JP2006096731A - カルシウム吸収促進剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 γ−グルタミルトランスペプチダーゼ(γ−GTP)またはカルシウムの吸収促進活性を有するγ−GTP誘導体を有効成分として含んでなるカルシウムの吸収促進剤およびγ−GTPを指標とするカルシウムの吸収促進剤のスクリーニング方法が提供される。
【選択図】 図2
Description
本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ(γ−GTP)またはカルシウムの吸収促進活性を有するγ−GTPの誘導体を有効成分とする、カルシウムの吸収促進剤およびその医薬用途に関する。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ(γ-Glutamyl transpeptidase、以下「γ−GTP」という。)は、ペプチドのN末端のグルタミン酸を他のペプチドまたはアミノ酸に転移する作用を有する酵素である。γ−GTPは、腎臓、膵臓、および肝臓などに存在し、特に、腎臓では近位尿細管に多く存在することが知られている。一方、通常の場合、カルシウム再吸収に関与する遠位尿細管において、γ−GTPが存在することは確認されていない。
本発明によるカルシウムの吸収促進剤の有効成分であるγ−GTP とは、全ての脊椎動物のγ−GTP を含む概念であり、好ましくはマウスまたはヒト由来のものが挙げられる。マウスまたはヒト由来のγ−GTPのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は既に公知である。例えば、マウスγ−GTPのヌクレオチド配列は配列番号1に示され、そのアミノ酸配列は配列番号2に示される。従って、本発明の好ましい態様によれば、γ−GTPは配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するものである。また、ヒトγ−GTPのヌクレオチド配列は配列番号3に示され、そのアミノ酸配列は配列番号4に示される。従って、本発明の好ましい態様によれば、γ−GTPは配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するものである。
Cre-Loxpシステムのメカニズムは以下の式に示される通りである。
本発明によるカルシウムの吸収促進剤は、上述のように、γ−GTPまたはγ−GTP誘導体を有効成分として含んでなることを特徴とするものである。ここで、「有効成分として含んでなる」とは、所望する目的および用途に応じた担体を含んでいてもよいことは当然として、併用可能な他の成分を含有する場合も包含する意味である。
γ−GTP (ganmma glutamyl transpeptidase)を過剰発現するマウスの作製
γ−GTPcDNAの単離
Mus Musculus γ−GTP(NCBI U30509)のN末端にkozac配列を配置し、さらにその両端にMfelsiteを配置したプライマーを設計した。各プライマーの塩基配列を次に示す。
Mfel1-GGT5':5'-ccgcaattgccaccatgaagaatcggtttc tgg-3'(配列番号:5)
Mfel1-GGT3':5'-ggcggggaacctgctggctactgacaattg-3'(配列番号:6)
C57BL6/crSlc(8w male)の両側腎臓を採取し、TRlzol(商標)Reagent(Invitrogen)を用いてtotal RNAを抽出した。このtotal RNAからRT-PCRにより約1.7kbのγ-GTP cDNA fragment(配列番号1のCDS 161-1867に相当)を得た。
pCXP-floxed EGFP-GGTの構築
図1に示されるベクター、すなわち、CMV IE enhancer + Chicken β-actin Promoterの下流にloxp配列で挟んだEGFP(enhanced green fluorescence Protein) + Rabbit β- globlin poly A(pCXP-floxed EGFP)、さらにその下流に前述のγ-GTPcDNA fragment + Rabbit β-globlin polyAが配置されているベクター(pCXP-floxed EGFP-GGT)を常法に従って構築した。
ここで、pCXP-floxed EGFP-GGTを構成するpCXP-floxed EGFPは、次のようにして構築した。plRES-EGFP(CLONETEC社)をpBS246(Invitrogen社)に挿入し、loxP-EGFP-pA-loxPの部位を切り出した。これを大阪大学宮崎教授より供与を受けたpCAGGSに挿入した。
上記pCXP-floxed EGFP-GGTからSaII、HindIIIにて切り出したDNAフラグメント(floxed EGFP-GGT 約5.6kb)をC57BL6/crSlcの受精卵前核に注入した。その結果、65匹の産仔が得られた。産仔(生後4w)の尾の先端1mmを切り離し蛍光顕微鏡で観察すると65匹中14匹(=23%)にEGFPの発色が確認された。このようにして、Floxed EGFP-GGT トランスジェニックマウスを得た。これらのマウスの尾からDNAを抽出し、γ−GTPゲノム exon 5〜7にプライマーを設定し、PCRにて遺伝子の導入の有無を確認したところ、遺伝子導入が確認された。PCRに用いたプライマーの塩基配列を次に示す。
GGT 5':5'-ggtgttctgccgccaagggaagg-3'(配列番号:7)
GGT 3':5'-gagacacatcgacaaactttggg-3'(配列番号:8)
常法に従って作成したChicken β-actin(CAG) Promoterの下流にCre gene(Gene bank Acc.#X03453)を配置した構築物を、マイクロインジェクション法を用いてマウス(C57BL6/crSlc)に導入した。このマウスが必要な構築物を保持していることを、下記に示すCre geneに設定したプライマーを用いて確認した。このプライマーによって、250bpの増幅産物が合成された。
Cre 5':5'-aggttcgttcactcatgga-3'(配列番号:9)
Cre 3':5'-tcgaccagtttagttaccc-3'(配列番号:10)
このようにして得られたCAG−Creトランスジェニックマウスを、Floxed EGFP-GGTトランスジェニックマウスと交配し、CAG−γ−GTP トランスジェニックマウスを得た。 上記両PCR陽性の固体の尾を1mm採取し、PBS 500μL中で組織を溶解しγGTP活性を測定し、野生型マウスと比較して高い活性を有することを確認した。
血液生化学的検査
上記にて得られたCAG−γ-GTPトランスジェニックマウス(Tg、8匹)および野生型マウス(WT、7匹)を用いて、血液を経心臓的に採血した。この血液を遠心分離し、得られた血清をサンプルについて、尿素窒素、クレアチニン、無機リン、γ-GTP、副甲状腺ホルモン、およびカルシウムを測定した。なお、尿素窒素、クレアチニン、無機リン、およびγ-GTPは酵素法により測定し、副甲状腺ホルモンは免疫放射定量法によりを測定し、カルシウムはO-CPC法により測定した。結果は表1に示される通りであった。
尿検査
CAG−γ-GTP トランスジェニックマウス(Tg、n=20)および野生型マウス(WT、n=17)を代謝ケージ(日本クレア)にて飼育し、24時間採尿を行った。その後、尿中の各成分を試験例1と同様の方法にて測定した。尿中カルシウム排泄量は、図4に示される通りであった。トランスジェニックマウスは野生型マウスと比較して、尿中カルシウム排泄量について有意に低い値を示した(p=0.02)。
RT-PCR
CAG−γ-GTP トランスジェニックマウスまたは野生型マウス由来の腎臓および十二指腸から、常法に従ってtotal RNAを採取した。このtotal RNAをRT-PCRにて処理し、各臓器における TRPV、 Calbindin、CaSR、γ−GTP、およびEF1αの発現を比較した。結果は図5に示される通りであった。CAG−γ-GTP トランスジェニックマウス由来の腎臓において、γ−GTPのmRNAの発現上昇が認められ、TRPV5、TRPV6、Calbindin-D28K、CaSRのmRNAの発現低下が認められた。
腎臓γ−GTP免疫染色
CAG−γ-GTP トランスジェニックマウスおよび野生型マウスから腎臓組織標本を得た。そして、この腎臓組織標本を用い、γ−GTPについて免疫染色を行った。ヒストファインシンプルステインラットMAX-PO(MULTI、第1抗体;抗ラットγ−GTP抗体(動物種;ウサギ)、第2抗体;抗ウサギIg(動物種;ヤギ))を用い、DAB染色にて発色させた。結果は図6に示される通りであった。
野生型マウスにおいては、近位尿細管にのみγ−GTPの発現が認められたが、CAG−γ-GTP トランスジェニックマウスにおいては、糸球体または遠位尿細管にγ−GTPの発現が認められた。
Claims (10)
- γ−グルタミルトランスペプチダーゼ(γ−GTP)またはカルシウムの吸収促進活性を有するγ−GTPの誘導体を有効成分として含んでなる、カルシウムの吸収促進剤。
- 腎臓におけるカルシウムの再吸収を亢進することを特徴とする、請求項1に記載のカルシウムの吸収促進剤。
- 前記γ−GTPが配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するものである、請求項1または2に記載のカルシウムの吸収促進剤。
- 前記γ−GTPが配列番号4に示されるアミノ酸配列を有するものである、請求項1または2に記載のカルシウムの吸収促進剤。
- カルシウム代謝障害およびこれに起因する疾患の予防または治療に用いられる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のカルシウムの吸収促進剤。
- 低カルシウム血症、骨粗鬆症、高血圧、または癌の予防または治療に用いられる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のカルシウムの吸収促進剤。
- カルシウムの吸収促進剤を製造するための、γ−GTPまたはカルシウムの吸収促進活性を有するγ−GTPの誘導体の使用。
- γ−GTPまたはカルシウムの吸収促進活性を有するγ−GTPの誘導体の発現が増強された非ヒト動物からなる、カルシウム代謝障害およびこれに起因する疾患のモデル動物。
- 上記疾患が、高カルシウム血症、低カルシウム尿症、または低PTH血症である、請求項8に記載のモデル動物。
- カルシウムの吸収促進剤のスクリーニング方法であって、
被検物質を非ヒト動物に投与し、
該非ヒト動物におけるγ−GTPの発現量または活性を測定し、
該γ−GTPの発現量または活性が増加した場合、前記被検物質はカルシウムの吸収促進活性を有すると判定すること
を含んでなる、方法。
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