JPH1087507A

JPH1087507A - γ−グルタミルトランスペプチターゼの新規な用途

Info

Publication number: JPH1087507A
Application number: JP9180422A
Authority: JP
Inventors: Yasuyuki Ishizuka; 保行石塚
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1997-06-19
Publication date: 1998-04-07
Anticipated expiration: 2017-06-19
Also published as: JP4034381B2

Abstract

(57)【要約】【解決手段】γ−グルタミルトランスペプチターゼ（以
下、γ−ＧＴＰ）または破骨細胞分化促進活性を有する
γ−ＧＴＰ誘導体を有効成分として含有する、破骨細胞
分化促進剤、該γ−ＧＴＰ等を用いることを特徴とする
破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法、該
スクリーニング方法を用いて得られる破骨細胞分化促進
活性阻害剤。【効果】γ−ＧＴＰは破骨細胞分化促進活性を有するこ
とから、低回転型骨粗鬆症に対する有効な治療薬とな
る。またγ−ＧＴＰを用いたスクリーニングにより得ら
れた破骨細胞分化促進活性阻害剤は、高回転型骨粗鬆
症、癌の骨転移に伴う高カルシウム血症や骨破壊、慢性
関節リウマチに伴う骨破壊、さらには慢性肝疾患に伴う
二次的骨減少症等の疾患に対する有効な治療薬となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、γ−グルタミルト
ランスペプチターゼ（以下、γ−ＧＴＰと略す）の新た
な用途に関する。さらに詳しくは、γ−ＧＴＰまたはそ
の活性を保持する誘導体を有効成分として含有する破骨
細胞分化促進剤、または該γ−ＧＴＰ等を用いる破骨細
胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法、さらには
該スクリーニングにより見出される破骨細胞分化促進活
性阻害剤、に関する。

【０００２】

【従来の技術】１．破骨細胞分化促進因子骨組織は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸
収とによって基本的形状を変えることなく、新生骨に置
換される。この過程は骨リモデリング（骨再造形）と呼
ばれ、生体の機能維持に重要な役割を果たしている。骨
形成の中心的な役割を果たしている骨芽細胞は、間葉系
由来の未分化細胞から分化し、骨基質を形成する。一
方、骨吸収の中心的な役割を果たしている破骨細胞は骨
髄細胞に由来し、骨芽細胞との細胞間接触を介して分化
することにより形成される。成熟破骨細胞は多核で増殖
性の乏しい巨細胞であり、カルシトニン受容体や酒石酸
抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を発現する。ま
た、骨や象牙質等の石灰化組織を吸収する活性を有して
いる。これら破骨細胞と骨芽細胞による骨リモデリング
のバランスは、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による
骨形成の繰り返しにより平衡に保たれている。しかし、
ひとたびこの平衡バランスが崩れると骨組織は異常をき
たし、種々の疾患を呈することになる。

【０００３】骨リモデリングの異常により起こる代表的
な疾患として、骨粗鬆症が知られている。骨粗鬆症は、
骨リモデリングの代謝回転速度からみて、閉経早期ある
いは甲状腺機能亢進症などにおいて認められる高回転型
骨粗鬆症と、老人性、ステロイド性、糖尿病性骨粗鬆症
において認められる低回転型骨粗鬆症に分類されてい
る。それ以外では、例えば癌の骨転移に伴う高カルシウ
ム血症や骨破壊、慢性関節リウマチに伴う骨破壊等の疾
患が、上記骨リモデリングの異常により起こる疾患とし
て知られている。これら癌の骨転移に伴う高カルシウム
血症や骨破壊、あるいは慢性関節リウマチに伴う骨破壊
は、破骨細胞の機能が異常に亢進した結果生じる疾患で
ある。

【０００４】以上のような疾患に対する有効な治療薬の
探索が種々なされているが、未だ決定的な治療薬は見出
されていない。アプローチの一つとして、骨髄細胞から
破骨細胞への分化を促進する因子、あるいはその阻害剤
が、上記疾患に対する治療薬となることが考えられる。
すなわち破骨細胞の分化促進因子は、上述の如き低回転
型骨粗鬆症においてみられる骨リモデリングの低回転を
正常に戻すことが考えられるため（J.Bone Miner Res.,
7, p65 (1992) ）、この低回転型骨粗鬆症の有効な治療
薬となることが考えられる。一方、破骨細胞分化促進因
子の阻害剤は、上述の如き高回転型骨粗鬆症における骨
リモデリングの高回転を正常に戻すことが考えられるた
め（Am.J.Med.Sci., 305(1), p40(1993)及び Mebio.,11
(2), p24(1994))、この高回転型骨粗鬆症の有効な治療
薬となることが考えられる。また、前記の如き破骨細胞
の機能の亢進に伴う癌患者の骨破壊や、慢性間接リウマ
チ患者の骨破壊等にも、この破骨細胞分化促進因子の阻
害剤が有効に働くことが考えられる。破骨細胞分化促進
因子は骨吸収因子とも呼ばれ、これまでに活性型のビタ
ミンＤ３、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インターロイ
キン１、プロスタグランディン等が知られている。しか
しこれらの因子は種々の問題点があり、未だ治療薬とは
なっておらず、新たな破骨細胞分化促進因子の出現が望
まれている。

【０００５】２．γ−ＧＴＰ γ−ＧＴＰは、γーグルタミルペプチドを加水分解する
と同時に、そのγーグルタミル基を他のペプチドやアミ
ノ酸に転移する反応を触媒する膜結合型酵素である。γ
−ＧＴＰは腎、膵、肝の順に活性が高く、特に腎臓では
近位尿細管、肝臓では毛細胆管、膵臓では膵腺房や膵管
系に広く存在している。γ−ＧＴＰの生理的機能とし
て、物質輸送能の高い臓器の細胞膜に結合した膜結合型
酵素であるという局在性と、上述の如き酵素の反応特性
から、γ−グルタミルサイクルの一員として細胞の外側
から細胞内へ共役的にアミノ酸を輸送する機能を有して
るという仮説が提唱されている（ Science,180, p33(19
73) ）。しかし、この仮説を否定する報告も種々なされ
ている（代謝、16,(3) (1979)、Eur.J.Biochem.,78,p60
9(1977)、Biochem.Biophys.Res.Commun.,65,p68(197
5)、およびBiochem.Biophys.Res.Commun.,73,p 997(197
6))。

【０００６】また、γ−ＧＴＰの別の生理的機能とし
て、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）のサルベージに関
与していることが推測されている。すなわち、生体には
非常に多くのグルタチオン（ＧＳＨ）が存在し、生体内
酸化反応に対応して酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）と
して血中に放出されていることが知られている（E.,Cli
n.Chim.Acta,7,p755(1969)）。このＧＳＳＧもＧＳＨと
同様に本酵素の基質となることが知られている。アミノ
酸と異なり、このものの細胞内への輸送速度は非常に遅
いため、腎近位尿細管のγ−ＧＴＰによりＧＳＨを分解
し、アミノ酸にして細胞内に取り込み、元のＧＳＨを合
成することで一定濃度を維持している。もし腎近位尿細
管に本酵素がなく、構成アミノ酸への水解が起こらなけ
れば、その大部分は尿中に失われてしまう。そのため、
本酵素欠損症の患者尿中には大量のＧＳＳＧが見出され
ている（グルタチオン尿症）。これらの知見に基づき、
ＧＳＳＧのサルベージが本酵素の生理機能の一つと推測
されている。

【０００７】また、γ−ＧＴＰの用途としては、肝疾患
の診断薬としての用途が知られている。すなわち、肝細
胞のγ−ＧＴＰは、大部分がミクロソーム分画に局在
し、血中には肝由来の可溶型γ−ＧＴＰが僅かに存在し
ている。γ−ＧＴＰは、種々の肝胆道疾患に伴い血中濃
度が上昇するため、これら肝胆道疾患の有効な診断薬と
なっている。その中でも診断的意義の最も高い疾患が、
胆汁うっ滞である。特に肝内性、肝外性うっ滞時にはア
ルカリ性ホスファターゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ
などの胆道系酵素とともに、著しくγ−ＧＴＰの血中濃
度が上昇する。具体的な疾患としては、胆汁うっ滞を起
こす薬剤性肝炎や急性アルコール性肝炎などが挙げられ
る。また部分的な胆汁うっ滞である原発性、転移性肝癌
などの限局性肝病変及びアルコール常習者の場合では、
γ−ＧＴＰは中等度の上昇を示す。急性肝炎ではアスパ
ラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、アラニ
ンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）などのトランス
アミナーゼの上昇に比し、γ−ＧＴＰの上昇は軽度であ
る。また、慢性肝炎、肝硬変でも軽度の上昇にとどま
る。このようにγ−ＧＴＰは、種々の肝疾患において特
異性の高い鋭敏な診断薬として日常的に利用されてい
る。

【０００８】以上のように、γ−ＧＴＰの種々の生物学
的機能が示唆され、また、肝疾患における診断薬として
の用途が知られている。しかし該γ−ＧＴＰが、前記破
骨細胞の分化促進に関与しているか否かについては、何
ら明らかにされていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、γ−ＧＴＰの新たな生理機能を見出すこと
により、γ−ＧＴＰまたはその活性を保持する誘導体
の、新たな用途を提供することにある。すなわち、γ−
ＧＴＰの破骨細胞分化促進因子としての機能を見出すこ
とにより、γ−ＧＴＰまたはその活性を保持する誘導体
を有効成分として含有する破骨細胞分化促進剤、あるい
は該γ−ＧＴＰ等を用いる破骨細胞分化促進活性阻害剤
のスクリーニング方法、さらには該スクリーニングによ
り見出される破骨細胞分化促進活性阻害剤、を提供する
ことにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、骨転移細
胞であるＢＷ５１４７細胞から発現クローニング法によ
り破骨細胞分化促進因子を探索したところ、（１）破骨
細胞のマーカー酵素であるＴＲＡＰ染色性、（２）カル
シトニン受容体の存在、（３）象牙の分解活性の、公知
の３つの特性を有する「破骨細胞」へと分化形成させる
因子を発見することに成功した。我々は、このタンパク
性因子をＯＰＦａ１２と命名してさらに解析を進めたと
ころ、驚くべきことに本発明者らがクローニングしたＯ
ＰＦａ１２は、γ−ＧＴＰと同一物質であることが判明
した。すなわち、現在まで細胞内へのアミノ酸の輸送、
あるいはＧＳＳＧのサルベージといった生体内機能しか
知られていなかったγ−ＧＴＰが、破骨細胞の分化促進
活性という新規な機能を有することを発見し、さらに研
究を重ねて本発明を完成するに至った。

【００１１】即ち本発明の要旨は、（１） γ−ＧＴ
Ｐ、または破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘
導体、を有効成分として含有する、破骨細胞分化促進
剤、（２） γ−ＧＴＰ、または破骨細胞分化促進活性
を有するγ−ＧＴＰ誘導体、を用いることを特徴とす
る、破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方
法、（３）前記（２）記載のスクリーニング方法を用
いて得られる、破骨細胞分化促進活性阻害剤、（４）
γ−ＧＴＰのペプチド断片、または破骨細胞分化促進活
性を有するγ−ＧＴＰ誘導体のペプチド断片よりなる、
前記（３）記載の破骨細胞分化促進活性阻害剤、（５）
γ−ＧＴＰに対する抗体、または破骨細胞分化促進活
性を有するγ−ＧＴＰ誘導体に対する抗体からなる、前
記（３）記載の破骨細胞分化促進活性阻害剤、（６）
前記（３）〜（５）いずれか記載の破骨細胞分化促進活
性阻害剤よりなる、高回転型骨粗鬆症、癌の骨転移に伴
う高カルシウム血症又は骨破壊、慢性関節リウマチに伴
う骨破壊、あるいは慢性肝疾患に伴う二次性骨減少症、
に対する治療薬、並びに（７）前記（１）記載の破骨
細胞分化促進剤よりなる、低回転型骨粗鬆症に対する治
療薬、に関する。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明においてγ−ＧＴＰとは、
全ての脊椎動物のγ−ＧＴＰを含むものである。既に、
ヒト(Gene,73, p1 (1988)）、マウス(Gene,167, p233(1
995))、ラット(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83, p937(198
6)）等、脊椎動物のγ−ＧＴＰのｃＤＮＡがクローニン
グされている。そして、マウスとラットγ−ＧＴＰでは
約９０％のホモロジーを、またヒトとラットγ−ＧＴＰ
では約８０％のホモロジーを有しており、種間で非常に
高いホモロジーを有することが分かっている。従って、
前記文献等において開示された塩基配列よりγ−ＧＴＰ
特異的なプライマーあるいはプローブを作製し、該プラ
イマーあるいはプローブを用いて脊椎動物の種々のｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本
発明のγ−ＧＴＰを容易にクローニングすることができ
る。これらクローニングの方法は、例えばMolecular Cl
oning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989)等に詳しく述べられており、具体的には、ハイブ
リダイゼーションを用いる方法、あるいはＰＣＲを用い
る方法等が挙げられる。

【００１３】また、クローニングされたｃＤＮＡの発現
ベクターへの挿入、および該発現ベクターの原核性生物
細胞または真核性生物細胞への導入は、いずれも前記Mo
lecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Labora
tory Press(1989)等に従い、当業者ならば容易に行える
状況にある。さらに、上記発現ベクター導入細胞の培養
上清中に産生されたγ−ＧＴＰは、亜鉛キレートアガロ
ース、コンカナバリンＡアガロース、セファデックスＧ
−１５０等を用いる公知の方法等によって、容易に精製
することができる。

【００１４】本発明において「破骨細胞分化促進活性を
有するγ−ＧＴＰ誘導体（以下単に、活性を有するγ−
ＧＴＰ誘導体、と略することもある）」とは、人為的に
作製したいわゆる改変タンパク質あるいはペプチドや、
生体内に存在するアレル変異体等のうち、破骨細胞分化
促進活性を有するものを指す。該誘導体をコードするＤ
ＮＡは、例えば特異的突然変異誘発 ( Methods in Enzy
mology, 100, p468 (1983)) やＰＣＲ法(Molecular Clo
ning 2nd Edt. 15章、Cold Spring Harbor Laboratory
Press(1989))等の手法により、当業者ならば容易に作製
することができる。また、このようにして作製されたＤ
ＮＡからタンパク質への発現は、前記γ−ＧＴＰと同様
にして行うことができる。

【００１５】またここで「破骨細胞分化促進活性」は、
例えば、骨髄細胞に対してγ−ＧＴＰの種々の誘導体を
作用させた後、破骨細胞の公知の作用−すなわち１）Ｔ
ＲＡＰ染色性、２）カルシトニン受容体の存在、３）象
牙の分解活性、を調べることにより、容易に測定するこ
とができる。具体的には以下のようにして測定すること
ができる。

【００１６】まずアッセイ用の細胞であるが、破骨細胞
は、骨髄系細胞から分化・誘導される細胞であると考え
られているため、アッセイ用細胞として、この骨髄系細
胞を使用する。具体的には、たとえば 6〜12週令のマウ
スの大腿骨および脛骨の骨端を切り落としたものをピペ
ッティングし、沈殿した骨残渣を除いた上清部分を骨髄
細胞として使用することができる。この調製された骨髄
細胞を、活性型ビタミンＤを含む培養液中に懸濁させ、
適当な濃度(例えば2×10⁶個細胞/ml )に調製してプレー
ト(例えば96穴プレート)上にまき、そこへ、被験物質で
あるγ−ＧＴＰの種々の誘導体を添加した後、１）ＴＲ
ＡＰ染色法、２）象牙を用いたｐｉｔ形成法、３）カル
シトニン受容体の検出法、の、破骨細胞の公知の３つの
作用を調べ、これら１）〜３）の全てにポジティブであ
った場合は、該γ−ＧＴＰの誘導体に、破骨細胞分化促
進活性が存すると判断する。ここで１）のＴＲＡＰ染色
は、例えばEndocrinology, 122, p1373(1988)等に従
い、まず上記の如く被験物質で処理された骨髄細胞をア
セトン−クエン酸緩衝液で固定した後、酒石酸存在下で
基質（Naphthol AS-Mxphosphate)と色素（Fastredviole
t LB salt）を３７℃で１時間程度反応させることによ
り、検出することができる。また２）のｐｉｔ形成測定
は、例えば、あらかじめ直径6mm、1mm厚程度の象牙質ス
ライスを96穴ウエルプレートのウエル底に敷いたものを
用意し、このウエル上で、上記の如き被験物質による骨
髄細胞の処理を行い、適当な期間の後、象牙質スライス
上の細胞を先のＴＲＡＰ染色し、0.25％トリプシン−0.
02％ＥＤＴＡで一晩処理し、スライス上の細胞をシリコ
ンスクレイパーで削り取った後、象牙質スライス上のｐ
ｉｔ（吸収窩）を顕微鏡下で観察し、その数を測定する
ことにより測定することができる。また、３）のカルシ
トニン受容体の検出は、例えばLAB-TECチェンバースラ
イド上で被験物質による処理を行った細胞に対し、[¹²⁵
I］サケ・カルシトニンを加えて37℃で反応させた後、
先のＴＲＡＰ染色を行い、その後スライドをエマルジョ
ン（KODAK NTB-2）に浸し、暗箱中４℃で2-7日保存
し、その後現像して顕微鏡下で観察することにより、検
出することができる。以上のような破骨細胞分化促進活
性の測定法に種々のγ−ＧＴＰの誘導体を供することに
より、上記の如き活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体を、容
易に選別することができる。

【００１７】本発明のγ−ＧＴＰまたは活性を有するγ
−ＧＴＰ誘導体は、破骨細胞分化促進活性を有する因子
である。従ってこれらの物質を有効成分として含有する
「破骨細胞分化促進剤」は、「従来の技術」の項にも記
載した如く、老人性、ステロイド性、糖尿病性骨粗鬆症
において認められる低回転型骨粗鬆症に対する有効な治
療薬となるものである。これら破骨細胞分化促進剤の患
者への投与方法としては、静脈注射による投与が好まし
いが、経口投与、坐薬としての投与、皮下注射、筋肉注
射、局所注入、腹腔内投与なども考えられる。また投与
量は、一日量 0.0001 〜100mg 程度を症状が改善される
まで投与することが可能である。

【００１８】本発明のγ−ＧＴＰまたは活性を有するγ
−ＧＴＰ誘導体はまた、破骨細胞分化促進活性阻害剤の
スクリーニングのためにも使用できる。ここで、「破骨
細胞分化促進活性阻害剤」とは、本発明のγ−ＧＴＰ等
の有する破骨細胞分化促進活性を阻害する薬剤を指す。
そして「破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング
方法」は、先に述べた破骨細胞分化促進活性の測定系
に、被験物質である阻害剤候補物質を添加することによ
って実施することができる。

【００１９】例えば上記の破骨細胞分化促進活性測定法
のうち、「２）象牙を用いたｐｉｔ形成法」により阻害
剤のスクリーニングを行う際は、まず前記の如く象牙質
スライス上で、マウス骨髄細胞に対し、γ−ＧＴＰと阻
害剤候補物質とを添加、作用させる。その際、阻害剤候
補物質に阻害作用があれば、象牙質に吸収窩（ｐｉｔ）
が形成されない。この吸収窩の形成を指標に、容易に阻
害剤をスクリーニングすることができる。以上のよう
な、γ−ＧＴＰを用いた破骨細胞分化促進活性阻害剤の
スクリーニング方法は、本発明においてγ−ＧＴＰの新
たな生理機能を見出したことに伴って、初めて可能とな
ったものである。

【００２０】本発明において「破骨細胞分化促進活性阻
害剤」とは、上記スクリーニング方法により見出される
ものであり、前記もしたように、本発明のγ−ＧＴＰの
有する破骨細胞分化促進活性を阻害する薬剤を意味す
る。このような破骨細胞分化促進活性阻害剤は、「従来
の技術」にも記載したように、閉経早期あるいは甲状腺
機能亢進症などにおいて認められる高回転型骨粗鬆症に
対する治療薬、また癌の骨転移に伴う高カルシウム血症
や骨破壊、あるいは慢性関節リウマチに伴う骨破壊等の
疾患に対する有効な治療薬となるものである。なお後述
の実施例に記載の如く、本発明のγ−ＧＴＰはコラーゲ
ン関節炎モデルの炎症部位で発現しており、またγ−Ｇ
ＴＰに対する抗体は、コラーゲン関節炎マウスの炎症関
節部位より分離した細胞から破骨細胞への分化誘導を、
抑制することが示された。これらの結果は、γ−ＧＴＰ
の阻害剤が、上記慢性関節リウマチに伴う骨破壊に対す
る有用な治療薬になることを裏付けるものである。さら
に、本発明のγ−ＧＴＰは、骨転移し易くまた高カルシ
ウム血症の合併頻度の高い癌細胞として知られている前
骨髄性白血病細胞、Burkittsリンパ腫細胞、あるいは肺
癌細胞等において高発現していることが示された。これ
らの結果は、γ−ＧＴＰの阻害剤が、上記癌の骨転移に
伴う高カルシウム血症や骨破壊に対する有用な治療薬と
なることを裏付けるものである。

【００２１】さらに、上記疾患以外にも、本発明の破骨
細胞分化促進活性阻害剤は、慢性肝疾患に伴う二次性骨
減少症の有効な治療薬となることが考えられる。すなわ
ち近年、大阪府立病院消化器内科グループの調査におい
て、慢性肝疾患の二次性（肝性）骨減少症の頻度とその
病態についての解析が行われており（肝臓 36巻, 2
号,1：p67,(1995))、これによると、ＤＸＡ法で骨塩量
を測定するとともに骨代謝のパラメーターを生化学的並
びに内分泌学的に検討した結果、慢性肝疾患では健常対
照群に比して二次的な骨減少症の頻度が有意に高く、し
かも、肝硬変に至る以前の慢性肝炎の時期に肝性骨減少
症が発症しているという結果が得られた。さらに、慢性
肝疾患において、骨減少症合併群は非合併群に比べてγ
−ＧＴＰと総胆汁酸量が有意な高値を示したことも報告
された。このように、上記慢性肝疾患における二次性骨
減少症においてγ−ＧＴＰが有意な高値を示したことが
報告されたが、これら二次性骨減少症とγ−ＧＴＰとの
関係については、何ら示されていない。本発明において
は、γ−ＧＴＰが破骨細胞分化促進活性を有すること
を、新たに見出した。この新たな発見と、上記慢性肝疾
患における二次的骨減少症においてγ−ＧＴＰが有意に
高値であったという報告とを併せ考慮すると、γ−ＧＴ
Ｐの有する破骨細胞分化促進活性が、この二次的骨減少
症の原因となっていることが考えられる。従って、γ−
ＧＴＰに対する阻害剤は、この二次的骨減少症の有効な
治療薬になると考えられる。このような本発明の破骨細
胞分化促進活性阻害剤の患者への投与方法としては、前
記破骨細胞分化促進剤と同様の投与法が考えられる。ま
た投与量は、一日量0.0001 〜100mg 程度を症状が改善
されるまで投与することが可能である。

【００２２】本発明において「γ−ＧＴＰのペプチド断
片、または破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘
導体のペプチド断片」とは、具体的には、γ−ＧＴＰま
たは活性を有する誘導体の、十数〜数十のアミノ酸配列
からなるペプチドを指し、好ましくは10〜20個程度のア
ミノ酸配列からなるペプチドを、さらに好ましくはγ−
ＧＴＰのエピトープ領域を形成する10〜20個程度のアミ
ノ酸配列からなるペプチドを指す。該エピトープ領域の
アミノ酸配列は、特開平3-4782等に記載の方法により推
定することが可能である。該ペプチドは、10〜20個程度
の短いものであればペプチド合成装置により合成するこ
とができるし、長いものであれば通常の遺伝子工学的手
法により（たとえば制限酵素処理等により）調製された
ＤＮＡを、上述の動物細胞等により発現させることによ
り、得ることができる。これら作製されたペプチド断片
を、上記破骨細胞の分化促進活性阻害剤のスクリーニン
グに供することにより、該阻害活性を有するペプチド断
片を、容易に選び出すことができる。

【００２３】本発明において「γ−ＧＴＰに対する抗
体、または破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘
導体に対する抗体」は、例えば新細胞工学実験プロトコ
ールp210秀潤社(1993)に記載された方法を用いてウサギ
等を免疫することにより、容易に作製することができ
る。また、例えば分子生物学研究のためのタンパク実験
法第4章羊土社（1994）に述べられている手法を用い
ることにより、容易にモノクローナル抗体を作製するこ
ともできる。上述のように、該γ−ＧＴＰの抗体は、コ
ラーゲン関節炎マウスの炎症関節より分離した細胞から
破骨細胞への分化を抑制することが明らかとなった。従
って、このようなγ−ＧＴＰの抗体は、破骨細胞分化促
進活性の有効な阻害剤となるものである。また、γ−Ｇ
ＴＰの種々の抗体のうち、いかなる抗体が破骨細胞分化
促進活性阻害効果を有するかについては、上記破骨細胞
分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法にこれら抗体
を供することにより、容易に見出すことができる。

【００２４】

【実施例】以下、本発明の一例として実施例により本発
明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例
によりなんら限定されるものではない。

【００２５】実施例１マウスｃＤＮＡライブラリーの構築１．１マウスＢＷ５１４７細胞からのｍＲＮＡの単離１．１．１全ＲＮＡの単離マウスＢＷ５１４７細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８
８）１×１０⁸個をＡＧＰＣ法（acid guanidium thio
cyanate-phenol-chloroform method；実験医学 9, 15,
p99 (1991)）に従い全ＲＮＡを分離した。即ち、ま
ず、細胞のペレットに４Ｍのグアニジンイソチオシアネ
ート１０ｍｌを加え、直ちに激しく振とうし、その溶液
を１８Ｇニードルにより５往復通過させることでＤＮＡ
を部分剪断した。この溶液に２Ｍ酢酸ナトリウム１ｍ
ｌ、水飽和フェノール１０ｍｌ及びクロロホルム−イソ
アミルアルコール（４９：１）２ｍｌを順次加え、添加
ごとに混和した。その後激しく振とうし、１５分間氷冷
した後、４℃で１０，０００ｇ、２０分間遠心した。そ
の水層を分取し、等量のイソプロパノールを加えて良く
混和した。これを−２０℃に１時間置いた後、４℃で１
０，０００ｇ、１０分間遠心した。遠心後、ＲＮＡの沈
殿に４Ｍグアニジンチオシアネート３ｍｌを加えて完全
に溶解させ、等量のイソプロパノールを加え、−２０℃
で１時間放置した。その後、４℃で１０，０００ｇ、１
５分間遠心した後、上清を捨て、ＲＮＡの沈殿を７５％
エタノールで洗浄することにより全ＲＮＡを得た。

【００２６】１．１．２ｍＲＮＡの単離上記の方法を数回繰り返すことで全ＲＮＡを１５ｍｇ集
め、容離緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳ）５ｍｌに溶
解し、６５℃で２分間加熱し、直ちに室温まで急冷し
た。５ＭＮａＣｌを０．５５ｍｌ添加後、その溶液を洗
浄緩衝液（０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳ）
で平衡化したオリゴｄＴセルロース（タイプ７、ファル
マシアバイオテク）０．５ｇのカラムに添加し、通過液
をさらに２回、カラムに添加することによりｍＲＮＡを
カラムに結合させた。カラムを洗浄緩衝液１５ｍｌで洗
浄した後、結合したＲＮＡを容離緩衝液４ｍｌで溶出し
た。溶出液を６５℃で２分間加熱し、その後冷却し、
０．５ＭＮａＣｌに調節し、再平衡カラムに再度添加し
て、同様に溶出操作を行った。その溶出液からエタノー
ル沈殿によりｍＲＮＡを回収し、７５％エタノールで洗
浄した。

【００２７】１．１．３ショ糖密度勾配遠心によるｍ
ＲＮＡの分画ジエチルピロカーボネイトで処理した密度勾配フラクシ
ョネータ（日立；ＤＧＦ−Ｕ）と遠心チューブ、２種類
の濃度のＲＮａｓｅフリーのショ糖溶液（５％と２０％
（ｗ／ｖ）ショ糖）、０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％
ＳＤＳを用意し、ＢｅｃｋｍａｎＳＷ４１Ｔｉ用チュ
ーブに密度勾配フラクショネータでショ糖勾配を作り、
２時間以上室温に放置して、勾配の不連続性をなくし
た。次に、ｍＲＮＡを２００μｌのＴＥ溶液（９９％ジ
メチルスルホキサイド、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）に溶解
し、３７℃で５分間処理し、４００μｌの５ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％Ｓ
ＤＳを加えて６５℃で１０分間熱処理をすることによ
り、その非特異的な会合を解離させた。その後急冷し、
ショ糖密度勾配にのせ、ＢｅｃｋｍａｎＳＷ４１Ｔｉ
ローターで２５℃、２０，０００ｒｐｍ、１４時間遠心
を行った。遠心後、チューブより０．５ｍｌずつ密度勾
配フラクショネータで分画し、エタノール沈殿した。ｍ
ＲＮＡの沈殿は最低３回、７５％エタノールで洗浄し
た。

【００２８】１．１．４ｍＲＮＡの同定５０画分に分画したｍＲＮＡは、その一部を後述の２．
１．３の方法に従いアフリカツメガエルの卵母細胞に注
入し、タンパク質に翻訳させた。この翻訳産物を含む培
養上清を、後述の２．２．２の方法によりアッセイ用の
マウス骨髄細胞に添加して培養した後、２．３．１のＴ
ＲＡＰ染色法により、破骨細胞が分化形成されたか否か
（すなわち、どのｍＲＮＡ画分中に破骨細胞分化促進活
性を有する因子が含まれているか）を同定した。その結
果、活性のピークは、２７番目の分画と３２番目の画分
に存在していた。

【００２９】１．２ｃＤＮＡライブラリーの作製活性のピーク画分の２７番目から３３番目を活性画分と
して集め、この画分に対するｃＤＮＡライブラリーを、
Ｇｕｂｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ法（Gene, 25,p263 (198
3）) の変法にて調製した。即ち、この活性画分のｍＲ
ＮＡ２μｇをもとに、ＸｈｏＩサイトを持つオリゴｄＴ
プライマーを用いて、Ｍ−ＭｕＬＶの逆転写酵素により
ファーストストランドを合成した。続いて DNA Polymer
ase I によりセカンドストランドを合成し、ＥｃｏＲＩ
アダプターとのライゲーションおよびＸｈｏＩ消化を行
った。その後、アダプターとプライマーをゲル濾過（Se
phacryl Spin Column；ファルマシア社）により除い
た。以上のｃＤＮＡ合成ステップはStratagene社のＺＡ
ＰｃＤＮＡ合成キットを用い、逆転写酵素はＢＲＬ社の
スーパースクリプトＩＩを用いて行った。次に、Ｅｃｏ
ＲＩ、ＸｈｏＩ切断済みＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓ^TMベク
ターを先に作製したｃＤＮＡとライゲーションした後、
Gigapack II Gold packing extract（ｍｃｒＡ^-、ｍｃ
ｒＢ^-、ｍｍｒ^-；Stratagene社）を用いてパッケージ
ングを行い、大腸菌ＰＬＫ−Ｆ^'株に感染させた。その
結果、平均長２．２６ｋｂ、インディペンデントクロー
ン数６．３×１０⁵個のｃＤＮＡライブラリーが得られ
た。

【００３０】実施例２発現クローニング概要１．２で作製したｃＤＮＡライブラリーを、１０，００
０個／プールとして計６３プールに分け、後述の２．
１．２〜２．１．３の方法にて各プールのｃＲＮＡをア
フリカツメガエルの卵母細胞に注入し、タンパク質に翻
訳させた。この翻訳産物を含む培養上清を、後述の２．
２．２の方法によりアッセイ用のマウス骨髄細胞に添加
して後述の各アッセイ法に供し、陽性と判断されたプー
ルを選別した。更に、その陽性プールを１０のサブプー
ルに分け、同様にしてｃＲＮＡを調製し、卵母細胞中で
発現させ、その活性を測定して陽性プールを選別するこ
とを繰り返し、最終的に単一クローンを得た。すなわち
具体的アッセイとしては、１次スクリーニングは後述の
２．３．１のＴＲＡＰ染色法にて破骨細胞分化促進活性
を判定し、６３プールから陽性プールを３プール選別し
た。２次スクリーニング以降は、後述の２．３．１のＴ
ＲＡＰ染色法、２．３．２の象牙を用いたｐｉｔ形成
法、２．３．３のカルシトニン受容体の検出の、３種類
の破骨細胞分化促進活性測定法の全てに陽性反応を示す
プールを選別することにし、まず、上述の３プールをそ
れぞれ１０のサブプール（１０００クローン／プール）
に分けて各アッセイを行った。その結果、陽性反応の強
さの順に上位３プールを選び、更にこの３プールをそれ
ぞれ１０のサブプール（２００クローン／プール）に分
けて３次スクリーニングを行った。その結果、陽性反応
の強さの順に３つの陽性プールを選択し、これを各々１
０のサブプール（２４クローン／プール）に分けて、さ
らに４次スクリーニングを行った。その結果、ＴＲＡＰ
染色及びｐｉｔ形成活性の強い順に上位２プール選択
し、更にこの２プールを全３６個の個々のクローンに分
けて５次スクリーニングを行った。５次スクリーニング
の結果、ＴＲＡＰ染色及びｐｉｔ形成活性の強い順に上
位３クローンを選別した。この３つのクローンのうちの
一つをＯＰＦａ１２と命名した。なおＯＰＦａ１２の各
アッセイ結果は、後述の（結果）の項に記した。

【００３１】２．１アッセイ用サンプルの調製２．１．１ＤＮＡの調製大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに各プールのラムダファージ１
×１０⁴pfuを感染させ、１５ｃｍシャーレにまき、プ
ラークを形成させた。このプレートに１３ｍｌのＳＭ緩
衝液を加え、プレートライセートを調製した。このファ
ージライセートにＤＥ５２（ＤＥＡＥセルロース；ワッ
トマン社）を加えてファージＤＮＡ以外を吸着させ、遠
心後の上清に再度ＤＥ５２を加え、その上清中のファー
ジＤＮＡを回収した。このＤＮＡをフェノールとフェノ
ール─クロロホルム（１：１）で１回ずつ抽出し、エタ
ノール沈殿にて回収し、ファージＤＮＡとした。調製し
たＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、１／５０量を１
％アガロース電気泳動にて定量した。

【００３２】２．１．２ｃＲＮＡの合成２．１．１で調製した各プールのファージＤＮＡの少な
くとも１μｇをプロテイナーゼＫ（Stratagene社）で３
７℃１時間処理し、フェノール−クロロホルム処理後、
エタノール沈殿により回収することによりテンプレート
ＤＮＡを調製した。このＤＮＡを用いて、ｍＲＮＡcapp
ingキット（Stratagene社）に従いｃＲＮＡを合成し
た。これをフェノール−クロロホルム処理、エタノール
沈殿に供することによりｃＲＮＡを回収し、１／１０量
を１％アガロースゲル電気泳動により定量した。その
後、１μｇ／μｌの濃度に調製してマイクロインジェク
ション用ｃＲＮＡとした。

【００３３】２．１．３アフリカツメガエル卵母細胞
による発現体長１０ｃｍ程度のメスのアフリカツメガエルから卵母
細胞の卵塊を取り出し、ＭＢＳ（＋Ｃａ²⁺；８８．０ｍ
ＭＮａＣｌ、１．０ｍＭＫＣｌ、２．４ｍＭＮａ
ＳＯ₃、０．３ｍＭＣａ（ＮＯ₃）₂４Ｈ₂Ｏ、０．
４１ｍＭＣａＣｌ₂４Ｈ₂０、０. ８２ｍＭＭｇＳ
Ｏ₄７Ｈ₂０、１０μｇ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／
ｍｌストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌニスタチン、
１５ｍＭトリス─ＨＣｌ（ｐＨ７．６））を入れたシ
ャーレに移し、実体顕微鏡下精密用鋏とピンセットで卵
母細胞を一つずつ切り放し、ステージＶかＶＩの傷のな
い生きている細胞を選別した。これらの卵母細胞に１０
μｌデジタルマイクロディスペンサー（Drummond社）を
用いて、キャピラリーより、卵母細胞１個当たり５０ｎ
ｌのｃＲＮＡを注入した。その後、死んだり傷ついた細
胞を除き、２％ＦＣＳを含むＭＢＳにて３日間、２０℃
で培養した。その培養上清を遠心し、更に０．２２μｍ
のフィルターを通し、残査を除くと同時に除菌した。そ
の上清をアッセイ用サンプルとした。

【００３４】２．２アッセイ２．２．１マウス骨髄細胞の調製６〜１２週令のマウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ；日本クレア）
の大腿骨及び脛骨を無菌的に取り出し、その骨端を切り
落とし、両端から１回づつ２６Ｇの針を付けたシリンジ
で１ｍｌのα−ＭＥＭ培地（１０％牛胎児血清、１００
単位/ｍｌペニシリンＧ、１００μｇ/ｍｌストレプトマ
イシンを含む）で骨髄細胞を押し出し、良くピペッティ
ングした後骨残査が沈殿するまで待ち、その上清を回収
した。それを更に新鮮な培地で１〜２回洗い、アッセイ
用の骨髄細胞を調製した。

【００３５】２．２．２破骨細胞分化形成法上記の骨髄細胞を１０^-8Ｍの活性型ビタミンＤ〔１、２
５（ＯＨ）₂Ｄ₃〕を含むα−ＭＥＭ培地中にけん濁さ
せ、２×１０⁶個細胞／ｍｌの濃度に調製し、９６穴プ
レートに１８０μｌと２．１．３で調製したアッセイ用
サンプルを２０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ₂下、１ま
たは２週間培養した。その間、３−４日間隔で培地の３
／４を新しい培地と交換し、新たにアッセイ用サンプル
を同量添加した。

【００３６】２．３破骨細胞の同定法２．３．１ＴＲＡＰ染色法破骨細胞のマーカー酵素であるＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性
酸性フォスファターゼ）を基質で染色した。即ち２．
２．２の培養骨髄細胞をアセトン─クエン酸緩衝液で固
定した後、酒石酸存在下で基質（Naphthol AS ─MXphos
phate）と色素（Fastredviolet LB salt）を３７℃で１
時間反応させることにより、染色した（Endocrinolog
y，122，p1373,(1988)）。（結果）ＯＰＦａ１２は、既知の破骨細胞分化形成因子
であるＩＬ─１β（５０ｎｇ／ｍｌ）やＬＩＦ（２５Ｕ
／ｍｌ）で骨髄細胞を処理し、破骨細胞を分化形成させ
たポジティブコントロールのＴＲＡＰ染色性と比較し
て、陽性と判断した。

【００３７】２．３．２象牙を用いたｐｉｔ形成法象牙より直径６ｍｍ、１ｍｍ厚の象牙質スライスを作製
し、それを８０％アルコール中で超音波処理することに
より滅菌した。α−ＭＥＭ培地で洗浄した後、各スライ
スを９６ウエルプレートのウエル底に移し、その上で
２．２．２の方法に従って骨髄細胞から破骨細胞を分化
誘導した。１または２週間後、象牙質スライス上の破骨
細胞を２．３．１のＴＲＡＰ染色法にて染色し、０．２
５％トリプシン─０．０２％ＥＤＴＡで一晩処理し、ス
ライス上の細胞をシリコンスクレイパーで削り取った。
象牙質スライス上のｐｉｔ（吸収窩）を顕微鏡下で観察
し、その数またはｐｉｔあたりのメッシュ数を測定する
ことにより骨髄細胞より分化誘導された細胞の骨吸収活
性（骨分解活性）を調べた。（結果）ＯＰＦａ１２により分化形成された細胞の象牙
質スライス上のｐｉｔ形成数は１００個であり、ポジテ
ィブコントロールであるＬＩＦ（２５Ｕ／ｍｌ）の３９
個に比較して、活性は同等がそれ以上であることが判明
した。

【００３８】２．３．３カルシトニン受容体の検出ＬＡＢ−ＴＥＣチェンバースライドを用いて２．２．２
の方法により、骨髄細胞から破骨細胞を分化誘導させた
後、細胞に０．２μＣｉ／ｍｌの［¹²⁵Ｉ］サケ・カル
シトニン（アマシャム）２００μｌを加え、３７℃で１
時間反応させ、チャンバーから反応液を除き、ＰＢＳで
３回洗浄して反応を停止した。その後、２．５％グルタ
ールアルデヒドで固定し、２．３．１の方法に従ってＴ
ＲＡＰ染色した。スライドグラスからチャンバーを外
し、十分に風乾させた後、暗室でエマルジョン（Kodak
ＮＴＢ−２）にさっと浸し、余分のエマルジョンを除
き、暗箱に入れて４℃で２−７日保存した。その後、定
法に従い現像し、スライドを風乾させ顕微鏡下で観察し
た。（結果）ＯＰＦａ１２により形成された細胞のオートラ
ジオグラフィーでは、ＴＲＡＰ陽性の赤褐色に染色され
た細胞にカルシトニン受容体の存在を示す黒化粒子が重
なって観察された。

【００３９】（結論）以上３通りの同定法において全て
に陽性を示したことから、ＯＰＦａ１２により骨髄細胞
から分化誘導された細胞は破骨細胞であり、ＯＰＦａ１
２は破骨細胞分化促進活性を有している因子であると、
判断した。

【００４０】実施例３組換えファージＤＮＡのファージミドＤＮＡへの変換ＺＡＰ ExpressベクターはインサートＤＮＡをｐＢＫ
−ＣＭＶへin vivoexcisionすることでサブクローニン
グすることができる。ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’大腸菌
にＺＡＰ ExpressファージとExAssistヘルパーファー
ジを感染させることで、ｐＢＫ−ＣＭＶファージミドを
産生させ、元の大腸菌を熱処理することで死滅させ、新
たにＸＬＯＬＲ大腸菌に感染させた。これに培地を加
え、４５分間培養後、ＬＢプレートにプレーティング
し、培養した。

【００４１】実施例４プラスミドＤＮＡの調製陽性コロニーを爪楊枝で拾い２ｍｌのＬＢ（アンピシリ
ン１００μｇ／ｍｌ）で一晩培養後、アルカリ−ＳＤＳ
法によりプラスミドを調製した。このプラスミドＤＮＡ
を適当な制限酵素で切断し、１％アガロースゲル中で電
気泳動し、ＯＰＦａ１２ｃＤＮＡのベクターへの挿入を
確認した。

【００４２】実施例５ＯＰＦａ１２ｃＤＮＡの塩基配列決定実施例５で得られたＯＰＦａ１２ｃＤＮＡの塩基配列の
決定は、Ｓａｎｇｅｒらによって開発されたダイデオキ
シ法によって行った（AutoRead Sequencing kit, Pharm
acia Biotech社製) 。その結果、配列表の配列番号：１
に記載の２１０４ｂｐからなるｃＤＮＡが得られ、また
５６８アミノ酸からなる配列番号：２のアミノ酸配列が
決定された。

【００４３】塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、
ＤＤＢＪの９６年１月現在の各データベースを用いて、
ＯＰＦａ１２の全塩基配列と既知の塩基配列とのホモロ
ジー検索を、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法により行
った。その結果、ラットγ−ＧＴＰと９０．１％、ヒト
γ−ＧＴＰと７９．８％一致していた。更にアミノ酸配
列は、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴとＰＩＲの９６年１月現在の
データベースを用いて、ＯＰＦａ１２のアミノ酸配列と
既知のアミノ酸配列とのホモロジー検索を、Ｓｍｉｔｈ
−Ｗａｔｅｒｍａｎ法により行った。その結果、ラット
γ−ＧＴＰと９６％、ヒトγ−ＧＴＰと８６．７％一致
していた。これらの結果及び、Gene,167,p233 (1995)に
記載の配列との比較より、ＯＰＦａ１２はマウス型γ−
ＧＴＰであることが判明した。以下、本発明においてク
ローニングされたＯＰＦａ１２を、γ−ＧＴＰと称する
こととする。

【００４４】実施例６γ−ＧＴＰの臓器特異的遺伝子発現のノーザンブロット
解析種々の組織由来のｍＲＮＡ、マウス胚の種々の発生段階
のｍＲＮＡ、及び種々のヒト癌細胞株由来のｍＲＮＡ
が、既にブロティングされたＭＴＮブロットメンブレン
（クローンテック社）を用いて、またプローブとして先
にクローニングされたγ−ＧＴＰｃＤＮＡ全長（約２．
１ｋｂｐ）を³²Ｐでランダムプライム法にて標識したも
のを用いて、以下のノーザンブロット解析を行った。す
なわち、上記プローブを５０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデ
ヒド／５×ＳＳＣ／５×デンハルト／１％（ｗ／ｖ）Ｓ
ＤＳ／０．０１％（ｗ／ｖ）変性サケ精子ＤＮＡ中でフ
ィルターに固定したＲＮＡに４２℃でハイブリダイズさ
せ、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃中で、次に
０．１％ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃中で洗浄し
た。水気を除いた後、−８０℃で１−３日間オートラジ
オグラフィーを行った。使用したＸ線フィルムはコダッ
クＳＢ５またはフジＡＩＦＲＸを増感スクリーンの存在
下で用いた。

【００４５】（結果）図１には、マウスの各組織（２μ
ｇｍＲＮＡ）のノーザンブロットの結果を示す。γ−Ｇ
ＴＰのバンドは腎臓にのみ特異的に発現し、その他の組
織では全く検出されなかった。この結果は公知のヒト型
γ−ＧＴＰの組織分布と一致していた。図２には、ヒト
胎児の各組織（２μｇｍＲＮＡ）のノーザンブロットの
結果を示す。その結果、腎臓の他に、肝臓でより強く発
現していた。「従来の技術」の項にも記述したように、
肝−胆道系疾患やアルコール摂取に際し、肝臓でγ−Ｇ
ＴＰが発現誘導されることが知られている。しかし、胎
児の肝臓での発現は未だ報告されておらず、本実施例に
てはじめて明らかになったことである。

【００４６】図３には、マウス７日胚から１７日胚まで
（２μｇｍＲＮＡ）のノーザンブロトの結果を示す。そ
の結果、７日胚で最大の発現を示し、１１日胚で最小と
なった後、徐々に発現量が増大していた。図４には、ヒ
トの種々の癌細胞株（２μｇｍＲＮＡ）のノーザンブロ
ットの結果を示す。その結果、骨転移し易くまた高カル
シウム血症の合併頻度の高い癌細胞として知られている
前骨髄性白血病細胞（HL-60）、Burkittsリンパ腫細胞
（Raji）、及び肺癌細胞（A549）において発現してい
た。以上の結果から、γ−ＧＴＰは発生期の初期から発
現し、胎生期では肝臓と腎臓で、また生体では腎臓で特
異的に発現していることが分かった。さらに、骨転移し
易くまた高カルシウム血症合併頻度が高いと言われてい
る癌細胞においても発現していることが分かった。

【００４７】実施例７γ−ＧＴＰの臓器特異的遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ解析１．１．１に従い種々の細胞や組織から調製した全ＲＮ
Ａ（１μｇ）より、ＲＴ−ＰＣＲキット（PERKIN ELMER
社製）に従い、まず２本鎖ＤＮＡを合成し、それをテン
プレートにしてＰＣＲ反応を行った。本遺伝子増幅のた
めのプライマー配列として、５’プライマー（５’−Ａ
ＴＣＡＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧ−３’）およ
び３’プライマー（５’−ＧＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴＧ
ＧＴＧＡＡＧＡ−３’）を合成した。これらのプライマ
ーの組み合わせで増幅されるＤＮＡサイズは２２８塩基
対である。また、コントロールとしてＧ３ＰＤＨ（glyc
eraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）プライマー
（５’プライマーが（５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧ
ＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣ−３’）、３’プライマ
ーが（５^'−ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣ
ＡＣＣＡＣ−３’）、増幅されるＤＮＡサイズが９８３
塩基対）を用いた。反応組成等は標準的手法に従いＤＮ
Ａサーマルサイクラーを用いて、熱変性９４℃で１分
間、アニーリング６０℃で１分間、鎖伸張反応７２℃で
２分間の条件で３０−４０サイクルで反応を行った。反
応混合物の１／１０量を１％アガロースゲルで電気泳動
し、バンドを確認した。

【００４８】（結果）図５に、各組織の全ＲＮＡ１μｇ
をテンプレートにして行った結果を示す。その結果、γ
−ＧＴＰのクローニング源であるＢＷ５１４７細胞（レ
ーン１）、コラーゲン関節炎モデルの炎症関節・骨部位
の細胞（レーン４）、そして腎臓（レーン９）で発現し
ていた。これらの結果は、図１のノーザンブロットの結
果と矛盾するものではなかった。なお、同一のＲＮＡを
用いてコントロールのＧ３ＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲも行
い、これを、各ＲＮＡの分解度の指標とした。

【００４９】実施例８γ−ＧＴＰｃＤＮＡの哺乳動物培養細胞による発現ｐＢＫ−ＣＭＶベクターに実施例２で得られたγ−ＧＴ
ＰｃＤＮＡをサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９株
に形質転換させた。アルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを
調製し、２回の超遠心分離法により精製した。この精製
ＤＮＡをＣＯＳ−７細胞にLIPOFECTAMINE（GIBCO ＢＲ
Ｌ）を用いてトランスフェクトした。その後、細胞を
無血清培地で５日間培養し、培養上清を回収してγ−Ｇ
ＴＰ培養上清標品とした。上記培養上清標品の活性は、
２．３．１のＴＲＡＰ染色性、２．３．２の象牙質スラ
イスを用いたｐｉｔ形成活性、及び２．３．３のカルシ
トニン受容体の検出の３種類の同定法で行った。その結
果、前記培養上清標品存在下、象牙質スライス上で培養
した骨髄細胞は、赤褐色に染色され、ＴＲＡＰ陽性を示
した。次に、象牙スライス上のＴＲＡＰ陽性細胞を物理
的に削り取った結果、図６（上）に示すようにＴＲＡＰ
陽性細胞残渣が残っているものの、ｐｉｔが形成されて
いた。一方、図６（下）に示すように、ベクターのみを
導入した細胞の培養上清を用いて同様の実験を行った場
合は、ＴＲＡＰ陽性細胞、ｐｉｔ共に形成されなかっ
た。

【００５０】図７（上）には、ＯＰＦａ１２ＤＮＡ導入
細胞の培養上清存在下で培養した骨髄細胞をＴＲＡＰ染
色し、¹²⁵Ｉ−サーモン・カルシトニン（ホット）を反
応させた結果を示す。その結果、カルシトニン受容体の
存在を示す黒化粒子が検出された。また、コールドのサ
ーモン・カルシトニンをホットの１０００倍添加した場
合、図７（左下）に示すように大量のコールドで希釈さ
れ、黒化粒子が消えたことから、カルシトニンとその受
容体の結合は特異的であることが確認された。一方、図
７（右下）には、ベクターのみを導入した細胞の培養上
清を用いて同様の実験を行った結果を示すが、ＴＲＡＰ
陰性であり、また黒化粒子も検出されなかった。以上の
結果より、γ−ＧＴＰｃＤＮＡを哺乳動物培養細胞に導
入し得られた培養上清は、破骨細胞分化促進活性を有す
ることが明らかとなった。

【００５１】実施例９γ―グルタミル基転移触媒活性の測定 γ−ＧＴＰの従来より知られている酵素活性である、γ
−グルタミル基の転移触媒活性は、γ−ＧＴ４１９「ア
スカ・シグマ」キット（SIGMA DIAGNOSTICS)を用いて測
定した。即ち、先に調製したγ−ＧＴＰｃＤＮＡ導入細
胞の培養上清をＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−
４−ニトロアニリドとグリシルグリシンを基質として３
０℃で反応させ、生じたＬ−γ−グルタミルグリシルグ
リシンと５−アミノ−２−ニトロ−安息香酸のうち、後
者の黄色を４０５ｎｍの吸光度で測定した。反応時間に
対する吸光度の増加はγ−ＧＴＰ活性に比例することか
ら、活性を算出した。その結果、ベクターのみを導入し
た細胞の培養上清の活性は検出限界以下であったのに対
しγ−ＧＴＰＤＮＡ導入細胞の培養上清は、１３Ｕ／Ｌ
を示した。この結果より、クローニングしたγ−ＧＴＰ
には、破骨細胞分化促進活性と、従来より知られていた
γ−グルタミル基転移触媒活性の両方を有することが確
認された。

【００５２】実施例１０ラット腎臓由来精製γ−ＧＴＰによる破骨細胞分化促進
活性の測定ラット腎臓由来の精製したγ−ＧＴＰ（Taniguchi N.
ら、Biochem.Biophys. Acta, 391, p261 (1995)）を、
２．２．１〜２．２．２の破骨細胞分化形成法（以下、
骨髄細胞培養系による破骨細胞分化形成法と称す）及
び、以下に示す骨髄細胞と骨芽細胞様細胞株との共存培
養系による破骨細胞分化形成法の、２種類のアッセイに
供した。すなわち、骨髄細胞と骨芽細胞様細胞株との共
存培養系による破骨細胞分化形成法は、以下のようにし
て行った。まず、２．２．１で調製した骨髄細胞を５×
１０^-7Ｍの活性型ビタミンＤ｛１，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃｝
および１．２５×１０^-8Ｍデキサメサゾンを含むα−Ｍ
ＥＭ培地中にけん濁させ、２×１０⁶個細胞／ｍｌの濃
度に調製し、９６穴プレートに６０μｌ加えた。一方、
骨芽細胞様細胞株であるＳＴ２細胞を骨髄細胞と同じ培
地にけん濁させ、４×１０⁴個細胞／ｍｌの濃度に調製
した後、先の骨髄細胞の入った９６穴プレートに１２０
μｌ加えた。更に、種々の濃度の精製γ−ＧＴＰを２０
μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ₂下、１週間培養した。そ
の間、３日目に培地の３／４を新しい培地と交換し、新
たにアッセイ用サンプルを同量添加した。これら2種類
の破骨細胞分化形成法を施した後、２．３．１のＴＲＡ
Ｐ染色法により、ＴＲＡＰ陽性細胞（破骨細胞）数を測
定した。

【００５３】結果を図８に示す。骨髄細胞培養系では、
γ−ＧＴＰは酵素活性として９．３Ｕ／ｍｌから９３０
Ｕ／ｍｌまでは用量依存的にＴＲＡＰ陽性細胞（破骨細
胞）数を増加させた。しかし、９３００Ｕ／ｍｌでは逆
に減少したことから、破骨細胞の分化促進活性には至適
濃度が存在することが考えられた。ＴＲＡＰ陽性細胞の
うち、３核以上の多核巨細胞（多核細胞）数も、９３０
Ｕ／ｍｌで最大値を示した。また、骨髄細胞と骨芽細胞
様細胞株との共存培養系（共存培養系）では、γ−ＧＴ
Ｐは酵素活性として９３００Ｕ／ｍｌまで用量依存的に
ＴＲＡＰ陽性細胞数もＴＲＡＰ陽性多核細胞数も増加さ
せた。以上より、γ−ＧＴＰに破骨細胞分化促進活性の
存在することが確認された。

【００５４】実施例１１抗ラットγ−ＧＴＰ抗体による、ＣＩＡマウスの炎症関
節より分離した細胞から破骨細胞への分化の抑制１１．１ＣＩＡマウスの作製Ｅ．Ｄ．Ｔｒｅｎｔｈａｍらの方法（J.Exp., 146, p85
7 (1977)）に準じた。即ち、酢酸溶液に溶解したウシＩ
Ｉ型コラーゲン（コラーゲン研修会）をフロイントの完
全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混和し、ＤＢＡ／１Ｊ
マウス（日本チャールスリバー）の尾根部に皮内注射し
た。３週間後に追加免疫のためフロイントの不完全アジ
ュバント（ＤＩＦＣＯ）に混和したウシＩＩ型コラーゲ
ンを、背部皮下に注射した。

【００５５】１１．２炎症関節部位からの細胞の調製日本骨代謝学会誌、第12巻、188頁（1994）、Arthritis
and Rheumatism, 39,S285 (1996)、および平成６年度
厚生省リウマチ調査研究事業研究報告書、130頁に記載
の方法に準じた。即ち、コラーゲン関節炎を発症した部
位の組織をディスパーゼ（合同酒精）で処理し、浮遊細
胞を得た。この細胞を５％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥ
Ｍ培地で３×１０⁵個細胞／ｍｌの濃度に調製した。１１．３破骨細胞分化形成阻害法上記で調製した細胞を、ヒドロキシアパタイトでコーテ
ィングしたプレート（商品名：Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｃ
Ｍｕｌｔｉ−Ｔｅｓｔ：ＭｉｌｌｅｎｉｕｍＢｉｏｌｏ
ｇｉｘＩｎｃ．）に１８０μｌ加え、更に、先の精製
抗ラットγ-ＧＴＰ抗体を終濃度０〜２００μｇ／ｍｌ
になるように２０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ₂下で５
日間培養後、形成されたｐｉｔ数を計測した。その際、
ＢＳＡ添加時のｐｉｔ数を１００％として抗体添加時の
ピット数を相対活性として表した。

【００５６】１１．４結果結果を図９に示す。非特異的イムノグロブリン（２２０
μｇ／ｍｌ）で３０％程度活性が阻害されたが、抗ラッ
トγ−ＧＴＰ抗体は用量依存的にｐｉｔ形成活性を阻害
度し、２００μｇ／ｍｌで８６％の活性を阻害した。以
上より、抗ラットγ−ＧＴＰ抗体は、破骨細胞への分化
を抑制することが明らかとなった。

【００５７】

【発明の効果】本発明により、γ−ＧＴＰまたはその活
性を保持する誘導体を有効成分として含有する破骨細胞
分化促進剤、あるいは該γ−ＧＴＰ等を用いる破骨細胞
分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法、さらには該
スクリーニングにより見出される破骨細胞分化促進活性
阻害剤、が提供される。

【００５８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２１０４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴特徴を決定した方法：Ｅ配列 CGACACTAGT GGATCCAAAG AATTCGGCAC GAGAACGCAG CAGCACGTGT CTGGCTGTGC 60 CCAGCTGCTG AATGACACCA AAAGCCCTCC TCATCGTCTC TGAGCTGCTG GACATCGAGT 120 GCCAGGAGGT AGCCTGCTCT AGCAGTTCAG GGAAGATCGG TCTCTGCAGA GTGTGGAGAG 180 AGTTCCTGCC CATCCATACA GCTGTTTTTC AAAAGCCATG AAGAATCGGT TTCTGGTGCT 240 GGGCCTGGTG GCTGTGGTTC TGGTATTTGT CATCATCGGC CTCTGTATCT GGTTGCCCTA 300 CACCTCTGGG AAGCCCGACC ACGTGTACTC CAGGGCGGCG GTGGCCACCG ACGCCAAGCG 360 CTGCTCAGAG ATTGGACGGG ATATCCTACA GGAAGGTGGT TCCGTGGTGG ATGCAGCCAT 420 CGCAAGCCTG CTGTGTATGG GGCTCATGAA TGCCCACAGT ATGGGCATCG GGGGCGGCCT 480 GTTCTTCACC ATCTACAACA GCACCACAGG AAAAGTTGAG GTTATCAATG CCCGTGAGGT 540 AGCTCCCAGG TTGGCCAATA CCACCATGTT CAACAACTCC AAGGACTCTG AAGAAGGTGG 600 CCTTTCAGTG GCTGTCCCTG GTGAAATCCG TGGTTATGAG CTGGCACACC AACGACACGG 660 CCGGCTCCCC TGGGCTCGCC TCTTCCAACC CAGCATCCAG CTGGCTCGCC ACGGCTTCCC 720 TGTGGGCAAG GGTTTGGCAA TAGCCCTGGA CAAAAAACGG GACGTCATTG AGAAGACCCC 780 TGCCTTGTGC GAGGTGTTCT GCCGCCAAGG GAAGGTGCTT CAAGAAGGAG AGACGGTGAC 840 TATGCCGAAG CTGGCTGACA CATTGCAGAT ACTGGCCCAG GAGGGCGCCA AGGCCTTCTA 900 CAATGGGAGC CTCACAGCCC AGATTGTGAA AGACATCCAG GAGGCTGGTG GCATTATGAC 960 GGTTGAGGAC CTCAACAACT ACCGTGCTGA GCTGATTGAG CATCCGATGA GCATCGGCCT 1020 CGGTGATGCG ACCCTGTACG TGCCCAGTGC CCCACTCAGC GGGCCCGTGC TGATTCTCAT 1080 CTTGAACATC CTCAAAGGAT ACAACTTCTC TCCGAAGAGC GTAGCGACCC CTGAACAGAA 1140 GGCACTGACG TATCACCGTA TCGTGGAGGC CTTTCGGTTT GCCTATGCCA AGAGGACCAT 1200 GCTCGGTGAC CCAAAGTTTG TCGATGTGTC TCAGGTGATC CGCAACATGA GCTCTGAGTT 1260 CTACGCCACC CAGCTCCGAG CCCGCATCAC TGATGAAACC ACCCACCCAG CCGCCTACTA 1320 TGAGCCTGAA TTCTACCTTC AGGATGATGG AGGCACCGCT CACCTGTCTG CGGTTTCAGA 1380 GGATGGCAGT GCTGTGGCTG CCACTAGTAC CATCAACCTC TACTTTGGCT CCAAGGTCCT 1440 GTCTCGGGTC AGTGGCATCC TGTTTAATGA TGAGATGGAT GACTTCAGCT CGCCCAACTT 1500 CATCAACCAG TTCAGGGTAG CCCCCTCACC AGCCAACTTC ATCAAGCCAG GTAAGCAGCC 1560 TCTTTCATCC ATGTGTCCCT CAATCATCCT GGATAAGGAC GGCCAGGTTC GCATGGTGGT 1620 CGGAGCCTCA GGGGGTACCC AGATCACCAC ATCTGTTGCA CTGGCCATCA TCAACAGCCT 1680 GTGGTTCGGA TACGATGTGA AGAGAGCTGT GGAGGAGCCC CGGCTGCACA ACCAGCTTTT 1740 ACCTAATACC ACAACGGTAG AGAAAGACAT TGATCAGGTG GTGACTGCAG GCCTGAAGAT 1800 TCGGCACCAC CATACAGAAG TCACGCCCAC CTTCATCGCT GTAGTTCAGG CTGTCGTTCG 1860 AGCATCAGGT GGTTGGGCAG CTGCCTCAGA CTCCAGAAAA GGCGGGGAAC CTGCTGGCTA 1920 CTGAGTGCCC GGAAGAGGAA GATTGACCCG CAGCCAAGGG ACGAGAATGG GAACAGGAGC 1980 AAGAGTGGGA CGTTGGAGAA CATGCCGCCT CTGGGTGGGA CAGAGGGAGC GCAATAAATG 2040 GAGGCCACCG CCAAGCTGCG GGAAGCCTTT GCGGGCTGAA CTTTCCAAAA AAAAAAAAAA 2100 AAAA 2104

【００５９】配列番号：２配列の長さ：５６８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Lys Asn Arg Phe Leu Val Leu Gly Leu Val Ala Val Val Leu Val 5 10 15 Phe Val Ile Ile Gly Leu Cys Ile Trp Leu Pro Tyr Thr Ser Gly Lys 20 25 30 Pro Asp His Val Tyr Ser Arg Ala Ala Val Ala Thr Asp Ala Lys Arg 35 40 45 Cys Ser Glu Ile Gly Arg Asp Ile Leu Gln Glu Gly Gly Ser Val Val 50 55 60 Asp Ala Ala Ile Ala Ser Leu Leu Cys Met Gly Leu Met Asn Ala His 65 70 75 80 Ser Met Gly Ile Gly Gly Gly Leu Phe Phe Thr Ile Tyr Asn Ser Thr 85 90 95 Thr Gly Lys Val Glu Val Ile Asn Ala Arg Glu Val Ala Pro Arg Leu 100 105 110 Ala Asn Thr Thr Met Phe Asn Asn Ser Lys Asp Ser Glu Glu Gly Gly 115 120 125 Leu Ser Val Ala Val Pro Gly Glu Ile Arg Gly Tyr Glu Leu Ala His 130 135 140 Gln Arg His Gly Arg Leu Pro Trp Ala Arg Leu Phe Gln Pro Ser Ile 145 150 155 160 Gln Leu Ala Arg His Gly Phe Pro Val Gly Lys Gly Leu Ala Ile Ala 165 170 175 Leu Asp Lys Lys Arg Asp Val Ile Glu Lys Thr Pro Ala Leu Cys Glu 180 185 190 Val Phe Cys Arg Gln Gly Lys Val Leu Gln Glu Gly Glu Thr Val Thr 195 200 205 Met Pro Lys Leu Ala Asp Thr Leu Gln Ile Leu Ala Gln Glu Gly Ala 210 215 220 Lys Ala Phe Tyr Asn Gly Ser Leu Thr Ala Gln Ile Val Lys Asp Ile 225 230 235 240 Gln Glu Ala Gly Gly Ile Met Thr Val Glu Asp Leu Asn Asn Tyr Arg 245 250 255 Ala Glu Leu Ile Glu His Pro Met Ser Ile Gly Leu Gly Asp Ala Thr 260 265 270 Leu Tyr Val Pro Ser Ala Pro Leu Ser Gly Pro Val Leu Ile Leu Ile 275 280 285 Leu Asn Ile Leu Lys Gly Tyr Asn Phe Ser Pro Lys Ser Val Ala Thr 290 295 300 Pro Glu Gln Lys Ala Leu Thr Tyr His Arg Ile Val Glu Ala Phe Arg 305 310 315 320 Phe Ala Tyr Ala Lys Arg Thr Met Leu Gly Asp Pro Lys Phe Val Asp 325 330 335 Val Ser Gln Val Ile Arg Asn Met Ser Ser Glu Phe Tyr Ala Thr Gln 340 345 350 Leu Arg Ala Arg Ile Thr Asp Glu Thr Thr His Pro Ala Ala Tyr Tyr 355 360 365 Glu Pro Glu Phe Tyr Leu Gln Asp Asp Gly Gly Thr Ala His Leu Ser 370 375 380 Ala Val Ser Glu Asp Gly Ser Ala Val Ala Ala Thr Ser Thr Ile Asn 385 390 395 400 Leu Tyr Phe Gly Ser Lys Val Leu Ser Arg Val Ser Gly Ile Leu Phe 405 410 415 Asn Asp Glu Met Asp Asp Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ile Asn Gln Phe 420 425 430 Arg Val Ala Pro Ser Pro Ala Asn Phe Ile Lys Pro Gly Lys Gln Pro 435 440 445 Leu Ser Ser Met Cys Pro Ser Ile Ile Leu Asp Lys Asp Gly Gln Val 450 455 460 Arg Met Val Val Gly Ala Ser Gly Gly Thr Gln Ile Thr Thr Ser Val 465 470 475 480 Ala Leu Ala Ile Ile Asn Ser Leu Trp Phe Gly Tyr Asp Val Lys Arg 485 490 495 Ala Val Glu Glu Pro Arg Leu His Asn Gln Leu Leu Pro Asn Thr Thr 500 505 510 Thr Val Glu Lys Asp Ile Asp Gln Val Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile 515 520 525 Arg His His His Thr Glu Val Thr Pro Thr Phe Ile Ala Val Val Gln 530 535 540 Ala Val Val Arg Ala Ser Gly Gly Trp Ala Ala Ala Ser Asp Ser Arg 545 550 555 560 Lys Gly Gly Glu Pro Ala Gly Tyr 565

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、マウス各組織におけるγ−ＧＴＰｍＲ
ＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により調べた
結果の電気泳動写真である。

【図２】図２は、ヒト胎児各組織におけるγ−ＧＴＰｍ
ＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により調べ
た結果の電気泳動写真である。

【図３】図３は、マウス７日胚から１７日胚までにおけ
るγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット
解析により調べた結果の電気泳動写真である。

【図４】図４は、ヒトの各癌細胞株におけるγ−ＧＴＰ
ｍＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により調
べた結果の電気泳動写真である。

【図５】図５は、骨、炎症部位を含む各組織および細胞
におけるγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ＲＴ−ＰＣ
Ｒ解析により調べた結果の電気泳動写真である。

【図６】図６（上）は、γ−ＧＴＰｃＤＮＡをＣＯＳ細
胞で発現させた培養上清中の活性を、ＴＲＡＰ染色及び
ｐｉｔ形成法により調べた結果の顕微鏡写真である。図
６（下）は、ベクターを導入して同様の実験を行った結
果の顕微鏡写真である。

【図７】図７（上）は、γ−ＧＴＰｃＤＮＡをＣＯＳ細
胞で発現させた培養上清中の活性を、¹²⁵Ｉカルシトニ
ンの結合（図中、矢印で示す）により示した結果の顕微
鏡写真である。図７（左下）は、大過剰のコールドカル
シトニンを加えたことで、¹²⁵Ｉカルシトニンの結合が
消失した結果を示した顕微鏡写真である。図７（右下）
は、ベクターを導入して同様の実験を行った結果を示し
た顕微鏡写真である。

【図８】図８は、ラット腎臓から精製したγ−ＧＴＰの
破骨細胞分化促進活性を調べた結果を示すグラフであ
る。

【図９】図９は、ＣＩＡマウスの炎症関節より分離した
細胞の破骨細胞への分化を、抗ラットγ−ＧＴＰ抗体が
抑制することを示したグラフである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＧＣ０７Ｋ 16/40 ＡＤＳＣ１２Ｑ 1/48 ＡＤＴ // Ｃ１２Ｎ 5/10 ＡＤＵ 9/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/09 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 γ−グルタミルトランスペプチターゼ
（γ−ＧＴＰ）、または破骨細胞分化促進活性を有する
γ−ＧＴＰ誘導体、を有効成分として含有する、破骨細
胞分化促進剤。
【請求項２】 γ−ＧＴＰ、または破骨細胞分化促進活
性を有するγ−ＧＴＰ誘導体、を用いることを特徴とす
る、破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方
法。
【請求項３】請求項２記載のスクリーニング方法を用
いて得られる、破骨細胞分化促進活性阻害剤。
【請求項４】 γ−ＧＴＰのペプチド断片、または破骨
細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体のペプチド
断片よりなる、請求項３記載の破骨細胞分化促進活性阻
害剤。
【請求項５】 γ−ＧＴＰに対する抗体、または破骨細
胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体に対する抗体
からなる、請求項３記載の破骨細胞分化促進活性阻害
剤。
【請求項６】請求項３〜５いずれか記載の破骨細胞分
化促進活性阻害剤よりなる、高回転型骨粗鬆症、癌の骨
転移に伴う高カルシウム血症又は骨破壊、慢性関節リウ
マチに伴う骨破壊、あるいは慢性肝疾患に伴う二次性骨
減少症、に対する治療薬。
【請求項７】請求項１記載の破骨細胞分化促進剤より
なる、低回転型骨粗鬆症に対する治療薬。