CN110384680A - 一种温度/pH响应性双载药复合纳米粒子及其制备方法和用途 - Google Patents

一种温度/pH响应性双载药复合纳米粒子及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种温度/pH响应性双载药复合纳米粒子及其制备方法和用途，它是通过依次制备BBR@MSNp(NIPAM‑co‑MA)、LB膜、LEBM得到的。本发明通过将小檗碱(BBR)载到特定的温度和pH双响应功能性纳米粒子上，之后再创造性地利用吴茱萸碱(EVO)对其进行包覆，从而制备得到了具有特定结构的温度/pH响应性双载药复合纳米粒子。体内外实验表明，本发明靶向给药系统能够准确定位至肿瘤部位并实现药物的有效释放，本发明通过温度/pH响应性双载药纳米给药系统将吴茱萸碱(EVO)和小檗碱(BBR)联合给药用于治疗癌症，尤其对肝癌、宫颈癌和乳腺癌的治疗具有协同增效的作用，疗效显著。

Description

一种温度/pH响应性双载药复合纳米粒子及其制备方法和 用途
技术领域
本发明涉及一种温度/pH响应性双载药复合纳米粒子及其制备方法和用途。
背景技术
癌症严重威胁人类的健康和生命。其中，肝癌发病率约为25.7/10万，成为死亡率仅次于胃癌、肺癌的第三大恶性肿瘤。肝癌的治疗目前主要采用局部治疗，包括TACE术,PEI,射频消融术，放射治疗和手术治疗。各种治疗方法都有其优缺点和适应症，并均有不同程度的副作用。例如TACE术后患者常合并发热、疼痛、呕吐及肝功能损伤，术后生存质量低，身体机能显著下降，免疫力降低。TACE术,PEI,射频消融术，局部放射治疗和手术治疗都会不同程度地引起肝功能损伤，进一步加重肝硬化。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。乳腺癌目前是恶性肿瘤里面最常见的一种，也是夺取广大女性生命健康和生活质量的最常见疾病。一般采用手术切除治疗结合化疗阻碍癌细胞的扩散，这种治疗方法有相当的治疗效果，但是化疗后的不良作用也非常大，其中白细胞数量减少、质量变差就是其中一种。
目前治疗癌症的药物及手段虽很多，但由于种种原因，其疗效均不尽人意，因此，亟需开发一种适宜大规模推广的、惠及平民大众的、高效的、副作用小的、定向治疗癌症的药物。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种温度/pH响应性双载药复合纳米粒子及其制备方法和用途。
本发明提供了一种温度/pH响应性双载药复合纳米粒子，它是由以下方法制备得到的：
(1)BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)的制备：取温度和pH双响应型功能纳米粒子MSN@p(NIPAM-co-MA)，将小檗碱载到MSN@p(NIPAM-co-MA)的介孔中，形成单载小檗碱的功能纳米粒子，即得；
(2)LB膜的制备：将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与吴茱萸碱混合成膜，即得；
(3)LEBM的制备：将LB膜包裹在BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)上，形成LB膜包裹的双载药复合纳米粒子，即为LEBM。
其中，骤(1)中，所述MSN@p(NIPAM-co-MA)是通过以下方法制备得到的：
(a)MSNs的制备：利用表面活性剂，通过溶胶-凝胶法制得介孔二氧化硅纳米粒子，即为MSNs；
(b)MSN-MPS复合材料的制备：将甲基丙烯酰氧基硅烷MPS修饰到MSNs表面，形成MSN-MPS复合材料；
(c)MSN@p(NIPAM-co-MA)的制备：N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸通过聚合过程嫁接到 MSN-MPS上，制得MSN@p(NIPAM-co-MA)。
其中，步骤(a)中，所述MSNs是通过以下方法制备得到的：
将十六烷基三甲基溴化铵溶于水中，加入氨水，40℃下搅拌2h，加入正硅酸甲酯和乙酸乙酯， 6h后，得混合物，加入硝酸铵的乙醇溶液中，80℃回流45min，得MSNs；
优选的，
所述十六烷基三甲基溴化铵与水、氨水、正硅酸甲酯乙酸乙酯、硝酸铵、乙醇的投料比为0.2：100：3：0.5：5：0.5：50g/mL/mL/mL/mL/g/mL；
所述氨水为氨的体积分数为30％的水溶液。
其中，步骤(b)中，所述MSN-MPS复合材料是通过以下方法制备得到的：
将MSNs混悬在异丙醇中，再依次加入氨水和甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，40℃下搅拌 50min，即得MSN-MPS复合材料；
优选的，
所述MSNs与异丙醇、氨水、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的投料比为60：27：1.05： 0.08g/mL/mL/mL；
所述氨水为氨的体积分数为30％的水溶液。
步骤(c)中，所述MSN@p(NIPAM-co-MA)是通过以下方法制备得到的：
将MSN-MPS、N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、十二烷基硫酸钠、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾溶于水中，超声脱气，70℃下搅拌4h，即得MSN@p(NIPAM-co-MA)；
优选的，
所述MSN-MPS与N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、十二烷基硫酸钠、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾溶、水的投料比为65：205：10.4：16.8：45：12：60mg/mg/mL/mg/mg/mg/mL。
步骤(1)中，所述BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)是通过以下方法制备得到的：
取MSN@p(NIPAM-co-MA)纳米粒子，溶于小檗碱的乙醇溶液中，25℃下搅拌48h，即得BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)；
优选的，
所述小檗碱的乙醇溶液中小檗碱的浓度为0.4mg/ml；
所述MSN@p(NIPAM-co-MA)与小檗碱的乙醇溶液的质量体积比为1:2mg/mL。
步骤(2)中，所述LB膜是通过以下方法制备得到的：
将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000溶于氯仿中，配置DSPE-PEG2000混悬液；将吴茱萸碱溶于氯仿中，配置成EVO混悬液；将DSPE-PEG2000混悬液与EVO混悬液超声混合20min，挥干溶剂，得LB膜；
优选的，
所述DSPE-PEG2000混悬液中DSPE-PEG2000的浓度为100mg/mL；所述EVO混悬液中EVO与氯仿的质量体积比为10：1.1mg/mL；所述DSPE-PEG2000混悬液与EVO混悬液的体积比为250：11。
步骤(3)中，所述LEBM是通过以下方法制备得到的：
将步骤(1)所得的BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)溶于氯化钠水溶液中，加入步骤(2)所得的 LB膜，超声20min，即得温度和pH响应性双载药纳米粒子LEBM。
优选的，所述氯化钠水溶液的浓度为0.99％mg/mL；所述BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)与氯化钠水溶液的质量体积比为10～15：1mg/mL；所述超声的频率为30kHz；所述LEBM中EVO与BBR 的质量比为1：6～6：1。
所述的双载药复合纳米粒子在制备治疗癌症中的用途；优选的，所述癌症为肝癌、宫颈癌或乳腺癌。
本发明中：
所述“室温”为25±5℃。
所述“过夜”为12±1h。
EVO：吴茱萸碱。
BBR：小檗碱。
DSPE-PEG2000：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
氨水：氨的体积分数为30％的水溶液。
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵。
TEOS：正硅酸甲酯。
NIPAM：N-异丙基丙烯酰胺。
MA：甲基丙烯酸。
MPS：甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。
KPS：过硫酸钾。
SDS：十二烷基硫酸钠。
MBA：N,N-亚甲基双丙烯酰胺。
EA：乙酸乙酯。
MSNs是指“介孔二氧化硅纳米粒子”。
MSN-MPS：由介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)与甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)形成的MSN-MPS复合材料，简称MSN-MPS。
MSN@p(NIPAM-co-MA)：是一种温度和pH双响应功能性纳米粒子，是由N-异丙基丙烯酰胺 (NIPAM)、甲基丙烯酸(MA)、MSN-MPS制备得到的，简称MSN@p(NIPAM-co-MA)。
BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)：是将小檗碱载到MSN@p(NIPAM-co-MA)的介孔中形成的，是一种单载BBR的功能纳米粒子。
LB膜：又称脂质层，是由DSPE-PEG2000和吴茱萸碱(EVO)形成的，简称LB膜。
LEBM是LB-EVO@BBR@MSN@p(NIPAM-co-MA)的简称，是一种温度和pH响应性双载药纳米粒子，是利用含有吴茱萸碱(EVO)的LB膜包覆载有小檗碱(BBR)的BBR@MSNp(NIPAM-co-MA) 形成的。
本发明成功制备了具有温度/pH响应性双载药纳米给药系统，具体的，本发明通过将小檗碱 (BBR)载到特定的温度和pH双响应功能性纳米粒子上，之后再创造性地利用吴茱萸碱(EVO)对其进行包覆，从而制备得到了具有特定结构的温度/pH响应性双载药复合纳米粒子。体内外实验表明，本发明靶向给药系统能够准确定位至肿瘤部位并实现药物的有效释放。特别地，本发明通过温度/pH 响应性双载药纳米给药系统将吴茱萸碱(EVO)和小檗碱(BBR)联合给药用于治疗癌症，值得注意的是，本发明通过特定配比的吴茱萸碱(EVO)和小檗碱(BBR)，以及结合本发明所用的特定温度/pH响应性双载药纳米给药系统，对肝癌、宫颈癌和乳腺癌的治疗具有协同增效的作用，疗效显著。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为纳米粒子的透射电镜照片，(a为MSN)，(b为MSN@(NIPAM-co-MA))。
图2为纳米粒子的动态光散射粒径及zeta电位结果图，(a为MSN)，(b为 MSN@(NIPAM-co-MA)。
图3为纳米粒子的傅里叶变换红外光谱图。
图4为纳米粒子的TG曲线。
图5为MSN@(NIPAM-co-MA)的粒径随温度变化的可逆响应。
图6为MSN@(NIPAM-co-MA)的粒径随pH变化的响应。
图7为MSN的氮气吸附脱附等温线。
图8为MSN@(NIPAM-co-MA)的氮气吸附脱附等温线。
图9为MSN@(NIPAM-co-MA)在PBS中的DLS。
图10为EVO和BBR的HPLC色谱图(1为BBR，2为EVO)。
图11为EVO和BBR在不同介质条件下的累计释放率(a,b为BBR；c,d为EVO)。
图12为合成材料的细胞毒性(a:HepG-2cell；b:BEL-7402cell；c:Hela cell；d:HUVEC cell)。
图13为不同比例复合纳米粒子在不同时间对不同肿瘤细胞的细胞毒性(a,e,i:HepG-2cell；b,f,j:BEL-7402cell；c.g,k:Hela cell；d,h,l:HUVEC cell)。
图14为划痕实验：双载药复合纳米粒子抑制肿瘤细胞迁移。
图15为划痕实验：双载药复合纳米粒子抑制肿瘤细胞迁移量化结果。
图16为Transwell实验结果图：双载药复合纳米粒子抑制肿瘤细胞迁移。
图17为Transwell实验结果图：双载药复合纳米粒子抑制肿瘤细胞迁移量化结果。
图18为Transwell实验结果图：双载药复合纳米粒子抑制肿瘤细胞侵袭。
图19为Transwell实验结果图：双载药复合纳米粒子抑制肿瘤细胞侵袭量化结果。
图20为Hoechst染色结果图。
图21为双载药复合纳米粒子诱导肿瘤细胞凋亡情况。
图22为裸鼠肿瘤体积随时间变化。
图23为裸鼠肿瘤大小直观图。
图24为裸鼠体重随时间变化。
图25为裸鼠生存期。
图26为裸鼠各器官组织HE染色结果。
图27为TUNEL染色结果。
图28为TUNEL染色量化结果。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
1)原材料与试剂
吴茱萸碱(EVO)：武汉东康源科技有限公司(请写明本发明所用原料的来源)。
小檗碱(BBR)：武汉东康源科技有限公司(请写明本发明所用原料的来源)。
二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)：上海源叶生物科技有限公司。
2)主要仪器
透射电子显微镜:日本JEOL公司；
NEXUS-870型傅立叶红外光谱仪：美国Nicolet公司；
QuadraSorb Station3比表面和孔径分布测定仪(美国QuantachromeInstruments公司)Ultimate3000 型高效液相色谱仪(美国Dionex公司)；
Mastersizer3000激光粒度仪(英国马尔文公司)；
Perkin-ElmerTGA-7热重分析仪(德国Bruker公司)。
实施例1温度和pH响应性双载药介孔二氧化硅纳米粒子药物载体LEBM(1:1)的制备方法
1、介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)的制备
向圆底烧瓶中加入0.2g的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和10mL蒸馏水，40℃下，磁力搅拌5min，再依次加入90mL水和3mL氨水，在40℃连续磁力搅拌2h，500转/min。随后迅速加入0.5mL正硅酸甲酯(TEOS)和5mL乙酸乙酯(EA)，待反应6h后，冷却至室温，用水和乙醇依次洗三遍，得到混合物。称取0.5g硝酸铵溶解在50mL乙醇中，加入上述混合物，80℃回流45min。用乙醇、水依次洗三遍，得到 55.88mg介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)，真空干燥保存。
2、MSN-MPS复合材料的制备
将60mg介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)混悬在27mL异丙醇中，再依次加入1.05mL的氨水溶液 (30％)和0.08mL的甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MPS)，40℃持续磁力搅拌50min，即得MSN-MPS 复合材料。将所得的MSN-MPS复合材料用乙醇清洗，并通过3次反复的离心和清洗将产物提纯。
3、温度和pH双响应功能性纳米粒子(MSN@p(NIPAM-co-MA))的制备
将205mg的N-异丙基丙烯酰胺、10.4mL甲基丙烯酸、16.8mg十二烷基硫酸钠(作为稳定剂)、45mg N,N-亚甲基双丙烯酰胺、12mg过硫酸钾(引发剂)溶于60mL水中，形成透明溶液。称量65mg的 MSN-MPS加入到混合溶液中，将混合溶液超声脱气，在70℃条件下，持续磁力搅拌反应4h后，通过乙醇、水离心清洗得到终产物，即得温度和pH双响应功能性纳米粒子(MSN@p(NIPAM-co-MA))，真空干燥保存。
4、脂质层(LB膜)的制备
将100mg的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)溶于100mL的氯仿中，配置成DSPE-PEG2000为100mg/mL的混悬液。
称取40mg吴茱萸碱(EVO)溶于4.4mL氯仿溶液中，得到EVO的混悬液。
将上述DSPE-PEG2000混悬液和EVO的混悬液按照250：11的体积比混合，在超声下混合20分钟，倒入圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪在真空条件下将溶剂挥干形成脂质层(LB膜)。LB膜放在化学罩过夜以除去剩余的微量有机残留。
5、温度和pH响应性双载药纳米粒子(LB-EVO@BBR@MSN@p(NIPAM-co-MA))(LEBM)的制备 (本发明中LEBM等同于(LB-EVO@BBR@MSN@p(NIPAM-co-MA))，是对 (LB-EVO@BBR@MSN@p(NIPAM-co-MA))的简称)。
称取50mg的(MSN@p(NIPAM-co-MA))纳米粒子，溶于100ml含0.4mg/ml的小檗碱(BBR)的乙醇溶液中，25℃下，持续磁力搅拌48小时，1000转离心5分钟收集上清液，离心后的纳米粒子干燥后溶于 6ml的0.99％mg/mL氯化钠溶液，混匀。
将混匀后的纳米粒子加入到铺满脂质层的圆底烧瓶中，以30kHz的频率超声20min。收集圆底烧瓶混悬液，离心后真空干燥，即得温度和pH响应性双载药纳米粒子 (LB-EVO@BBR@MSN@p(NIPAM-co-MA))(LEBM)，制备得到的温度和pH响应性双载药纳米粒子中EVO和BBR的载药量为1:1，即为LEBM(1:1)。
实施例2不同比例的双载药复合纳米粒子的制备
根据EVO和BBR的载药量，通过调节EVO和BBR的搭载量，以实施例1所述载药方法合成EVO和 BBR的比例为6:1的双响应型复合纳米粒子。即EVO:BBR(6:1)的双载药纳米粒子，即为LEBM(6:1)。
实施例3不同比例的双载药复合纳米粒子的制备
根据EVO和BBR的载药量，通过调节EVO和BBR的搭载量，以实施例1所述载药方法合成EVO和 BBR的比例为1:6的双响应型复合纳米粒子。即EVO:BBR(1:6)的双载药纳米粒子，即为LEBM(1:6)。
实施例4双载药复合纳米粒子的药物释放
称实施例3制备的载药纳米粒子LEBM(1：6)60mg，分散于10ml的PBS中，随后转移至透析袋中，将透析袋置于100ml的PBS中，在设定的温度37℃下，140转/分钟，水浴恒温振荡仪中缓慢振荡。每隔30min取2ml溶液，同时补加2ml的PBS使得总体积不变，以HPLC检测其药物含量，计算药物累计释放率。
实验例1纳米粒子的表征
1、透射电镜的表征结果
本发明利用透射电镜表征介孔二氧化硅纳米粒子的表面，图1是合成材料的透射电镜图，图1-a是实施例1步骤1和步骤3制备得到的介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)的电镜图，图1-b是MSN修饰后的温敏材料和pH敏感材料的电镜图。
由图1-a可以得出，MSNs的平均直径为80±15nm，呈现规则的球形，且分散均匀，表面能看到其独特的孔道结构。由图1-b可以得出，温度和pH双响应功能性纳米粒子(MSN@p(NIPAM-co-MA))的平均直径为200±25nm，纳米粒子依然具有良好的分散性且不发生聚集。
由透射电镜可以得出，修饰后的纳米粒子MSN@p(NIPAM-co-MA)的表面成功包覆有一层聚合物包裹的外壳。
2、动态光散射粒径及zeta电位结果
本发明通过动态光散射粒径及zeta电位结果来检测合成材料是否均匀的分散在水中，图2是合成材料的动态光散射粒径结果，图2-a是实施例1步骤1制备得到的介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)的动态光散射粒径结果以及Zeta电位图，图2-b是MSN修饰后的温敏材料和pH敏感材料的动态光散射粒径结果以及Zeta电位图。
由图2的动态光散射粒径结果可知，合成材料能够均匀的分散在水中。由Zeta电位图可以看出修饰后的MSN负电荷增加，其表面电势值约为-35.7mV。
综上，由图2可知，修饰前后的MSN粒径分布均一，无较大或较小颗粒；MSN@(NIPAM-co-MA) 比MSN的表面上显示出更加稳定的负电荷，即修饰后的纳米粒子更加稳定且不容易发生聚集。
3、傅里叶转换红外(FTIR)光谱
本发明利用傅氏转换红外线光谱分析仪通过表征MSN、MSN-MPS、MSN@(NIPAM-co-MA)的傅里叶变换红外光谱来判断NIPAM和MA是否成功的聚合到MSN上，图3为傅里叶转换红外(FTIR)光谱图。
图3中MSN-MPS的傅里叶变换红外光谱中的1720cm-1处出现了-C＝C-COO-的振动，说明MPS已经成功修饰到MSN表面了。MSN@(NIPAM-co-MA)的傅里叶变换红外光谱在1545cm-1和1643cm-1处的特征吸收峰分别为二级酰胺C＝O键的伸展振动和N-H的弯曲振动，表明NIPAM及MA成功的聚合到MSN 上。
综上，由图3可知，MPS已经成功修饰到MSN表面，NIPAM及MA成功的聚合到MSN上，表明了 MSN@(NIPAM-co-MA)的成功修饰。
4、热重分析结果
本发明利用热重分析表征MSN、MSN-MPS、MSN@(NIPAM-co-MA)的TG曲线来进一步表征 MSN@(NIPAM-co-MA)是否成功合成。图4为纳米粒子的TG曲线。
由图4可知，温度升高到600℃时，MSN-MPS的重量损失为7.58％，MSN@(NIPAM-co-MA)的重量损失为15.33％。
综上，图4中的重量损失规律符合共聚物的分解规律，进一步证实MSN@(NIPAM-co-MA)的成功合成。
5、MSN@(NIPAM-co-MA)功能性纳米粒子的温度和pH双响应
本发明通过测定不同pH和温度条件下复合纳米粒子的粒径，来观察MSN@(NIPAM-co-MA)的响应特性，图5为MSN@(NIPAM-co-MA)的粒径随温度变化的可逆响应，图6为MSN@(NIPAM-co-MA) 的粒径随pH变化的响应。
图5中，当介质温度由35℃升高到45℃时，纳米粒子的粒径减小约为220±20nm；温度再降低为35℃时，纳米粒子的粒径恢复至原始值，约为355±28nm。连续升温降温几个循环发现纳米粒子的粒径大小随温度的变化是重复可逆的。
图6中，固定介质温度，调节其pH，同样可以看到复合纳米粒子的粒径随pH的升高而增大。
综上，由图5和图6可知，本发明合成的离子型共聚凝胶介孔二氧化硅MSN@(NIPAM-co-MA)的体积相变同时有温敏性和pH值敏感性，即具有温度和pH双响应型，本发明通过温度和pH的变化可诱导 MSN@(NIPAM-co-MA)纳米粒子表面的聚合材料发生解聚而促使其粒径发生改变，实现温度和pH双响应。
6、氮气吸附脱附等温线和相应的孔径分布曲线
本发明通过表征MSN、MSN@(NIPAM-co-MA)的氮气吸附脱附等温线和相应的孔径分布曲线来判断MSN及修饰后的MSN@(NIPAM-co-MA)是否具有明显的介孔结构特征。图7和图8分别为MSN、 MSN@(NIPAM-co-MA)的氮气吸附脱附等温线和相应的孔径分布曲线。
由图7和图8可知，根据IUPPAC的分类类型，合成材料的氮气吸附脱附曲线为典型的Ⅳ型等温曲线，并且在0.8-1.09(P/PO)之间表现出明显的H1滞后环。说明MSN及修饰后的MSN@(NIPAM-co-MA) 具有明显的介孔结构特征。
利用Barret-Joyner-Halenda(BJH)的计算方法(如表1)，可以看出MSN的主孔径为2.88nm， MSN@(NIPAM-co-MA)的主孔径为2.2nm。尽管修饰后的纳米粒子孔径减小，但是其主孔径仍然大于 2nm，说明修饰材料并没有较大程度上堵塞介孔，修饰后的纳米粒子仍然能够充分实现药物的负载。通过Brunauer-Emmet-Teller(BET)方法计算(如表1)，MSN和MSN@(NIPAM-co-MA)的比表面积分别为 670.8m2/g和528.2m2/g。
综上，本发明合成后的介孔二氧化硅纳米粒子仍然具有较大介孔孔径、介孔体积和比表面积，具有足够的空间实现药物搭载。
表1两种材料结构和表面性质
样品 表面积(m<sup>2</sup>/g) 介孔体积(cm<sup>3</sup>/g) 介孔直径(nm)
MSN 670.8 0.96 2.88
MSN@p(NIPAM-co-MA) 528.2 0.84 2.2
7、动态光散射粒径(DLS)
本发明利用动态光散射粒径(DLS)来观察复合纳米粒子的稳定性，图9为MSN@(NIPAM-co-MA) 在PBS中的DLS。
将MSN@(NIPAM-co-MA)浸泡在PBS中，在25℃条件下，检测其动态光散射粒径(DLS)，浸泡72h 后，MSN@(NIPAM-co-MA)的粒径约为380±10nm，与之前粒径(365±15nm)相比没有多大变化，说明复合纳米粒子在PBS中具有良好的稳定性，不容易出现聚集沉淀等现象。
图9表明，本发明制备得到的MSN@(NIPAM-co-MA)复合纳米粒子在PBS中具有良好的稳定性，不容易出现聚集沉淀。
综上，由实验例1可知，本发明成功制备得到了MSN@(NIPAM-co-MA)，修饰后的纳米粒子 MSN@p(NIPAM-co-MA)的表面成功包覆有一层聚合物包裹的外壳，且粒径分布均一，更加稳定且不容易发生聚集，同时有温敏性和pH值敏感性，具有较大介孔孔径、介孔体积和比表面积，具有足够的空间实现药物搭载，在PBS中具有良好的稳定性，不容易出现聚集沉淀。
实验例2双载药功能性纳米粒子的药物释放
1、EVO和BBR的最大载药量和包封率
本发明利用高效液相色谱仪检测EVO和BBR的载药量和包封率，图10为EVO和BBR的HPLC色谱图(图10中，1为BBR，2为EVO)。
HPLC检测方法为：
色谱柱ChromplusTM-C18(150mm×4.6mm,5μm)，
流动相A为乙腈，流动相B为0.3％磷酸-0.3％三乙胺；修改说明：流动相B为0.3％磷酸-0.3％三乙胺，此处，0.3％磷酸是指体积分数为0.3％的磷酸水溶液；0.3％三乙胺是指体积分数为0.3％的三乙胺水溶液。
梯度洗脱见表2；
流速为1.0mL·min-1；
柱温为25℃；
检测波长为225nm；
进样量为10μL；
流动相进样前超声脱气30min。
表2HPLC梯度洗脱
时间(min) 流动相A：乙腈(％) 流动相B：0.3％磷酸-0.3％三乙胺(％)
0 25 75
10 30 70
15 55 45
25 65 35
30 25 75
综上，根据HPLC检测含量的结果可计算得出，EVO的包封率为98％，载药率为56.22％；BBR 的包封率为87％，载药率为8.41％。
2、EVO和BBR在不同介质条件下的累计释放率
本发明通过EVO和BBR在不同介质条件下的累计释放率来推断本发明温度和pH敏感性药物载体是否成功合成以及是否能够实现药物的可控释放。图11为EVO和BBR在不同介质条件下的累计释放率 (其中，图11-a,11-b为BBR；11-c,11-d为EVO)，具体为，负载了EVO和BBR的LEBM(1：6)在PBS 缓冲溶液中，随温度、pH及时间变化(测试温度为35℃及45℃,pH为3.5、5.5、7.4)的体外释放曲线。
如图11a所示，本发明LEBM(1：6)在pH3.5条件下BBR的释放量最高为22.06％，当环境温度高于人体正常生理环境，为45℃时，BBR的释放量明显增加，且在pH3.5条件下出现了一个小爆发，随后实现持续稳定释放(如图11b)。药物在11小时左右达到坪值，累计药物释放量达到了57.98％。由于环境温度高于LCST，介孔二氧化硅表面聚合物骤缩打开介孔，内部的BBR以自由扩散的形式向外快速释放至达到平衡。
而环境pH值也同样影响了BBR的释放，在固定温度下，p(NIPAM-co-MA)聚合物群的低临界溶解温度(LCST)值随p H值的减小而降低。更加促使介孔表面共聚物发生卷曲，聚合物链收缩打开介孔表面使药物从介孔内部释放出来。与BBR的释放相比，包裹在脂质层的EVO释放更快速。在pH为 7.4、低温条件下，EVO的释放量与BBR都较低约为9.26％，10.68％(如图11a,c)。说明双载药物在复合型纳米载体中比较稳定，只具有最小的药物渗漏量，在血液循环过程中对正常组织的毒性作用较小。而在低pH和高温条件下，包裹在介孔表面的脂质层迅速容散释放药物，能够实现药物的靶向突释(如图11b,d)。EVO和BBR的最高释放量高达57.98％，89.01％。
根据两种药物的累计释放曲线，可以推断本研究的温度和pH敏感性药物载体的成功合成并且能够实现药物的可控释放，具有潜在的临床应用价值。因为如癌症或炎症这类疾病会使患者体温升高。此靶向载体在到达目标肿瘤组织时，通过强渗透性和EPR效应的胞吞作用，被细胞摄取。由于进一步减少的内涵体/溶酶体区室内pH值，使肿瘤组织处于弱酸性环境中，使靶向载体中药物快速释放，更大程度的诱导肿瘤细胞死亡。此类靶向药物输送载体可有效地减少药物的副作用和药物毒性，并可最大限度地积累在肿瘤组织中。
实验例3温度和pH响应的双载药纳米粒子介导肿瘤细胞凋亡
1、实验仪器及试剂
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
1.1、主要试剂
DMEM培养基：美国HyClone。
胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司)。
胰蛋白酶：美国HyClone。
双抗：美国HyClone。
Matrigel胶：美国sigma。
CCK-8试剂盒、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒、Hoechst染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)
Transwell侵袭小室(ECM550)(美国Millipore)
μ-Slide血管生成载玻片(德国ibidi公司)。
1.2、试剂的配置
所有试剂的配置均在超净工作台内。
DMEM培养基：1mL双抗加入到10mL胎牛血清中，用无血清DMEM培养基定容至100mL，4℃冷藏保存。
冻存液：用胎牛血清配置含10％DMSO的细胞-20℃冻存液。
LEBM(6:1)：用DMSO配置LEBM(6:1)母液(0.5mg/mL)，再根据所需药物浓度用已配置好的DMEM 培养基稀释。
LEBM(1:6)：用DMSO配置LEBM(1:6)母液(0.5mg/mL)，再根据所需药物浓度用已配置好的DMEM 培养基稀释。
FEVO/BBR(6:1)组：EVO与BBR按6:1机械混合(free EVO:BBR(6:1)(FEVO/BBR(6:1)：按照 LEBM(6:1)中药物含量称取EVO与BBR，用DMSO配置母液(0.5mg/mL)，再根据所需药物浓度用已配置好的DMEM培养基依次稀释。
FEVO/BBR(1:6)组：EVO与BBR按1:6机械混合(free EVO:BBR(1:6)(FEVO/BBR(1:6)：按照 LEBM(1:6)中药物含量称取EVO与BBR，用DMSO配置母液(0.5mg/mL)，再根据所需药物浓度用已配置好的DMEM培养基依次稀释。
FEVO组：用DMSO配置Free EVO(FEVO)母液(0.5mg/mL)，再根据实验所需药物组浓度用已配置好的DMEM培养基依次稀释。
FBBR组：用DMSO配置Free BBR(FBBR)母液(0.5mg/mL)，再根据实验所需药物组浓度用已配置好的DMEM培养基依次稀释。
1.3、实验细胞
HepG-2细胞和Hela细胞由本实验室冻存。
BEL-7402细胞和HUVEC细胞购于武汉普洛塞生命科技有限公司。
EMT-6细胞由电子科技大学生命科学实验室馈赠。
2、双载药纳米粒子细胞学实验方法
2.1、细胞培养方法
细胞冻存：冻存前一天需要更换新鲜培养基。用PBS清洗细胞两遍，加入适量胰蛋白酶消化，用含血清的培养基终止消化低速离心去上清液并收集对数生长期细胞。加入1mL冻存液使细胞混悬均匀后转移至冻存管中，将冻存管置于-20℃下30分钟和-80℃过夜再移至液氮罐中长期储存。
细胞复苏：从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃恒温水浴锅中快速晃动1～2分钟，直至冻存液完全溶解。加入5mL培养基混悬冻存液后离心去上清液收集细胞。用已配置的DMEM培养基混悬细胞并将细胞悬液转移至培养瓶中于37℃，5％CO2浓度培养箱中培养。
细胞传代培养：显微镜下观察细胞生长情况，当细胞贴壁密度达到80％时，用PBS清洗细胞两遍，加入适量胰蛋白酶消化，用含血清的培养基终止消化低速离心去上清液并收集细胞，再次加入DMEM 培养基混悬细胞并将细胞混悬液分装于2个培养瓶中继续于培养箱中培养。
2.2、细胞毒性实验
Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。甲瓒物生成量可以用酶标仪在450nm处进行测定其吸光度值(OD)确定。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
①细胞铺板
收集对数生长期的HepG-2细胞、Hela细胞、BEL-7402细胞和HUVEC细胞，经胰蛋白酶消化后用 DMEM配置成细胞悬液。在96孔板中每孔加入100μL密度为104个/孔的细胞悬液，96孔板边缘加入无菌PBS。于37℃、5％CO2培养箱中培养贴壁。细胞分组给药：①合成材料的细胞毒性：将上述贴壁细胞分6组，分别加入0μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml的MSN、MSN-MSP、(MSN@p(NIPAM-co-MA))于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，加入10μLCCK-8试剂至每孔。培养箱中继续培养3小时，在450nm波长处用酶标仪测定其吸光度。
根据下式计算细胞存活率：
细胞存活率％＝[(A加药)-(A空白]/[(A0加药)-(A空白)]×100％
A加药：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度。
A空白：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度。
A0加药：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
②药物的抗肿瘤作用
把上述贴壁细胞分为6个组6个梯度，并加入相应的药物组即单纯EVO组、单纯BBR组、 FEVO/BBR(1:6)组、FEVO/BBR(6:1)组、LEBM(1:6)组、LEBM(6:1)组。将6种不同药物浓度分别加入相应孔中，于37℃、5％CO2培养箱中培养12h、24h、36h、后，加入10μLCCK-8试剂至每孔。培养箱中继续培养3小时，在450nm波长处用酶标仪测定其吸光度。按照①中公式计算细胞存活率。
根据单纯药物组药物浓度设置FEVO/BBR(1:6)组、FEVO/BBR(6:1)组、LEBM(1:6)组、 LEBM(6:1)组药物浓度梯度。即两种药物混合组其含药总量为单纯药物组单一药物含量。例如单纯 EVO组、单纯BBR组中含EVO和BBR各30μg/ml，则对应FEVO/BBR(1:6)组、FEVO/BBR(6:1)组、 LEBM(1:6)组、LEBM(6:1)组中含EVO和BBR一共30μg/ml。其药物浓度配置适用于本研究所有细胞学实验和动物学实验。
2.3、细胞划痕实验
先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。取对数生长期的3种肿瘤细胞(HepG-2；Hela；BEL-7402)加入到6孔板中，细胞浓度为每孔约5×105个细胞，过夜培养贴壁。将细胞分为7组，即空白组、单纯EVO组FEVO组、单纯BBR 组FBBR组、FEVO/BBR(1:6)组、FEVO/BBR(6:1)组、LEBM(1:6)组、LEBM(6:1)组，药物组用无血清DMEM培养基配置。第二天用100μL枪头比着直尺，尽量垂直于6孔板背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞。加入3mL药物浓度为30μg/ml的相应药物组，转移至37℃、5％CO2培养箱。培养12小时后取样，显微镜下拍照。
2.4、Transwell实验
①细胞迁移实验：用image J软件计算肿瘤细胞的迁移量
取对数生长期肿瘤细胞制备细胞悬液，用无血清DMEM培养基调整细胞浓度为5×104cells/ml，加入到Transwell小室中。24孔板下室加入600μL含20％FBS的培养基，注意不要产生气泡。将24孔板放入培养箱培养贴壁后(约2～3小时)，小心移出上室培养基，根据分组分别加入100μL药物浓度为30μg/ml 的FEVO组、FBBR组、LEBM(1:6)组、LEBM(6:1)组于上室细胞中。药物组用无血清DMEM培养基配置。继续培养48h后取出Transwell小室，弃去孔中培养基，甲醇固定30分钟后用无钙的PBS洗2遍，将小室适当风干。0.1％结晶紫染色20分钟，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。用活细胞工作站随机选取5个视野观察细胞，并计数。
②细胞侵袭实验
将Matrigel在4℃过夜融化，用4℃预冷的无血清DMEM培养基稀释其终浓度为1mg/mL(冰上操作)。在小室上室底部中央垂直加入100μL稀释后的Matrigel，注意不要产生气泡，37℃温育4小时使其干成胶状。取对数生长期肿瘤细胞制备细胞悬液，用无血清DMEM培养基调整细胞浓度为 5×104cells/ml，加入Transwell小室中。24孔板下室加入600μL含20％FBS的培养基，注意不要产生气泡。将24孔板放入培养箱培养贴壁后(约2～3小时)，小心移出上室培养基，根据分组分别加入100μL药物浓度为30μg/ml的FEVO组、FBBR组、LEBM(1:6)组、LEBM(6:1)组于上室细胞中。药物组用无血清DMEM 培养基配置。继续培养48h后取出Transwell小室，弃去孔中培养基，甲醇固定30分钟后用无钙的PBS 洗2遍，将小室适当风干。0.1％结晶紫染色20分钟，用棉签轻轻擦掉上层基质胶以及未迁移细胞，用 PBS洗3遍。用活细胞工作站随机选取5个视野观察细胞，并计数。
2.5、体外血管新生实验
实验前一天将Matrigel置于冰盒中4℃过夜缓慢融化。(注意：枪头、ibidi血管生成载玻片于4℃预冷)。取出ibidi血管生成载玻片，每孔中加入10μL Matrigel。注意枪头要垂直于内孔的正上方加入 Matrigel，防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。将载玻片放入10cm 的培养皿中，整个培养皿放入培养箱中，静置30分钟左右，等待胶凝结。取对数生长期HUVEC细胞，制备密度为2×105cells/ml的细胞悬液并充分混匀。将胶已经凝固的ibidi血管生成载玻片取出，每孔加入50μl的细胞悬液，注意保持枪头垂直在上孔的上方，不要接触下孔的凝胶。用培养基稀释相应药物组药物浓度为30μg/ml，根据分组分别加入100μl药物浓度为30μg/ml的FEVO组、FBBR组、LEBM(1:6) 组、LEBM(6:1)组于上室细胞中。盖上盖，放回培养箱培养4h后取出在显微镜下随机选取5个视野观察小管数目及管状结构完整性。
2.6、Hoechst染色
Hoechst33342能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的蓝色荧光。凋亡的细胞核染色增强,荧光更为明亮，呈圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易判别。取盖玻片于70％乙醇中浸泡5分钟后用PBS洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍并将盖玻片置于6孔板内。取对数生长期肿瘤细胞，制备密度为4×105cells/ml 的细胞悬液并充分混匀。加入3ml细胞混悬液与载玻片上，培养箱中过夜培养贴壁。吸取6孔板内培养基并用PBS洗3遍，用培养基稀释相应药物组药物浓度为30μg/ml，根据分组分别加入100μl药物浓度为 30μg/ml的FEVO组、FBBR组、LEBM(1:6)组、LEBM(6:1)组于上室细胞中。培养箱培养12h后，吸尽培养液，加入固定液，固定30分钟。去固定液，用PBS洗两遍，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。加入终浓度为10μg/ml的Hoechst染色液，染色10分钟。用PBS洗两遍后将贴有细胞的盖玻片盖于载玻片上，尽量避免气泡。置于荧光显微镜下检测。
2.7、流式细胞仪检测
取对数生长期肿瘤细胞，制备密度为3×105cells/ml的细胞混悬液并充分混匀取3mL细胞悬液于6 孔板中置培养箱中培养过夜，弃去旧培养基并用PBS清洗3遍后加入3mL药物浓度为30μg/ml的FEVO 组、FBBR组、FEVO/BBR(1:6)组、FEVO/BBR(6:1)组、LEBM(1:6)组、LEBM(6:1)组的含药培养基继续培养12h。用不含EDTA的胰蛋白酶消化各组细胞并低速离心收集，用预冷的PBS洗涤细胞2次，离心5min，收集1×105个细胞。吸弃PBS，加入100μLBinding Buffer重悬细胞。加入5μl Annexin V-FITC 和10μL PI Staining Solution，轻轻混匀。避光、室温反应10-15min。样品在1小时内用流式细胞仪检测。
2.8、统计分析
采用SPSS13.0软件(IBM,USA)进行统计分析，各组数据以平均值±标准偏差(SD)表示。单因素方差分析(one-way ANOVA)用于确定组间的显著性，之后使用Bonferroni校正检验用于各组之间的比较。统计显著性在p<0.05处建立。
3、实验结果：双载药纳米粒子抑制肿瘤细胞侵袭、迁移及诱导凋亡
3.1、细胞划痕实验判断药物抑制肿瘤细胞迁移的能力
细胞划痕实验(Wound Healing)是一种研究肿瘤细胞迁移的体外试验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。根据不同实验分组加入抑制细胞迁移的药物观察划痕愈合情况来判断所加药物是否具有抑制肿瘤细胞迁移的能力。
在加入不同药物组过后，3种肿瘤细胞的迁移都受到一定程度的抑制(如图14所示)。与Control组相比，含药对照组的细胞愈合率均低于70％，具有一定程度的抑制肿瘤细胞迁移作用。
根据量化实验结果(图15)可知，LEBM(1:6)和LEBM(6:1)组处理的三组肿瘤细胞最低愈合率分别为29.65％,12.44％，与Control组相比具有显著性差异。通过对比单类药物的抑制肿瘤细胞迁移情况可以发现，FEVO比FBBR具有更强的抑制细胞迁移的能力，而在EVO高比例组FEVO/BBR(6:1)和 LEBM(6:1)组中同样可以看到类似结果。说明EVO比BBR更能抑制肿瘤细胞迁移，可以与BBR协同作用于肿瘤细胞提高抑制肿瘤活性。
3.2、利用Transwell实验判断所加药物是否具有抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的能力
肿瘤细胞的侵袭和迁移是肿瘤细胞恶性行为，即恶性肿瘤细胞离开原发肿瘤向周围组织进攻，其标志是肿瘤细胞突破基底膜。肿瘤侵袭是肿瘤细胞与周围间质相互作用和机体整体调节的结果。因此细胞与基底膜间的相互作用是调控细胞行为的重要因素之一。利用Transwell小室建立肿瘤细胞迁移和侵袭模型，位于上室的matrigel基质胶模拟肿瘤细胞周围间质。通过加入不同实验分组药物观察肿瘤细胞穿透基质层的数量来判断所加药物是否具有抑制肿瘤细胞迁移、侵袭的能力。
3种肿瘤细胞经过不同药物组处理后，根据量化结果(如图17,19)可知LEBM(1:6)和LEBM(6:1)组与游离药物组相比更能有效的抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。特别是对于BEL-7402细胞，双载药符合纳米粒子与Control相比显示出更强的抑制能力，其细胞迁移和侵袭率分别为6.01％，3.37％。
而在Transwell实验中同样可以发现EVO比BBR具有更强的抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的能力(如图 16,18)。
结合划痕实验和Transwell实验结果，对比细胞毒性结果可以推断，EVO在抑制细胞增殖的基础上更倾向于抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭，而BBR则更侧重于抑制肿瘤细胞增殖。LEBM(1:6)和LEBM(6:1) 通过不同比例搭载两种药物，使其相互促进抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭，实现两种药物协同发挥抗肿瘤作用。为EVO和BBR联合用药提供新思路，和前期实验基础。
3.2、利用Hoechst染色检测细胞凋亡
细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。又称为程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程。它涉及一系列基因的激活，表达以及调控等作用。它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。
细胞凋亡的形态特征主要表现在：细胞凋亡初期，细胞核内染色质浓缩形成密集颗粒呈帽状，位于核膜下，其邻近的核孔消失，而在常染色质区核孔数增加。随后，细胞凋亡过程中出现核膜下核纤层的分解，核内染色质固缩为不均一点状结构。改变特征随着细胞核的改变，相邻细胞间连接复合体普遍消失,其它细胞膜特有的结构如微绒毛等也随之消失。此时，细胞膜仍保持完整，有的细胞器如内质网，高尔基体及核被膜膨大，形成泡状结构与细胞膜融合，以出胞作用离开正在死亡的细胞，将所包含的完整细胞器和核膜碎片等细胞内容物由细胞质膜包被成有蜷曲外形的凋亡小体。凋亡小体很快被周围邻近的间质细胞或巨噬细胞吞噬，而不引起周围组织的炎症反应。
Hoechst33342，是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。Hoechst33342染色用于细胞凋亡检测，染色封片后在荧光显微镜下观察。细胞发生凋亡时，会看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。
如图20所示，Control组细胞多为多角形、菱形。HepG-2、BEL-7402、Hela3种不同肿瘤细胞经FEVO、 FBBR、LEBM(1:6)和LEBM(6:1)处理后与正常组细胞相比均出现不同的亮蓝色荧光，3种肿瘤细胞逐渐变圆、变小，细胞核内颗粒增加；呈波纹状、折缝样，染色质出现浓缩状态。说明FEVO、FBBR、 LEBM(1:6)和LEBM(6:1)均能够不同程度的诱导肿瘤细胞发生凋亡。
3.3、流式细胞仪分析检测凋亡早晚期的细胞以及死细胞
AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(AnnexinV-FITC Apoptosis DetectionKit)是用FITC标记的重组人AnnexinV来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸的一种细胞凋亡检测试剂盒。在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV 是相对分子质量为35000大小的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。碘化丙啶 (PropidineIodide，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失，Annexin V-FITC 可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
在流式细胞仪的结果中可见(如图20)，左下象限Annexin-V(-)/PI(-)代表正常细胞，右下象限 Annexin-V(+)/PI(-)代表早期凋亡细胞，左上象限Annexin-V(-)/PI(+)代表坏死细胞，右上象限 Annexin-V(+)/PI(+)代表晚期凋亡细胞。为了进一步研究LEBM对诱导Hela细胞、HepG-2细胞、 BEL-7402细胞凋亡的增强作用，通过将3种肿瘤细胞分为7两组加药后进行Annexin-V/PI双染，通过流式细胞仪分析。
Control组加入0μg/ml药物；其他5组分别加入0μg/ml FEVO、FBBR、FEVO/BBR(1:6)、 FEVO/BBR(6:1)、LEBM(1:6)、LEBM(6:1)。结果表明：FEVO和FBBR分别作用于3种肿瘤细胞，FEVO 诱导肿瘤细胞最高早期凋亡率约为13.1％，FBBR约为7.6％。表明EVO比BBR更能够诱导肿瘤细胞发生早期凋亡。当两种药物按不同比例混合给药后，其诱导细胞发生凋亡的程度更强，FEVO/BBR(1:6) 组HepG-2肿瘤细胞早期凋亡率约为78.0％、Hela肿瘤细胞早期凋亡率约为75.7％、BEL-7402肿瘤细胞早期凋亡率约为76.9％。而FEVO/BBR(6:1)诱导肿瘤细胞早期凋亡率最高为41.0％，虽然高于单纯药物组，但是与FEVO/BBR(1:6)相比仍然较低。
综合LEBM(1:6)、LEBM(6:1)组诱导肿瘤细胞凋亡结果，可以发现EVO与BBR联合用药可以增强两药诱导肿瘤细胞发生凋亡。当BBR以高比例混合用药时，更能够诱导肿瘤细胞发生凋亡。以 MSN@p(NIPAM-co-MA)为载体用1：6和6：1比例搭载EVO与BBR时即LEBM(1:6),LEBM(6：1)， 3种肿瘤细胞平均早期凋亡率到达90％。结合前期细胞学实验，说明我们合成的双载药复合纳米粒子不仅能够有效的抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，并且能够诱导肿瘤细胞最大程度的发生早期凋亡，并且实现两种药物的协同增效作用。
实验例4温度和pH响应的双载药纳米粒子体内抗肿瘤作用
1、实验仪器及试剂
1.1、主要仪器
转轮式切片机(徕卡-2016，德国)；
TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司)；
BMJ-Ⅲ型包埋机(常州郊区中威电子仪器厂)；
PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；
数码三目摄像显微镜(BA400Digital，麦克奥迪实业集团有限公司)等；
图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)。
1.2、主要试剂
组织标本固定液(4％多聚甲醛固定液)：国药集团化学试剂有限公司生产。
PBS磷酸盐缓冲液，北京中杉金桥生物技术有限公司生产。
无水乙醇(AR级)，成都科龙化工试剂厂生产。
二甲苯(AR级)，成都科龙化工试剂厂生产。
苏木素染液：苏木素(AR级)，北京百灵威科技有限公司生产。
伊红染液：伊红(AR级)，东京化成工业株式会社生产。
封片试剂；中性树胶，中国上海懿洋仪器有限公司。
3-氨丙基-3-乙养基甲硅烷(APES)，北京中杉金桥生物技术有限公司。
显色剂：浓缩型DAB试剂盒，批号：K135925C，北京中衫金桥生物有限公司；
胰蛋白酶K(Proteinase K)，批号：1245680100，美国Merck Millipore公司；
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒(In situ cell death detection kit-POD法)，批号：10279600，瑞士罗氏公司(Roche Group)。
1.3、实验动物
裸小鼠(BALB/C)，雌性，17～20g，5～6周龄，40只，由四川省人民医院实验动物研究所提供。饲养于成都医学院科研中心SPF级动物实验室。饲养条件：恒温(22～25℃)、恒湿(40％～50％)的SPF层流，饲料和水经高温高压灭菌。
1.4、试剂的配制
所有试剂的配置均在超净工作台内。
LEBM(6:1)：用DMSO配置LEBM(6:1)母液(5mg/mL)，用注射用生理盐水(0.99％的氯化钠水溶液) 稀释至0.2mg/ml，根据实验动物体重计算给药体积。
LEBM(1:6)：用DMSO配置LEBM(1:6)母液(5mg/mL)，再用注射用生理盐水(0.99％的氯化钠水溶液)稀释至0.2mg/ml，根据实验动物体重计算给药体积。
FEVO/BBR(6:1)：EVO与BBR按6:1机械混合(free EVO:BBR(6:1)(FEVO/BBR(6:1)：按照 LEBM(6:1)中药物含量称取EVO与BBR，用DMSO配置母液(5mg/mL)，再用注射用生理盐水(0.99％的氯化钠水溶液)稀释至0.2mg/ml，根据实验动物体重计算给药体积。
FEVO/BBR(1:6)：EVO与BBR按1:6机械混合(free EVO:BBR(1:6)(FEVO/BBR(1:6)：按照 LEBM(1:6)中药物含量称取EVO与BBR，用DMSO配置母液5mg/mL)，再用注射用生理盐水(0.99％的氯化钠水溶液)稀释至0.2mg/ml，根据实验动物体重计算给药体积。
Saline：注射用生理盐水(0.99％的氯化钠水溶液)，该实验组每只动物注射生理盐水0.3mL。
Taxol：用注射用生理盐水(0.99％的氯化钠水溶液)配置0.2mg/ml，根据实验动物体重计算给药体积。
2、双载药纳米粒子体内抗肿瘤作用实验方法
2.1、动物模型的建立
取对数生长期EMT-6细胞，用注射用生理盐水(0.9％的氯化钠水溶液)制成浓度为2×106个/ml的细胞悬液，于每只裸鼠腋下皮下接种细胞悬液0.2ml。一周后待肿瘤长出，并且肿瘤体积达到100mm3，对裸鼠进行分组实验。
2.2、肿瘤生长体重及体积的测量
将实验动物随机分为6组，每组6只。实验组分组：空白组(尾静脉注射生理盐水)，紫杉醇组(尾静脉注射紫杉醇2mg/kg)，单纯EVO和BBR混合组(尾静脉注射含EVO和BBR两种药物总量为2mg/kg)，加载EVO和BBR的MSN@p(NIPAM-co-MA)组(尾静脉注射含EVO和BBR两种药物总量为2mg/kg的纳米粒混合液)，以给予处理日第二天开始为0日，隔2天测量1次各组裸鼠体重和肿瘤体积。以游标卡尺测量肿瘤长径和短径，根据steel肿瘤体积计算公式v＝ab2/2，a代表长径，b代表短径，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
2.3、肿瘤组织的保存
给药21天后，在无菌条件下，脱颈处死各实验组裸鼠。切开裸鼠腹部，小心取出其心、肝、脾、肺、肾等各个器官组织，并置于4％多聚甲醛溶液中固定保存。同时切开裸鼠腋下皮肤后小心剥离取出肿瘤组织，将取出的裸鼠肿瘤置于4％多聚甲醛溶液中固定保存，并分组做好标记。
2.4HE染色
固定器官组织经全自动脱水机脱水，包埋，切片后进行染色封片。在显微镜下观察并用Image-Pro Plus 6.0对实验结果图片进行处理分析。每个组织切片随机选择5个视野进行观察进行统计分析。
2.5、TUNEL染色检测
双载药纳米粒子对肿瘤细胞凋亡的作用固定器官组织经全自动脱水机脱水，修剪、包埋、切片、染色、封片后。在显微镜下观察并用Image-Pro Plus 6.0对实验结果图片进行处理分析。每个组织切片随机选择5个视野进行观察进行统计分析。
2.6、统计分析
数据以平均值±标准偏差(SD)表示。单因素方差分析(one-way ANOVA)用于确定组间的显著性，之后使用Bonferroni校正检验用于各组之间的比较。统计显著性在p<0.05处建立。
3、实验结果
3.1、肿瘤体积及体重的测量
在给药第一天后每隔两天测量一次肿瘤体积，研究双载药纳米载体对消退肿瘤生长的效果。通过对每组测定的肿瘤体积绘制以时间轴函数图像。
如图22所示，其中只用生理盐水处理的小鼠肿瘤体积增长迅速。相比之下，用单纯EVO和BBR 混合处理的小鼠，对肿瘤生长只有轻微的抑制效果，这表明单纯EVO和BBR在抑制和消退肿瘤生长方面的疗效不佳。而紫杉醇作为临床上治疗乳腺癌的一线用药，对于乳腺癌的治疗效果是显而易见的。但是由于紫杉醇的水难溶性，故其体内生物利用度较低、靶向性较差。虽然紫杉醇处理的小鼠其肿瘤生长受到了明显的抑制但是其小鼠体重及生存周期明显收到了抑制。
与之相比，负载EVO和BBR的MSN@p(NIPAM-co-MA)组则有效抑制了肿瘤的生长，并且肿瘤出现了一定程度的消退(如图23所示)。同时，LEBM(1:6)和LEBM(6:1)组的小鼠体重出现了一定程度的增长，其生存周期较紫杉醇对照组相比也有相当程度的延长(如图24所示)。通过肿瘤终体积直观图可以看出本文制备的靶向给药系统中对肿瘤消退效果作用明显(如图23)。位于体内LEBM(1:6)和LEBM(6:1)对抗肿瘤的功效与位于体外的细胞毒性一致。LEBM在体内循环时间较单纯药物相比增长，同时纳米粒的靶向作用使得肿瘤中EVO和BBR局部浓度的增加。
3.2、HE染色检测结果
双载药纳米粒子对肿瘤转移的作用生理盐水组小鼠由于没有用任何药物治疗，各器官组织均出现了很大程度的病变(如图26所示)。部分肝细胞颗粒变性、胞质染色不均，可见数量不等的细小颗粒物质；小叶内部分肝细胞呈点状坏死，伴少量炎细胞浸润；肝窦内偶见少量炎细胞浸润；脾脏白髓区域脾小结反应性增生，可见生发中心明显扩张，淋巴细胞数量明显增多。肺内可见大量异形性较大的细胞聚集成团，疑似肿瘤转移灶。肿瘤组织出现多发性灶状或片状坏死，坏死区域所占面积约为5％。
而与生理盐水组相比，紫杉醇组小鼠肿瘤组织坏死区域所占面积约为60％，但其其他器官组织也均产生了一定程度的病变，特别是脾脏可见均质淡染的淀粉样物质沉积，淋巴细胞数量减少，部分肾小管可见上皮细胞变性，胞质染色不均，少量细胞脱落。单纯EVO和BBR混合组虽然其肿瘤坏死区域面积与紫杉醇组相比较小(FEVO/BBR(1:6)约为35％,FEVO/BBR(6:1)约为20％)，且其对正常器官也产生了一定的影响，其脾脏、肝脏均出现了一定程度的病变。LEBM(1:6)和LEBM(6:1)组中肿瘤组织坏死部位面积为74％、80％，同时，两靶向给药组其正常器官组织均未出现较大病变，或见肿瘤转移灶出现。
说明我们合成的双响应性靶向给药系统确实具有靶向性，能够定位到肿瘤组织中产生较强的抗肿瘤活性作用，并且对正常器官组织不会产生毒副作用。
3.3、Tunel法检测肿瘤细胞凋亡
TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素(fluorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3-OH末端，并与连接辣根过氧化酶(HRP，horse-radish peroxidase)的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺 (DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色)，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNEL染色还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
如图27所示，凋亡细胞核颜色为浅黄色或棕黄色，阴性表达为蓝色，底色为白色。与生理盐水组相比各个用药对照组肿瘤组织均出现了一定程度的凋亡。根据量化结果可知，LEBM(1:6)和LEBM(6:1) 组肿瘤细胞凋亡率分40.32％,51.24％，远远高于FEVO/BBR(1:6)和FEVO/BBR(6:1)(14.36％,20.76％)(如图28)。这说明pH/温度智能双响应控释介孔二氧化硅纳米粒子能够提高EVO和BBR介导乳腺癌EMT-6 细胞凋亡的发生。这一结果与体外实验所得结果相一致。
综上，本发明成功制备了具有温度/pH响应性双载药纳米给药系统，具体的，本发明通过将小檗碱(BBR)载到特定的温度和pH双响应功能性纳米粒子上，之后再创造性地利用吴茱萸碱(EVO)对其进行包覆，从而制备得到了具有特定结构的温度/pH响应性双载药复合纳米粒子。体内外实验表明，本发明靶向给药系统能够准确定位至肿瘤部位并实现药物的有效释放。特别地，本发明通过温度/pH响应性双载药纳米给药系统将吴茱萸碱(EVO)和小檗碱(BBR)联合给药用于治疗癌症，值得注意的是，本发明通过特定配比的吴茱萸碱(EVO)和小檗碱(BBR)，以及结合本发明所用的特定温度/pH响应性双载药纳米给药系统，对肝癌、宫颈癌和乳腺癌的治疗具有协同增效的作用，疗效显著。

Claims (10)

1.一种温度/pH响应性双载药复合纳米粒子，其特征在于：它是由以下方法制备得到的：
(1)BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)的制备：取温度和pH双响应型功能纳米粒子MSN@p(NIPAM-co-MA)，将小檗碱载到MSN@p(NIPAM-co-MA)的介孔中，形成单载小檗碱的功能纳米粒子，即得；
(2)LB膜的制备：将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇与吴茱萸碱混合成膜，即得；
(3)LEBM的制备：将LB膜包裹在BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)上，形成LB膜包裹的双载药复合纳米粒子，即为LEBM。
2.根据权利要求1所述的双载药复合纳米粒子，其特征在于：步骤(1)中，所述MSN@p(NIPAM-co-MA)是通过以下方法制备得到的：
(a)MSNs的制备：利用表面活性剂，通过溶胶-凝胶法制得介孔二氧化硅纳米粒子，即为MSNs；
(b)MSN-MPS复合材料的制备：将甲基丙烯酰氧基硅烷MPS修饰到MSNs表面，形成MSN-MPS复合材料；
(c)MSN@p(NIPAM-co-MA)的制备：N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸通过聚合过程嫁接到MSN-MPS上，制得MSN@p(NIPAM-co-MA)。
3.根据权利要求2所述的双载药复合纳米粒子，其特征在于：步骤(a)中，所述MSNs是通过以下方法制备得到的：
将十六烷基三甲基溴化铵溶于水中，加入氨水，40℃下搅拌2h，加入正硅酸甲酯和乙酸乙酯，6h后，得混合物，加入硝酸铵的乙醇溶液中，80℃回流45min，得MSNs；
优选的，
所述十六烷基三甲基溴化铵与水、氨水、正硅酸甲酯乙酸乙酯、硝酸铵、乙醇的投料比为0.2：100：3：0.5：5：0.5：50g/mL/mL/mL/mL/g/mL；
所述氨水为氨的体积分数为30％的水溶液。
4.根据权利要求2所述的双载药复合纳米粒子，其特征在于：步骤(b)中，所述MSN-MPS复合材料是通过以下方法制备得到的：
将MSNs混悬在异丙醇中，再依次加入氨水和甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，40℃下搅拌50min，即得MSN-MPS复合材料；
优选的，
所述MSNs与异丙醇、氨水、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的投料比为60：27：1.05：0.08g/mL/mL/mL；
所述氨水为氨的体积分数为30％的水溶液。
5.根据权利要求2所述的双载药复合纳米粒子，其特征在于：步骤(c)中，所述MSN@p(NIPAM-co-MA)是通过以下方法制备得到的：
将MSN-MPS、N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、十二烷基硫酸钠、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾溶于水中，超声脱气，70℃下搅拌4h，即得MSN@p(NIPAM-co-MA)；
优选的，
所述MSN-MPS与N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、十二烷基硫酸钠、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸钾溶、水的投料比为65：205：10.4：16.8：45：12：60mg/mg/mL/mg/mg/mg/mL。
6.根据权利要求1所述的双载药复合纳米粒子，其特征在于：步骤(1)中，所述BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)是通过以下方法制备得到的：
取MSN@p(NIPAM-co-MA)纳米粒子，溶于小檗碱的乙醇溶液中，25℃下搅拌48h，即得BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)；
优选的，
所述小檗碱的乙醇溶液中小檗碱的浓度为0.4mg/ml；
所述MSN@p(NIPAM-co-MA)与小檗碱的乙醇溶液的质量体积比为1:2mg/mL。
7.根据权利要求1所述的双载药复合纳米粒子，其特征在于：步骤(2)中，所述LB膜是通过以下方法制备得到的：
将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000溶于氯仿中，配置DSPE-PEG2000混悬液；将吴茱萸碱溶于氯仿中，配置成EVO混悬液；将DSPE-PEG2000混悬液与EVO混悬液超声混合20min，挥干溶剂，得LB膜；
优选的，
所述DSPE-PEG2000混悬液中DSPE-PEG2000的浓度为100mg/mL；所述EVO混悬液中EVO与氯仿的质量体积比为10：1.1mg/mL；所述DSPE-PEG2000混悬液与EVO混悬液的体积比为250：11。
8.根据权利要求1所述的双载药复合纳米粒子，其特征在于：步骤(3)中，所述LEBM是通过以下方法制备得到的：
将步骤(1)所得的BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)溶于氯化钠水溶液中，加入步骤(2)所得的LB膜，超声20min，即得温度和pH响应性双载药纳米粒子LEBM。
9.根据权利要求8所述的双载药复合纳米粒子，其特征在于：所述氯化钠水溶液的浓度为0.99％mg/mL；所述BBR@MSNp(NIPAM-co-MA)与氯化钠水溶液的质量体积比为10～15：1mg/mL；所述超声的频率为30kHz；所述LEBM中EVO与BBR的质量比为1：6～6：1。
10.权利要求1～9任意一项所述的双载药复合纳米粒子在制备治疗癌症中的用途；优选的，所述癌症为肝癌、宫颈癌或乳腺癌。
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