CN108159432B - 一种抑制乳腺癌的靶向纳米粒子及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制乳腺癌的靶向纳米粒子及其制备和应用，所述纳米粒子为原花青素、儿茶素、阿霉素和卵磷脂经修饰后脱水缩合后接枝乳腺癌特异性配体得到的纳米粒子。本发明中制备靶向乳腺癌细胞纳米粒子的制备过程简单，产物具有较好的稳定性、分散性以及均一性，实现了天然药物、合成药物与生物靶向的有机结合，而且具有良好的细胞穿透性，最重要的是具有极强的特异性靶向能力，构成了一种新型的抑制乳腺癌细胞生长的治疗系统。在提高靶向治疗肿瘤的同时，还能降低药物的不良反应。它的这些特性对临床上肿瘤靶向治疗提供了一个新的发展方向，可以进一步推动纳米载体给药系统的发展。

Description

一种抑制乳腺癌的靶向纳米粒子及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物医药材料技术领域，更具体地，涉及一种抑制乳腺癌的靶向纳米粒子。
背景技术
纳米健康材料技术是一个新兴的技术，利用纳米健康材料技术合成的纳米材料具有肠道吸收效率高，生物利用率高，持续性和靶向运输的能力、有效性，体内稳定性好，溶解性好等方面的优良特征，已经被广泛应用于疾病的诊断及治疗，纳米材料作为药物载体已经成为纳米医学研究领域的热点。小分子药物被纳米载体荷载后，可以在病灶部位聚集，发挥缓释的作用，增强对靶细胞的杀伤作用，降低小分子药物对周围健康组织的伤害。近年来，乳腺癌发病率与死亡率的逐年升高，越来越多的人开始研究乳腺癌的靶向治疗，乳腺癌干细胞靶向、抗体介导的靶向与微载体介导的靶向等研究领域应运而生，为乳腺癌的治疗奠定了理论基础。近几十年研究发现，将纳米技术与化疗药物联合起来治疗退行性疾病，如心血管疾病、肿瘤和糖尿病等的预防以及治疗有着非常好的疗效。
近几年，许多实验表明肿瘤细胞是一个多层次的细胞群体，同一肿瘤中可能存在多种不同的基因型或亚型的细胞，甚至在同一个体中上的肿瘤细胞也存在不同的特性和差异，肿瘤细胞存在异质性。这是由于肿瘤在生长过程中，进行了多次分裂增殖，蛋白表达方面或基因方面的改变，其子细胞呈现出不同的表型，造成了肿瘤的异质性。肿瘤的异质性，给肿瘤的治疗带来了严重的障碍，使同一种化疗药物在不同个体中具有不同的治疗效果及预后。
肿瘤的异质性对靶向药物疗效和复发起着至关重要的作用，靶向药物可以选择性的杀伤靶分子依赖性的肿瘤细胞，造成肿瘤细胞群体上的失衡，肿瘤细胞可以通过基因突变和蛋白表达水平的改变，加速克隆选择，达到逃避靶向药物杀伤的目的。肿瘤的异质性不仅是细胞类型的多样性，还表现在生长调控途径的多样性。一小部分的肿瘤细胞依赖单一信号通路，而许多乳腺癌细胞存在多个并存的信号通路，并可能形成相互交联的信号网络。因此，仅仅依赖单一靶向药物，很难治愈异质性乳腺癌，达到治疗的目的。
乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，而且发病率呈逐年上升的趋势，严重威胁着女性的身体健康和生活质量。作为严重危害女性身心健康的恶性肿瘤，乳腺癌的发病率在我国女性恶性肿瘤中居首位。目前，乳腺癌的治疗主要通过外科手术、内分泌治疗、化疗、放疗等手段，然而由于乳腺癌的异质性，使得治疗效果与预后不尽人意。针对乳腺癌发生、发展有关的信号通路进行靶向药物的开发与临床应用成为乳腺癌治疗研究的新热点。
随着分子生物学技术的发展和对发病机制从细胞、分子水平的进一步认识，乳腺癌治疗进入了一个全新分子靶向治疗时代。与全身、广泛性的化疗、放疗相比，靶向治疗具有高效、选择性地杀伤乳腺癌细胞，能减少对正常组织损伤，不良反应小等优点。针对肿瘤在器官组织、分子水平的靶点不同，可以使用不同的靶向治疗技术进行靶点治疗。局部的病灶靶点可以用局部靶向消融治疗、靶向放射治疗、放射性粒子植入靶向内照射治疗、高能聚焦超声治疗、血管内介入治疗和局部药物注射治疗。分子靶向治疗的靶点是针对肿瘤细胞的恶性表型分子，作用于促进肿瘤生长、存活的特异性细胞受体、信号传导等通道，新生血管形成和细胞周期的调节，实现抑制肿瘤细胞生长或促进凋亡的抗肿瘤作用。与传统细胞毒化疗不同，肿瘤分子靶向治疗具有特异性抗肿瘤作用，并且毒性明显减少，开创了肿瘤化疗的新领域。
但是，目前乳腺癌细胞的靶向治疗主要集中于乳腺癌干细胞靶向、抗体介导的靶向与微载体介导的靶向。但是由于肿瘤细胞存在异质性以及对化疗药物的耐药性，严重影响了治疗效果与患者预后。本发明中，我们汲取了前人的研究经验，接枝多种乳腺癌细胞特异性配体，可以靶向多种乳腺癌细胞，治疗多种类型乳腺癌患者。同时，我们利用了原花青素可以逆转肿瘤细胞的耐药机制，增强化疗药物对乳腺癌细胞的治疗效果。我们的研究可能会给乳腺癌的治疗带来新的理论支持。
发明内容
本发明的第一个目的是为了克服现有技术的不足，提供一种抑制乳腺癌的靶向纳米粒子。
本发明的第二个目的是为了克服现有技术的不足，提供所述的靶向纳米粒子的制备方法。
本发明的第三个目的是为了克服现有技术的不足，提供所述的制备方法制备得到的抑制乳腺癌的靶向纳米粒子。
本发明的第四个目的是为了克服现有技术的不足，提供所述的纳米粒子在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
本发明的第五个目的是为了克服现有技术的不足，提供一种治疗乳腺癌药物。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种抑制乳腺癌的靶向纳米粒子，所述靶向纳米粒子是由原花青素、儿茶素、阿霉素和卵磷脂经修饰后脱水缩合后接枝乳腺癌特异性抗体得到。
阿霉素类药物是目前临床上治疗乳腺癌最常用的药物，其在乳腺癌术后辅助化疗、新辅助化疗及复发转移的解救化疗中均发挥着重要作用。
儿茶素对端粒酶有很强的抑制活性，其中以表没食子儿茶素没食子酸酯最强，表儿茶素没食子酸酯次之，没食子儿茶素和表儿茶素也有一定的抑制活性。
原花青素对多种癌细胞如乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、皮肤癌细胞等都具有不同程度的抑制作用，原花青素能选择性诱导人类乳腺癌细胞凋亡。
磷脂酰胆碱，俗称卵磷脂，是自然界中广泛分布的甘油磷脂和所有细胞中存在的神经鞘脂的统称，是一种以磷酸基为亲水基团的生物表面活性剂。磷脂酰胆碱是疏水性的，有助于纳米粒子的合成；同时，磷脂酰胆碱是细胞膜的组分之一，可以有助于纳米粒子进入癌细胞。
优选地，所述儿茶素为表没食子儿茶素没食子酸酯，表儿茶素没食子酸酯，没食子儿茶素和表儿茶素中的一种或几种的混合物。
更优选地，所述儿茶素为表没食子儿茶素没食子酸酯。
优选地，所述乳腺癌特异性抗体为雌激素受体的抗体、孕激素受体的抗体或人表皮生长因子受体的抗体中的一种或几种的混合物。
优选地，乳腺癌特异性抗体为雌激素受体的抗体、孕激素受体的抗体或人表皮生长因子受体3种。
本发明中，接枝多种乳腺癌细胞特异性配体，可以靶向多种乳腺癌细胞，治疗多种类型乳腺癌患者。同时，利用了原花青素可以逆转肿瘤细胞的耐药机制，增强化疗药物对乳腺癌细胞的治疗效果。
所述的靶向纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1. 阿霉素经过羧基化处理得到羧基化的阿霉素；
S2. 原花青素与卵磷脂酯化反应，得到PC-PA；
S3. 表没食子儿茶素没食子酸酯与羧基化的阿霉素脱水缩合，得到DOX-EGCG；
S4. 将步骤S2的PC-PA和S3的DOX-EGCG混合反应合成得到纳米粒子PC-PA-DOX-EGCG；
S5. 在纳米粒子PC-PA-DOX-EGCG上接枝乳腺癌特异性抗体，即得靶向纳米粒子。
优选地，步骤S1的具体操作为：取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，草酸，混合搅拌后，加入阿霉素，室温搅拌离心，收集上清液，使用乙酸乙酯进行萃取，干燥后得到橙色的晶体；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：草酸：阿霉素（V/W/W/W/W）=（6～10）：（18～22）：（1.8～2.2）：（9～11）：（0.9～1.1） 。
更优选地，步骤S1的具体操作为：取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，草酸，混合搅拌20～40 min后，加入1 mg/ml的阿霉素，室温搅拌2～4 h后4500～5500 rpm离心8～12 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入1.5～2.5倍体积的乙酸乙酯，萃取2～4次，收集乙酸乙酯，使用透析10～14 h，冷冻干燥，得到橙色的晶体；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：草酸：阿霉素（V/W/W/W/W）=8：20：2：10：1。
优选地，步骤S2的具体操作为：取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，原花青素，混合搅拌，再加入卵磷脂，室温搅拌，离心，收集上清液，使用乙酸乙酯进行萃取，干燥后得到褐色粉末PC-PA；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：花青素：卵磷脂（V/W/W/W/W）=（3～5）：（9～11）：（0.9～1.1）：（2.7～3.3）：（4.5～5.5）。
更优选地，步骤S2的具体操作为：取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，原花青素，混合搅拌20～40 min，再加入卵磷脂，用磁力搅拌器室温搅拌2～4h，4500～5500 rpm离心8～12 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入1.5～2.5体积的乙酸乙酯，萃取2～4次，使用透析10～14 h，冷冻干燥，得到褐色粉末PC-PA；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：花青素：卵磷脂（V/W/W/W/W）=4：10：1：3：5。
优选地，步骤S3的具体操作为：取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，表没食子儿茶素没食子酸酯，羧基化的阿霉素，室温搅拌，离心，收集上清液，使用乙酸乙酯进行萃取，后得到褐色粉末DOX-EGCG；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：表没食子儿茶素没食子酸酯：羧基化的阿霉素（V/W/W/W/W）=（3～5）：（9～11）：（0.9～1.1）：（4.5～5.5）：（1.8～2.2）。
更优选地，步骤S3的具体操作为：取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶
，表没食子儿茶素没食子酸酯，羧基化的阿霉素, 用磁力搅拌器室温搅拌2～4 h，收集反应液到离心管中，4500～5500 rpm离心8～12 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入1.5～2.5体积的乙酸乙酯，萃取2～4次，使用透析10～14 h，冷冻干燥，得到褐色粉末DOX-EGCG；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：表没食子儿茶素没食子酸酯：羧基化的阿霉素（V/W/W/W/W）=4：10：1：5：2。
优选地，步骤S4的具体操作为：取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，步骤S2的产物PC-PA粉末，步骤S3的产物DOX-EGCG粉末，室温搅拌，离心，收集上清液，使用乙酸乙酯进行萃取，干燥后得到褐色粉末PC-PA-DOX-EGCG，即NP；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：步骤S2的产物PC-PA粉末：步骤S3的产物DOX-EGCG粉末（V/W/W/W/W）=（3～5）：（9～11）：（0.9～1.1）：（4.5～5.5）：（1.8～2.2）。
更优选地，步骤S4的具体操作为：取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，步骤S2的产物PC-PA粉末，步骤S3的产物DOX-EGCG粉末，用磁力搅拌器室温搅拌2～4 h，收集反应液到离心管中，4500～5500 rpm离心8～12 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入1.5～2.5体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析10～14 h，冷冻干燥，得到褐色粉末PC-PA-DOX-EGCG，即NP；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：步骤S2的产物PC-PA粉末：步骤S3的产物DOX-EGCG粉末（V/W/W/W/W）=4：10：1：5：2。
优选地，步骤S5的具体操作为：取步骤S4的产物NP粉末，加入二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺，室温活化后进行浓缩，再依次加入雌激素受体的抗体、人表皮生长因子受体的抗体或孕激素受体的抗体的一种或几种的混合物，冰浴搅拌，即得靶向纳米粒子悬液，冻干保存备用；其中，NP粉末：二氯乙烷：N-羟基琥珀酰亚胺：抗体（W/W/W/W）=（2.7～3.3）：（0.45～0.55）：（0.45～0.55）：（0.009～0.011）。
更优选地，步骤S5的具体操作为：取步骤S4的产物NP粉末，加入50 mg/ml 的二氯乙烷和50 mg/ml 的N-羟基琥珀酰亚胺，室温活化20～40 min后，使用透析袋透析10～14h，浓缩后再加入1 mg/m1雌激素受体的抗体、孕激素受体的抗体或人表皮生长因子受体的抗体的一种或几种的混合物，冰浴搅拌10～14 h，即得靶向纳米粒子悬液，冻干保存备用；其中，NP粉末：二氯乙烷：N-羟基琥珀酰亚胺：抗体（W/W/W/W）=3：0.5：0.5：0.01。
最优选地，所述纳米粒子其制备过程包括以下步骤：
S1. 取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，草酸，混合搅拌30min后，加入1 mg/ml的阿霉素，室温搅拌3 h后5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2倍体积的乙酸乙酯，萃取3次，收集乙酸乙酯，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到橙色的晶体；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：草酸：阿霉素（V/W/W/W/W）=8：20：2：10：1；
S2. 取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，原花青素，混合搅拌30 min，再加入卵磷脂，用磁力搅拌器室温搅拌3h，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末PC-PA；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：花青素：卵磷脂（V/W/W/W/W）=4：10：1：3：5；
S3. 取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，表没食子儿茶素没食子酸酯，羧基化的阿霉素, 用磁力搅拌器室温搅拌3 h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末DOX-EGCG；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：表没食子儿茶素没食子酸酯：羧基化的阿霉素（V/W/W/W/W）=4：10：1：5：2；
S4. 取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，步骤S2的产物PC-PA粉末，步骤S3的产物DOX-EGCG粉末，用磁力搅拌器室温搅拌3 h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末PC-PA-DOX-EGCG，即NP；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：步骤S2的产物PC-PA粉末：步骤S3的产物DOX-EGCG粉末（V/W/W/W/W）=4：10：1：5：2；
S5. 取步骤S4的产物NP粉末，加入50 mg/ml 的二氯乙烷和50 mg/ml 的N-羟基琥珀酰亚胺，室温活化30 min后，使用透析袋透析12 h，浓缩后再加入1 mg/m1再依次加入雌激素受体的抗体、人表皮生长因子受体的抗体和孕激素受体的抗体，冰浴搅拌12 h，即得靶向纳米粒子悬液，冻干保存备用；其中，NP粉末：二氯乙烷：N-羟基琥珀酰亚胺：抗体（W/W/W/W）=3：0.5：0.5：0.01。
所述的制备方法制备得到的抑制乳腺癌的靶向纳米粒子也属于本发明的保护范围。
所述的靶向纳米粒子在制备治疗乳腺癌药物中的应用也属于本发明的保护范围。
一种治疗乳腺癌药物，含有所述的靶向纳米粒子，也属于本发明的保护范围。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明中，原花青素（PA）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、阿霉素（DOX）和卵磷脂（PC）经修饰后脱水缩合得到两亲性的纳米粒子。随后接枝乳腺癌特异性抗体为雌激素受体的抗体（anti-ER）、孕激素受体的抗体（anti-PR）和人表皮生长因子受体的抗体（anti-HER2），制备靶向纳米粒子。
通过红外光谱、紫外吸收检测、粒径检测与Zeta电位等表征，结果表明成功合成天然纳米粒子，并具有良好的稳定性。靶向纳米粒子的粒径在100nm左右，并且粒子具有良好的分散性与均一性。靶向纳米粒子作用于乳腺癌细胞MCF-7，纳米粒子可以有效的抑制乳腺癌细胞的生长与迁移，接枝乳腺癌细胞特异性配体后，靶向纳米粒子具有更好的作用效果。发现靶向纳米粒子对乳腺癌细胞具有显著的杀伤作用，表明靶向纳米粒子对乳腺癌的治疗是有效的。纳米粒子有明显的抑制乳腺癌细胞生长的效果，可以抑制多种乳腺癌，为乳腺癌的精准化个体化综合治疗和靶向药物治疗临床治疗提供了新的思路。
本法的靶向纳米粒子制备过程简单，其具有较好的稳定性、分散性以及均一性的特点，实现了天然药物、合成药物与生物靶向的有机结合，而且具有良好的细胞穿透性，最重要的是具有极强的特异性靶向能力，构成了一种新型的抑制乳腺癌细胞生长的治疗系统。在提高靶向治疗肿瘤的同时，还能降低药物的不良反应。它的这些特性对临床上肿瘤靶向治疗提供了一个新的发展方向，可以进一步推动纳米载体给药系统的发展。本发明的研究可能会给乳腺癌的治疗带来新的理论支持。
附图说明
图1为粒子合成示意图；PA：原花青素，PC：卵磷脂，EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯，DOX：阿霉素，ER：雌激素受体的单克隆抗体，PR：孕激素受体的单克隆抗体，HER2：人表皮生长因子受体的单克隆抗体，NP：纳米粒子，NP-ER-HER2-PR：靶向纳米粒子。
图2为纳米粒子傅里叶红外图谱；PA：原花青素，EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯，PC：卵磷脂，NP：纳米粒子。
图3为纳米粒子紫外吸收图谱；PA：原花青素，EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯，PC：卵磷脂，DOX：阿霉素，NP：纳米粒子。
图4为纳米粒子粒径分布图；PA-PC：原花青素与卵磷脂复合物；EGCG-DOX： 表没食子儿茶素没食子酸酯与羧基化阿霉素复合物；NP，NP-ER，NP-ER-HER2， NP-ER-HER2-PR：为各种纳米粒子。
图5为纳米粒子透射电子显微镜观察图；NP，NP-ER，NP-ER-HER2，NP-ER-HER2-PR：为各种纳米粒子。
图6为纳米粒子组分与纳米粒子对乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性结果； PA：原花青素；PC：卵磷脂；EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；NP，NP-ER，NP-ER-HER2，NP-ER-HER2-PR：为各种纳米粒子。
图7为靶向纳米粒子作用于MCF-7的死活细胞染色；NP，NP-ER，NP-ER-HER2，NP-ER-HER2-PR：为各种纳米粒子。
图8为靶向纳米粒子作用于MCF-7的细胞迁移效果；NP，NP-ER，NP-ER-HER2，NP-ER-HER2-PR：为各种纳米粒子。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下实施例中所使用的材料、试剂与仪器来源如下：
（1）细胞株：人乳腺癌细胞(MCF-7细胞株）由中国科学院深圳先进技术研究院赠送，经本实验室扩大培养并保种。
（2）试剂：花青素，表没食子儿茶素没食子酸酯，卵磷脂，阿霉素购自上海源叶有限公司；胰酶、低糖DMEM培养基均为Gibco公司产品；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；24孔与96孔聚苯乙烯组织培养板为美国Corning康宁公司产品；雌激素受体的抗体（anti-ER）、孕激素受体的抗体（anti-PR）或人表皮生长因子受体的抗体（anti-HER2），均从万类生物科技有限公司购买的多克隆抗体。
（3）仪器：Nikon显微镜，Sigma32184高速冷冻离心机，日本Olympus公司光学倒置显微镜，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，Thermo CO2培养箱，HV-85 高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。
实施例1 一种抑制乳腺癌的靶向纳米粒子的制备
1、制备方法
（1）阿霉素的羧基化：
量取4 ml的二甲基甲酰胺（DMF），加入烧杯中，称取10 mg的二环己基碳二亚胺（DCC），1 mg的4-二甲氨基吡啶（DMAP），5 mg的草酸，混合搅拌30 min，加入500μl 1mg/ml的阿霉素（DOX），用磁力搅拌器室温搅拌3 h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，收集乙酸乙酯层，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到橙色的晶体，即为羧基化的阿霉素。
（2）原花青素与卵磷脂酯化反应
量取4 ml的DMF，加入烧杯中，称取10 mg的DCC，1 mg的DMAP，称取3 mg的原花青素（PA），混合搅拌30 min，再加入5 mg的卵磷脂（PC），用磁力搅拌器室温搅拌3h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末PC-PA。
（3）表没食子儿茶素没食子酸酯与阿霉素脱水缩合
量取4 ml的DMF，加入烧杯中，称取10 mg的DCC，1 mg的DMAP，称取5 mg的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），再加入2 mg羧基化的阿霉素，用磁力搅拌器室温搅拌3 h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末DOX-EGCG。
（4）合成纳米粒子PC-PA-DOX-EGCG
量取4 ml的DMF，加入烧杯中，称取10 mg的DCC，1 mg的DMAP，称取5 mg的PC-PA粉末，再加入2 mg DOX-EGCG粉末，用磁力搅拌器室温搅拌3 h，收集反应液到离心管中，5000rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末PC-PA-DOX-EGCG。
（5）接枝抗体制备靶向纳米粒子
精密称量上述PC-PA-DOX-EGCG（即NP）悬液3 mg，加入50mg/ml二氯乙烷溶液（EDC溶液）和50mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺溶液（NHS溶液）各0.01 ml，室温活化30 min后，使用透析袋透析12 h，浓缩后再依次分别加入anti-ER，anti-PR，anti-HER2溶液各(1 mg/m1)0.011 ml，冰浴搅拌12 h，即得靶向纳米粒子悬液，冻干保存备用。只加入anti-ER，制备得到靶向纳米粒子NP-ER；依次加入anti-ER和anti-HER2，制备得到靶向纳米粒子NP-ER-HER2；依次加入anti-ER，anti-HER2和anti-PR制备得到靶向纳米粒子NP-ER-HER2-PR。
2、结果
原花青素与卵磷脂在4-二甲氨基吡啶（DMAP）的催化下，脱水缩合形成复合物PC-PA；与阿霉素在DMAP的催化下与草酸连接起来，随后与表没食子儿茶素没食子酸酯反应，得到化合物DOX-EGCG；最后PC-PA与DOX-EGCG反应得到一种两亲性的纳米小分子（PC-PA-DOX-EGCG，NP），并与乳腺癌细胞特异性配体anti-ER，anti-PR，anti-HER2通过酯化反应连接起来，成功构建了新型靶向纳米粒子NP-ER，NP-ER-HER2与NP-ER-HER2-PR。靶向纳米粒子的具体合成过程如图1所示。
实施例2 一种抑制乳腺癌的靶向纳米粒子的制备
1、制备方法
（1）阿霉素的羧基化：
量取3 ml的二甲基甲酰胺（DMF），加入烧杯中，称取9 mg的二环己基碳二亚胺（DCC），0.9 mg的4-二甲氨基吡啶（DMAP），4.5 mg的草酸，混合搅拌30 min，加入450μl 1mg/ml的阿霉素（DOX），用磁力搅拌器室温搅拌3 h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，收集乙酸乙酯层，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到橙色的晶体，即为羧基化的阿霉素。
（2）原花青素与卵磷脂酯化反应
量取3 ml的DMF，加入烧杯中，称取9 mg的DCC，0.9 mg的DMAP，称取2.7 mg的原花青素（PA），混合搅拌30 min，再加入4.5 mg的卵磷脂（PC），用磁力搅拌器室温搅拌3h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末PC-PA。
（3）表没食子儿茶素没食子酸酯与阿霉素脱水缩合
量取3 ml的DMF，加入烧杯中，称取9 mg的DCC，0.9 mg的DMAP，称取4.5 mg的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），再加入1.8 mg羧基化的阿霉素，用磁力搅拌器室温搅拌3h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末DOX-EGCG。
（4）合成纳米粒子PC-PA-DOX-EGCG
量取3 ml的DMF，加入烧杯中，称取9 mg的DCC，0.9 mg的DMAP，称取4.5 mg的PC-PA粉末，再加入1.8 mg DOX-EGCG粉末，用磁力搅拌器室温搅拌3 h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末PC-PA-DOX-EGCG。
（5）接枝抗体制备靶向纳米粒子
精密称量上述PC-PA-DOX-EGCG（即NP）悬液2.7 mg，加入50mg/ml二氯乙烷溶液（EDC溶液）和50mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺溶液（NHS溶液）各0.09ml，室温活化30 min后，使用透析袋透析12 h，浓缩后再依次分别加入anti-ER，anti-PR，anti-HER2溶液各(1 mg/m1)0.009 ml，冰浴搅拌12 h，即得靶向纳米粒子悬液，冻干保存备用。只加入anti-ER，制备得到靶向纳米粒子NP-ER；依次加入anti-ER和anti-HER2，制备得到靶向纳米粒子NP-ER-HER2；依次加入anti-ER，anti-HER2和anti-PR制备得到靶向纳米粒子NP-ER-HER2-PR。
2、结果
原花青素与卵磷脂在4-二甲氨基吡啶（DMAP）的催化下，脱水缩合形成复合物PC-PA；与阿霉素在DMAP的催化下与草酸连接起来，随后与表没食子儿茶素没食子酸酯反应，得到化合物DOX-EGCG；最后PC-PA与DOX-EGCG反应得到一种两亲性的纳米小分子（PC-PA-DOX-EGCG，NP），并与乳腺癌细胞特异性配体anti-ER，anti-PR，anti-HER2通过酯化反应连接起来，成功构建了新型靶向纳米粒子NP-ER，NP-ER-HER2与NP-ER-HER2-PR。靶向纳米粒子的具体合成过程如图1所示。
实施例3 一种抑制乳腺癌的靶向纳米粒子的制备
1、制备方法
（1）阿霉素的羧基化：
量取5 ml的二甲基甲酰胺（DMF），加入烧杯中，称取11 mg的二环己基碳二亚胺（DCC），1.1 mg的4-二甲氨基吡啶（DMAP），5.5 mg的草酸，混合搅拌30 min，加入550μl 1mg/ml的阿霉素（DOX），用磁力搅拌器室温搅拌3 h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，收集乙酸乙酯层，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到橙色的晶体，即为羧基化的阿霉素。
（2）原花青素与卵磷脂酯化反应
量取5 ml的DMF，加入烧杯中，称取11 mg的DCC，1.1 mg的DMAP，称取3.3 mg的原花青素（PA），混合搅拌30 min，再加入5.5 mg的卵磷脂（PC），用磁力搅拌器室温搅拌3h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末PC-PA。
（3）表没食子儿茶素没食子酸酯与阿霉素脱水缩合
量取5 ml的DMF，加入烧杯中，称取11 mg的DCC，1.1 mg的DMAP，称取5.5 mg的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），再加入2.2 mg羧基化的阿霉素，用磁力搅拌器室温搅拌3h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末DOX-EGCG。
（4）合成纳米粒子PC-PA-DOX-EGCG
量取5 ml的DMF，加入烧杯中，称取11 mg的DCC，1.1 mg的DMAP，称取5.5 mg的PC-PA粉末，再加入2.2 mg DOX-EGCG粉末，用磁力搅拌器室温搅拌3 h，收集反应液到离心管中，5000 rpm离心10 min，收集上清液，加入5～7倍体积的水，震荡摇匀，加入2体积的乙酸乙酯，萃取3次，使用透析袋透析12 h，冷冻干燥，得到褐色粉末PC-PA-DOX-EGCG。
（5）接枝抗体制备靶向纳米粒子
精密称量上述PC-PA-DOX-EGCG（即NP）悬液3.3 mg，加入50mg/ml二氯乙烷溶液（EDC溶液）和50mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺溶液（NHS溶液）各0.011 ml，室温活化30 min后，使用透析袋透析12 h，浓缩后再依次分别加入anti-ER，anti-PR，anti-HER2溶液各(1 mg/m1) 0.011 ml，冰浴搅拌12 h，即得靶向纳米粒子悬液，冻干保存备用。只加入anti-ER，制备得到靶向纳米粒子NP-ER；依次加入anti-ER和anti-HER2，制备得到靶向纳米粒子NP-ER-HER2；依次加入anti-ER，anti-HER2和anti-PR制备得到靶向纳米粒子NP-ER-HER2-PR。
2、结果
原花青素与卵磷脂在4-二甲氨基吡啶（DMAP）的催化下，脱水缩合形成复合物PC-PA；与阿霉素在DMAP的催化下与草酸连接起来，随后与表没食子儿茶素没食子酸酯反应，得到化合物DOX-EGCG；最后PC-PA与DOX-EGCG反应得到一种两亲性的纳米小分子（PC-PA-DOX-EGCG，NP），并与乳腺癌细胞特异性配体anti-ER，anti-PR，anti-HER2通过酯化反应连接起来，成功构建了新型靶向纳米粒子NP-ER，NP-ER-HER2与NP-ER-HER2-PR。靶向纳米粒子的具体合成过程如图1所示。
实施例4 抑制乳腺癌的靶向纳米粒子的表征
1、红外光谱检测
（1）操作：
将实施例1制备得到的PA、PC、EGCG、DOX、PC-PA、DOX-EGCG与PC-PA-DOX-EGCG进行干燥处理，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2 μm，避免散射光的影响，放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用10 MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，上机测定。
（2）结果：
红外光谱法是一种根据分子内部原子间的相对振动和分子转动等信息来确定物质分子结构和鉴别化合物的分析方法。图2是利用傅立叶转换红外光谱仪对相应反应物和产物表征的红外谱图。谱图PA在2853 cm-1、2825 cm-1的吸收峰，是原花青素中-OH的伸缩振动；谱图PC在2854 cm-1的吸收峰，是卵磷脂中C-H的伸缩振动；在1091 cm-1的吸收峰，是卵磷脂中脂键C-O的伸缩振动；谱图EGCG在1610 cm-1、1028 cm-1的吸收峰，是表没食子儿茶素没食子酸酯中的脂键C-O伸缩振动；谱图DOX在2928 cm-1的吸收峰，是阿霉素中的羟基-OH伸缩振动；谱图PC-PA在1213 cm-1处的吸收峰，是原花青素与卵磷脂复合物中脂键C-O的伸缩振动；谱图EGCG-DOX在1567 cm-1的吸收峰，是纳米粒子中肽键-CONH的伸缩振动；谱图NP在1563 cm-1处的吸收峰，是表没食子儿茶素没食子酸酯与阿霉素复合物中肽键-CONH的伸缩振动，1213 cm-1的吸收峰，是纳米粒子中中C=O的伸缩振动谱图NP在1563 cm-1处的吸收峰，是纳米粒子中肽键-CONH的伸缩振动，1213 cm-1的吸收峰，是纳米粒子中中=O的伸缩振动，表明酯化反应是成功的，四种化学小分子被成功连接起来，得到一种新的纳米粒子。
实施例2和实施例3制备得到的靶向纳米粒子也有相同的检测结果。
2、紫外可见光谱检测
（1）操作：
通过紫外可见分光光度计，在190-900 nm的波长范围内对样品进行扫描，可以获得样品在这个波长范围内的最大吸收波长。以分散剂水为参比液，分别取适量的将实施例1制备得到的PA、DOX、EGCG、PC、PC-PA、DOX-EGCG与PC-PA-DOX-EGCG样品于比色皿中，在190-900 nm的范围内进行光谱扫描检测。
（2）结果：
紫外吸收是利用物质的分子或离子对紫外和可见光的吸收所产生的紫外可见光谱及吸收程度可以对物质的组成、含量和结构进行分析、测定、推断。不同化学小分子含有不同官能团，吸收的波长不一样。如图3所示，原花青素的吸收波长在511 nm左右，卵磷脂的吸收波长在423 nm左右，表没食子儿茶素没食子酸酯的吸收波长在374 nm左右，阿霉素的吸收波长在477 nm左右。从谱图NP中我们可以比较明了的看到在相应接枝的波长处出现的紫外吸收峰，由此可以表明后均已接枝成功。
实施例2和实施例3制备得到的靶向纳米粒子也有相同的检测结果。
3、粒径检测
（1）操作：
取将实施例1制备得到的PC-PA、DOX-EGCG、PC-PA-DOX-EGCG，以及靶向纳米粒子，溶于去离子水中，超声5 min，吸取上清液100 μl加入样品池中，打开相应测量软件进行测量，并进行分析。
（2）结果：
图4是通过动态光衍射测得的纳米粒子的粒径大小分布图，图中PA与PC偶联得到的复合物PA-PC的平均粒径在3.5 nm左右，DOX与EGCG偶联得到的复合物DOX-EGCG的平均粒径在6.3 nm左右，复合物PA-PC与DOX-EGCG偶联得到纳米粒子PA-PC-DOX-EGCG（NP）的平均粒径在23 nm左右，并且具有很好的均一性。而接枝乳腺癌细胞特异性配体anti-ER，anti-PR，anti-HER2后，靶向纳米粒子的粒径明显变大。接枝一种配体，NP-ER的平均粒径在75 nm左右；接枝两种配体，NP-ER-HER2的平均粒径在98 nm左右；接枝三种配体，靶向纳米粒子NP-ER-HER2-PR的平均粒径在115 nm左右。由此可见，纳米粒子的合成是成功的，并成功接枝了乳腺癌细胞特异性配体，而且具有良好的均一性。
实施例2和实施例3制备得到的靶向纳米粒子也有相同的检测结果。
4、透射电子显微镜检测
（1）操作：
将靶向纳米粒子悬浮于超纯水中，将溶液滴在透射电镜专用铜网的石蜡膜上，溶剂挥发出去，透射电镜（TEM，JEM-2100HR，200keV，Japan）测定靶向纳米粒形貌。
（2）结果：
图5是通过透射电子显微镜观察的纳米粒子及靶向纳米粒子形貌图，图中纳米粒子PA-PC-DOX-EGCG（NP）的平均粒径在40 nm左右，呈现不规则的外形，粒子呈现出双层结构。而接枝乳腺癌细胞特异性配体anti-ER，anti-PR，anti-HER2后，靶向纳米粒子NP-ER、NP-ER-HER2与NP-ER-HER2-PR的粒径明显变大。粒子呈现出一种规则的球形结构，并具有均一稳定的结构，由此可见，纳米粒子的合成是成功的，并成功接枝了乳腺癌细胞特异性配体，而且具有良好的均一性与分散性。
实施例2和实施例3制备得到的靶向纳米粒子也有相同的检测结果。
实施例5 抑制乳腺癌的靶向纳米粒子对乳腺癌MCF7细胞生长的体外抑制
1、细胞培养
人乳腺癌细胞(MCF-7细胞株）由中国科学院深圳先进技术研究院提供。乳腺癌细胞在培养瓶中融合培养至80%后，胰酶消化2 min，加4 ml培养液吹打细胞。以3×104/孔的密度接种到24孔板中，培养24 h。以进行后续实验。其它细胞培养条件为：含10%新生牛血清的高糖DMEM培养基，37℃，5.0% CO2恒温恒湿培养箱培养。
2、MTT检测细胞毒性
（1）操作：
从培养箱中取出培养好的细胞，胰酶消化2 min，加4 ml培养液吹打细胞。以3×104/孔的密度接种到96孔板中，使细胞贴壁培养12 h。取出培养好的细胞，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，加入新鲜培养基。加将实施例1制备得到的靶向纳米粒子NP-ER，NP-ER-HER2，NP-ER-HER2-PR孵育24 h与48 h。提前4 h加入MTT溶液20 μl，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，每孔加入100 μL的二甲基亚枫（DMSO），静置10 min，酶标仪检测490 nm吸光值。使用SPSS数据处理软件处理数据。
（2）结果：
为了更加客观地评价靶向纳米粒子对乳腺癌细胞的作用效果，MTT法被用来检测纳米粒子的细胞毒性。从图6中可以看出，使用1 μg/mL的PA、PC、EGCG、NP、NP-ER、NP-ER-HER2与NP-ER-HER2-PR作用于MCF-7细胞，分别孵育12 h与24 h。如图所示，与对照组相比，MCF-7细胞的存活率逐渐降低。卵磷脂对乳腺癌细胞MCF-7基本没有杀伤作用，原花青素与茶多酚对乳腺癌细胞有轻微的杀伤作用，纳米粒子NP对乳腺癌细胞具有明显的杀伤作用，并且随着时间的增长，对乳腺癌细胞MCF-7的杀伤效果呈上升趋势。而接枝乳腺癌细胞特异性配体anti-ER，anti-PR与anti-HER2后，与单独纳米粒子相比，靶向纳米粒子NP-ER、NP-ER-HER2与NP-ER-HER2-PR对乳腺癌细胞MCF-7具有更好的杀伤效果。而且随着时间的延长，靶向纳米粒子具有更好的杀伤效果。表明接枝配体后，纳米粒子可以有效地靶向乳腺癌细胞，发挥更好的作用效果。为乳腺癌的治疗提供了很好的理论基础。
实施例2和实施例3制备得到的靶向纳米粒子也有相同的检测结果。
3、死活细胞染色
（1）操作：
从培养箱中取出培养好的细胞，以3×104/孔的密度接种到24孔板中，使细胞贴壁培养24h。取出培养好的细胞，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，加入1 μmol/L将实施例1制备得到的NP，NP-ER，NP-ER-HER2，NP-ER-HER2-PR孵育24 h，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，在黑暗条件下使用死活细胞染色试剂盒染色，使用荧光显微镜拍照。
（2）结果：
为了更加客观地评价靶向纳米粒子对乳腺癌细胞的作用效果，MTT法被用来检测纳米粒子的细胞毒性。从图7中可以看出，使用1 μg/mL的NP、NP-ER、NP-ER-HER2与NP-ER-HER2-PR分别作用于乳腺癌细胞MCF-7，孵育24 h后，使用死活细胞荧光染色试剂盒染色，与对照组相比，纳米粒子NP处理的乳腺癌细胞，死细胞数明显上升，表明纳米粒子对乳腺癌细胞具有很好的的杀伤效果。而接枝乳腺癌细胞特异性配体anti-ER，anti-PR与anti-HER2后，与单独纳米粒子相比，靶向纳米粒子NP-ER、NP-ER-HER2与NP-ER-HER2-PR处理的乳腺癌细胞，死细胞数更多，靶向纳米粒子具有更好的杀伤效果。表明接枝配体后，纳米粒子可以有效地靶向乳腺癌细胞，发挥更好的作用效果。为乳腺癌的治疗提供了很好的理论基础。
实施例2和实施例3制备得到的靶向纳米粒子也有相同的检测结果。
4、细胞迁移检测
（1）操作：
从培养箱中取出培养好的细胞，胰酶消化2 min，加4 ml培养液吹打细胞。以3×104/孔的密度接种到24孔板中，使细胞贴壁培养24 h。取出培养好的细胞，用10 μL的移液枪头笔直的在培养板底部画一条直线，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，加入1 μmol/L将实施例1制备得到的靶向纳米粒子NP-ER，NP-ER-HER2，NP-ER-HER2-PR孵育24 h，吸去细胞废液，加PBS洗两遍，在培养箱中继续培养12与24 h，吸去废液，PBS洗两遍。使用显微镜拍照。
（2）结果：
细胞划痕法是间接测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板上培养的单层贴壁细胞细胞上，用微量枪头在细胞生长的中间区域划线，去除中央部分的细胞。使用1 μg/mL的NP、NP-ER、NP-ER-HER2与NP-ER-HER2-PR分别作用于乳腺癌细胞MCF-7，继续培养细胞到12h与24h。从图8可以观察到与对照组相比，纳米粒子NP处理的细胞迁移到至中央划痕区的明显减少。接枝乳腺癌细胞特异性配体anti-ER，anti-PR与anti-HER2后，与单独纳米粒子相比，靶向纳米粒子NP-ER、NP-ER-HER2与NP-ER-HER2-PR处理的乳腺癌细胞迁移更少，作用24 h后，乳腺癌细胞的形态明显发生改变，细胞数目明显减少。纳米粒子可以有效的抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移，并且可以有效地杀伤乳腺癌细胞。
实施例2和实施例3制备得到的靶向纳米粒子也有相同的检测结果。

Claims (4)

1.一种抑制乳腺癌的靶向纳米粒子，其特征在于，所述靶向纳米粒子是由原花青素、儿茶素、阿霉素和卵磷脂经修饰后脱水缩合后接枝乳腺癌特异性抗体得到；
所述儿茶素为表没食子儿茶素没食子酸酯；乳腺癌特异性抗体为雌激素受体的抗体、孕激素受体的抗体或人表皮生长因子受体；
所述靶向纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
S1. 阿霉素经过羧基化处理得到羧基化的阿霉素；
S2. 原花青素与卵磷脂酯化反应，得到PC-PA；
S3. 表没食子儿茶素没食子酸酯与羧基化的阿霉素脱水缩合，得到DOX-EGCG；
S4. 将步骤S2的PC-PA和S3的DOX-EGCG混合反应合成得到纳米粒子PC-PA-DOX-EGCG；
S5. 在纳米粒子PC-PA-DOX-EGCG上接枝乳腺癌特异性抗体，即得靶向纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的靶向纳米粒子，其特征在于，制备过程包括以下步骤：
S1. 取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，草酸，混合搅拌后，加入阿霉素，室温搅拌离心，收集上清液，使用乙酸乙酯进行萃取，干燥后得到橙色的晶体；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：草酸：阿霉素（V/W/W/W/W）=（6～10）：（18～22）：（1.8～2.2）：（9～11）：（0.9～1.1）；
S2. 取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，原花青素，混合搅拌，再加入卵磷脂，室温搅拌，离心，收集上清液，使用乙酸乙酯进行萃取，干燥后得到褐色粉末PC-PA；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：花青素：卵磷脂（V/W/W/W/W）=（3～5）：（9～11）：（0.9～1.1）：（2.7～3.3）：（4.5～5.5）；
S3. 取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，表没食子儿茶素没食子酸酯，羧基化的阿霉素，室温搅拌，离心，收集上清液，使用乙酸乙酯进行萃取，后得到褐色粉末DOX-EGCG；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：表没食子儿茶素没食子酸酯：羧基化的阿霉素（V/W/W/W/W）=（3～5）：（9～11）：（0.9～1.1）：（4.5～5.5）：（1.8～2.2）；
S4. 取二甲基甲酰胺，二环己基碳二亚胺，4-二甲氨基吡啶，步骤S2的产物PC-PA粉末，步骤S3的产物DOX-EGCG粉末，室温搅拌，离心，收集上清液，使用乙酸乙酯进行萃取，干燥后得到褐色粉末PC-PA-DOX-EGCG，即NP；其中，二甲基甲酰胺：二环己基碳二亚胺：4-二甲氨基吡啶：步骤S2的产物PC-PA粉末：步骤S3的产物DOX-EGCG粉末（V/W/W/W/W）=（3～5）：（9～11）：（0.9～1.1）：（4.5～5.5）：（1.8～2.2）；
S5.取步骤S4的产物NP粉末，加入二氯乙烷和N-羟基琥珀酰亚胺，室温活化后进行浓缩，再依次加入雌激素受体的抗体、人表皮生长因子受体的抗体或孕激素受体的抗体的一种或几种的混合物，冰浴搅拌，即得靶向纳米粒子悬液，冻干保存备用；其中，NP粉末：二氯乙烷：N-羟基琥珀酰亚胺：抗体（W/W/W/W）=（2.7～3.3）：（0.45～0.55）：（0.45～0.55）：（0.009～0.011）。
3.权利要求1或2所述的靶向纳米粒子在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
4.一种治疗乳腺癌药物，其特征在于，含有权利要求1或2所述的靶向纳米粒子。
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