CN108403665A - EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体、递送系统及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体、递送系统及其制备与应用。本发明以聚酰胺‑胺纳米粒为药物载体,质粒pCDNA‑MEG3为模型药物,EpDT3适体为靶向头基,EpCAM为作用靶点,以双功能聚乙二醇NHS‑PEG‑MAL为桥接,构建纳米主动靶向给药系统[EpDT3‑PEG‑PAMAM/pCDNA‑MEG3]。本发明具有很好的靶向性以及抗肿瘤活性,安全性高,稳定性强,易于合成,经济成本低,不仅为前列腺癌特别是激素非依赖性以及转移性前列腺癌的治疗开辟一条新途径,同时也为其他上皮细胞肿瘤的靶向基因治疗提供了新的研究方法和思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体地说,是一种EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体、递送系统及其制备与应用。
背景技术
前列腺癌(Prostatic carcinoma,Prostatic cancer,PCa)是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤,其发病率随年龄的增长而提高,已成为严重威胁人类健康的恶性疾病。目前临床上治疗中晚期PCa主要采用放疗、化疗(包括内分泌治疗)等手段,这些治疗方法存在用药顺应性差、组织选择性差、毒性反应大及耐药性等问题。基因治疗相对于上述方法来说具有许多无可比拟的优点,如靶向性好、毒副作用小及可特异性地杀伤肿瘤细胞等,近年已报道了一系列涉及前列腺癌基因治疗的临床试验,但是外源基因自己不能主动进入细胞,因此基因治疗应用于临床还需要一种安全、高效的传递载体进行递送。
非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)是所有不能编码翻译蛋白质的功能性RNA的统称,包括短链非编码RNA(如siRNA、miRNA等)和长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)。近年研究发现LncRNA与肿瘤的发生、发展亦有着密切关系,使其成为肿瘤基因治疗的新研究热点。如Zhang等于2003年发现LncRNA MEG3在大部分正常组织中均有表达,但在人类肿瘤细胞(如前列腺癌细胞株DU145、乳腺癌细胞株MCF-7等)中几乎检测不到,推测MEG3可能通过异位表达起到肿瘤抑制作用。后对MEG3进一步研究证明其通过刺激p53介导的转录过程抑制了DNA在脑膜瘤细胞里的合成,从而抑制肿瘤细胞增殖。研究亦证实LncRNAMEG3可抑制非小细胞肺癌细胞(NSCLC)增殖,并可通过影响p53表达诱导NSCLC细胞凋亡。因此,LncRNA MEG3是一种很有临床应用前景的抑癌基因,在体内如何通过靶向纳米给药系统将其转导入前列腺癌等肿瘤细胞就成为转化医学研究关键。
聚酰胺胺(PAMAM)是一种性能卓越的基因药物载体,具有高度分枝,呈单分散性,其末端氨基丰富,正电性强,并易于经过适当的修饰连接抗体、适配体等生物活性物质以增加载体高分子的靶向性。与目前常用的病毒载体、脂质体等药物载体相比,PAMAM具有稳定、对生物活性物质的转运效率高等优点,因此被认为是较好的基因载体。
上皮细胞黏附分子(Epithelial cellular adhesion molecule,EpCAM,又称CD326)是一种高表达于大多数恶性上皮肿瘤细胞表面的糖蛋白,具有加快细胞周期、促进细胞增殖、分化、迁移以及免疫逃逸等多种生物学功能,是目前表达最强的肿瘤表面抗原之一。EpCAM在激素非依赖性前列腺癌细胞株(如PC3、DU145等)、激素依赖性前列腺癌细胞株(如LNCaP、DuCaP)、淋巴结转移前列腺癌细胞中均高表达,转移性前列腺癌病人的血循环前列腺癌细胞80%以上高表达EpCAM,因此EpCAM非常适合作为前列腺癌治疗的靶点,无论是原位前列腺癌细胞,还是血液、淋巴、微环境中转移性前列腺癌细胞,都可通过系统给予抗EpCAM治疗以阻止前列腺癌转移,进一步研究发现EpCAM通过活化PI3/Akt/mTOR信号通路与前列腺癌的转移、放/化疗抗性等相关。
适配体是一种能与多种靶分子特异高效结合的单链或双链寡核苷酸,其制备方便、稳定性好、适用范围广,具有很多蛋白质抗体所不具备的优点。适配体作为肿瘤靶向纳米给药系统的靶头具有非常好的开发前景。
中文期刊《中国药学杂志》2012年公开论文《YPSMA-1单克隆抗体修饰的树突状高分子前列腺癌靶向基因递送载体》,通过聚乙二醇(PEG)将YPSMA-1单克隆抗体(mAb)和聚酰胺-胺(PAMAM)连接,合成新型的前列腺癌靶向基因载体PAMAM-PEG-mAb,提高基因的转染效率和前列腺癌细胞靶向性。实验表明,PAMAM-PEG-mAb的细胞摄取效率呈浓度依赖性,PAMAM经PEG修饰后转染效率和前列腺癌靶向性无明显变化,再经mAb修饰后LNCaP细胞显著增加。中国专利201410200726X,公开一种前列腺癌超声诊断靶向试剂,为EpDT3适体修饰的全氟溴辛烷纳米粒,所述的EpDT3适体选自:a)EpDT3-SH:5'-GCGACUGGUUACCCGGUCG-(CH2)6-SH-3',且具有2'-氟代嘧啶修饰,或b)EpDT3-NH2:5’-NH2-spacer-GCGACUGGUUACCCGGUCGinvertedT-3’,具有2'-氟代嘧啶,3’-倒置T帽,并且5’-氨基通过六乙二醇连接。第二军医大学2012年硕士学位论文《PSMA靶向的纳米主动靶向给药系统构建及其抗前列腺癌作用研究》,以PAMAM为药物载体,miR-15a和miR-16-1为模型药物,寡核苷酸适配体A10-3.2适体为靶向头基,PSMA为作用靶点,构建纳米给药系统PAMAM-PEG-APT/miRNA。现有技术中,关于本发明的纳米主动靶向给药系统EpDT3-PEG-PAMAM/pCDNA-MEG3,还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足,提供一种EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体。
本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足,提供一种EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向药物递送系统。
本发明的第三个目的在于,提供如上所述的EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体的制备方法。
本发明的第四个目的在于,提供如上所述的EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向药物递送系统的制备方法。
本发明的第五个目的在于,提供如上所述的EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向药物递送系统的制药用途。
为实现上述第一个目的,本发明采取的技术方案是:
一种EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体,该给药载体由聚酰胺-胺型树状分支物PAMAM、聚乙二醇和EpDT3适配体构成,三者以共价方式链接;所述聚乙二醇与PAMAM的摩尔比为2~10:1,所述PAMAM与EpDT3的摩尔比为1:0.1~1;所述EpDT3适配体组成为:5'GCGACUGGUUACCCGGUCG-/3thiol/3'。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
一种EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向药物递送系统,所述药物递送系统包含如上所述EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体和pCDNA-MEG质粒。
作为本发明的一个优选实施方案,所述PAMAM与pCDNA-MEG质粒的N/P为1~25:1。
为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:
如上所述EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体的制备方法,该方法包括:
a)NHS-PEG-MAL与PAMAM按照摩尔比2~10:1的比例,室温避光搅拌反应,合成PAMAM-PEG;
b)PAMAM-PEG与权利要求1所述的EpDT3按照摩尔比1:0.1~1的比例,室温避光搅拌反应,合成PAMAM-PEG-EpDT3。
为实现上述第四个目的,本发明采取的技术方案是:
如上所述EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向药物递送系统的制备方法,该方法包括:
取PAMAM-PEG-EpDT3和pCDNA-MEG质粒分别稀释,混合,涡旋,静置,制成EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向药物递送系统,其中,所述PAMAM与pCDNA-MEG质粒的N/P为1~25:1。
为实现上述第五个目的,本发明采取的技术方案是:
如上所述EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
如上所述EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向药物递送系统在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
本发明将PEG修饰的聚阳离子载体PAMAM-PEG-NHS与适配体EpDT3连接,构建了一种新型的、具有前列腺癌靶向性能的纳米基因载体PAMAM-PEG-EpDT3。PAMAM-PEG-EpDT3的细胞毒性小于PAMAM,表明该载体具有良好的生物相容性。
进一步以能够抑制雄激素非依赖型前列腺癌细胞PC3生长的pCDNA MEG3作为基因药物,并包裹于PAMAM-PEG-EpDT3载体,构建了新型的纳米主动靶向给药系统PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNA MEG3(其结构如图1所示),实验显示:PAMAM可以有效的包封DNA,起到保护作用,使其免受酶类降解的作用;PAMAM-PEG经过EpDT3修饰后,能显著提高质粒DNA的转染效率;EpDT3能显著促进质粒pCDNA MEG3进入细胞,使其对细胞的抑制作用增强。
本发明的纳米主动靶向给药系统PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNA MEG3具有很好的靶向性以及抗肿瘤活性,安全性高,稳定性强,易于合成,经济成本低,为前列腺癌特别是激素非依赖性以及转移性前列腺癌的治疗开辟一条新途径,同时也为其他上皮细胞肿瘤的靶向基因治疗提供了新的研究方法和思路。
附图说明
附图1为发明的EpDT3-PEG-PAMAM/pCDNA-MEG3纳米主动靶向给药系统示意图。
附图2为pCDNA3.1(+/-)质粒图谱。
附图3为三种前列腺癌细胞转染后的MEG3表达水平。
附图4为MEG3对前列腺癌细胞DU145和PC3增殖的影响(A:DU145,B:PC3)。
附图5为thiol-EpDT3质谱图分析。
附图6为5'Cy3-EpDT3质谱图分析。
附图7为EpDT3适配体在前列腺癌细胞DU145、PC3和LNCaP的分布情况。
附图8为PAMAM–PEG-EpDT3合成路线图。
附图9为1H-NMR图谱(A:PAMAM,B:PEG,C:PAMAM-PEG,D:PAMAM-PEG-EpDT3)。
附图10为荧光显微镜观察DU145、PC3和LNCaP细胞对不同浓度BODIPY-labledPAMAM-PEG-EpDT3的摄取结果。
附图11为纳米载体的安全性考察实验结果(A:DU145,B:PC3,C:LNCaP)。
附图12为琼脂糖凝胶电泳实验结果。(A)PAMAM-PEG/DNA,(B),PAMAM-PEG-EpDT3/DNA,(C)不同N/P比。
附图13为载基因纳米复合物的体外表达效率考察结果。
附图14为载基因纳米复合物对前列腺癌细胞抑制效果评价结果。
附图15为裸鼠平均体重观察结果。
附图16为裸鼠移植瘤组织切片观察结果。(A)PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNA3.1(+),(B)PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNAMEG3(C)PAMAM-PEG/pCDNAMEG3(D)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1质粒pCDNAMEG3和适配体EpDT3的体外评价
1仪器与材料
1.1质粒和适配体
质粒pCDNAMEG3由上海Invitrogen公司合成,pCDNA 3.1(+)载体图谱如图2;阴性对照pCDNA3.1(+)由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院中西医结合临床研究所王培伟老师惠赠;EpDT3和5'Cy-3荧光素标记的适配体EpDT3由广州锐博生物科技有限公司合成,序列如下:
(1)EpDT3,sense:
5'G(fC)GA(fC)(fU)GG(fU)(fU)A(fC)(fC)(fC)GG(fU)(fC)G-/3thiol/3'
(2)5'Cy-3EpDT3,sense:
5'/5cy3/-G(fC)GA(fC)(fU)GG(fU)(fU)A(fC)(fC)(fC)GG(fU)(fC)G-/3thiol/3'
(3)pCDNAMEG3(cDNA序列,NR_002766.2,inNCBI),sense:
GGTACCagcccctagcgcagacggcggagagcagagagggagcgcgccttggctcgctggccttggcggcggctcctcaggagagctggggcgcccacgagaggatccctcacccgggtctctcctcagggatgacatcatccgtccacctccttgtcttcaaggaccacctcctctccatgctgagctgctgccaaggggcctgctgcccatctacacctcacgagggcactaggagcacggtttcctggatcccaccaacatacaaagcagccactcactgacccccaggaccaggatggcaaaggatgaagaggaccggaactgaccagccagctgtccctcttacctaaagacttaaaccaatgccctagtgagggggcattgggcattaagccctgacctttgctatgctcatactttgactctatgagtactttcctataagtctttgcttgtgttcacctgctagcaaactggagtgtttccctccccaagggggtgtcagtctttgtcgactgactctgtcatcacccttatgatgtcctgaatggaaggatccctttgggaaattctcaggagggggacctgggccaagggcttggccagcatcctgctggcaactccaaggccctgggtgggcttctggaatgagcatgctactgaatcaccaaaggcacgcccgacctctctgaagatcttcctatccttttctgggggaatggggtcgatgagagcaacctcctagggttgttgtgagaattaaatgagataaaagaggcctcaggcaggatctggcatagaggaggtgatcagcaaatgtttgttgaaaaggtttgacaggtcagtcccttcccacccctcttgcttgtcttacttgtcttatttattctccaacagcactccaggcagcccttgtccacgggctctccttgcatcagccaagcttcttgaaaggcctgtctacacttgctgtcttccttcctcacctccaatttcctcttcaacccactgcttcctgactcgctctactccgtggaagcacgctcacaaaggcacgtgggccgtggcccggctgggtcggctgaagaactgcggatggaagctgcggaagaggccctgatggggcccaccatcccggacccaagtcttcttcctggcgggcctctcgtctccttcctggtttgggcggaagccatcacctggatgcctacgtgggaagggacctcgaatgtgggaccccagcccctctccagctcgaaatccctccacagccacggggacaccctgcacctattcccacgggacaggctggacccagagactctggacccggggcctccccttgagtagagacccgccctctgactgatggacgccgctgacctggggtcagacccgtgggctggacccctgcccaccccgcaggaaccctgaggcctaggggagctgttgagccttcagtgtctgcatgtgggaagtgggctccttcacctacctcacagggctgttgtgaggggcgctgtgatgcggttccaaagcacagggcttggcgcaccccactgtgctctcaataaatgtgtttcctgtcttaacaaaaaGAATTC
1.2细胞株
激素非依赖型前列腺癌DU145和PC3细胞由上海市肿瘤研究所刘永忠教授惠赠;激素依赖型前列腺癌LNCaP细胞购自上海圆创生物有限公司。
2实验方法
2.1实时荧光定量PCR检测质粒转染后MEG3的表达水平
1、取对数生长期的DU145、PC3和LNCaP细胞分别经0.25%的胰蛋白酶消化、吹打分散后计数,用含10%胎牛血清的1640培养液制成浓度为1x105个/ml的细胞悬液,接种于24孔板上,每孔500ul,轻轻水平振荡24孔板以使细胞均匀铺于底壁上,接种完放入37℃、5%C02培养箱中。
2、当细胞密度达到70%-90%时,采用lipo2000转染试剂将质粒pCDNAMEG3和Empty vector分别转染到癌细胞中,每孔加0.3ug的质粒和2ul的lipo2000,每组设3个复孔。转染后6小时,将转染培养基换成完全培养基。
3、RNA的提取及浓度测定
(1)细胞转染24h后,每孔加500ul Trizol后,室温放置5min,使其充分裂解。
(2)12000rpm离心5min,弃沉淀。
(3)按200uL氯仿/mLTrizol加入氯仿,震荡混匀后室温放置15min。
(4)4℃12000g离心15min。
(5)吸取上层水相,至另一离心管中。
(6)按0.5mL异丙醇/mL Trizol加入异丙醇混匀,室温放置5-10min。
(7)4℃12000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底。
(8)按1mL 75%乙醇/mL Trizol加入75%乙醇(DEPC水新鲜配制),温和震荡离心管,悬浮沉淀。
(9)4℃8000g离心5min,尽量弃上清。
(10)室温晾干或真空干燥5-10min。
(11)可用50ul H2O、TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品,55-60℃,5-10min
(12)以DEPC水作为空白对照,采用微量紫外分光光度计上测定样品RNA浓度,及A260/280比值。
4、逆转录反应
按说明书(Takara PrimeScriptTM RT Master Mix)配制以下反应体系,共10ul。离心液体都集中在底部,置于逆转录仪中,反应条件为37℃15min(反转录反应)85℃5sec(反转录酶的失活反应)4℃。
表1逆转录反应体系
5、实时荧光定量反应
配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)。离心使液体都集中在底部。GAPDH为内参。放入Roche 480II中进行PCR反应,并收集信号进行分析。RT-qPCR反应条件如下:95℃20sec,60℃20sec,72℃20sec,50个循环。
表2PCR反应液
表3引物序列
2.2LncRNAMEG3对前列腺癌细胞增殖的抑制作用
细胞增殖实验采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒进行分析。其基本原理为:该试剂中含有-8[其化学名称为:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐],它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜染料(Formazan dye)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比,因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
将对数生长期的DU145、PC3和LNCaP细胞经0.25%胰蛋白酶消化、吹打分散后计数,用含10%胎牛血清的1640培养液制备浓度为1×105个/mL的细胞悬液,按100uL/孔(即1×104个细胞/孔)的密度接种于96孔培养板,空白调零孔加100uL的1640培养液。四周边缘孔不接种细胞,只加100uL/孔的PBS,起边缘封闭作用。培养板接种后水平放置于37℃、5%C02、饱和湿度培养箱中培养。当细胞密度达到70%-90%时,采用lipo2000转染试剂将质粒pCDNAMEG3和空载分别转染到癌细胞中,每孔加0.4ul的lipo2000和0.05ug的质粒,每组设六个复孔。转染后6小时,将转染培养基换成完全培养基。注:转染过程中培养基不加抗生素。分别在转染后24h、48h、72h、96h取出96孔板,每孔加入含10ul CCK8的1640培养液100uL,培养箱中孵育30min,用酶标仪在490nm处测定各孔的光密度值(OD值),实验重复3次,绘制细胞生长曲线。
2.3EpDT3适配体的体外靶向性评价
将对数生长期的DU145、PC3和LnCAP细胞经0.25%胰蛋白酶消化、吹打分散后计数,用含10%胎牛血清的1640培养液制备成浓度为7×104个/mL的细胞悬液,按每皿7×104个细胞的密度接种于共聚焦专用培养皿中,于培养箱中培养。细胞密度达到50%左右,吸弃原培养基,PBS润洗三次,加100nM的Cy3标记的EpDT3适体1mL,于培养箱中孵育30min,去适体溶液,PBS润洗三次,加1mL多聚甲醛固定20min,去固定液,加PBS润洗三次,加1mLBisbenzimide Hoechst 33342(3ug/mL),于培养箱中染核15min,吸弃Hoechst溶液,加冷的PBS润洗三次,于激光共聚焦显微镜下观察拍照。
2.4数据处理和统计方法
实验数据用SPSS 18.0软件进行统计,以mean±SD表示。数据组间比较采用ANOVA方差分析,p<0.05即认为存在显著性差异。
3实验结果
3.1实时荧光定量PCR结果
如图3所示,质粒pCDNAMEG3转染到DU145,PC3和LNCaP三种前列腺癌细胞24h后,与空载组相比,pCDNAMEG3组细胞中MEG3的表达均显著升高。
3.2CCK8结果
MEG3对前列腺癌细胞DU145和PC3增殖的影响如图4所示,质粒pCDNAMEG3转染到DU145和PC3前列腺癌细胞48h、72h、96h后,与空载组相比,pCDNAMEG3组细胞增殖受到了明显的抑制作用。
3.3EpDT3适配体的表征
利用HPLC色谱法检测合成的适配体EpDT3纯度,纯度大于80%。利用质谱法鉴定合成的适配体并最终确定其分子量,如图5和图6所示,质谱图符合适配体的结构特征,EpDT3和5'Cy3-EpDT3分子量分别为6285.6和6853.8。
3.4EpDT3适配体的体外靶向性评价
采用激光共聚焦显微镜观察EpDT3适配体在前列腺癌细胞DU145,PC3和LNCaP的分布情况,如图7所示,EpDT3主要分布在癌细胞的细胞膜和细胞质中,其中EpDT3在DU145和PC3的细胞膜和细胞质的表达都很多,而对于LNCaP,主要表达在细胞膜上,细胞质中较少。
实施例2 EpDT3适配体修饰的纳米载体的合成及其体外评价
首先合成PEG修饰的聚阳离子载体PAMAM-PEG-NHS。其次,将其与可以特异性识别EpCAM的EpDT3适配体连接,构建了一种新型的,具有前列腺癌靶向性能的纳米基因载药系统PAMAM-PEG-EpDT3。整体思路如下:以NHS-PEG-MAL和PAMAM合成NHS-PEG-PAMAM,生物公司合成EpDT3-SH,由于NHS和SH可以在温和条件下反应,因此在不影响EpDT3活性的情况下,利用已经合成的NHS-PEG-PAMAM和EpDT3-SH为材料,合成目标载体EpDT3-PEG-PAMAM,对其高分子性质进行考察。选用三种高表达EpCAM的前列腺癌细胞株激素依赖型细胞LNCaP、激素非依赖型细胞DU145和PC3,考察其对高分子载体PAMAM-PEG-EpDT3的摄取机制,以及安全性进行考察。
1实验方法
1.1PAMAM-PEG-EpDT3纳米载体的合成(图8)
称取一定量的NHS-PEG-MAL粉末,于磷酸盐缓冲液(PBS,pH 8.0)溶解,配制成浓度为10mg/mL的溶液,将适量PAMAM甲醇溶液至于反应瓶中氮气吹干,按照PEG:PAMAM=2:1(mol/mol)的比例,室温避光搅拌反应2h,使得PEG上的NHS基团和PAMAM分子表面的氨基特异反应,合成PAMAM-PEG。反应产物采用超滤管(分子量截留量10000)进行超滤纯化,4℃,12000rpm离心20min,重复过程1-2次,以PBS(pH 7.0)复溶,产物采用氢核磁共振(1H-NMR)进行鉴定。
TCEP还原二硫键适配体EpDT3:300uLRNA溶液加入等体积5mM的TCEP溶液,37℃孵育1h,分装至两个1.5mL EP管中,每管300uL,加1/10th体系3M的NaOAc溶液30uL,混匀,再加3倍体积的无水乙醇1ml,混匀,-20℃沉淀一小时以上,13200r/min离心20min,弃上清,重复上述操作两次,产物采用微量紫外分光光度计检测浓度。
核酸适配体EpDT33'端的巯基可以与NHS-PEG-MAL另一端的MAL特异反应,形成共价连接。按照PAMAM-PEG:EpDT3=1:0.1(mol/mol)的比例,充氮气,室温避光搅拌反应24h,制得PAMAM-PEG-EpDT3,产物采用1H-NMR和琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.2PAMAM-PEG-EpDT3的合成验证
PAMAM-PEG和PAMAM-PEG-EpDT3合成后,分别进行透析纯化,冻干,定量称取,溶于0.5mL重水(D2O)中,300MHz进行1H-NMR分析
1.3前列腺细胞DU145、PC3和LNCaP摄取PAMAM-PEG-EpDT3的浓度依赖性考察
称取5mg的BODIPY-493/503NHS Ester粉末,加1mL DMSO溶解,分装后避光冷冻保存。BODIPY和PAMAM以摩尔比5:l(mol/mol)的比例在100mM NaHCO3溶液,4℃,避光搅拌反应12h,使得BODIPY上的NHS基团和PAMAM分子表面的氨基特异反应,合成BODIPY-PAMAM。反应产物采用超滤管(分子量10000截留)进行超滤纯化,4℃,12000rpm离心20min,合成BODIPY标记的PAMAM。重复过程1-2次,以PBS(pH 8.0)复溶。其余反应步骤同上。
取对数生长期的DU145、PC3和LNCaP以7×104个/孔接种于24孔板中培养48h,显微镜下观察汇合度达到90%且细胞形态饱满可进行摄取实验。将BODIPY-493/503标记的PAMAM-PEG-EpDT3稀释成一系列浓度:0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM和1μM,37℃、5%CO2条件下分别与DU145、PC3和LNCaP孵育30min,PBS润洗3次,利用倒置荧光显微镜,观察前列腺癌细胞对不同浓度载体的摄取情况。
同时,重复上述实验,PBS润洗3次后,利用胰酶消化,4℃,1000rpm离心5min,弃去上清液,PBS吹悬,调整细胞浓度至1×106个/ml,以空白细胞作阴性对照,每个样品收集5000events,流式检测参数的获取,采用NovoCyte软件,流式细胞仪测定细胞摄的定量摄取情况以及细胞的平均荧光强度。
1.4纳米载体的摄取机制考察
取对数生长期的DU145、PC3和LNCaP以7×104个/孔接种于24孔板中培养48h,显微镜下观察汇合度达到90%且细胞形态饱满可进行摄取实验。在考察摄取过程是否需要能量依赖时,孵育在4℃下进行。分别采用游离的不同内吞途径抑制剂菲力平(0.5mg/mL)、氧化苯砷(2.5mM)和秋水仙碱(2.5mM)预孵育癌细胞10min,再分别加入1μM的BODIPY-493/503标记的PAMAM-PEG-EpDT3,37℃孵育30min,吸弃载体溶液,冷的PBS洗三次,倒置荧光显微镜下定性比较不同内吞途径抑制剂对纳米粒摄取情况的影响。
1.5PAMAM-PEG-EpDT3纳米载体的安全性考察
采用CCK8法考察PAMAM材料本身和PAMAM-PEG-EpDT3载体对前列腺癌细胞的毒性。取对数生长期的DU145、PC3和LNCaP细胞接种于96孔板中,每孔8000个,于培养箱中孵育24h,至显微镜观察细胞浓度达到90%。在细胞孔中分别加入浓度为10、50、100、150、200μg/mL(以PAMAM计)的PAMAM或PAMAM-PEG-EpDT3溶液,每组6个复孔,37℃孵育4h,吸除孵育液后,PBS洗两次,每孔加入含10ul CCK8的1640培养液100ul,培养箱中孵育30min,用酶标仪测定各孔在参比波长(630nm)和测定波长(450nm)处的OD值。未经纳米复合物处理的细胞孔为对照孔,计算细胞存活百分数。
1.6数据处理和统计方法
实验数据用SPSS 18.0软件进行统计,以mean±SD表示。数据组间比较采用ANOVA方差分析,p<0.05即认为存在显著性差异。
2结果
2.1PAMAM-PEG-EpDT3的合成验证
采用1H-NMR鉴定纳米载体,结果见图9。
由于PEG带有马来酰亚胺(MAL)和琥珀酰亚胺(NHS)双功能基团,其中NHS可与PAMAM表面氨基特异连接,得到PEG化的PAMAM。EpDT3的巯基可与PEG上的马来酰亚胺(MAL)特异反应而连接到PAMAM上。通过NMR分析鉴定,4.7ppm左右为D2O溶剂峰,2.2-3.4ppm处是PAMAM骨架峰;3.6ppm左右为PEG中亚甲基特征吸收峰,6.7ppm处为MAL的特征峰。图9C所示PAMAM-PEG合成成功。图9D马来酰亚胺与巯基发生特异性反应,6.7ppm处MAL特征峰消失,表明PAMAM-PEG-EpDT3合成成功。
2.2纳米载体的浓度依赖性考察
2.2.1定性观察结果
荧光显微镜观察DU145、PC3和LNCaP细胞对不同浓度BODIPY-labled PAMAM-PEG-EpDT3的摄取结果,见图10。由图可知,随着BODIPY-PAMAM–PEG–EpDT3浓度升高,DU145和PC3绿色荧光强度增强,细胞摄取量也增多,而LNCaP绿色荧光强度增强缓慢,细胞摄取量增多不明显,因此,提高PAMAM材料浓度可增加前列腺癌细胞的摄取效率,但对DU145和PC3细胞在不同浓度下对BODIPY-PAMAM–PEG–EpDT3的摄取效率,高于对LNCaP的细胞摄取效率。
2.2.2定量观察结果
为了进一步验证,采用流式细胞仪检测DU145、PC3和LNCaP细胞对不同浓度BODIPY-labled PAMAM-PEG-EpDT3的摄取,显示:随着BODIPY-PAMAM–PEG–EpDT3浓度升高,PC3细胞阳性率从5.21%增加到92.14%,DU145细胞阳性率从2.64%增加到8.72%,LNCaP细胞阳性率从3.5%增加到64.2%,与荧光显微镜下观察结果一致。
2.3纳米载体的安全性考察
不同浓度的PAMAM-PEG-EpDT3和PAMAM载体对前列腺癌细胞DU145、PC3和LNCaP的细胞毒性结果,见图11。随着PAMAM浓度的增加,PAMAM材料本身和PAMAM-PEG-EpDT3的毒性增强,且同一浓度下,PAMAM毒性高于PAMAM-PEG-EpDT3,说明通过PEG和EpDT3适体的修饰,极大地降低了PAMAM的毒性。在DU145(图11A)中,当PAMAM 100μg/mL时,PAMAM-PEG-EpDT3纳米载体对细胞的毒性较低,而PAMAM对其还有一定的毒性。PAMAM浓度为300μg/mL和100μg/mL及以上时PAMAM材料本身和PAMAM-PEG-EpDT3对PC3(图11B)和LNCaP(图11C)毒性较低,细胞存活率80%以上,具有较高的生物安全性。
实施例3 EpDT3适配体修饰的纳米靶向给药系统的制备及其体外评价
1.1载体/DNA纳米粒的制备
新鲜制备的PAMAM、PAMAM-PEG和PAMAM-PEG-EpDT3用蒸馏水稀释至适宜浓度,质粒DNA溶液以50mM Na2SO4稀释至浓度为100μg/mL的溶液,PAMAM-PEG-EpDT3和质粒DNA溶液按照PAMAM与DNA的N/P为1,5,10,15,20,25混合,立即漩涡30s,室温静置30min,即自组装形成纳米复合物。PAMAM/DNA与PAMAM-PEG/DNA制备方法同上。
1.2琼脂糖凝胶电泳实验
称取适量琼脂糖,加入1×TAE溶液,至琼脂糖浓度为0.5%,微波非连续加热,使其溶解,室温冷却至约50℃,加入荧光染料Gelview,灌胶,待冷却至室温,取按照N/P为1,5,10,15新鲜制备的PAMAM-PEG-EpDT3/DNA加样,同时加入DNA Ladder和裸DNA作为对照,电泳电压设定为120V,20min后,紫外透射仪观察并拍照。考察经过树枝状载体对DNA的包封效果。
1.3载体/DNA的体外转染效率考察
取对数生长期的前列腺癌细胞(PC3和LNCaP)以7×104个/孔接种于24孔板中,待细胞汇合度为70%时换无血清培养液。以5μgpRFp质粒/孔,分别加入新鲜配置的PAMAM与DNA的N/P为15的PAMAM-PEG-EpDT3/DNA和PAMAM-PEG/DNA载基因纳米粒,于37℃、5%CO2条件孵育,4h后换含血清培养液继续培养48h,采用倒置荧光显微镜观察基因表达产物红色荧光蛋白的红色荧光并拍照。
1.4PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNAMEG3纳米粒对前列腺癌细胞抑制效果评价
将DU145、PC3和LNCaP细胞株置于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中,37℃、5%CO2培养。取对数生长期细胞制成浓度为5×104个/ml的细胞悬液,以100μl/孔接种于96孔培养板,培养24h后,吸去培养基。将新鲜配制的两种纳米复合物(PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNAMEG3,PAMAM-PEG/pCDNAMEG3)按照以下浓度稀释备用:20nM、50nM、100nM、300nM、600nM、1000nM、3000nM、9000nM、30000nM。将稀释好的纳米复合物材料按照100μL/孔加至备用的96孔培养板,每组6个复孔,37℃、5%CO2培养4h,吸去纳米复合物,细胞用pH=7.4的PBS洗3次。按照100μL/孔更换含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液,继续培养48h。取出培养板,按照10μl/孔加入CCK-8试剂,37℃、5%CO2继续培养2h。结束后,取出培养板,震荡10s,酶标仪测定各孔在参比波长(630nm)和测定波长(450nm)处的OD值。未经纳米复合物处理的细胞孔为对照孔,计算细胞存活百分数。以上每组实验均重复3次。
1.5数据处理和统计方法
实验数据用SPSS 18.0软件进行统计,以mean±SD表示。数据组间比较采用ANOVA方差分析,p<0.05即认为存在显著性差异。
2实验结果
2.1琼脂糖凝胶电泳实验结果
三种不同的载体分别以不同的N/P比与质粒DNA混合,制备成相应的纳米粒。琼脂糖凝胶电泳结果如图12所示。较之裸DNA,N/P为10时,PAMAM/DNA和PAMAM-PEG-EpDT3/DNA纳米粒中的DNA未发生迁移;而N/P为15时,PAMAM-PEG/DNA纳米粒中的DNA未发生迁移,DNA和纳米载体一起滞留在凝胶加样孔中,说明PAMAM可以有效的包封DNA,在体内外环境下,起到保护DNA,使其免受酶类降解的作用。
2.2载基因纳米复合物的体外表达效率考察
利用PAMAM-PEG-EpDT3和PAMAM-PEG包裹pRFP质粒(N/P为10)转染PC3和LNCaP细胞48h后,荧光显微镜观察pRFp红色荧光蛋白质粒的表达结果如图13所示,PC3和LNCaP细胞中PAMAM-PEG-EpDT3/pRFp组中红色荧光蛋白表达较PAMAM-PEG/pRFp组高,表明PAMAM-PEG经过EpDT3修饰后,能显著提高质粒DNA的转染效率。
2.3载基因纳米复合物对前列腺癌细胞抑制效果评价
PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNA MEG3对癌细胞的抑制作用比PAMAM-PEG/pCDNA MEG3强,说明EpDT3能显著促进质粒pCDNAMEG3进入细胞,使其对细胞的抑制作用增强,且对LNCAP的抑制作用较显著(图14)。
实施例4 PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNAMEG3体内抗肿瘤效果
1实验方法
1.1前列腺癌裸鼠模型构建
利用人前列腺癌细胞株PC3诱导形成雄激素非依赖型前列腺肿瘤,取对数生长期的PC3细胞利用胰酶消化,离心后用不完全培养基重悬,制成浓度为1×107个/mL的细胞悬液,混合均匀;选取BALB/c裸鼠,取细胞悬液接种至裸鼠右上肢背部皮下(0.1mL/只);裸鼠精心饲养7-10天后,选取肿瘤形态圆润,致密,而且肿瘤体积达到50mm3的裸鼠,作为实验模型。
1.2分组和给药
将20只人前列腺癌PC3移植瘤裸鼠随机分为4组,每组5只。分别为:空白对照组(生理盐水);PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNA 3.1(+)组;PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNAMEG3组;PAMAM-PEG/pCDNAMEG3组。
具体给药方法为:将所有制剂分别溶于0.lmL生理盐水中,经尾静脉注射。于治疗的第1,3,5,7,9天以同样剂量药物治疗1次。每只鼠约20g给药剂量为50ug DNA。
从给药当天开始,隔天对裸鼠肿瘤的最长径以及其垂直径进行测量,计算出肿瘤体积,计算公式如下:体积=(最长径×垂直径2)/2,治疗结束后,继续观察10天,采用摘眼球取血法取裸鼠血清,使用颈椎脱臼法处死裸鼠,剥离肿瘤,称重,于生理盐水清洗后固定于4%的多聚甲醛,计算肿瘤重量的抑制率。
瘤重抑制率=(对照组平均瘤重—实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%
1.3组织免疫组化检测
治疗实验观察结束后,用颈椎脱臼法处死裸鼠,取得肿瘤组织,用中性福尔马林进行固定、脱水、包埋、切片以及常规苏木精-伊红染色,用于组织相关病理学检查。
2结果
2.1荷瘤裸鼠造模结果
造模裸鼠25只,在造模后15天,选出20只肿瘤形态规整,大小一致的荷瘤裸鼠用于实验。
2.2裸鼠平均体重观察结果
四组荷瘤裸鼠在成功接种前列腺癌移植瘤后开始计算体重,在1,3,5,7,9天进行给药后,如图15所示,荷瘤小鼠的体重在前13天内相对平稳,体重略有增加,各组平均体重在22-25g之间,表明纳米载体本身毒副作用小;在给药结束后,荷瘤小鼠的体重开始下降,各组平均体重在22g左右。根据体重结果分析显示,荷瘤小鼠的体重在肿瘤偏小的阶段,呈上升趋势,随着肿瘤血管的增生,肿瘤体积的增大,开始吸收裸鼠身体内的营养,所以,裸鼠体重在后期呈现下降趋势。但是,随着肿瘤的生长,裸鼠逐渐适应了肿瘤的存在,在一定时期内,裸鼠的体重保持稳定状态。
2.3裸鼠移植瘤平均体积以及不同给药组肿瘤抑制率观察结果
结果如下表所示,从肿瘤抑制率上分析,PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNAMEG3组的肿瘤抑制率最大,显著高于PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNA3.1(+)组和PAMAM-PEG/pCDNAMEG。说明采用EpDT3作为靶头,可使药物更好的在肿瘤部位富集,提高抑瘤效果。
表4不同比别裸鼠平均瘤重及瘤重抑制率比较
分组 | 平均瘤重 | 瘤重抑制率 |
空白对照 | 1.22±0.31 | - |
PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNA3.1(+) | 1.15±0.27 | 5.35 |
PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNAMEG3 | 0.45±0.08 | 63.34 |
PAMAM-PEG/pCDNAMEG | 0.72±0.13 | 40.95 |
2.4肿瘤组织H&E染色分析结果
不同给药组肿瘤组织的H&E染色结果见图16,生理盐水组和PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNA 3.1(+)组的肿瘤生长良好,营养充足,无坏死区域,癌细胞核呈蓝色,大且明显,边缘也较为清晰,说明纳米载体本身没有明显的毒副作用,安全性较好;PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNAMEG3组和PAMAM-PEG/pCDNAMEG3组肿瘤组织疏松或呈空泡状,PAMAM-PEG-EpDT3/pCDNAMEG3组可见细胞核固缩深染或碎裂溶解并伴有很多中性粒细胞浸润,说明LncRNAMEG3对肿瘤细胞有明显的杀伤作用,且EpDT3适配体修饰的纳米粒有更好的靶向性。
实施例5
称取一定量的NHS-PEG-MAL粉末,于磷酸盐缓冲液(PBS,pH 8.0)溶解,配制成浓度为10mg/mL的溶液,将适量PAMAM甲醇溶液至于反应瓶中氮气吹干,按照PEG:PAMAM=4:1(mol/mol)的比例,室温避光搅拌反应2h,使得PEG上的NHS基团和PAMAM分子表面的氨基特异反应,合成PAMAM-PEG。按照PAMAM-PEG:EpDT3=1:0.3(mol/mol)的比例,充氮气,室温避光搅拌反应24h,制得PAMAM-PEG-EpDT3。
实施例6
称取一定量的NHS-PEG-MAL粉末,于磷酸盐缓冲液(PBS,pH 8.0)溶解,配制成浓度为10mg/mL的溶液,将适量PAMAM甲醇溶液至于反应瓶中氮气吹干,按照PEG:PAMAM=6:1(mol/mol)的比例,室温避光搅拌反应2h,使得PEG上的NHS基团和PAMAM分子表面的氨基特异反应,合成PAMAM-PEG。按照PAMAM-PEG:EpDT3=1:0.5(mol/mol)的比例,充氮气,室温避光搅拌反应24h,制得PAMAM-PEG-EpDT3。
实施例7
称取一定量的NHS-PEG-MAL粉末,于磷酸盐缓冲液(PBS,pH 8.0)溶解,配制成浓度为10mg/mL的溶液,将适量PAMAM甲醇溶液至于反应瓶中氮气吹干,按照PEG:PAMAM=7:1(mol/mol)的比例,室温避光搅拌反应2h,使得PEG上的NHS基团和PAMAM分子表面的氨基特异反应,合成PAMAM-PEG。按照PAMAM-PEG:EpDT3=1:0.7(mol/mol)的比例,充氮气,室温避光搅拌反应24h,制得PAMAM-PEG-EpDT3。
实施例8
称取一定量的NHS-PEG-MAL粉末,于磷酸盐缓冲液(PBS,pH 8.0)溶解,配制成浓度为10mg/mL的溶液,将适量PAMAM甲醇溶液至于反应瓶中氮气吹干,按照PEG:PAMAM=10:1(mol/mol)的比例,室温避光搅拌反应2h,使得PEG上的NHS基团和PAMAM分子表面的氨基特异反应,合成PAMAM-PEG。按照PAMAM-PEG:EpDT3=1:1(mol/mol)的比例,充氮气,室温避光搅拌反应24h,制得PAMAM-PEG-EpDT3。
实施例9
采用CCK8法考察不同PAMAM-PEG-EpDT3载体对LNCaP细胞的毒性,具体方法如下:取对数生长期的LNCaP细胞接种于96孔板中,每孔8000个,于培养箱中孵育24h,至显微镜观察细胞浓度达到90%。在细胞孔中加入浓度为100、150、200μg/mL的PAMAM-PEG-EpDT3溶液,37℃孵育4h,吸除孵育液后,PBS洗两次,每孔加入含10ul CCK8的1640培养液100ul,培养箱中孵育30min,用酶标仪测定各孔在参比波长(630nm)和测定波长(450nm)处的OD值。未经纳米复合物处理的细胞孔为对照孔,计算细胞存活百分数,结果如下表所示。
表5不同载体对LNCaP细胞的毒性对比
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体,其特征在于,该给药载体由聚酰胺-胺型树状分支物PAMAM、聚乙二醇和EpDT3适配体构成,三者以共价方式链接;所述聚乙二醇与PAMAM的摩尔比为2~10:1,所述PAMAM与EpDT3的摩尔比为1:0.1~1;所述EpDT3适配体组成为:5'GCGACUGGUUACCCGGUCG-/3thiol/3'。
2.一种EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向药物递送系统,其特征在于,所述药物递送系统包含权利要求1所述的给药载体和pCDNA-MEG质粒。
3.根据权利要求2所述的EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向药物递送系统,其特征在于,所述PAMAM与pCDNA-MEG质粒的N/P为1~25:1。
4.一种如权利要求1所述的EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向给药载体的制备方法,其特征在于,该方法包括:
a)NHS-PEG-MAL与PAMAM按照摩尔比2~10:1的比例,室温避光搅拌反应,合成PAMAM-PEG;
b)PAMAM-PEG与权利要求1所述的EpDT3按照摩尔比1:0.1~1的比例,室温避光搅拌反应,合成PAMAM-PEG-EpDT3。
5.一种如权利要求2-3任一所述的EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向药物递送系统的制备方法,其特征在于,该方法包括:PAMAM-PEG-EpDT3和pCDNA-MEG质粒分别稀释,混合,涡旋,静置,制成EpDT3适配体修饰的前列腺癌靶向药物递送系统,其中,所述PAMAM与pCDNA-MEG质粒的N/P为1~25:1。
6.权利要求1所述的给药载体、权利要求2-3所述的药物递送系统在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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