CN116327706A - 一种纳米药物递送系统及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纳米药物递送系统及其制备方法与应用，所述纳米药物递送系统包括二氢卟吩e6和茶碱衍生物d17。本发明方案制备得到的纳米药物递送系统，将两种不同作用机制的药物二氢卟吩e6和茶碱衍生物d17合成并包封在一个纳米粒中，采用化学药物治疗与光动力治疗双通路联合治疗肿瘤，在肿瘤微环境及特定近红外光照中可以释放出两种药物，还可调节作用靶点、控制时间并且能在肿瘤细胞处浓集、有效降低光敏剂的毒副作用、提高溶解性、减少机体不良反应，为临床抗肿瘤药物的开发提供新的方案和理论依据。

Description

一种纳米药物递送系统及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于纳米生物材料领域，具体涉及一种纳米药物递送系统及其制备方法与应用。

背景技术

肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。癌症是全世界人民主要的死亡原因之一，也是提高预期寿命的一个重要障碍。

治疗肿瘤的传统方式是化疗，即通过口服或者静脉注射抗肿瘤药物，经体循环将药物传输到达病灶部位，杀死肿瘤细胞。但大部分的化疗药物对肿瘤组织没有选择特异性，对正常组织也会造成伤害，病人承受较大痛苦。其次，由于人体存在各种生物屏障，只有少量的化疗药物到达肿瘤部位，导致生物利用度低，治疗效果不佳。另外，由于肿瘤微环境的改变、耐药相关蛋白的异常表达及耐药相关基因的调控等引起的肿瘤耐药，严重制约了化疗效果。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，，本发明提出一种纳米药物递送系统。

本发明还提出一种上述纳米药物递送系统的制备方法。

本发明还提出上述纳米药物递送系统的应用。

根据本发明的一个方面，提出了一种纳米药物递送系统，所述纳米药物递送系统包括二氢卟吩e6和茶碱衍生物d17；所述茶碱衍生物d17的结构如式(I)所示：

在本发明的一些实施方式中，所述纳米药物递送系统的粒径为80-100nm。

在本发明的一些实施方式中，所述二氢卟吩e6和茶碱衍生物d17的质量添加比为(1～2)：(1～4)。

根据本发明的第二方面，提出了上述纳米药物递送系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：将二氢卟吩e6和茶碱衍生物d17超声后，进行磁力搅拌即得。

在本发明的一些实施方式中，所述二氢卟吩e6的浓度为8-12mg/ml。

在本发明的一些实施方式中，溶解二氢卟吩e6的溶剂选择DMSO。

在本发明的一些实施方式中，所述茶碱衍生物d17的浓度为8-12mg/ml。

在本发明的一些实施方式中，溶解茶碱衍生物d17的溶剂选择DMSO。

在本发明的一些实施方式中，所述超声的时间为40-80min，超声的温度为15-25℃。

在本发明的一些实施方式中，所述超声的频率为40KHz，功率为300W。

在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括将磁力搅拌得到的产物进行过滤的步骤。

在本发明的一些实施方式中，所述过滤采用超滤。

在本发明的一些实施方式中，所述超滤采用的超滤膜的粒径为80-120KD。

在本发明的一些实施方式中，所述超滤离心的转速为3000-5000rpm，时间为6-15min。

在本发明的第三方面，提出了上述纳米药物递送系统的应用，所述应用为在制备抗肿瘤药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤为肺癌。

在本发明的一些实施方式中，抗肿瘤纳米药物递送系统的使用方法如下：将纳米递药系统导入到体内，当纳米递药系统在肿瘤部位的富集量达到最大时，采用激光辐照肿瘤部位。

在本发明的一些实施方式中，所述激光的波长为630～680nm，照射时间为0.5-30min。

在本发明的一些实施方式中，所述激光为红外光。

在本发明的一些实施方式中，所述导入方式为尾静脉注射。

根据本发明的一些实施方式，至少具有如下有益效果：本发明方案制备得到的纳米药物递送系统，将两种不同作用机制的药物二氢卟吩e6和茶碱衍生物d17合成并包封在一个纳米粒中，采用化学药物治疗与光动力治疗双通路联合治疗肿瘤，在肿瘤微环境及特定近红外光照中可以释放出两种药物，可调节作用靶点、控制时间并且能在肿瘤细胞处浓集、有效降低光敏剂的毒副作用、提高溶解性、减少机体不良反应，为临床抗肿瘤药物的开发提供新的思路和理论依据。同时，采用的近红外光对机体无损伤，且可通过外界调整近红外光的作用部位和作用时间来控制光敏剂Ce6的释放，产生ROS杀伤肿瘤细胞或组织。增加了光敏剂Ce6的靶向性、提高了化疗药物d17的溶解度和生物利用度、降低化疗药物d17对正常细胞或组织的毒副作用。本发明方案制备得到的纳米药物递送系统，利用二氢卟吩e6和d17的自组装制备得到，制备方法简单，成本价格低，效果显著，为制作肿瘤治疗提供了新的方案。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明测试例中的不同浓度自组装纳米递药系统的粒径分布结果图；

图2为本发明测试例中的纳米递药系统的紫外光谱图；

图3为本发明测试例中的非小细胞肺癌细胞H460杀伤效果检测结果图；

图4为本发明测试例中的非小细胞肺癌细胞A549杀伤效果检测结果图；

图5为本发明测试例中的纳米递药系统对肿瘤的影响结果图，其中，A为小鼠的体重变化图，B为小鼠肿瘤的体积变化图，C为肿瘤的质量变化结果图，D为量化后的肿瘤的质量变化结果图；E为H&E染色结果图；

图6为不同组别荷瘤裸鼠治疗后的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)的H&E染色结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1一种纳米药物递送系统

本实施例制备了一种纳米药物递送系统，具体制备过程为：

(1)溶液的配制：将二氢卟吩e6(Ce6)溶于DMSO中配置成母液，其浓度为10mg/ml；化合物d17溶于DMSO中配置成母液，其浓度为10mg/ml。

(2)纳米药物的合成：采用超声沉淀法合成自组装纳米药物，将配置好的二氢卟吩e6和d17按照比例加入5mL玻璃瓶中，d17与二氢卟吩e6的比例为2:1(即添加量为100μL：50μL)置于1.5mL EP管中，20℃恒温超声60min。

(3)将超声完毕的溶液转移至2mL玻璃容量瓶中，加超纯水定容至1mL，用磁力搅拌仪搅拌30min。

(4)搅拌完毕后转移至100KD超滤管中，4200rpm离心15min，即可获得d17@Ce6自组装纳米颗粒。

实施例2

本实施例制备了一种纳米药物递送系统，与实施例1的区别仅在于，d17与二氢卟吩e6的比例为1:2(即添加量为50μL：100μL)。

实施例3

本实施例制备了一种纳米药物递送系统，与实施例1的区别仅在于，d17与二氢卟吩e6的比例为1:1(即添加量为50μL：50μL)。

实施例4

本实施例制备了一种纳米递送系统，与实施例1的区别仅在于，d17与二氢卟吩e6的比例为3:1(即添加量为150μL：50μL)。

实施例5

本实施例制备了一种纳米药物递送系统，与实施例1的区别仅在于，d17与二氢卟吩e6的比例为4:1(即添加量为200μL：50μL)。

试验例

本试验例测试了实施例1-5制备的纳米药物递送系统的性能。

1、理化测定

(1)粒径检测

采用透射电镜检测实施例1-5制备的纳米药物递送系统的形态，具体步骤如下：

1)吸取100μL制备好的实施例1-5制备的纳米药物递送系统溶液滴在透射电镜专用铜网上。

2)将滴样后的铜网置于干燥箱干燥。

3)待铜网上纳米药物递送系统溶液完全干燥后用透射电镜观察拍照。

(2)光谱检测

采用紫外-可见分光光度法(UV-Vis)检测实施例1制备的纳米药物递送系统的紫外可见光光谱。

1)分别吸取100μL制备好的d17-ce6 NPs溶液至1mL去离子水、氯化钠溶液、DMSO和0.2％的SDS溶液中。

2)将步骤(1)中配好的检测液转移至紫外分光光度计检测皿中。

3)将分光光度计扫描波长范围设置为200-900nm，调零，点击启动即可。

(3)粒径检测

采用态光散射仪表征实施例1制备的纳米药物递送系统的粒径范围。

检测结果如图1-2所示，从图中可以看出，只有在d17与二氢卟吩e6的比例为2:1时，才能在水溶液中自组装形成核壳纳米粒，纳米颗粒呈圆球状，形态规整，分布较均匀；采用动态光散射仪表征这个纳米粒的平均粒径为89.33±0.58nm。化合物d17的载药率为72.97％，包封率为71.41％；Ce6的载药率为27.03％，包封率为52.89％。

2、抗肿瘤效果测定

(1)采用1640完全培养基(含10％胎牛血清，1％青霉素、链霉素双抗)培养H460(购自ATCC)和A549非小细胞肺癌细胞(购自ATCC)，培养环境为稳定37℃，5％CO₂浓度细胞培养箱。

(2)待细胞培养2-3代后状态良好，生长密度为80％-90％时，取H460和A549细胞于紫外照射消毒30min的细胞超净操作台中，吸去培养基上清，PBS洗两遍，加适量胰酶后置于细胞培养箱消化2-3min，待细胞成流沙状时加两倍胰酶体积的完全培养基终止消化，然后将细胞悬液转移至15mL离心管中，平角离心机室温离心1000rpm，离心3min后弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀，以每100μL完全培养基中2000-4000个活细胞的密度铺板种植于96孔板中。

(3)用1640完全培养基配置浓度梯度为0、0.0625、0.625、1.25、2.5、5、10和20μM的茶碱衍生物d17溶液；用1640完全培养基配置浓度梯度为0、0.03125、0.0625、0.625、1.25、2.5、5和10μM的Ce6溶液；用1640完全培养基分别配置含有与上述浓度梯度等量d17、Ce6的d17-Ce6 NPs溶液。96孔板中H460和A549细胞过夜培养至细胞完全贴壁且细胞密度适宜时，弃上清分别加100μL不同浓度的茶碱衍生物d17、Ce6和d17-Ce6 NPs溶液共孵育(分别为d17组、Ce6组、Ce6+光照组、d17@Ce6纳米颗粒组和d17@Ce6纳米颗粒组(实施例1制备的纳米药物递送系统)+光照组)，每组设置4个复孔，于细胞培养箱中培养。

(4)H460和A549细胞与不同浓度的茶碱衍生物d17、Ce6和d17-Ce6 NPs共培养72h(光照组给与650nm近红外光照射处理，光照时间为30s)后，提前配置含10％ CCK-8溶液的完全培养基，吸去96孔板细胞上清，每孔加100μL含10％CCK-8溶液的完全培养基，另增加一组不含细胞和茶碱衍生物的10％ CCK-8完全培养基作为空白对照(Ab)，孵育0.5h后用多功能酶标仪检测各孔在450nm处的吸光度，计算细胞活性。

结果如图3-4所示，从图中可以看出，肿瘤细胞的存活率随着d17-Ce6 NPs溶液浓度的处理浓度的升高而逐渐降低，同时d17-Ce6 NPs溶液+光照组表现出更好的肿瘤细胞杀伤效果，表明纳米药物在光照下，可以达到更好的肿瘤细胞杀伤效果。

3、动物实验

(1)纳米载药系统的富集

(1)皮下成瘤：取对数生长期的人肺癌细胞A549，用0.25％的胰蛋白酶消化，离心收集细胞，用PBS重悬后，按2×10⁶个细胞/只的密度接种于裸鼠皮下；

(2)随机分组：待皮下肿瘤长至约80mm³时，随机分为4组：对照组、d17组、d17-Ce6NPs+光照组、d17和Ce6联合给药+光照组；

(3)准备药物：先用DMSO溶解化合物d17再用无菌水将其稀释至终浓度为666μg/mL；先用DMSO溶解光敏剂Ce6再用无菌水将其稀释至终浓度为333μg/mL；用无菌水将d17-Ce6 NPs稀释至d17和Ce6浓度分别为666μg/mL和333μg/mL；用无菌水配制化合物d17和Ce6混合液，其中化合物d17和Ce6浓度分别为666μg/mL和333μg/mL；

(4)尾静脉注射给药与光照：将步骤(3)中配制好的药物按分组分别给予200μL/只裸鼠，对照组给予200μL PBS溶液，给药4h后用强光手电筒对d17-Ce6纳米颗粒+光照组和d17/Ce6联合给药(d17和Ce6浓度分别为666μg/mL和333μg/mL)+光照组所有裸鼠的皮下肿瘤部位光照20min；

(5)测量肿瘤与称量体重：从第一天尾静脉注射给药开始，每两天用电子秤称量小鼠体重并用游标卡尺测量皮下肿瘤长和宽，计算肿瘤体积，公式为：肿瘤体积(mm³)＝长×宽×宽/2；

(6)解剖：待裸鼠皮下肿瘤直径超过15mm时颈椎脱臼处死裸鼠，解剖肿瘤，进行称重并拍照，取裸鼠心肝脾肺肾和肿瘤组织切片做H&E染色，具体的染色步骤如下：

(1)固定：将各组的肿瘤组织和主要器官(心肝脾肺肾)浸泡在10倍体积的4％多聚甲醛中，固定48-72h；

(2)脱水：取出后放入用铅笔标记好的包埋盒内，在全封闭生物组织脱水机中进行程序性脱水；

(3)包埋：用70℃呈液态状的石蜡对脱水后的组织进行包埋；

(4)切片：包埋后的蜡块经石蜡组织切片机切片后(层厚为3-5μm)，再展片、贴片和烤片；

(5)脱蜡：将切片置于二甲苯中进行脱蜡，换用新鲜的二甲苯再重复2次，每次放置10min；

(6)水化：将脱蜡后的切片依次浸泡在100％、95％、75％的无水乙醇中，浸泡时间为5min，最后浸泡在蒸馏水中；

(7)染色：先用苏木素染液染色2min，蒸馏水洗去多余的染液，再用伊红染液染色1min，水流缓慢冲洗2s；

(8)封片：滴加少量二甲苯使其透明，用中性树胶封固盖玻片，于倒置显微镜下观察并拍照。

实验结果如图5-6所示，从图5的A中可以看出，化合物d17组裸鼠体重无明显变化；d17-Ce6 NPs+光照组小鼠体重虽然在治疗后的第2、第4和第6天呈连续下降趋势，但在第10天至第14天又逐渐恢复到治疗前；从图5的B中可以看出，使用实施例1制备得到的纳米药物递送系统+光照组的小鼠肿瘤体积的增长速度相较其他组明显更低；从图5的C中可以看出，使用实施例1制备得到的纳米药物递送系统+光照组的小鼠肿瘤相较其他组明显更小；从图5的D中可以看出，使用实施例1制备得到的纳米药物递送系统+光照组的小鼠肿瘤体积的增长速度相较其他组明显更低；从图5的E中可以看出，d17-Ce6 NPs+光照组的肿瘤细胞受到损伤，形态不规则，细胞核缩小，而其他各组肿瘤细胞未见明显损伤，也未发生其他炎症和免疫反应。

从图6中的A可以看出，各组间未见明显的细胞损伤和形态学改变；从图6中的B-E可以看出，与对照组相比，d17-Ce6 NPs+光照组AST、ALT、CRE、BUN水平无显著差异(P＞0.05)。这表明d17-Ce6 NPs无明显的肝、肾毒性。体内安全性实验结果表明茶碱衍生物d17-Ce6 NPs相对安全，不会产生任何免疫反应或诱导炎症反应。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种纳米药物递送系统，其特征在于，所述纳米药物递送系统包括二氢卟吩e6和茶碱衍生物d17；所述茶碱衍生物d17的结构如式(I)所示：

2.根据权利要求1所述的纳米药物递送系统，其特征在于，所述纳米药物递送系统的粒径为80-100nm。

3.根据权利要求1所述的纳米药物递送系统，其特征在于，所述二氢卟吩e6和茶碱衍生物d17的质量添加比为(1～2)：(1～4)。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的纳米药物递送系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将二氢卟吩e6和茶碱衍生物d17超声后，进行磁力搅拌即得。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述超声的时间为40-80min，温度为15-25℃。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括将磁力搅拌得到的产物进行过滤的步骤；优选地，所述过滤采用超滤，所述超滤采用的超滤膜的粒径为80-120KD。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述过滤的方式采用超滤离心，所述离心的转速为3000-5000rpm，时间为6-15min。

8.权利要求1-3任一项所述的纳米药物递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌。。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述纳米递药系统的使用方法如下：将纳米递药系统导入到体内，当纳米递药系统在肿瘤部位的富集量达到最大时，采用激光辐照肿瘤部位。

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