/PTX溶液组较小分子组，药物在溶酶体中蓄积地更多；ICG/SN38纳米颗粒组有效地提高了细胞对药物的摄取，且很多药物已经逃逸出溶酶体，进入细胞质中。因此纳米载药系统进入细胞的ICG药量最多。

Claims (7)

1.一种自组装纳米颗粒，包含一种亲水性的光疗药物和一种疏水性的化疗药物，其特征在于，所述亲水性的光疗药物为具有平面共轭结构的光敏剂吲哚菁绿(ICG)，所述疏水性的化疗药物为7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)；所述亲水性的光疗药物与疏水性的化疗药物通过相互作用形成可分散于水的纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述自组装纳米颗粒，其特征在于吲哚菁绿(ICG)与7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的摩尔比为2:1、1:1、1:2、1:5或1:10。

3.根据权利要求2所述自组装纳米颗粒，其特征在于吲哚菁绿(ICG)与7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的摩尔比为1:2。

4.一种权利要求1-3任一项所述自组装纳米颗粒在用于制备治疗肿瘤药物的应用。

5.一种复合制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将权利要求1-3任一项所述亲水性的光疗药物与疏水性的化疗药物共同溶解于有机溶剂中；

(2)加入含水溶液，形成纳米颗粒；

(3)除去有机溶剂得到水溶液型制剂或进一步冷冻干燥制备干粉制剂。

6.根据权利要求5所述复合制剂的制备方法，其特征在于所述有机溶剂选自：DMSO、DMF、DMAC、THF、甲醇、乙腈、乙醇或异丙醇。

7.根据权利要求5-6任一项所述复合制剂的制备方法，其特征在于所述含水溶液选自纯水、生理盐水、5wt％葡萄糖溶液、磷酸缓冲液。

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