CN111481507B - 一种酶促阳离子化脂质体及其应用 - Google Patents

一种酶促阳离子化脂质体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种酶促阳离子化脂质体及酶促阳离子化载药脂质体。该脂质体经静脉注射进入血液循环后，可以在肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞高表达的γ‑谷氨酰转肽酶的催化下发生γ‑谷氨酰转移反应，生成阳离子伯胺，完成表面电势由负电势转变为正电势，形成阳离子化脂质体。随后，阳离子化脂质体引发胞膜窖和囊泡介导的胞吞转运作用完成跨血管内皮细胞和肿瘤细胞转运，从而增强脂质体的肿瘤富集和实现深部渗透递药。该脂质体对肝癌和胰腺癌等实体瘤具有优异的抗肿瘤效果，解决了传统纳米药物在实体瘤富集低和渗透差的问题，在纳米药物治疗实体瘤领域具有重要意义。

Description

一种酶促阳离子化脂质体及其应用
(一)技术领域
本发明涉及抗肿瘤纳米药物的技术领域，具体涉及一种通过胞吞转运作用实现肿瘤富集和深部递送的酶促阳离子化脂质体及其应用。
(二)背景技术
抗肿瘤纳米药物被认为利用肿瘤通透性和滞留效应(Enhanced Permeabilityand Retention，EPR effect)实现肿瘤靶向蓄积并降低药物毒副作用。但是，实体瘤中常常伴随着复杂的生物屏障，诸如细胞外基质稠密、组织液压升高、乏血管分布、血管内皮细胞排布致密等。这些生物屏障极大降低了肿瘤EPR效应，阻碍纳米药物的富集和渗透，使得纳米药物难以有效发挥抗肿瘤作用。研究发现(Wilhelm S,Tavares A J,Dai Q,etal.Analysis of nanoparticle delivery to tumours[J].Nature Reviews Materials,2016,1(5):1-12.)仅约0.7％的纳米药物被递送到了实体瘤。同时，目前基于EPR效应的纳米药物在临床疗效上未有显著提高，诸如
Figure BDA0002445656470000011
Figure BDA0002445656470000012
-PM等。因此，克服实体瘤生物屏障增强纳米药物富集和渗透以提高疗效是目前抗肿瘤纳米药物领域亟待解决的问题。
纳米药物的粒径、表面电荷、表面配体和形状等理化特性均会影响其渗透能力，载体上有少量正电荷可以促进载药系统在肿瘤内的渗透(Yuan Y,Mao C,Du X,etal.Surface charge switchable nanoparticles based on zwitterionic polymer forenhanced drug delivery to tumor.[J].Advanced Materials,2012,24(40):5476-5480.)。研究发现，通过胞吞转运作用的主动转运可能是纳米药物进入实体瘤的主要机制，而不是EPR效应中的被动扩散(Sindhwani S,Syed A M,Ngai J,et al.The entry ofnanoparticles into solid tumours[J].Nature Materials,2020:1-10.)。纳米药物的胞吞转运作用程度可能会随着其结构、表面化学性质和材料的不同而改变，文献(Zhou Q,Shao S,Wang J,et al.Enzyme-activatable polymer–drug conjugateaugments tumourpenetration and treatment efficacy[J].Nature Nanotechnology,2019,14(8):799-809.)报道了一种γ-谷氨酰转肽酶(GGT)催化水解致电荷翻转的聚合物用于肿瘤治疗，电荷转正后的聚合物颗粒可以渗透至肿瘤深处，并被肿瘤细胞摄取。因此，设计一种能在血液环境中保持负电势，而能在肿瘤部位转变为正电势的纳米药物，使其能够通过胞吞转运作用克服实体瘤生物屏障增强纳米药物富集和渗透以提高疗效。
脂质体作为一种药物输送载体，具有良好的生物相容性和生物降解性，可以增加药物的溶解度，降低药物的毒副作用，已广泛应用于抗肿瘤小分子药物和多肽、蛋白质、核酸等大分子药物的递送。PEG化长循环脂质体阿霉素Doxil被FDA批准用于卡波西氏肉瘤和多发性骨髓瘤等肿瘤的治疗，但其依靠EPR效应在实体瘤中的富集和渗透较差，没有表现出比游离阿霉素(DOX)制剂更好的抗癌功效(Barenholz Y.
Figure BDA0002445656470000022
-The first FDA-approved nano-drug:Lessons learned[J].Journal of Controlled Release,2012,160(2):117-134.)。因此，研发具有非EPR效应依赖性的脂质体纳米药物，以通过胞吞转运作用增强在实体瘤的富集和渗透，以提高治疗效果。
(三)发明内容
本发明涉及一种通过胞吞转运作用实现肿瘤富集和深部递送的酶促阳离子化脂质体及其应用，该脂质体含有酶促反应响应单元，可实现表面电势由负电势转变为正电势。
本发明采用的技术方案是：
一种酶促阳离子化脂质体，由含有酶促阳离子化的脂质组分构成，所述脂质组分结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002445656470000021
式(Ⅰ)中，X为酶促反应基团(如氨基酸的残基序列等)，R为烷基、芳香基或卤素原子中的一种。
所述酶为γ-谷氨酰转肽酶、基质金属蛋白酶或羧酸酯酶中的一种。
具体的，以实施例制得GCSDL所用的脂质材料谷胱甘肽修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE-GSH)为例，X为谷胱甘肽的残基序列，R为1,2-二油酰-甘油烷基链，所述酶促阳离子化脂质体的脂质组分结构如式(Ⅰ-1)所示：
Figure BDA0002445656470000031
该酶促阳离子化脂质体由氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇(CHOL)和谷胱甘肽修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE-GSH)按照物质的量之比3:2:3反应制得。
本发明还涉及所述酶促阳离子化脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还涉及一种酶促阳离子化载药脂质体，由所述酶促阳离子化脂质体负载药物制得，所述药物为下列之一：阿霉素、紫杉醇、喜树碱、吉西他滨、顺铂。
所述酶促阳离子化载药脂质体还可负载有超声造影剂，或荧光染料，或核磁造影剂，或光敏剂。所述超声造影剂包括六氟化硫、八氟化丙烷等，所述荧光染料包括罗丹明、荧光素、菁染料等，所述核磁造影剂包括钆离子、锰离子、铁离子等，所述光敏剂包括卟啉、卟酚等。
具体的，所述酶促阳离子化载药脂质体由如下方法制得：
(1)将氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇(CHOL)和谷胱甘肽修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE-GSH)按照物质的量之比3:2:3溶解在氯仿中，减压旋转蒸发，形成脂质膜；
(2)往脂质膜中加入硫酸铵溶液，超声下水化，将溶液在聚碳酸酯滤膜挤出，得到空白脂质体溶液在超滤管中离心，去除多余硫酸铵溶液，得到脂质体；
(3)将脂质体与阿霉素按照质量比16:2混合于含蔗糖的组氨酸缓冲液中，50～200r/min、40～60℃振荡反应3～5h，得到γ-谷氨酰转肽酶酶促阳离子化负载阿霉素脂质体(GCSDL)。
GGT可以催化GSH的γ-谷氨酰转移反应，生成阳离子伯胺，将阴离子GCSDL转化为阳离子GCSDL。静脉注射进入血液循环后，由于肿瘤血管内皮细胞高表达GGT酶，阴离子GCSDL将在肿瘤部位被GGT酶促反应转变为阳离子脂质体，引发胞吞转运作用并促进其跨血管内皮细胞运输，从而增强肿瘤富集。阳离子GCSDL迅速进入肿瘤细胞，通过释放DOX诱导细胞凋亡。同时，一些内化的阳离子GCSDL可通过胞吞转运作用进入肿瘤间质，继而被周围肿瘤细胞内化，跨肿瘤细胞转运至更深的区域，从而实现肿瘤深部渗透递药，提高肿瘤治疗效果。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)可根据在肿瘤部位高表达酶所催化的反应过程设计载体，在肿瘤局部触发酶促响应。研究表明胰腺癌和肝癌等实体瘤中，GGT在肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞表面具有较高的表达量。
(2)具有响应性阳离子化特征。表面电荷为负的纳米药物在体内血液循环中不易被蛋白吸附和网状内皮系统识别清除，具有血液稳定性和长循环特性；在肿瘤部位响应性阳离子化可以促进其在肿瘤的富集和渗透。GGT可催化GSH的γ-谷氨酰转移反应生成阳离子伯胺，触发脂质体阳离子化。
(3)胞吞转运作用介导肿瘤富集。该酶促阳离子化负载DOX脂质体的转运通过GGT酶催化触发阳离子化，胞吞转运作用依赖于胞膜窖和囊泡跨细胞运输，此过程为非EPR依赖性，
(4)具有肿瘤深部渗透递药特征。该酶促阳离子化负载DOX脂质体能够跨肿瘤细胞转运至肿瘤深部区域，增强纳米药物在肿瘤的深部渗透递药，在肝癌和胰腺癌等实体瘤中实现高效的药物蓄积和深部渗透，具有更佳的抗肿瘤效果。
(四)附图说明
图1为实施例1制备的DOPE-GSH(a)和DOPE-EGG(b)的1H-NMR表征图谱；
图2为实施例2制备的GCSDL在溶液中的动态光散射图；
图3为实施例2制备的GCSDL在冷冻透射电子显微镜图；
图4为实施例2制备的脂质体与GGT(10U/mL)孵育8h的电势变化图；
图5为实施例2制备的脂质体体外抗肿瘤实验中人胰腺癌细胞BxPC3(a)和BxPC3肿瘤球(b)增殖曲线图；
图6为Transwell实验中脂质体跨血管内皮细胞转运后被BxPC3细胞摄取的药物荧光强度图；
图7为内吞抑制剂预处理后的细胞摄取药物荧光强度；
图8为激光共聚焦显微镜拍摄脂质体胞吞转运过程(a)和流式细胞仪检测胞吞转运后BxPC3细胞内药物荧光强度(b)；
图9为激光共聚焦显微镜拍摄脂质体在BxPC3肿瘤球的深部渗透递药特性；
图10为抗肿瘤动物实验中所获得的肿瘤平均体积-时间曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：DOPE-GSH和对照DOPE-EGG的制备
DOPE-GSH的制备：
1)在二氯甲烷(DCM，10mL)中加入Boc保护的赖氨酸(Boc-Lys，0.35g，1mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.39g，2mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.23g，2mmol)，室温下反应4h，随后添加二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE，0.75g，1mmol)，室温下反应12h。
2)加入三氟乙酸(TFA，10mL)，室温下反应4h。旋转蒸发浓缩后，在甲醇中透析(截留分子量为500Da)24h，旋转蒸发干燥后，获得赖氨酸修饰的DOPE产物(DOPE-Lys，约0.65g，产率为74.5％)。
3)在DCM(10mL)中加入Boc-γ-Glu(otbu)-Cys(Trt)-Gly(pro-GSH，0.71g，1mmol)，EDC(0.39g，2mmol)和NHS(0.23g，2mmol)，在室温下反应4h，然后加入DOPE-Lys(0.38g，0.5mmol)，室温下反应24h。
Boc-γ-Glu(otbu)-Cys(Trt)-Gly(pro-GSH)采用固相合成法合成，具体步骤如下：
(1)合成NH2-Gly-树脂
a.AnaSpec树脂(1.27g，活性反应位点1.0mmol)分散在10mL DCM中，置于反应管内，室温震荡1.5h。
b.Fmoc-Gly-OH(0.89g，3.0mmol)、800μL二异丙基乙胺(DIPEA)和10mL二甲基甲酰胺(DMF)加入反应管，室温震荡2h。
c.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。
d.10mL甲醇和400μLDIPEA加入反应管，震荡20min。然后再加入400μLDIPEA，震荡20min。
e.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。
f.加入10mL体积分数20％哌啶的DMF溶液，震荡1h除去保护基Fmoc，重复操作3次。
g.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。即得到NH2-Gly-树脂。
(2)合成NH2-Cys(Trt)-Gly-树脂
a.Fmoc-Cys(Trt)-OH(1.76g，3.0mmol)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop，2.6g，5.0mmol)、羟基苯并三唑(HoBt，0.68g，5.0mmol)、800μL DIPEA和10mLDMF加入反应管，室温震荡2h。
b.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。
c.加入10mL体积分数20％哌啶的DMF溶液，震荡1h除去保护基Fmoc，重复操作3次。
d.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。即得到NH2-Cys(Trt)-Gly-树脂。
(3)合成Boc-γ-Glu(otbu)-Cys(Trt)-Gly-树脂
a.Boc-γ-Glu(otbu)-OH(0.91g，3.0mmol)、PyBop(2.6g，5.0mmol)、HoBt(0.68g，5.0mmol)、800μL DIPEA和10mL DMF加入反应管，室温震荡2h。
b.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。即得到Boc-γ-Glu(otbu)-Cys(Trt)-Gly-树脂。
(4)合成pro-GSH
a.反应管用DCM充分冲洗3次，每次20mL。
b.反应管中加入由2mL TFA、2mL乙酸和6mL DCM组成的切割液，震荡1h，该反应液能够保护Boc、otbu和Trt基团不受影响。
c.将切割液滴入10倍体积的低温乙醚中，离心得沉淀物。将沉淀物用甲醇溶解后，再滴入10倍体积的低温乙醚中，重复离心、复溶、沉淀操作3次。最后沉淀物经真空干燥后，即得到pro-GSH.其核磁图谱为1H-NMR(400MHz,MeOD,δ):7.31(s,15H),4.22(s,1H),3.82(s,4H),3.01(q,J＝17.2Hz,2H),2.63(s,2H),2.30(s,2H),1.95(d,J＝88.0Hz,3H),1.44(s,18H)；其质谱分子量为728.3。
4)加入TFA(10mL)，室温下反应12h。混合溶液经旋转蒸发浓缩，透析和干燥后，得到γ-Glu-Cys-Gly(GSH)修饰的DOPE(DOPE-GSH，约0.51g，产率为68.9％)。产物结构通过1H-NMR进行表征，1H-NMR谱图如图1(a)所示。
对照DOPE-EGG的制备：
Boc-γ-Glu(otbu)-Gly-Gly(pro-EGG)采用同样的固相合成法合成，具体步骤如下：
(1)合成NH2-Gly-树脂
a.AnaSpec树脂(1.27g，活性反应位点1.0mmol)分散在10mLDCM中，置于反应管内，室温震荡1.5h。
b.Fmoc-Gly-OH(0.89g，3.0mmol)、800μL二异丙基乙胺(DIPEA)和10mL二甲基甲酰胺(DMF)加入反应管，室温震荡2h。
c.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。
d.10mL甲醇和400μLDIPEA加入反应管，震荡20min。然后再加入400μLDIPEA，震荡20min。
e.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。
f.加入10mL体积分数20％哌啶的DMF溶液，震荡1h除去保护基Fmoc，重复操作3次。
g.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。即得到NH2-Gly-树脂。
(2)合成NH2-Gly-Gly-树脂
a.Fmoc-Gly-OH(0.89g，3.0mmol)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop，2.6g，5.0mmol)、羟基苯并三唑(HoBt，0.68g，5.0mmol)、800μL DIPEA和10mL DMF加入反应管，室温震荡2h。
b.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。
c.加入10mL体积分数20％哌啶的DMF溶液，震荡1h除去保护基Fmoc，重复操作3次。
d.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。即得到NH2-Gly-Gly-树脂。
(3)合成Boc-γ-Glu(otbu)-Gly-Gly-树脂
a.Boc-γ-Glu(otbu)-OH(0.91g，3.0mmol)、PyBop(2.6g，5.0mmol)、HoBt(0.68g，5.0mmol)、800μL DIPEA和10mL DMF加入反应管，室温震荡2h。
b.反应管用体积比为1/1的DCM/DMF混合溶剂冲洗3次，每次10mL。即得到Boc-γ-Glu(otbu)-Gly-Gly-树脂。
(4)合成pro-EGG
a.反应管用DCM充分冲洗3次，每次20mL。
b.反应管中加入由2mL TFA、2mL乙酸和6mL DCM组成的切割液，震荡1h，该反应液能够保护Boc和otbu基团不受影响。
c.将切割液滴入10倍体积的低温乙醚中，离心得沉淀物。将沉淀物用甲醇溶解后，再滴入10倍体积的低温乙醚中，重复离心、复溶、沉淀操作3次。最后沉淀物经真空干燥后，即得到pro-EGG.其核磁图谱为1H-NMR(400MHz,MeOD,δ):4.05-3.77(m,5H),2.99(s,2H),2.37(s,2H),1.97(d,J＝126.6Hz,2H),1.47(s,16H)；其质谱分子量为440.2。
按上述制备工艺采用Boc-γ-Glu(otbu)-Gly-Gly(pro-EGG)合成对照脂质材料γ-Glu-Gly-Gly(EGG)修饰的DOPE(DOPE-EGG)。产物结构通过1H-NMR进行表征，1H-NMR谱图如图1(b)所示。
实施例2：GCSDL脂质体和对照CCDL脂质体的制备和表征
采用硫酸铵梯度法制备GCSDL脂质体，制备过程如下：
1)在250mL烧瓶中，将摩尔比为3：2：3的HSPC(氢化大豆磷脂)(23.6mg，0.03mmol)，CHOL(胆固醇)(7.7mg，0.02mmol)和DOPE-GSH(谷胱甘肽修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺)(43.0mg，0.03mmol)溶解在氯仿(10mL)中，减压旋转蒸发，以形成脂质膜。
2)加入硫酸铵溶液(0.3M，20mL)，在超声下水化后，将溶液在聚碳酸酯滤膜(100nm)挤出，得到空白脂质体溶液，在超滤管中(截留分子量为100kDa)以5000r/min，离心60min，去除多余的硫酸铵溶液。
3)将浓缩后的脂质体与DOX(阿霉素)(质量比为16：2)混合于4.6mL含10％(w/w)蔗糖的组氨酸缓冲液(10mM，pH 6.5)，在振荡器(100r/min，50℃)中振荡4h，制备得到GCSDL脂质体。
对照CCDL脂质体的制备：
采用上述工艺，以DOPE-EGG替换DOPE-GSH制备对照脂质体CCDL。
性能测试1：脂质体的粒径和载药量表征
在用PBS缓冲液(10mM，pH7.4)适当稀释后，使用动态光散射分析仪(Dynamiclight scattering，DLS)测定实施例2制备的脂质体的粒径和电势。用冷冻透射电子显微镜(Cryo-TEM)对脂质体形态进行表征。通过Sephadex G-50凝胶过滤层析测定脂质体的包封率和载药率。
制备得到的GCSDL脂质体粒径和电势如图2所示，其Cryo-TEM图如图3所示，GCSDL脂质体分散良好，粒径约65nm。实施例2制备得到的脂质体的粒径、分布、包封率和载药量汇总如下：
表1：脂质体的粒径、分布、包封率和载药量
脂质体 粒径(nm) 粒径分布 包封率(％) 载药量(％)
GCSDL 65.2±5.7 ～0.05 >95 10
CCDL 68.8±7.1 ～0.05 >95 10
如表1显示，包载DOX的GCSDL脂质体包封率大于95％，载药量约为10％，制备得到的GCSDL脂质体包封率高、载药量高、粒径小、分布均匀。
性能测试2：脂质体的酶促阳离子化测试
分别取实施例2制备的脂质体和商品化脂质体Doxil(总脂质含量为10mM)，置于含10U/mL GGT酶的PBS缓冲液中，100r/min摇床震荡，37℃孵育，在系列时间点取100μL样品，转移到900μL PBS缓冲液中，测定脂质体的电势。
实施例2制备的脂质体与GGT(10U/mL)孵育8h的电势变化图如图4所示，3h内GCSDL脂质体的电势由-14.6mV改变为+9.4mV，而对照脂质体CCDL依然呈现为负电势，Doxil电势没有明显改变。证明了GGT特异性催化GSH的γ-谷氨酰转移反应，生成阳离子伯胺，从而实现GCSDL的阳离子化。
应用例1：体外抗肿瘤细胞增殖实验
采用人胰腺癌细胞BxPC3测试实施例2制备的脂质体、商品化脂质体Doxil和游离DOX的细胞毒性，在96孔板(104个细胞/孔)中分别加入GCSDL、CCDL、Doxil和DOX溶液(等效DOX浓度为0～10μg/mL)，孵育48h后，将培养基替换为含Alamar Blue细胞活力检测试剂的新鲜培养基，孵育12h后，使用酶标仪在530nm激发和590nm发射下检测样品板的荧光强度。
另将BxPC3细胞(106个细胞/mL)稀释在含1.2％甲基纤维素和RPMI1640培养基(体积比为1/4)的混合溶液中。将20μL细胞悬液接种到100mm细胞培养皿的盖子上，将盖子翻转。置于细胞培养箱培养5天后，将肿瘤球转移到1％琼脂糖(50μL)预包被的96孔板中，构建肿瘤球模型，按上述方法测试实施例2制备的脂质体、商品化脂质体Doxil和游离DOX的细胞毒性。
脂质体体外抗BxPC3细胞增殖曲线图如图5(a)所示，制备得到的脂质体具有相似的细胞毒性，且呈剂量依赖性；抗BxPC3肿瘤球增殖曲线图如图(b)所示，具有酶促阳离子化特性的GCSDL脂质体具有更高的细胞毒性，显著优于商品化脂质体Doxil和游离DOX。
应用例2：跨血管内皮细胞胞吞转运递送实验
通过Transwell装置研究实施例2制备的脂质体和商品化脂质体Doxil在血管内皮细胞中的跨细胞转运。将高表达GGT的人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC或低表达GGT的人脐静脉内皮细胞HUVEC(5×105个细胞/mL，1mL)接种于上室基底膜，培养4天，将人胰腺癌细胞BxPC3(105个细胞/mL，1mL)接种于下室，培养12h，将脂质体溶液(等效DOX浓度为1μg/mL)添加到上室中，孵育3h后，将BxPC3细胞用PBS洗涤3次，胰酶消化，PBS缓冲液中重悬，通过流式细胞仪测定BxPC3细胞内DOX的荧光强度。另用胞吐抑制剂EXO1(20μM)和GGT抑制剂GGsTop(50μM)对血管内皮细胞预处理3h，再加入脂质体溶液，以考察抑制剂对胞吞转运的影响。
孵育6h后，BxPC3细胞内的药物荧光强度如图6所示，GSCDL可在高表达GGT的ECDHCC细胞进行跨细胞转运，递送至BxPC3细胞中的药物荧光强度约为Doxil和CCDL的2倍，并且这种转运可被GGT抑制剂GGsTOP和胞吐抑制剂EXO1所抑制；而在低表达GGT的HUVEC细胞中没有观察到这种现象，而且GGsTOP和EXO1对Doxil和CCDL的递送没有明显影响。结果表明GCSDL是通过GGT酶促阳离子化诱发胞吞转运实现跨血管内皮细胞输送。
应用例3：肿瘤细胞内吞途径实验
将BxPC3细胞(105个细胞/mL，1mL)在12孔板培养24h，加入实施例2制备的脂质体和商品化脂质体Doxil(等效DOX浓度为1μg/mL)，应用网格蛋白介导内吞抑制剂(氯丙嗪，50μM)，胞膜窖蛋白介导内吞抑制剂(金雀异黄酮，200μM)，巨胞饮抑制剂(渥曼青霉素，5μM)和肌动蛋白依赖内吞抑制剂(细胞松弛素D，5μM)和低温(4℃)预处理细胞后，流式细胞仪检测细胞内药物荧光强度。
流式细胞仪检测内吞抑制剂预处理的细胞内药物荧光强度如图7所示，结果表明，氯丙嗪和低温会导致Doxil和CCDL的细胞摄取效率显著降低，表明二者为能量依赖性的网格蛋白介导的内吞途径；金雀异黄酮和低温明显抑制GCSDL的细胞摄取，表明GCSDL是主要通过能量依赖性的胞膜窖介导内吞途径。
应用例4：跨肿瘤细胞胞吞转运实验
将BxPC3细胞(105个细胞/mL，1mL)在共聚焦培养皿中培养24h，分别加入实施例2制备的脂质体和商品化脂质体Doxil(等效DOX浓度为1μg/mL)，孵育3h，用PBS缓冲液洗涤两次，加入新鲜细胞(105个细胞/mL，1mL)至培养皿中，使用激光共聚焦显微镜拍摄2h内脂质体向新添加细胞的跨细胞转运过程。并将新加入的细胞收集到离心管中，流式细胞仪进行检测细胞内药物荧光强度。另采用P-糖蛋白抑制剂Tariquidar(10nM)和胞吐抑制剂EXO1(20μM)预处理细胞，研究其对跨细胞转运的抑制情况。
激光共聚焦显微镜拍摄脂质体跨肿瘤细胞胞吞转运过程如图8(a)所示，流式细胞仪检测细胞内药物荧光强度如图8(b)所示，GCSDL可以在2h内被大量转运到新添加的BxPC3细胞中，而在新添加的BxPC3细胞中几乎观察不到Doxil和CCDL；GCSDL的转运不受P-糖蛋白抑制剂Tariquidar的抑制，表明P-糖蛋白介导的外排泵对这种跨细胞转运特性没有影响，而胞吐抑制剂EXO1显着抑制了GCSDL的转运，证明GCSDL可以通过胞吞转运作用实现在肿瘤细胞间输送。
应用例4：肿瘤球渗透实验
建立BxPC3肿瘤球评价实施例2制备的脂质体和商品化脂质体Doxil的肿瘤深部渗透能力。培养皿中加入脂质体(等效DOX浓度为1μg/mL)，孵育6h，PBS洗涤两次后，用激光共聚焦显微镜观察肿瘤球不同切面药物的渗透情况。另采用P-糖蛋白抑制剂Tariquidar(10nM)、胞吐抑制剂EXO1(20μM)、内吞抑制剂Genistein(200μM)和GGT抑制剂GGsTop(50μM)预处理3h，考察脂质体在肿瘤球的胞吞转运特性。
激光共聚焦显微镜拍摄的脂质体在肿瘤球的渗透情况如图9所示。GCSDL可渗透分布于肿瘤球内部，而Doxil和CCDL均仅仅分布在肿瘤球边缘。P-糖蛋白抑制剂对GCSDL的渗透能力没有明显影响，GGsTop、金雀异黄酮和EXO1预处理后，GCSDL的渗透能力明显降低，再次证明GCSDL的渗透主要通过GGT酶促阳离子化触发的胞吞转运作用实现，并且依赖于胞膜窖和囊泡介导的内吞和胞吐完成。
应用例5：动物模型抗肿瘤活性实验
采用原位胰腺接种BxPC3肿瘤的裸鼠测试实施例2制备的脂质体、商品化脂质体Doxil和游离DOX的体内抗肿瘤活性。将BxPC3-Luci细胞(4×108个细胞/mL)与基质胶和PBS的混合液(体积比为1/2)混合，麻醉小鼠并暴露胰腺，将细胞悬液(25μL)注入胰腺，缝合腹部肌肉和外部皮肤，待肿瘤长成后开始分组实验。临床一线化疗药物吉西他滨(GEM)被用作阳性对照，PBS溶液为阴性对照。实验分五组即PBS、GCSDL、Doxil、DOX(等效DOX剂量为4mg/kg)和GEM(50mg/kg)，每组5只，每两天静脉注射，共注射三次，使用小动物生物发光成像评估原位肿瘤的生长情况，并于实验结束时处死小鼠剥离肿瘤，计算肿瘤抑制率。
体内抗肿瘤活性实验结果如图10所示，在给药治疗期间DOX、Doxil、GCSDL和GEM组肿瘤生长均能受到抑制。但在停药观察期，DOX、Doxil和GEM组肿瘤又恢复迅速生长，只有GCSDL组肿瘤被抑制生长。处死小鼠，剥离肿瘤，对比肿瘤重量，GEM、DOX和Doxil的肿瘤抑制率为74.5％、53.8％和63.1％，而GCSDL具有高达90.4％的肿瘤抑制率，显示出优异的抗肿瘤效果。

Claims (5)

1.一种酶促阳离子化脂质体，由含有酶促阳离子化的脂质组分构成，所述脂质组分结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003238962460000011
式(I)中，X为酶促反应基团，R为烷基、芳香基或卤素原子中的一种；
所述酶为γ-谷氨酰转肽酶；
所述酶促阳离子化脂质体的脂质组分结构如式(I-1)所示：
Figure FDA0003238962460000012
2.权利要求1所述酶促阳离子化脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.一种酶促阳离子化载药脂质体，由权利要求1所述酶促阳离子化脂质体负载药物制得，所述药物为下列之一：阿霉素、紫杉醇、喜树碱、吉西他滨、顺铂。
4.如权利要求3所述的酶促阳离子化载药脂质体，其特征在于所述酶促阳离子化载药脂质体还负载有超声造影剂，或荧光染料，或核磁造影剂，或光敏剂。
5.如权利要求3所述的酶促阳离子化载药脂质体，其特征在于所述酶促阳离子化载药脂质体为γ-谷氨酰转肽酶酶促阳离子化负载阿霉素脂质体，由如下方法制得：
(1)将氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇(CHOL)和谷胱甘肽修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE-GSH)按照物质的量之比3:2:3溶解在氯仿中，减压旋转蒸发，形成脂质膜；
(2)往脂质膜中加入硫酸铵溶液，超声下水化，将溶液在聚碳酸酯滤膜挤出，得到空白脂质体溶液在超滤管中离心，去除多余硫酸铵溶液，得到脂质体；
(3)将脂质体与阿霉素按照质量比16:2混合于含蔗糖的组氨酸缓冲液中，50～200r/min、40～60℃振荡反应3～5h，得到γ-谷氨酰转肽酶酶促阳离子化负载阿霉素脂质体(GCSDL)。
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