CN105434347B - 一种多肽纳米胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

一种多肽纳米胶束及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种癌症治疗性多肽纳米胶束，所述多肽能够抑制癌症转移，所述多肽纳米胶束是由聚乙二醇化磷脂(PEG‑PE)和多肽自组装形成，所述的聚乙二醇化磷脂为聚乙二醇通过共价键和磷脂分子上的含氮碱基结合形成的化合物。具体而言，本发明涉及一种利用PEG‑PE胶束提高多肽生物稳定性的方法，并提供了多肽‑PEG‑PE纳米胶束的制备方法和在抑制癌症转移中的应用。PEG‑PE和多肽形成的纳米胶束在盐溶液中具有较好的稳定性，与单独的多肽相比，表现出更强的抑制癌症细胞迁移浸润的特性。本发明的多肽‑PEG‑PE纳米胶束为抑制癌症转移和治疗癌症提供可行的方法和技术。

Description

一种多肽纳米胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一种以聚乙二醇化磷脂为载体的多肽纳米胶束，及其制备方法和应用。
背景技术
恶性癌症是目前全球发病和死亡的主要原因，其中约90％的癌症患者死于癌症转移和复发，阻断癌症转移的某个环节以达到遏制癌症扩散的目的对于癌症的治疗至关重要。趋化因子与趋化因子受体不仅参与正常生理活动，而且参与癌症发生、浸润和转移等病理过程，其中CXCR4/SDF-1(或CXCL12)在癌症迁移和侵袭过程中起着重要作用，发展CXCR4受体的拮抗剂对于控制癌症转移、提高癌症治愈率非常关键。
由于多肽易于设计合成、在人体内易于代谢并且不会带来毒副作用和严重的免疫反应，因此开发CXCR4受体的多肽拮抗剂为癌症治疗提供了新的有效手段和策略。然而，多肽药物通常存在口服给药生物活性低、易降解和体内半衰期短、水溶性不理想等问题，导致其临床应用受到极大限制，亟需开发新的制剂和工艺来改善多肽药物的体内外稳定性，提高药物在癌症组织中的有效浓度和延长体内循环时间，这对于治疗转移性癌症具有重要的实际意义。
为了提高多肽药物的稳定性和生物利用度，迄今为止人们进行了许多载体方面的研究。例如：利用生物相容性可降解材料(例如聚乳酸或乳酸-乙醇酸共聚物)包裹多肽分子，制成微球制剂，通过高分子材料的降解来控制药物释放，维持有效的血药浓度。但多数微球制剂都存在药物突释及随后的低释现象，会造成血药浓度过高或者过低，此外，微球制剂在生产过程中也容易造成多肽的降解。利用脂质体包载亲水性或亲脂性多肽虽然能够提高多肽的稳定性，但是单位质量脂质体中可包载的多肽量通常较低，药物的生物利用度难以达到期望值。因此，需要开发新的载体系统来提高多肽的包载量及维持释放期间的有效血药浓度。
聚合物型胶束是一类受到广泛关注的新型药物载体，是由两亲性嵌段聚合物在合适的浓度和温度条件下在溶剂体系中自发地形成的直径小于100nm的核-壳结构体系。目前，聚合物型胶束主要用于小分子化疗药物的包载，不仅可以有效解决化疗药物水溶性差、体循环中降解较快、药物吸收困难及毒副作用大等问题，还能通过渗透滞留增强效应(EPR)实现其在癌症病灶区域的富集。虽然，利用聚合物胶束包载多肽的研究在国内外的报道中还很少，但从两者的物理化学性质方面来看，胶束载体的疏水核及核壳层能够对水溶性较低的多肽或两亲性多肽具有较高的包载能力，胶束载体的亲水冠能保护多肽不受蛋白酶的降解，增加多肽的体内外稳定性；此外，从生物相容性角度考虑，多肽被胶束化后能够提高其在循环系统中的稳定时间，增加多肽的生物利用度。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种多肽纳米胶束及其制备方法和应用，所述多肽纳米胶束由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和癌症靶向性多肽自组装形成，该多肽纳米胶束提高了水溶性好但盐溶性差的癌症靶向性多肽在盐溶液中溶解性和生物稳定性，提高了多肽和靶点的结合效率而发挥抗肿瘤作用，该多肽纳米胶束具有抑制癌症转移的作用。
本发明采用如下技术方案：
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和癌症靶向性多肽自组装形成，所述癌症靶向性多肽是能够与表达或过量表达趋化因子受体CXCR4的癌症细胞或癌症组织靶向结合的多肽。
上述多肽纳米胶束，其中：
所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)为聚乙二醇(亲水嵌段)通过共价键和磷脂分子(疏水嵌段)上的含氮碱基结合形成的化合物。
优选地，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为500～10000，进一步优选为1500～5000，更优选为2000～3000；最优选为2000。
优选地，所述多肽纳米胶束的粒径为10-100nm；进一步优选为10-50nm；更优选为15-30nm。
优选地，所述癌症靶向性多肽选自以极性氨基酸为主、以疏水氨基酸为主、或者兼有极性氨基酸和疏水性氨基酸的多肽中的一种或几种。
优选地，所述癌症靶向性多肽由5～100个氨基酸组成，进一步优选为10～50个氨基酸，更优选为20～30个氨基酸。
最优选地，所述癌症靶向性多肽为E5多肽或FITC(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)标记的E5多肽。
所述E5多肽由22个氨基酸组成。本发明发现，该E5多肽能主动靶向到高表达CXCR4受体的肿瘤细胞表面，进而发挥作用。
具体地，所述E5多肽的氨基酸序列：GGRSFFLLRRIQGCRFRNTVDD；所述FITC标记的E5多肽的氨基酸序列：FITC-GGRSFFLLRRIQGCRFRNTVDD。
所述E5多肽或FITC标记的E5多肽可按现有常规技术人工合成，也可外购商品化产品，例如由上海科肽生物科技有限公司合成的E5多肽或FITC标记的E5多肽，纯度为98％。
所述E5多肽或FITC标记的E5多肽具有水溶性好、盐溶性差的特点。
所述E5多肽相关信息参见文献www.nature.com/scientificreports，4:6610|DOI:10.1038/srep06610 1，A designed peptide targeting CXCR4 displays anti-acute myelocytic leukemia activity in vitro and in vivo(一种靶向CXCR4的治疗白血病的多肽)，Xiaojin Li et al.(李潇瑾等)。
优选地，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和所述癌症靶向性多肽的摩尔比为4～20:1，例如可以是20:1、10:1、5:1或4:1。
优选地，所述癌症靶向性多肽与PEG-PE的结合方式为物理结合。
优选地，所述多肽纳米胶束为溶液形式或冻干形式。
本发明还提供上述多肽纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
分别制备PEG-PE分子溶液和多肽分子溶液；将PEG-PE分子溶液和多肽分子溶液混匀、孵育、静置，获得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液。
上述多肽纳米胶束的制备方法，其中：
优选地，制备PEG-PE分子溶液和多肽分子溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液(即PBS溶液)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、生理盐水或无菌超纯水中的任意一种；更优选为磷酸盐缓冲液(即PBS溶液)；
优选地，将上述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子配制成2-20mg/mL溶液；将上述癌症靶向性多肽分子配制成1-5mg/mL溶液；
优选地，所述混匀是将所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子溶液加入到所述癌症靶向性多肽分子溶液中，充分混匀，得混合溶液；
优选地，所述混合溶液中聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子和癌症靶向性多肽分子的摩尔比为4～20:1，例如可以是20:1、10:1、5:1或4:1；
优选地，所述孵育温度为20～60℃，孵育时间为10～60min；进一步优选地，所述孵育温度为40～55℃，孵育时间为20～30min；
优选地，所述静置为室温(一般15-25℃)静置2～24小时。
根据需要，上述多肽纳米胶束的制备方法还进一步包括将除菌后的多肽-PEG-PE纳米胶束溶液进行冻干，制备多肽纳米胶束冻干粉的步骤。
进一步优选地，所述冻干包括向所得除菌后的多肽-PEG-PE纳米胶束溶液中添加一定量的冻干保护剂；所述冻干保护剂优选为甘露醇，例如浓度为0.01～0.2g/mL的甘露醇。
具体地，上述多肽纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制溶液：将上述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子用磷酸盐缓冲液配制成2-20mg/mL溶液；将上述癌症靶向性多肽分子用磷酸盐缓冲液配制成1-5mg/mL溶液；
(2)混匀：将所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子溶液加入到所述癌症靶向性多肽分子溶液中，充分混匀，得混合溶液；
(3)孵育：将步骤(2)中所得混合溶液于20～60℃水浴孵育10～60min；
优选地，所述孵育温度为40～55℃，孵育时间为20～30min。
(4)静置；优选地，所述静置为室温(一般15-25℃)静置2～24小时；得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液。
优选地，上述多肽纳米胶束的制备方法还进一步包括将静置后所得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液除菌的步骤，进一步优选地，所述除菌为将步骤(4)静置后所得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液用0.22μm滤膜过滤。
根据需要，上述多肽纳米胶束的制备方法还进一步包括将除菌后的多肽-PEG-PE纳米胶束溶液进行冻干，制备多肽纳米胶束冻干粉的步骤。
进一步优选地，所述冻干包括向所得除菌后的多肽-PEG-PE纳米胶束溶液中添加一定量的冻干保护剂；所述冻干保护剂优选为甘露醇，例如浓度为0.01～0.2g/mL的甘露醇。
本发明所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)可由现有常规技术制备。
本发明还包括上述多肽纳米胶束以及上述制备方法所制备的多肽纳米胶束在制备治疗癌症药物中的应用；优选地，在制备抑制癌症转移药物中的应用；进一步优选地，在制备抑制与表达或过量表达趋化因子受体CXCR4的癌症细胞或癌症组织相关的癌症转移药物中的应用。
优选地，所述与表达或过量表达趋化因子受体CXCR4的癌症细胞或癌症组织相关的癌症包括乳腺癌、白血病、淋巴瘤、膀胱癌或肝癌中的任意一种；进一步优选地，为乳腺癌或肝癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所述多肽纳米胶束(即多肽-PEG-PE纳米胶束)具有提高多肽在盐溶液中溶解性的能力，且增强了其生物稳定性；提高了多肽和靶点的结合效率。本发明多肽分子在磷酸缓冲液(PBS)溶液中是不能完全溶解且有肉眼可见的白色片状物存在；而多肽-PEG-PE纳米胶束在PBS溶液中得到了很好的分散，初始粒径均在30nm左右，并且在72h内粒径没有发生明显改变；同时所得到的多肽和多肽-PEG-PE纳米胶束具有抑制癌症细胞转移的作用，与单独的多肽相比，表现出更强的抑制癌症细胞迁移浸润的特性。该多肽及多肽-PEG-PE纳米胶束可以为抑制癌症转移和治疗癌症提供可行的方法和技术。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。
图1为实验例1中，E5-PEG-PE纳米胶束(FITC标记的E5多肽)在PBS溶液中的溶解度。
图2a-2b为实验例1中，PEG-PE空胶束和E5-PEG-PE纳米胶束在PBS溶液中的动态光散射粒径分析。
图3a-3b为实验例1中，PEG-PE空胶束和E5-PEG-PE纳米胶束在PBS溶液中的透射电镜图片。
图4a-4b为实验例2中，FITC-E5多肽和FITC-E5-PEG-PE纳米胶束与MCF-7细胞CXCR4受体在不同多肽浓度或不同孵育时间条件下的亲和力检测。
图5a-5b为实验例3中，FITC-E5多肽和FITC-E5-PEG-PE纳米胶束与HepG2细胞CXCR4受体在不同多肽浓度或不同孵育时间条件下的亲和力检测。
图6为实验例4中，E5多肽和E5-PEG-PE纳米胶束对CXCL12诱导MCF-7细胞迁移过程中相关基因表达的抑制作用结果图。
图7为实验例5中，E5多肽和E5-PEG-PE纳米胶束对CXCL12诱导HepG2细胞迁移过程中相关基因表达的抑制作用结果图。
图8a-8b为实验例6中，E5多肽和E5-PEG-PE纳米胶束对CXCL12诱导MCF-7细胞迁移的抑制作用结果图。
图9a-9b为实验例7中，E5多肽和E5-PEG-PE纳米胶束对CXCL12诱导HepG2细胞迁移的抑制作用结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
除非特别指明，以下实施例中所用的人乳腺癌细胞系MCF-7和人肝癌细胞系HepG2均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。
除非特别指明，以下实施例中所用的PBS溶液均为1×PBS溶液。
10×PBS溶液的配制：NaCl 80.00g，KCl 2g，Na2HPO4·12H2O 35.8g或Na2HPO414.2g，KH2PO4 2.7g，用超纯水定容至1000mL，调节其pH值为7.2～7.4，高压灭菌。
1×PBS溶液的配制：将10×PBS溶液用无菌超纯水稀释10倍。
多肽E5的合成：
E5多肽的氨基酸序列：GGRSFFLLRRIQGCRFRNTVDD，FITC标记的E5多肽的氨基酸序列：FITC-GGRSFFLLRRIQGCRFRNTVDD。按照所示的序列分别合成E5多肽和FITC标记的E5多肽(由上海科肽生物科技有限公司合成，纯度为98％)，实验前配制成合适浓度的母液。
实施例1
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽的摩尔比为20:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例2
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽的摩尔比为10:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例3
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽的摩尔比为5:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例4
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽的摩尔比为4:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例5
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和FITC标记的E5多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽的摩尔比为20:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例6
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和FITC标记的E5多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽的摩尔比为10:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例7
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和FITC标记的E5多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽的摩尔比为5:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例8
一种多肽纳米胶束，由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和FITC标记的E5多肽自组装形成，其中，所述聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000，聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和E5多肽的摩尔比为4:1，该多肽纳米胶束的粒径为10-30nm。
实施例9
一种实施例1所述多肽纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：将E5多肽分子用无菌超纯水配制成1mg/mL溶液，将PEG-PE分子用无菌超纯水配制成10mg/mL溶液，取一定量的PEG-PE分子水溶液加入到E5多肽水溶液中，在溶液充分混匀后，加入1/9溶液体积的10×PBS溶液，使之稀释为E5-PEG-PE纳米胶束的1×PBS溶液，使混合溶液中PEG-PE分子与E5多肽分子的摩尔比为20:1；孵育：将所得混合溶液于40℃水浴孵育30min；静置：室温(25℃)静置12小时，得到E5-PEG-PE纳米胶束溶液。
实施例10
一种实施例2所述多肽纳米胶束的制备方法，与实施例9的区别仅在于混合溶液中PEG-PE分子与E5多肽分子的摩尔比为10:1。
实施例11
一种实施例3所述多肽纳米胶束的制备方法，与实施例9的区别仅在于混合溶液中PEG-PE分子与E5多肽分子的摩尔比为5:1。
实施例12
一种实施例4所述多肽纳米胶束的制备方法，与实施例9的区别仅在于混合溶液中PEG-PE分子与E5多肽分子的摩尔比为4:1。
实施例13
一种实施例5所述多肽纳米胶束的制备方法，与实施例9的区别仅在于：将E5多肽替换为FITC标记的E5多肽，孵育温度为55℃，孵育时间为20min。
实施例14
一种实施例6所述多肽纳米胶束的制备方法，与实施例13的区别在于混合溶液中PEG-PE分子与E5多肽分子的摩尔比为10:1。
实施例15
一种实施例7所述多肽纳米胶束的制备方法，与实施例13的区别在于混合溶液中PEG-PE分子与E5多肽分子的摩尔比为5:1。
实施例16
一种实施例8所述多肽纳米胶束的制备方法，与实施例13的区别在于混合溶液中PEG-PE分子与E5多肽分子的摩尔比为4:1。
实施例17
一种多肽纳米胶束及其制备方法，该制备方法与实施例9的区别仅在于还包括进一步加入在多肽-PEG-PE纳米胶束溶液中添加冻干保护剂浓度为0.05g/mL的甘露醇，制备成多肽纳米胶束冻干粉。
实验例1 E5多肽分子、FITC标记的E5多肽分子及E5-PEG-PE纳米胶束在PBS溶液中溶解性实验
分别将E5多肽分子或FITC标记的E5多肽分子(即FITC-E5多肽分子)用无菌超纯水配制成1mg/mL溶液，将PEG-PE分子(其中PEG段的分子量为2000)用无菌超纯水配制成10mg/mL溶液。取一定量的PEG-PE水溶液加入FITC-E5多肽或E5多肽水溶液中，使溶液中PEG-PE分子与FITC-E5多肽或E5多肽分子的摩尔比为20:1～4:1之间。在溶液充分混匀后，加入1/9溶液体积的10×PBS溶液，使之稀释为FITC-E5-PEG-PE纳米胶束或E5-PEG-PE纳米胶束的1×PBS溶液。将配制好的溶液置于4℃冰箱中。以仅含FITC-E5多肽分子或E5多肽分子或PEG-PE分子的1×PBS溶液作为对照。
FITC-E5多肽浓度为40μM，PEG-PE胶束浓度依次为0-200μM(0，20，40，80，120，160，200μM)，然后将FITC-E5和FITC-E5-PEG-PE的1×PBS溶液分别在40℃水浴中孵育20min，之后，室温避光静置2h。将上述FITC-E5和FITC-E5-PEG-PE的1×PBS溶液以2000rpm的转速离心5min，取上清液，荧光酶标仪检测FITC-E5多肽的相对荧光强度(激发发射波长488/535nm)以计算不同条件下溶解的FITC-E5多肽的相对浓度。
FITC-E5多肽溶液在1×PBS溶液中是不溶解的，静置后分层，FITC-E5多肽聚集在试管底。随着PEG-PE胶束的加入，FITC-E5多肽在PBS中的溶解度随着PEG-PE浓度的不断增大而增加，当PEG-PE和FITC-E5多肽的摩尔比大于或等于4:1时，FITC-E5多肽完全溶解在PBS溶液中。如图1所示(图1中Control是指PBS溶剂对照组)，从离心后上清液中FITC-E5多肽的相对荧光强度来看，其溶解在PBS中的FITC-E5多肽分子数量是随着PEG-PE浓度的增大而增加的，说明PEG-PE胶束能够显著增加E5多肽在盐溶液中的溶解性。
FITC-E5多肽分子的浓度为25μM，PEG-PE胶束浓度为100μM，将E5和FITC-E5-PEG-PE的1×PBS溶液混匀后，40℃水浴30min，室温避光静置12h。将E5-PEG-PE纳米胶束的PBS溶液摇匀后取1mL置于1cm×1cm塑料样品池内，进行动态光散射(DLS，Zetasizer Nano ZS，Malvern，英国)测试，以PEG-PE空胶束的1×PBS溶液(100μM)作为空白对照，测量各样品的粒径分布情况。
动态光散射反映了溶液中分子的粒径变化，如图2a所示，PEG-PE空胶束在1×PBS溶液中的粒径为10-30nm。根据实验室前期实验结果，E5多肽(或FITC-E5多肽)在1×PBS溶液中是不溶解的，有肉眼可见的白色(或粉黄色)片状物出现，其粒径均在300nm以上；如图2b所示，E5-PEG-PE纳米胶束在PBS溶液的粒径为10-30nm，与PEG-PE空胶束的粒径相近，说明E5多肽和PEG-PE发生了物理结合，PEG-PE能够显著地增加E5多肽在盐溶液中的溶解性。
E5多肽分子的浓度为25μM，PEG-PE胶束浓度为100μM，将E5和E5-PEG-PE纳米胶束的1×PBS溶液混匀后，40℃水浴30min，室温避光静置12h。将E5-PEG-PE纳米胶束的PBS溶液摇匀后，取10μL样品滴在经辉光放电处理后表面活化的镀碳膜铜网上，静置5min，滤纸吸干溶液，取5μL 2％醋酸双氧铀或2％磷酸钨染色液(使用之前以4000rpm的转速离心5min，除去未能完全溶解的染色液)染色60s，滤纸吸干染色液，用透射电子显微镜(transmissionelectron microscopy，TEM，HT7700，日立公司)观察样品，图3的样品是经2％醋酸双氧铀负染。
透射电镜反映了样品的形貌和粒径大小，如图3a所示，PEG-PE空胶束在PBS溶液中是以球形结构存在，粒径分布较均一；如图3b所示，当PEG-PE胶束载入E5多肽分子后，E5-PEG-PE纳米胶束保持球形结构，均一性更优于PEG-PE空胶束，粒径大小无明显变化。说明PEG-PE之所以能够增加E5多肽分子在盐溶液中的溶解性，是因为单个E5多肽分子能被PEG-PE胶束的核壳分界层包载，避免了E5多肽分子之间的相互作用而引起的聚集。
实验例2 FITC-E5多肽或FITC-E5-PEG-PE纳米胶束与MCF-7细胞CXCR4受体亲和力的检测。
以MCF-7细胞系作为研究乳腺癌细胞系的模型体系。在康宁(Corning)24孔板中，每孔使用1mL DMEM培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养2×105个细胞，将24孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，使细胞贴壁。
第一种实验条件：向Corning 24孔板中每孔加入10μL不同浓度FITC-E5多肽或FITC-E5-PEG-PE纳米胶束(实施例5，6，8的样品)的PBS溶液，使E5多肽的最终浓度为1μM、5μM和10μM，PEG-PE胶束的浓度为10-40μM，空白对照组只加入10μL PBS溶液，将24孔细胞培养板在孵箱中孵育2h。
第二种实验条件：向Corning 24孔板中加入10μL FITC-E5多肽或FITC-E5-PEG-PE纳米胶束(实施例8的样品)的PBS溶液，使E5多肽的最终浓度为5μM，PEG-PE的浓度为20μM，空白对照只加入10μL PBS溶液，将24孔细胞培养板在孵箱中孵育0-5h。
在上述两种情况下，利用流式细胞仪(FCM，acoustic focusingcytometer，Applied Biosystems，Life Technologies，Carlsbad，CA)，设置发射波长488nm，检测波长535nm(1通道)。将阴性对照组细胞样品放置于仪器样品架并开始检测，根据细胞大小，在前向角信号(FSC)，侧向角信号(SSC)的散点图中设门，并在记录检测结果前设置阈值，使得荧光强度的数量统计峰图中，门中的细胞荧光强度高于阈值荧光强度以上的数量低于1％，设置完成后，计数10,000个细胞。在上述门设置以及计数条件下，依次检测空白对照组和实验组样品，记录相应的检测值，即高于阈值荧光强度的数量百分比。
在第一种情况下，如图4a所示，在相同的孵育时间下(2h)，单独的FITC-E5多肽与MCF-7细胞CXCR4受体的结合率(即阳性细胞所占％)随着FITC-E5多肽的浓度增加而增加。FITC-E5-PEG-PE纳米胶束与MCF-7细胞CXCR4受体的结合率(即阳性细胞所占％)也是随着FITC-E5多肽的浓度增加而增加。但在相同的FITC-E5多肽浓度(1μM、5μM和10μM)和相同孵育时间(2h)条件下，FITC-E5-PEG-PE纳米胶束(实施例5，6，8的样品)与MCF-7细胞CXCR4受体的结合率要明显高于单独的FITC-E5多肽与MCF-7细胞CXCR4受体的结合率。
在第二种情况下，如图4b所示，FITC-E5多肽(5μM)和PEG-PE胶束(20μM)的浓度，改变孵育时间(0-5h)，当孵育时间大于或等于2h时，FITC-E5-PEG-PE纳米胶束(实施例8的样品)与MCF-7细胞CXCR4受体的结合率要明显高于单独的FITC-E5多肽与MCF-7细胞CXCR4受体的结合率。以上两种实验结果均得益于PEG-PE能够显著增加E5多肽在PBS溶液中的溶解性，促进了FITC-E5多肽与CXCR4受体的结合作用。
实验例3 FITC-E5多肽或FITC-E5-PEG-PE纳米胶束与HepG2细胞CXCR4受体亲和力的检测。
以HepG2细胞系作为研究肝癌细胞系的模型体系。在Corning 24孔板中，每孔使用1mL DMEM培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养2×105个细胞，将24孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，使细胞贴壁。
第一种实验条件：向Corning 24孔板中每孔加入10μL不同浓度FITC-E5多肽或FITC-E5-PEG-PE纳米胶束(实施例5、6、8的样品)的PBS溶液，使FITC-E5多肽的最终浓度为1μM、5μM和10μM，PEG-PE胶束的浓度均为10-40μM，空白对照组只加入10μL PBS溶液，将24孔细胞培养板在孵箱中孵育2h。
第二种实验条件：向Corning 24孔板中加入10μL FITC-E5多肽或FITC-E5-PEG-PE纳米胶束(实施例8的样品)的PBS溶液，使FITC-E5多肽的最终浓度为5μM，PEG-PE的浓度为20μM，空白对照只加入10μL PBS溶液，将24孔细胞培养板在孵箱中孵育0-5h。
在上述两种情况下，利用流式细胞仪记录检测空白对照组和实验组样品，记录相应的检测值，即高于阈值荧光强度的数量百分比。
在第一种情况下，如图5a所示，在相同的孵育时间下(2h)，单独的FITC-E5多肽与HepG2细胞CXCR4受体的结合率(即阳性细胞所占％)随着FITC-E5多肽的浓度增加而增加。FITC-E5-PEG-PE纳米胶束(实施例5、6、8的样品)与HepG2细胞CXCR4受体的结合率(即阳性细胞所占％)也是随着FITC-E5多肽的浓度增加而增加。但在相同的FITC-E5多肽浓度(1μM、5μM和10μM)和相同孵育时间(2h)条件下，FITC-E5-PEG-PE纳米胶束与HepG2细胞CXCR4受体的结合率要明显高于单独的FITC-E5多肽与HepG2细胞CXCR4受体的结合率。
在第二种情况下，如图5b所示，固定FITC-E5多肽(5μM)和PEG-PE胶束(20μM)的浓度，改变孵育时间(0-5h)，当孵育时间大于或等于2h时，FITC-E5-PEG-PE纳米胶束(实施例8的样品)与HepG2细胞CXCR4受体的结合率要明显高于单独的FITC-E5多肽与HepG2细胞CXCR4受体的结合率。以上两种实验结果均得益于PEG-PE能够显著增加FITC-E5多肽在PBS溶液中的溶解性，促进了FITC-E5多肽与CXCR4受体的结合作用。
实验例4 E5多肽和E5-PEG-PE纳米胶束对CXCL12诱导MCF-7细胞迁移过程中相关基因表达的抑制作用。
以MCF-7作为研究乳腺癌细胞系的模型体系，选取细胞迁移过程中的标志性事件(上皮间质转化EMT)的代表性基因(N-钙粘蛋白：N-cadherin，波形蛋白：Vimentin，基质金属蛋白酶：MMP2和MMP9)作为研究对象。
在直径为60cm的Corning皿中，每皿使用2.5mL DMEM培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养5×105个MCF-7细胞，将Corning皿置于37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，使细胞贴壁。加入CXCL12溶液诱导，使每孔的CXCL12浓度为100ng/mL；同时向培养皿中加入10μL E5多肽的PBS溶液或E5-PEG-PE纳米胶束的PBS溶液(实施例3的样品)，其中E5多肽的终浓度为4μM，PEG-PE的终浓度为20μM，空白对照只加入10μL PBS溶液，将培养皿在孵箱中孵育24h。
从MCF-7细胞中提取RNA：细胞处理所需时间后，每皿加入1mL Trizol裂解细胞，静置5min；将细胞裂解液转入EP管，加入1/5体积的氯仿，剧烈混匀，室温放置10min；4℃条件下以12000g的转速离心15min，取上清水相转入新的EP管；加入1/2体积的异丙醇，混匀，室温放置5-10min；4℃条件下以12000g的转速离心8min，弃上清，沉淀用75％乙醇清洗；4℃条件下以7500g的转速离心5min，留沉淀；干燥RNA，倒置EP管5-10min，加入10-20μL DEPC处理过的无菌水溶解，核酸分析仪分析RNA的质量和浓度。
将RNA反转录成cDNA：将模板RNA(50ng-2μg)在冰上解冻；引物、10X RT Mix、SuperPure dNTP、ddH2O在室温解冻，解冻后迅速置于冰上，使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体；按照下表中的逆转录体系配制混合液(最后加模板RNA)，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5s，简短离心后置于冰上，37℃孵育60min。
内容 体积(μL)
10X RT Mix 2
Super Pure dNTP 2
Oligo(dT)15 2
Quant Reverse Transcriptase 1
ddH2O X
模板RNA Y
总体积 20
SYBR Green 1嵌合荧光法Real Time PCR(RT-PCR)：按照下表，先将“ddH2O+SYBRmix+正反向引物”混合完毕，加入到各个小反应管中(20μL体系)，最后加cDNA模板，上机检测，分析结果。
内容 体积(μL)
2X SuperReal PreMix Plus 10
正向引物(10μM) 0.6
反向引物(10μM) 0.6
cDNA模板 —
50X ROX Reference Dye —
RNase-free ddH2O 20
N-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9的mRNA相对表达水平与细胞的迁移能力紧密相关，表达上调则表示细胞迁移能力增强，表达下调则表示细胞迁移能力减弱。预实验中，经20μM的PEG-PE胶束孵育的MCF-7细胞与空白对照组对比，上述基因mRNA相对表达水平没有显著性差异。如图6所示，相比于对照组细胞，单独E5多肽的PBS溶液处理MCF-7细胞后，其N-cadherin、Vimentin和MMP2的mRNA相对表达水平基本没有变化，MMP9的mRNA相对表达水平下调30％左右。E5-PEG-PE纳米胶束的PBS溶液(实施例3的样品)处理MCF-7细胞后，其Vimentin的mRNA相对表达水平基本没有变化，N-cadherin和MMP2的mRNA相对表达水平下调20％左右，MMP9的mRNA相对表达水平下调70％左右。说明E5多肽和E5-PEG-PE纳米胶束(实施例3的样品)均能在mRNA水平上抑制EMT相关基因的表达，但E5-PEG-PE纳米胶束(实施例3的样品)的抑制作用要优于E5多肽。
实验例5 E5多肽和E5-PEG-PE纳米胶束对CXCL12诱导HepG2细胞迁移过程中相关基因表达的抑制作用。
以HepG2细胞系作为研究肝癌细胞系的模型体系。在直径为60cm的Corning皿中，每皿使用2.5mL DMEM培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养5×105个HepG2细胞，将Corning皿置于37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，使细胞贴壁。加入CXCL12溶液诱导，使每孔的CXCL12浓度为100ng/mL；同时向培养皿中加入10μL E5多肽的PBS溶液或E5-PEG-PE纳米胶束的PBS溶液(实施例3的样品)，其中E5多肽的终浓度为4μM，PEG-PE的终浓度为20μM，空白对照只加入10μL PBS溶液，将培养皿在孵箱中孵育24h。
按照实验例4中的实验步骤，从HepG2细胞中提取RNA，RNA反转录成cDNA，SYBRGreen1嵌合荧光法Real Time PCR(RT-PCR)检测EMT过程中N-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9的mRNA相对表达水平。
预实验中，经20μM的PEG-PE胶束孵育的HepG2细胞与空白对照组对比，上述基因mRNA相对表达水平没有显著性差异。如图7所示，相比于对照组细胞，单独E5多肽的PBS溶液处理HepG2细胞后，其N-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9的mRNA相对表达水平下调30-40％。E5-PEG-PE纳米胶束的PBS溶液(实施例3的样品)处理HepG2细胞后，其Vimentin和N-cadherin的mRNA相对表达水平下调50％，MMP2的mRNA相对表达水平下调80％左右，MMP9的mRNA相对表达水平下调90％左右。说明E5多肽和E5-PEG-PE纳米胶束均能在mRNA水平上抑制EMT相关基因的表达，但E5-PEG-PE纳米胶束(实施例3的样品)的抑制作用要优于E5多肽。
实验例6 E5多肽和E5-PEG-PE纳米胶束对CXCL12诱导MCF-7细胞体外迁移的抑制作用；
AMD3100是一种CXCR4趋化因子受体拮抗剂，作用于CXCR4和CXCL12调节的趋化性。
收获对数生长期的MCF-7细胞，用含有5％FBS的DMEM培养基悬浮细胞，将300μL含有1×106个细胞的悬液，以及E5多肽或E5-PEG-PE纳米胶束的PBS溶液(实施例4的样品)加入transwell小室(直径为8μm的PET微孔滤膜)的上室，使E5多肽的最终浓度为5μM，PEG-PE的最终浓度为20μM，空白对照加入PBS溶液，AMD3100(5μM)作为阳性对照组。下室(Corning24孔板)加入800μL含有5％FBS的DMEM培养基，同时含有CXCL12水溶液(100ng/mL)诱导。培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h。取出转移小皿，冰甲醇固定5min，晾干，用0.1％结晶紫溶液(纯水配置)染色5min，再用PBS溶液洗两次，之后，用棉棒将内侧的紫色结晶擦去，各选择5个无重叠区，用光学显微镜(×200)对小皿外侧的结晶紫计数，进而推算转移细胞的数目(第一种检测方法)。染色拍照完成后用33％醋酸(0.1mL/孔)脱色10min，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm测其OD值，间接反映细胞数(第二种检测方法)。
在预实验中，经20μM的PEG-PE孵育的MCF-7细胞与空白对照的迁移率相比没有显著性差异。如图8a、8b所示(图中Control、AMD3100、E5、E5+PEG-PE分别是指PBS对照组、CXCR4小分子拮抗剂、E5多肽、E5-PEG-PE纳米胶束)，在加入了5μM AMD3100与细胞孵育后，通过计算下室中细胞数量得MCF-7细胞的迁移能力被降低了约50％；在加入了E5多肽或E5-PEG-PE纳米胶束(实施例4的样品，其中E5多肽浓度为5μM，PEG-PE胶束浓度为20μM)与细胞孵育后，通过计算下室中细胞数量得MCF-7细胞的迁移能力被依次降低了约75％或98％，即E5-PEG-PE纳米胶束(实施例4的样品)可以更有效地抑制MCF-7细胞被趋化因子CXCL12诱导的迁移作用。
实验例7 E5多肽和E5-PEG-PE纳米胶束对CXCL12诱导HepG2细胞体外迁移的抑制作用；
收获对数生长期的HepG2细胞，用含有5％FBS的DMEM培养基悬浮细胞，将300μL含有1×106个细胞的悬液，以及E5多肽或E5-PEG-PE纳米胶束的PBS溶液(实施例4的样品)加入transwell小室(直径为8μm的PET微孔滤膜)的上室，使E5多肽的最终浓度为5μM，PEG-PE的最终浓度为20μM，空白对照加入PBS溶液，AMD3100(5μM)作为阳性对照组。下室(Corning24孔板)加入800μL含有5％FBS的DMEM培养基，同时含有CXCL12水溶液(100ng/mL)诱导。培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h。取出转移小皿，冰甲醇固定5min，晾干，用0.1％结晶紫溶液(纯水配置)染色5min，再用PBS溶液洗两次，之后，用棉棒将内侧的紫色结晶擦去，各选择5个无重叠区，用光学显微镜(×200)对小皿外侧的结晶紫计数，进而推算转移细胞的数目(第一种检测方法)。染色拍照完成后用33％醋酸(0.1mL/孔)脱色10min，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm测其OD值，间接反映细胞数(第二种检测方法)。
预实验中，加入了20μM PEG-PE胶束的HepG2细胞与空白对照的迁移率相比没有显著性差异。如图9a、9b所示(图中Control、AMD3100、E5、E5+PEG-PE分别是指PBS对照组、CXCR4小分子拮抗剂、E5多肽、E5-PEG-PE纳米胶束)，在加入了5μM AMD3100与细胞孵育后，通过计算下室中细胞数量得HepG2细胞的迁移能力被降低了约60％；在加入了E5多肽或E5-PEG-PE纳米胶束(实施例4的样品，其中E5多肽浓度为5μM，PEG-PE胶束浓度为20μM)与细胞孵育后，通过计算下室中细胞数量得HepG2细胞的迁移能力被依次降低了约75％或95％，即E5-PEG-PE纳米胶束(实施例4的样品)可以更有效地抑制HepG2细胞被趋化因子CXCL12诱导的迁移作用。
其他实施例多肽纳米胶束(E5-PEG-PE纳米胶束或FITC-E5-PEG-PE纳米胶束)与以上实验例1-7记载的E5-PEG-PE纳米胶束或FITC-E5-PEG-PE纳米胶束的效果相当。限于篇幅，本文仅例举部分最具说服力的试验例。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (29)

1.一种多肽纳米胶束，其特征在于，其由聚乙二醇化磷脂和癌症靶向性多肽自组装形成，所述癌症靶向性多肽是能够与表达或过量表达趋化因子受体CXCR4的癌症细胞或癌症组织靶向结合的多肽；
所述癌症靶向性多肽为E5多肽或FITC标记的E5多肽；
所述E5多肽的氨基酸序列：GGRSFFLLRRIQGCRFRNTVDD；所述FITC标记的E5多肽的氨基酸序列：FITC-GGRSFFLLRRIQGCRFRNTVDD。
2.根据权利要求1所述的多肽纳米胶束，其特征在于，所述聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为500～10000；和/或，
所述多肽纳米胶束的粒径为10-100nm。
3.根据权利要求1所述的多肽纳米胶束，其特征在于，所述聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为1500～5000；和/或，所述多肽纳米胶束的粒径为10-50nm。
4.根据权利要求1所述的多肽纳米胶束，其特征在于，所述聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇亲水嵌段的分子量为2000～3000；和/或，所述多肽纳米胶束的粒径为15-30nm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的多肽纳米胶束，其特征在于，所述聚乙二醇化磷脂和所述癌症靶向性多肽的摩尔比为4～20:1。
6.根据权利要求5所述的多肽纳米胶束，其特征在于，所述聚乙二醇化磷脂和所述癌症靶向性多肽的摩尔比为20:1、10:1、5:1或4:1。
7.根据权利要求1-4任一项所述的多肽纳米胶束，其特征在于，所述癌症靶向性多肽与PEG-PE的结合方式为物理结合。
8.根据权利要求7所述的多肽纳米胶束，其特征在于，所述多肽纳米胶束为溶液形式或冻干形式。
9.权利要求1-8任一项所述多肽纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：分别制备PEG-PE分子溶液和多肽分子溶液；将PEG-PE分子溶液和多肽分子溶液混匀、孵育、静置，获得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，制备PEG-PE分子溶液和多肽分子溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、生理盐水或无菌超纯水中的任意一种。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，将所述聚乙二醇化磷脂分子配制成2-20mg/mL溶液；将所述癌症靶向性多肽分子配制成1-5mg/mL溶液。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述混匀是将所述聚乙二醇化磷脂分子溶液加入到所述癌症靶向性多肽分子溶液中，充分混匀，得混合溶液。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中聚乙二醇化磷脂分子和癌症靶向性多肽分子的摩尔比为4～20:1。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中聚乙二醇化磷脂分子和癌症靶向性多肽分子的摩尔比为20:1、10:1、5:1或4:1。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述孵育温度为20～60℃，孵育时间为10～60min。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述孵育温度为40～55℃，孵育时间为20～30min。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述静置为室温静置2～24小时。
18.根据权利要求10-17任一项所述的制备方法，其特征在于，还进一步包括将静置后所得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液除菌的步骤。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述除菌为将静置后所得多肽
-PEG-PE纳米胶束溶液用0.22μm滤膜过滤。
20.根据权利要求19所述的制备方法，其特征在于，还进一步包括将除菌后的多肽
-PEG-PE纳米胶束溶液进行冻干，制备多肽纳米胶束冻干粉的步骤。
21.根据权利要求20所述的制备方法，其特征在于，所述冻干包括向所得除菌后的多肽-PEG-PE纳米胶束溶液中添加一定量的冻干保护剂。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂为甘露醇。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂为浓度0.01～0.2g/mL的甘露醇。
24.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制溶液：将所述聚乙二醇化磷脂分子用磷酸盐缓冲液配制成2-20mg/mL溶液；将所述癌症靶向性多肽分子用磷酸盐缓冲液配制成1-5mg/mL溶液；
(2)混匀：将所述聚乙二醇化磷脂分子溶液加入到所述癌症靶向性多肽分子溶液中，充分混匀，得混合溶液；
(3)孵育：将步骤(2)中所得混合溶液于20～60℃水浴孵育10～60min；
(4)静置；
还进一步包括将静置后所得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液除菌的步骤，所述除菌为将步骤(4)静置后所得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液用0.22μm滤膜过滤；
还进一步包括将除菌后的多肽-PEG-PE纳米胶束溶液进行冻干，制备多肽纳米胶束冻干粉的步骤；
所述冻干包括向所得除菌后的多肽-PEG-PE纳米胶束溶液中添加一定量的冻干保护剂；所述冻干保护剂为浓度0.01～0.2g/mL的甘露醇。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育温度为40～55℃，孵育时间为20～30min；和/或，步骤(3)所述静置为室温静置2～24小时；得多肽-PEG-PE纳米胶束溶液。
26.权利要求1-8任一项所述多肽纳米胶束或权利要求9-25任一项所述方法制备的多肽纳米胶束在制备治疗癌症药物中的应用。
27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，是在制备抑制癌症转移药物中的应用。
28.根据权利要求27所述的应用，其特征在于，是在制备抑制与表达或过量表达趋化因子受体CXCR4的癌症细胞或癌症组织相关的癌症转移药物中的应用。
29.根据权利要求28所述的应用，其特征在于，所述与表达或过量表达趋化因子受体CXCR4的癌症细胞或癌症组织相关的癌症包括乳腺癌、白血病、淋巴瘤、膀胱癌或肝癌中的任意一种。
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