CN110841056A - Pamam-多肽复合物、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种PAMAM‑多肽复合物，及其制备方法和应用。本发明的PAMAM‑多肽复合物具有提高多肽在盐溶液中溶解性的能力，同时所得到的PAMAM‑多肽复合物具有抑制肿瘤转移和治疗白血病的作用，并且其抑制肿瘤转移和治疗白血病的效果大大好于多肽本身。该PAMAM‑多肽复合物可以为抑制肿瘤转移和治疗白血病提供可行的方法和技术。

Description

PAMAM-多肽复合物、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于材料科学领域，具体涉及一种PAMAM-多肽复合物，及其制备方法和应用。
背景技术
聚酰胺-胺型树枝状大分子(PAMAM)，是最早合成的树枝形聚合物之一。其呈单分散性，内部具有空腔，表面具有高密度的胺基。PAMAM是以乙二胺为核，通过分散合成法制备得到的。PAMAM树枝状高分子高密度的末端官能团能与许多有机、无机和生物物质等发生化学反应。通过共价修饰引进阴离子、阳离子及疏水基团，从而提高生物相容性、生物利用度和靶向性。此外，由于大的空腔结构使得PAMAM载体对许多难溶性药物具有增溶和包合作用，这些特点使之有希望成为新一代药物载体。相比于其他的药物载体，PAMAM具有很多明显的结构优势。首先，它的表面具有高密度的伯胺基团，可以容易的通过共价反应的方式对其进行改性或修饰，也可以将一些药物分子共价结合到PAMAM表面以达到提高药物溶解性与可控释放的目的；其次，高代的树枝状大分子在空间呈球状分布，尺寸精确可控，内部存在着较大的孔腔，这些孔腔里可以通过物理的方法包埋药物分子，从而增加了药物的溶解性，提高了药物在血液中的循环时间，降低了药物对正常组织的毒副作用。
肿瘤是严重危害人们身体健康的一类疾病，恶性肿瘤具有转移(metastasis)和复发的特征。肿瘤转移是预后不良的征兆，也是导致肿瘤病人死亡的主要原因。其中趋化因子在许多肿瘤的转移过程中起到了关键的作用。趋化因子(chemokines)作为一类单链小分子蛋白质，通过与G蛋白偶联受体的相互作用，引起靶细胞支架重排，牢固地黏附于内皮细胞并且定向迁移。近年来，国内外研究均指出，基质细胞衍生因子(stromal cell-derivedfactor-1，SDF-1)，也就是趋化因子CXCL12，及其特异性趋化因子受体CXCR4在多种肿瘤的器官特异性转移中发挥着重要的作用。很多实体肿瘤细胞和白血病细胞表面高表达。高表达CXCR4的实体瘤细胞和白血病细胞在CXCL12的趋化下，逆浓度梯度转移至作为趋化因子产生源的某些器官，例如肺、骨髓等，形成器官特异性转移。因此，使用CXCR4拮抗剂靶向抑制CXCL12/CXCL4相互作用可以阻断肿瘤细胞和白血病细胞与基质细胞黏附，增加肿瘤细胞和白血病细胞对化疗药物的敏感性，防止肿瘤细胞和白血病细胞的转移和复发。
近年来，多肽作为新的药物分子，具有很多优点，首先多肽易于合成，大大降低得药物成本；其次多肽在人体内易于代谢并且不会带来毒副作用和严重的免疫反应；最重要的是多肽具有良好的特异性。因此对于抑制肿瘤转移和治疗白血病，发展特异性靶向CXCR4受体的多肽拮抗剂具有非常重要的意义。然而，与传统的小分子有机药物相比，多肽具有溶解性差和稳定性差的缺点。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种PAMAM-多肽复合物，以及其制备方法和应用。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“PAMAM”是指：聚酰胺-胺型树枝状大分子。
术语“5代PAMAM”是指：以乙二胺为核心，通过分散合成法得到的具有128个表面胺基的树状大分子。
术语“PAMAMAc80”是指：80个表面胺基被乙酰化的5代PAMAM。
术语“PBS”是指：磷酸缓冲盐溶液。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种PAMAM-多肽复合物，所述复合物中，PAMAM与多肽的结合方式为物理结合，所述多肽为E4或E5，其中，E4的氨基酸序列为SEQID NO:1，E5的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；
优选地，所述PAMAM为5代PAMAM，所述多肽为E5。
根据本发明第一方面的复合物，其中，所述PAMAM与多肽的摩尔比为1:0.2～5，优选为1:3。
根据本发明第一方面的复合物，其中，所述PAMAM为乙酰化PAMAM；优选地，所述PAMAM的乙酰化程度为10～100％；最优选地，所述PAMAM的乙酰化程度为62.5％。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的PAMAM-多肽复合物的制备方法，该制备方法可以包括以下步骤：
(1)配制溶液：将所述多肽和PAMAM配制成水溶液；
(2)混匀：按照摩尔比将PAMAM溶液加入到多肽溶液中，充分混匀。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(1)中，所述多肽溶液的浓度为0.5～5mg/mL，优选为1mg/mL；
所述PAMAM溶液的浓度为100～300mg/mL，优选为200mg/mL。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
(3)PAMAM-多肽复合物PBS溶液的配制：向步骤(2)所得混合溶液中加入溶液1/9体积的10×PBS溶液，使之稀释为PAMAM-多肽的1×PBS溶液。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的PAMAM-多肽复合物或按照第二方面所述的制备方法而制得的PAMAM-多肽复合物在制备用于治疗肿瘤转移相关疾病的药物中的应用。
根据本发明第三方面的应用，其中，所述肿瘤为趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤；优选地，所述肿瘤为乳腺癌和/或白血病。
本发明的第四方面提供了一种用于抑制肿瘤细胞的横向迁移和/或纵向迁移的药物，所述药物包括：
第一方面所述的PAMAM-多肽复合物；以及
药学上可接受的载体。
根据本发明第四方面的药物，其中，所述肿瘤细胞为趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤细胞；优选地，所述肿瘤细胞选自以下一种或多种：乳腺癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、膀胱癌细胞。
本发明涉及乙酰化PAMAM在调控多肽溶解性与生物效应方面的应用，涉及肿瘤转移抑制与治疗领域。本发明的目的在于提供一种乙酰化PAMAM-多肽复合物的制备方法及其应用。所述技术可以通过乙酰化改性PAMAM降低其生物毒性，并提高了多肽在盐溶液以及组织液中的溶解性，进而提高了多肽在抑制肿瘤转移方面的生物效应。本发明方法简单、成本低，丰富了现今调控多肽溶解性与生物效应的手法。
本发明的目的在于提供一种乙酰化PAMAM-多肽复合物的制备方法及其应用，特别是一种能提高多肽在盐溶液中溶解性的PAMAMAc80-多肽复合物的制备方法及其在抑制肿瘤转移方面的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种可抑制肿瘤细胞和白血病细胞转移的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO：1～2所示的氨基酸序列，对应序列表中的名称为E4和E5。
本发明的多肽可通过人工化学合成制得，具有水溶性好、盐溶性差的特点。
本发明的多肽能够抑制乳腺癌细胞的迁移，并能够杀死白血病细胞，延长移植白血病细胞小鼠的生存期。
本发明还提供了一种提高上述本发明所述多肽在盐溶液中溶解性的方法，所述方法包括：将所述多肽与乙酰化PAMAM相结合；
优选地，所述多肽与乙酰化PAMAM的结合方式为物理结合。
优选地，乙酰化PAMAM为任何程度乙酰化的PAMAM或未乙酰化的PAMAM；
进一步优选地，PAMAM为5代PAMAM；
进一步优选地，乙酰化PAMAM为PAMAMAc80。
本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞转移和治疗白血病的PAMAMAc80-多肽复合物，该复合物包含上述多肽和PAMAMAc80。
优选地，所述多肽与PAMAMAc80通过物理作用相结合；
优选地，所述PAMAMAc80和多肽的摩尔比为5:1-1:5，例如可以是5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5。
本发明还提供了PAMAMAc80-多肽复合物的制备方法，包括以下步骤：
1)配制溶液：将所述多肽分子配制成0.5-5mg/mL溶液，将PAMAMAc80分子配制成100-300mg/mL溶液；
2)混匀：将PAMAMAc80分子溶液加入到多肽分子溶液中，充分混匀即可；
3)加入溶液1/9体积的10×PBS溶液，使之稀释为PAMAMAc80-多肽的1×PBS溶液。
优选地，所述多肽分子配制成1mg/mL溶液；
优选地，PAMAMAc80分子配制成200mg/mL溶液；
优选地，在步骤1)中，所述多肽溶液和PAMAMAc80的溶剂均为无菌超纯水；
优选地，在步骤2)中，所述溶液中PAMAMAc80分子与多肽分子的摩尔比为5:1-1:5，例如可以是5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5。
本发明还提供了PAMAMAc80-多肽复合物在制备用于抑制肿瘤转移相关疾病或治疗白血病药物中的应用。
优选地，所述的PAMAMAc80-多肽复合物中PAMAMAc80分子与多肽分子的摩尔比为1:3。
优选地，所述肿瘤转移相关疾病为趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤；
优选地，所述趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤为乳腺癌、白血病、淋巴瘤或膀胱癌中的任意一种。
优选地，所述趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤为乳腺癌和白血病。
本发明还提供PAMAMAc80-多肽复合物在制备用于抑制肿瘤细胞或白血病细胞的横向迁移和/或纵向迁移药物中的应用。
优选地，所述的PAMAMAc80-多肽复合物中PAMAMAc80分子与多肽分子的摩尔比为1:3。
优选地，所述肿瘤细胞为趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤细胞；
优选地，所述趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤细胞为乳腺癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞或膀胱癌细胞中的任意一种。
优选地，所述趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤细胞为乳腺癌细胞和白血病细胞。
本发明所用的5代PAMAM是一种分子大小、形状和官能团精确可控的纳米材料，分子内部具有广阔的空穴，便于物理包埋药物，表面存在大量的功能基团，这些特性便于对其进行修饰。通过对纳米材料的表面修饰，可以提高其水溶性、降低其毒性，使之成为生物大分子、核酸、化疗药物等良好的载体。本发明人发现，用乙酰基修饰表面胺基，随着乙酰化程度增加，材料的细胞毒性不断减小，同时，与未经修饰的树状大分子比较来看，表面修饰乙酰基的材料对细胞的非特异性结合作用大大降低。
PAMAMAc80，其作为药物载体，既能降低载体的生物毒性，又为包载药物保留了足够的空腔，用来提高多肽药物的溶解性和稳定性。
本发明的PAMAM-多肽复合物可以具有但不限于以下有益效果：
本发明的PAMAM-多肽复合物具有提高多肽在盐溶液中溶解性的能力，同时所得到的PAMAM-多肽复合物具有抑制肿瘤转移和治疗白血病的作用，并且其抑制肿瘤转移和治疗白血病的效果大大好于多肽本身。该PAMAM-多肽复合物可以为抑制肿瘤转移和治疗白血病提供可行的方法和技术。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了PAMAM和PAMAMAc80质谱结果图。
图2示出了PAMAMAc80核磁结果图。
图3示出了PAMAM和PAMAMAc80对MCF-7细胞活力影响结果图。
图4示出了PAMAM和PAMAMAc80对MDA-MB-231细胞活力影响结果图。
图5示出了E4和PAMAMAc80-E4在PBS中的荧光半定量结果图。
图6示出了E5和PAMAMAc80-E5在PBS中的荧光半定量结果图。
图7示出了E5和PAMAMAc80-E5对CXCL12诱导MCF-7细胞横向迁移的抑制作用结果图。
图8示出了E5和PAMAMAc80-E5对CXCL12诱导MDA-MB-231细胞横向迁移的抑制作用结果图。
图9示出了E5和PAMAMAc80-E5对CXCL12诱导MCF-7细胞纵向迁移的抑制作用结果图。
图10示出了E5和PAMAMAc80-E5对CXCL12诱导MDA-MB-231细胞纵向迁移的抑制作用结果图。
图11示出了E5和PAMAMAc80-E5对CXCL12诱导HL-60细胞纵向迁移的抑制作用结果图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
除非特别指明，以下实施例中所用的乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和白血病细胞系HL-60均购自中国医学科学院。
除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。
除非特别指明，以下实施例中所用的PBS溶液均为1×PBS溶液。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
PAMAM，无水甲醇，乙酸酐，三乙胺，乙腈，D2O，购自Sigma-Aldrich；
Corning 96孔板，RPMI-1640培养基，DMEM培养基，购自北京华力德科技有限公司，中国；
CCK溶液，购自北京泛博生物化学有限公司；
NaCl，KCl，Na2HPO4·12H2O，KH2PO4，购自国药集团化学试剂有限公司，中国；
CXCL12，购自R&D systems，美国；
transwell小室，购自Millipore，瑞士。
仪器：
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，购自Bruker Daltonics，美国；型号MALDI-TOF MS，Microflex LRF；
核磁共振仪，购自Bruker公司，美国；型号Avance III HD 400；
Zeta电位使用动态光散射仪，购自Malvern公司，英国；型号Zetasizer NanoZS；
连续光谱多功能酶标仪购自TECAN公司，瑞士，型号ecan infinite M200。
实施例1
本实施例用于说明PAMAMAc80的合成。
26mg(0.9μmol)PAMAM(G5，Sigma-Aldrich，美国)溶解在2mL无水甲醇(Sigma-Aldrich，美国)中，之后加入6.8L(72μmol)乙酸酐(Sigma-Aldrich，美国)和12.48L(90μmol，25％过量)三乙胺(Sigma-Aldrich，美国)。混合后在室温下搅拌并反应4h。过量的溶剂和未参与反应的反应物通过旋转蒸发和在超纯水中透析(截留分子量为10K)的方法除去。之后冻干得到纯净的PAMAMAc80。
实施例2
本实施例用于说明PAMAMAc80的表征。
PAMAMAc80的分子量使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS，Microflex LRF，Bruker Daltonics，美国)进行表征。将1mg的PAMAM或PAMAMAc80溶解到1mL的超纯水中配成1mg/mL的溶液。将2μL上述溶液和2μL基质溶液混合后滴到靶板(BrukerDaltonics，美国)上，待溶剂蒸发后在真空状态下检测分子量。基质溶液为10mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸(Sigma-Aldrich，美国)溶液，溶剂为体积比为1:1的乙腈(Sigma-Aldrich，美国)/水。
实验结果如图1所示，PAMAMAc80的分子量(31998)相比PAMAM本身明显增加(28825)，说明乙酰基与胺基之间形成了共价键。由于乙酰基的分子量为43，计算所得PAMAMAc80上共有76个乙酰基。
PAMAMAc80的化学结构使用核磁共振氢谱法(1H NMR)进行表征。将样品溶解于重水(D2O，Sigma-Aldrich，美国)中，在Avance III HD 400核磁共振仪(Bruker，美国)上进行实验。
实验结果如图2所示，1.89ppm处的新峰，也就是与酰胺基相连的甲基(-NHCOCH3)的质子峰出现，意味着PAMAM成功被乙酰基修饰。根据甲基(-NHCOCH3)的质子峰和与胺基相连的亚甲基的(-CONHCH2CH2和-CH2CH2NH2,2.95-3.20ppm)质子峰的积分，计算得到PAMAMAc80上共有73个乙酰基。
PAMAM或PAMAMAc80的水化半径和Zeta电位使用动态光散射(Zetasizer NanoZS，Malvern，英国)进行表征。样品用超纯水配成1mg/mL的溶液，取1mL溶液转移在测试用标配的1cm×1cm马尔文聚乙烯塑料样品池内，进行测试。测试温度为25℃。
实验结果如表1所示，修饰之后的PAMAMAc80的粒径(6.81nm)相比于未修饰的PAMAM(5.85nm)明显增加，说明PAMAM被成功乙酰化。另外，Zeta电位的结果也表明，乙酰化后的PAMAM的电位(5.95mV)相比于PAMAM本身(17.1mV)明显降低，说明PAMAM中胺基所带的正电被酰胺基中和。
表1 PAMAM和PAMAMAc80的粒径和Zeta电位
粒径(nm) Zeta电位(mV)
PAMAM 5.85 17.1
PAMAM<sub>Ac80</sub> 6.81 5.95
实施例3
本实施例用于说明PAMAMAc80分子对MCF-7细胞毒性的检测实验。
在Corning 96孔板中，每孔使用100μL RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清FBS和1％青链霉素)培养1×104个细胞，将96孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，向培养板中加入10μL不同浓度PAMAMAc80分子的PBS溶液，使PAMAMAc80分子的最终浓度为2.5，5，7.5，10，12.5，15，17.5和20μM。空白对照只加入10μL的PBS溶液。将培养板在孵箱中孵育48h，向每孔加入10μL CCK溶液(北京泛博生物化学有限公司)。将培养板在孵箱中孵育2h，用连续光谱多功能酶标仪(ecan infinite M200，TECAN，瑞士)测定在450nm波长下的吸光度值(OD值)，计算细胞存活率。
细胞存活率＝OD450nm(PAMAMAc80分子)/(OD450nm(空白对照)×100％。
实验结果如图3所示，乙酰化之后的PAMAM对MCF-7细胞的毒性明显降低。
实施例4
本实施例用于说明PAMAMAc80分子对MDA-MB-231细胞毒性的检测实验。
在96孔板中，每孔使用100μL DMEM培养基培养1×104个细胞，将96孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，向培养板中加入10μL不同浓度PAMAMAc80分子的PBS溶液，使多肽的最终浓度为2.5，5，7.5，10，12.5，15，17.5和20μM。空白对照只加入10μL的PBS溶液。将培养板在孵箱中孵育48h，向每孔加入10μL CCK溶液。将培养板在孵箱中孵育2h，用酶标仪测定在450nm波长下的OD值，计算细胞存活率。
实验结果如图4所示，乙酰化之后的PAMAM对MDA-MB-231细胞的毒性明显降低。
实施例5
本实施例用于说明多肽的合成。
按照序列表所示的序列合成多肽，以及异硫氰酸荧光素(FITC)标记的多肽(由上海科肽生物科技有限公司合成，纯度为98％)。
其中，E4、E5多肽的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
实施例6
本实施例用于说明PAMAMAc80-多肽复合物的制备和溶解性检测。
10×PBS溶液的配制：NaCl 80.00g，KCl 2g，Na2HPO4·12H2O 35.8g或Na2HPO414.2g，KH2PO4 2.7g，用超纯水定容至1000mL，调节其pH值为7.2～7.4，高压灭菌。
1×PBS溶液的配制：将10×PBS溶液用无菌超纯水稀释10倍。
将多肽用无菌超纯水配制成1mg/mL溶液，将PAMAMAc80分子用无菌超纯水配制成200mg/mL溶液，取一定量的PAMAMAc80水溶液加入多肽水溶液中，使溶液中PAMAMAc80与多肽的摩尔比为2:1,1:1,1:2,1:3和1:4。将配好的复合体系涡旋1分钟，然后再通过水浴超声3分钟使其充分的混匀，加入溶液1/9体积的10×PBS溶液，使之稀释为PAMAMAc80-多肽的1×PBS溶液。将配制好的溶液置于4℃冰箱中。
使用荧光半定量的方法检测多肽的溶解性。PAMAMAc80与FITC标记的多肽以2:1,1:1,1:2,1:3和1:4的比例按照上述方法配置成复合物溶液，使多肽的浓度为100μM。在0h，将配置好的溶液摇匀后离心，取100μL上清液转移到96孔板中，用酶标仪检测溶液的相对荧光强度(激发波长488nm，发射波长525nm)。24h后用同样的方法检测储存在4℃冰箱的溶液的相对荧光强度。
实验结果如图5和图6所示，多肽单独存在时，上清液中溶解的多肽浓度较低，并且在24h后上清液中溶解的多肽的浓度进一步降低，说明多肽在PBS中溶解性较差，并且存在聚集的趋势。而加入PAMAMAc80后，多肽在PBS中的有效浓度明显升高，并且在24h之内都保持稳定。但是当PAMAMAc80与多肽的摩尔比为1:4时，多肽在0h的溶解性有所降低，并且在24h后溶液中的有效浓度也有所下降。因此，当PAMAMAc80与多肽的摩尔比为1:3时，在较少的载体作用下，就可以有效地提高多肽在PBS中的溶解性和稳定性。
试验例1
本试验例用于说明PAMAM Ac80-E5复合物对CXCL12诱导MCF-7细胞横向迁移的抑制作用。
在Corning六孔板中，每孔使用2mL RPMI-1640培养基培养50×104个MCF-7细胞，将六孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，MCF-7细胞生长至临近90％融合时，用10μL无菌枪头在培养板的孔中沿直线划痕，然后用PBS溶液将细胞轻柔的洗涤3遍，之后每孔加入RPMI-1640培养基，同时加入CXCL12(R&D systems，美国)水溶液诱导，使每孔的CXCL12分子浓度为100ng/mL，并加入PAMAMAc80-E5(PAMAMAc80与E5的摩尔比为1:3)的PBS溶液，使E5的最终浓度为0.01μM、0.1μM、1μM。划痕后的0h、24h用10×镜头的显微镜(IX71，OLYMPUS，日本)观察细胞移动情况以及划痕宽度的变化，计算细胞迁移率(CXCL12组划痕宽度的变化设为100％)。
实验结果如图7所示，加入CXCL12可以明显引起MCF-7细胞的迁移，E5和PAMAMAc80-E5复合物均可以抑制MCF-7细胞的横向迁移，并且PAMAMAc80-E5复合物的效果要明显好于E5本身。
试验例2
本试验例用于说明PAMAMAc80-E5复合物对CXCL12诱导MDA-MB-231细胞横向迁移的抑制作用。
在六孔板中，每孔使用2mL DMEM培养基培养30×104个MDA-MB-231细胞，将六孔板在37℃、5％CO2条件的孵箱中预培养24h，MDA-MB-231细胞生长至临近90％融合时，用10μL无菌枪头在培养板的孔中沿直线划痕，然后用PBS溶液将细胞轻柔的洗涤3遍，后每孔加入DMEM培养基，同时加入CXCL12水溶液诱导，使每孔的CXCL12分子浓度为100ng/mL，并加入PAMAMAc80-E5(PAMAMAc80与E5的摩尔比为1:3)的PBS溶液，使E5的最终浓度为0.01μM、0.1μM、1μM。划痕后的0h、24h用10×镜头的显微镜观察细胞移动情况以及划痕宽度的变化，计算细胞迁移率。
实验结果如图8所示，加入CXCL12可以明显引起MDA-MB-231细胞的迁移，E5和PAMAMAc80-E5复合物均可以抑制MDA-MB-231细胞的横向迁移，并且PAMAMAc80-E5复合物的效果要明显好于E5本身。
试验例3
本试验例用于说明PAMAMAc80-E5对CXCL12诱导MCF-7细胞纵向迁移的抑制作用。
收获对数生长期的MCF-7细胞，用不加血清的opti-MEM培养基悬浮细胞，将200μL含有10×104个细胞的悬液以及不同浓度PAMAMAc80-E5复合物(PAMAMAc80与E5的摩尔比为1:3)的PBS溶液加入transwell小室(直径为8μm的PET微孔滤膜，Millipore，瑞士)的上室，使E5的最终浓度为0.01μM、0.1μM、1μM，空白对照加入PBS溶液。下室(Corning24孔板)加入800μL RPMI-1640培养基，同时含有CXCL12水溶液(100ng/mL)诱导。培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h后取出transwell小室，用棉签小心擦除滤膜上室面的未迁移细胞，用结晶紫溶液(A液为2g结晶紫溶解至20mL 95％酒精中，B液为0.8g草酸铵溶解至80mL蒸馏水中，A、B液混合过滤后使用)固定迁移到小室膜下表面的细胞并染色20min，清水冲洗后用10×显微镜(DMI3000B，LEICA，德国)观察迁移的细胞。每个小室膜按照上下左右中的方位取5个视野，计数每个视野内迁移的细胞数，取平均值后计算细胞迁移率(CXCL12组迁移的细胞数设为100％)。
实验结果如图9所示，加入CXCL12可以明显引起MCF-7细胞的迁移，E5和PAMAMAc80-E5复合物均可以抑制MCF-7细胞的纵向迁移，并且PAMAMAc80-E5复合物的效果要明显好于E5本身。
试验例4
本试验例用于说明PAMAMAc80-E5对CXCL12诱导MDA-MB-231细胞纵向迁移的抑制作用。
收获对数生长期的MDA-MB-231细胞，用不加血清的opti-MEM培养基悬浮细胞，将200μL含有10×104个细胞的悬液以及不同浓度PAMAMAc80-E5复合物(PAMAMAc80与E5的摩尔比为1:3)的PBS溶液加入transwell小室的上室，使E5的最终浓度为0.01μM、0.1μM、1μM，空白对照加入PBS溶液。下室加入800μL DMEM培养基，同时含有CXCL12水溶液(100ng/mL)诱导。培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h后取出transwell小室，用棉签小心擦除滤膜上室面的未迁移细胞，用结晶紫溶液固定迁移到小室膜下表面的细胞并染色20min，清水冲洗后用10×显微镜观察迁移的细胞。每个小室膜按照上下左右中的方位取5个视野，计数每个视野内迁移的细胞数，取平均值后计算细胞迁移率。
实验结果如图10所示，加入CXCL12可以明显引起MDA-MB-231细胞的迁移，E5和PAMAMAc80-E5复合物均可以抑制MDA-MB-231细胞的纵向迁移，并且PAMAMAc80-E5复合物的效果要明显好于E5本身。
试验例5
本试验例用于说明PAMAMAc80-E5对CXCL12诱导HL-60细胞纵向迁移的抑制作用。
收获对数生长期的HL-60细胞，用不加血清的opti-MEM培养基悬浮细胞，将200μL含有20×104个细胞的悬液以及不同浓度PAMAMAc80-E5复合物(PAMAMAc80与E5的摩尔比为1:3)的PBS溶液加入transwell小室的上室，使E5的最终浓度为0.01μM、0.1μM、1μM，空白对照加入PBS溶液。下室加入800μL RPMI-1640培养基，同时含有CXCL12水溶液(200ng/mL)诱导。培养板在37℃、5％CO2条件的孵箱中培养24h后取出transwell小室，用棉签小心擦除滤膜上室面的未迁移细胞，用结晶紫溶液固定迁移到小室膜下表面的细胞并染色20min，清水冲洗后用10×显微镜观察迁移的细胞。每个小室膜按照上下左右中的方位取5个视野，计数每个视野内迁移的细胞数，取平均值后计算细胞迁移率。
实验结果如图11所示，加入CXCL12可以明显引起HL-60细胞的迁移，E5和PAMAMAc80-E5复合物均可以抑制HL-60细胞的纵向迁移，并且PAMAMAc80-E5复合物的效果要明显好于E5本身。
上述实验显示：PAMAMAc80-多肽复合物在盐溶液中具有较好的溶解性，并且可以大大提高多肽抑制肿瘤细胞和白血病细胞的迁移率，该PAMAMAc80-多肽复合物可以为肿瘤转移和白血病治疗提供可行的方法。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 国家纳米科学中心
<120> PAMAM-多肽复合物、其制备方法和应用
<130> YZDI-180041
<141> 2018-08-03
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Gly Arg Ser Phe Ile Leu Leu Arg Ile Ile Gln Gly Cys Arg Arg
1 5 10 15
Arg Asn Thr Val Asp Asp
20
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Gly Arg Ser Phe Phe Leu Leu Arg Arg Ile Gln Gly Cys Arg Phe
1 5 10 15
Arg Asn Thr Val Asp Asp
20

Claims (10)

1.一种PAMAM-多肽复合物，其特征在于，所述复合物中，PAMAM与多肽的结合方式为物理结合，所述多肽为E4或E5，其中，E4的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，E5的氨基酸序列为SEQID NO:2；
优选地，所述PAMAM为5代PAMAM，所述多肽为E5。
2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述PAMAM与多肽的摩尔比为1:0.2～5，优选为1:3。
3.根据权利要求1或2所述的复合物，其特征在于，所述PAMAM为乙酰化PAMAM；优选地，所述PAMAM的乙酰化程度为10％～100％；最优选地，所述PAMAM的乙酰化程度为62.5％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的PAMAM-多肽复合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)配制溶液：将所述多肽和PAMAM配制成水溶液；
(2)混匀：按照摩尔比将PAMAM溶液加入到多肽溶液中，充分混匀。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述多肽溶液的浓度为0.5～5mg/mL，优选为1mg/mL；
所述PAMAM溶液的浓度为100～300mg/mL，优选为200mg/mL。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
(3)PAMAM-多肽复合物PBS溶液的配制：向步骤(2)所得混合溶液中加入溶液1/9体积的10×PBS溶液，使之稀释为PAMAM-多肽的1×PBS溶液。
7.根据权利要求1至3任一项所述的PAMAM-多肽复合物或按照权利要求4至6任一项所述的制备方法而制得的PAMAM-多肽复合物在制备用于治疗肿瘤转移相关疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤；优选地，所述肿瘤为乳腺癌和/或白血病。
9.一种用于抑制肿瘤细胞的横向迁移和/或纵向迁移的药物，其特征在于，所述药物包括：
权利要求1至3任一项所述的PAMAM-多肽复合物；以及药学上可接受的载体。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述肿瘤细胞为趋化因子受体CXCR4高表达相关的肿瘤细胞；优选地，所述肿瘤细胞选自以下一种或多种：乳腺癌细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、膀胱癌细胞。
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