JP4034381B2 - γ−グルタミルトランスペプチターゼの新規な用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、γ−グルタミルトランスペプチターゼ（以下、γ−ＧＴＰと略す）の新たな用途に関する。さらに詳しくは、γ−ＧＴＰまたはその活性を保持する誘導体を有効成分として含有する破骨細胞分化促進剤、または該γ−ＧＴＰ等を用いる破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法、さらには該γ−ＧＴＰ等に対する抗体からなる破骨細胞分化促進活性阻害剤、に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１．破骨細胞分化促進因子
骨組織は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とによって基本的形状を変えることなく、新生骨に置換される。この過程は骨リモデリング（骨再造形）と呼ばれ、生体の機能維持に重要な役割を果たしている。
骨形成の中心的な役割を果たしている骨芽細胞は、間葉系由来の未分化細胞から分化し、骨基質を形成する。
一方、骨吸収の中心的な役割を果たしている破骨細胞は骨髄細胞に由来し、骨芽細胞との細胞間接触を介して分化することにより形成される。成熟破骨細胞は多核で増殖性の乏しい巨細胞であり、カルシトニン受容体や酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を発現する。また、骨や象牙質等の石灰化組織を吸収する活性を有している。
これら破骨細胞と骨芽細胞による骨リモデリングのバランスは、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成の繰り返しにより平衡に保たれている。しかし、ひとたびこの平衡バランスが崩れると骨組織は異常をきたし、種々の疾患を呈することになる。
【０００３】
骨リモデリングの異常により起こる代表的な疾患として、骨粗鬆症が知られている。骨粗鬆症は、骨リモデリングの代謝回転速度からみて、閉経早期あるいは甲状腺機能亢進症などにおいて認められる高回転型骨粗鬆症と、老人性、ステロイド性、糖尿病性骨粗鬆症において認められる低回転型骨粗鬆症に分類されている。それ以外では、例えば癌の骨転移に伴う高カルシウム血症や骨破壊、慢性関節リウマチに伴う骨破壊等の疾患が、上記骨リモデリングの異常により起こる疾患として知られている。これら癌の骨転移に伴う高カルシウム血症や骨破壊、あるいは慢性関節リウマチに伴う骨破壊は、破骨細胞の機能が異常に亢進した結果生じる疾患である。
【０００４】
以上のような疾患に対する有効な治療薬の探索が種々なされているが、未だ決定的な治療薬は見出されていない。アプローチの一つとして、骨髄細胞から破骨細胞への分化を促進する因子、あるいはその阻害剤が、上記疾患に対する治療薬となることが考えられる。すなわち破骨細胞の分化促進因子は、上述の如き低回転型骨粗鬆症においてみられる骨リモデリングの低回転を正常に戻すことが考えられるため（J.Bone Miner Res.,7, p65 (1992) ）、この低回転型骨粗鬆症の有効な治療薬となることが考えられる。一方、破骨細胞分化促進因子の阻害剤は、上述の如き高回転型骨粗鬆症における骨リモデリングの高回転を正常に戻すことが考えられるため（Am.J.Med.Sci., 305(1), p40(1993)及び Mebio.,11(2), p24 (1994))、この高回転型骨粗鬆症の有効な治療薬となることが考えられる。また、前記の如き破骨細胞の機能の亢進に伴う癌患者の骨破壊や、慢性間接リウマチ患者の骨破壊等にも、この破骨細胞分化促進因子の阻害剤が有効に働くことが考えられる。
破骨細胞分化促進因子は骨吸収因子とも呼ばれ、これまでに活性型のビタミンＤ３ 、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インターロイキン１、プロスタグランディン等が知られている。しかしこれらの因子は種々の問題点があり、未だ治療薬とはなっておらず、新たな破骨細胞分化促進因子の出現が望まれている。
【０００５】
２．γ−ＧＴＰ
γ−ＧＴＰは、γーグルタミルペプチドを加水分解すると同時に、そのγーグルタミル基を他のペプチドやアミノ酸に転移する反応を触媒する膜結合型酵素である。
γ−ＧＴＰは腎、膵、肝の順に活性が高く、特に腎臓では近位尿細管、肝臓では毛細胆管、膵臓では膵腺房や膵管系に広く存在している。
γ−ＧＴＰの生理的機能として、物質輸送能の高い臓器の細胞膜に結合した膜結合型酵素であるという局在性と、上述の如き酵素の反応特性から、γ−グルタミルサイクルの一員として細胞の外側から細胞内へ共役的にアミノ酸を輸送する機能を有してるという仮説が提唱されている（ Science,180, p33(1973) ）。しかし、この仮説を否定する報告も種々なされている（代謝、16,(3) (1979)、Eur.J.Biochem.,78,p609(1977)、Biochem.Biophys.Res.Commun.,65,p68(1975)、およびBiochem.Biophys.Res.Commun.,73,p 997(1976))。
【０００６】
また、γ−ＧＴＰの別の生理的機能として、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）のサルベージに関与していることが推測されている。すなわち、生体には非常に多くのグルタチオン（ＧＳＨ）が存在し、生体内酸化反応に対応して酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）として血中に放出されていることが知られている（E.,Clin.Chim.Acta,7,p755(1969)）。このＧＳＳＧもＧＳＨと同様に本酵素の基質となることが知られている。アミノ酸と異なり、このものの細胞内への輸送速度は非常に遅いため、腎近位尿細管のγ−ＧＴＰによりＧＳＨを分解し、アミノ酸にして細胞内に取り込み、元のＧＳＨを合成することで一定濃度を維持している。もし腎近位尿細管に本酵素がなく、構成アミノ酸への水解が起こらなければ、その大部分は尿中に失われてしまう。そのため、本酵素欠損症の患者尿中には大量のＧＳＳＧが見出されている（グルタチオン尿症）。これらの知見に基づき、ＧＳＳＧのサルベージが本酵素の生理機能の一つと推測されている。
【０００７】
また、γ−ＧＴＰの用途としては、肝疾患の診断薬としての用途が知られている。すなわち、肝細胞のγ−ＧＴＰは、大部分がミクロソーム分画に局在し、血中には肝由来の可溶型γ−ＧＴＰが僅かに存在している。γ−ＧＴＰは、種々の肝胆道疾患に伴い血中濃度が上昇するため、これら肝胆道疾患の有効な診断薬となっている。その中でも診断的意義の最も高い疾患が、胆汁うっ滞である。特に肝内性、肝外性うっ滞時にはアルカリ性ホスファターゼ、ロイシンアミノペプチダーゼなどの胆道系酵素とともに、著しくγ−ＧＴＰの血中濃度が上昇する。具体的な疾患としては、胆汁うっ滞を起こす薬剤性肝炎や急性アルコール性肝炎などが挙げられる。また部分的な胆汁うっ滞である原発性、転移性肝癌などの限局性肝病変及びアルコール常習者の場合では、γ−ＧＴＰは中等度の上昇を示す。急性肝炎ではアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）などのトランスアミナーゼの上昇に比し、γ−ＧＴＰの上昇は軽度である。また、慢性肝炎、肝硬変でも軽度の上昇にとどまる。このようにγ−ＧＴＰは、種々の肝疾患において特異性の高い鋭敏な診断薬として日常的に利用されている。
【０００８】
以上のように、γ−ＧＴＰの種々の生物学的機能が示唆され、また、肝疾患における診断薬としての用途が知られている。しかし該γ−ＧＴＰが、前記破骨細胞の分化促進に関与しているか否かについては、何ら明らかにされていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、γ−ＧＴＰの新たな生理機能を見出すことにより、γ−ＧＴＰまたはその活性を保持する誘導体の、新たな用途を提供することにある。すなわち、γ−ＧＴＰの破骨細胞分化促進因子としての機能を見出すことにより、γ−ＧＴＰまたはその活性を保持する誘導体を有効成分として含有する破骨細胞分化促進剤、あるいは該γ−ＧＴＰ等を用いる破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法、さらには該γ−ＧＴＰ等に対する抗体からなる破骨細胞分化促進活性阻害剤、を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、骨転移細胞であるＢＷ５１４７細胞から発現クローニング法により破骨細胞分化促進因子を探索したところ、（１）破骨細胞のマーカー酵素であるＴＲＡＰ染色性、（２）カルシトニン受容体の存在、（３）象牙の分解活性の、公知の３つの特性を有する「破骨細胞」へと分化形成させる因子を発見することに成功した。我々は、このタンパク性因子をＯＰＦａ１２と命名してさらに解析を進めたところ、驚くべきことに本発明者らがクローニングしたＯＰＦａ１２は、γ−ＧＴＰと同一物質であることが判明した。すなわち、現在まで細胞内へのアミノ酸の輸送、あるいはＧＳＳＧのサルベージといった生体内機能しか知られていなかったγ−ＧＴＰが、破骨細胞の分化促進活性という新規な機能を有することを発見し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち本発明の要旨は、（１） γ−ＧＴＰ、または破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体、を有効成分として含有する、破骨細胞分化促進剤、（２） γ−ＧＴＰまたはγ−ＧＴＰ誘導体を用いることを特徴とする、破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法、（３）γ−ＧＴＰまたはγ−ＧＴＰ誘導体に対する抗体であって、γ−ＧＴＰまたはγ−ＧＴＰ誘導体の破骨細胞分化促進活性を阻害する機能を有する抗体からなる、破骨細胞分化促進活性阻害剤、（４） 前記（３）記載の破骨細胞分化促進活性阻害剤よりなる、高回転型骨粗鬆症、癌の骨転移に伴う高カルシウム血症又は骨破壊、慢性関節リウマチに伴う骨破壊、あるいは慢性肝疾患に伴う二次性骨減少症、に対する治療薬、並びに（５） 前記（１）記載の破骨細胞分化促進剤よりなる、低回転型骨粗鬆症に対する治療薬、に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明においてγ−ＧＴＰとは、全ての脊椎動物のγ−ＧＴＰを含むものである。既に、ヒト(Gene,73, p1 (1988)）、マウス(Gene,167, p233(1995))、ラット(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83, p937(1986)）等、脊椎動物のγ−ＧＴＰのｃＤＮＡがクローニングされている。そして、マウスとラットγ−ＧＴＰでは約９０％のホモロジーを、またヒトとラットγ−ＧＴＰでは約８０％のホモロジーを有しており、種間で非常に高いホモロジーを有することが分かっている。従って、前記文献等において開示された塩基配列よりγ−ＧＴＰ特異的なプライマーあるいはプローブを作製し、該プライマーあるいはプローブを用いて脊椎動物の種々のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のγ−ＧＴＰを容易にクローニングすることができる。これらクローニングの方法は、例えばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等に詳しく述べられており、具体的には、ハイブリダイゼーションを用いる方法、あるいはＰＣＲを用いる方法等が挙げられる。
【００１３】
また、クローニングされたｃＤＮＡの発現ベクターへの挿入、および該発現ベクターの原核性生物細胞または真核性生物細胞への導入は、いずれも前記Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等に従い、当業者ならば容易に行える状況にある。さらに、上記発現ベクター導入細胞の培養上清中に産生されたγ−ＧＴＰは、亜鉛キレートアガロース、コンカナバリンＡアガロース、セファデックスＧ−１５０等を用いる公知の方法等によって、容易に精製することができる。
【００１４】
本発明において「破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体（以下単に、活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体、と略することもある）」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質あるいはペプチドや、生体内に存在するアレル変異体等のうち、破骨細胞分化促進活性を有するものを指す。該誘導体をコードするＤＮＡは、例えば特異的突然変異誘発 ( Methods in Enzymology, 100, p468 (1983)) やＰＣＲ法(Molecular Cloning 2nd Edt. 15章、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))等の手法により、当業者ならば容易に作製することができる。また、このようにして作製されたＤＮＡからタンパク質への発現は、前記γ−ＧＴＰと同様にして行うことができる。
【００１５】
またここで「破骨細胞分化促進活性」は、例えば、骨髄細胞に対してγ−ＧＴＰの種々の誘導体を作用させた後、破骨細胞の公知の作用−すなわち１）ＴＲＡＰ染色性、２）カルシトニン受容体の存在、３）象牙の分解活性、を調べることにより、容易に測定することができる。具体的には以下のようにして測定することができる。
【００１６】
まずアッセイ用の細胞であるが、破骨細胞は、骨髄系細胞から分化・誘導される細胞であると考えられているため、アッセイ用細胞として、この骨髄系細胞を使用する。具体的には、たとえば 6〜12週令のマウスの大腿骨および脛骨の骨端を切り落としたものをピペッティングし、沈殿した骨残渣を除いた上清部分を骨髄細胞として使用することができる。この調製された骨髄細胞を、活性型ビタミンＤを含む培養液中に懸濁させ、適当な濃度(例えば2×106個細胞/ml )に調製してプレート(例えば96穴プレート)上にまき、そこへ、被験物質であるγ−ＧＴＰの種々の誘導体を添加した後、１）ＴＲＡＰ染色法、２）象牙を用いたｐｉｔ形成法、３）カルシトニン受容体の検出法、の、破骨細胞の公知の３つの作用を調べ、これら１）〜３）の全てにポジティブであった場合は、該γ−ＧＴＰの誘導体に、破骨細胞分化促進活性が存すると判断する。ここで１）のＴＲＡＰ染色は、例えばEndocrinology, 122, p1373(1988)等に従い、まず上記の如く被験物質で処理された骨髄細胞をアセトン−クエン酸緩衝液で固定した後、酒石酸存在下で基質（Naphthol AS-Mxphosphate)と色素（Fastredviolet LB salt）を３７℃で１時間程度反応させることにより、検出することができる。また２）のｐｉｔ形成測定は、例えば、あらかじめ直径6mm、1mm厚程度の象牙質スライスを96穴ウエルプレートのウエル底に敷いたものを用意し、このウエル上で、上記の如き被験物質による骨髄細胞の処理を行い、適当な期間の後、象牙質スライス上の細胞を先のＴＲＡＰ染色し、0.25％トリプシン−0.02％ＥＤＴＡで一晩処理し、スライス上の細胞をシリコンスクレイパーで削り取った後、象牙質スライス上のｐｉｔ（吸収窩）を顕微鏡下で観察し、その数を測定することにより測定することができる。また、３）のカルシトニン受容体の検出は、例えばLAB-TECチェンバースライド上で被験物質による処理を行った細胞に対し、[125I］サケ・カルシトニンを加えて37℃で反応させた後、先のＴＲＡＰ染色を行い、その後スライドをエマルジョン（KODAK NTB-2）に浸し、暗箱中４℃で2-7日保存し、その後現像して顕微鏡下で観察することにより、検出することができる。
以上のような破骨細胞分化促進活性の測定法に種々のγ−ＧＴＰの誘導体を供することにより、上記の如き活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体を、容易に選別することができる。
【００１７】
本発明のγ−ＧＴＰまたは活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体は、破骨細胞分化促進活性を有する因子である。従ってこれらの物質を有効成分として含有する「破骨細胞分化促進剤」は、「従来の技術」の項にも記載した如く、老人性、ステロイド性、糖尿病性骨粗鬆症において認められる低回転型骨粗鬆症に対する有効な治療薬となるものである。
これら破骨細胞分化促進剤の患者への投与方法としては、静脈注射による投与が好ましいが、経口投与、坐薬としての投与、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与なども考えられる。また投与量は、一日量 0.0001 〜100mg 程度を症状が改善されるまで投与することが可能である。
【００１８】
本発明のγ−ＧＴＰまたは活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体はまた、破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニングのためにも使用できる。ここで、「破骨細胞分化促進活性阻害剤」とは、本発明のγ−ＧＴＰ等の有する破骨細胞分化促進活性を阻害する薬剤を指す。そして「破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法」は、先に述べた破骨細胞分化促進活性の測定系に、被験物質である阻害剤候補物質を添加することによって実施することができる。
【００１９】
例えば上記の破骨細胞分化促進活性測定法のうち、「２）象牙を用いたｐｉｔ形成法」により阻害剤のスクリーニングを行う際は、まず前記の如く象牙質スライス上で、マウス骨髄細胞に対し、γ−ＧＴＰと阻害剤候補物質とを添加、作用させる。その際、阻害剤候補物質に阻害作用があれば、象牙質に吸収窩（ｐｉｔ）が形成されない。この吸収窩の形成を指標に、容易に阻害剤をスクリーニングすることができる。
以上のような、γ−ＧＴＰを用いた破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法は、本発明においてγ−ＧＴＰの新たな生理機能を見出したことに伴って、初めて可能となったものである。
【００２０】
本発明において「破骨細胞分化促進活性阻害剤」とは、上記スクリーニング方法により見出されるものであり、前記もしたように、本発明のγ−ＧＴＰの有する破骨細胞分化促進活性を阻害する薬剤を意味する。このような破骨細胞分化促進活性阻害剤は、「従来の技術」にも記載したように、閉経早期あるいは甲状腺機能亢進症などにおいて認められる高回転型骨粗鬆症に対する治療薬、また癌の骨転移に伴う高カルシウム血症や骨破壊、あるいは慢性関節リウマチに伴う骨破壊等の疾患に対する有効な治療薬となるものである。
なお後述の実施例に記載の如く、本発明のγ−ＧＴＰはコラーゲン関節炎モデルの炎症部位で発現しており、またγ−ＧＴＰに対する抗体は、コラーゲン関節炎マウスの炎症関節部位より分離した細胞から破骨細胞への分化誘導を、抑制することが示された。これらの結果は、γ−ＧＴＰの阻害剤が、上記慢性関節リウマチに伴う骨破壊に対する有用な治療薬になることを裏付けるものである。さらに、本発明のγ−ＧＴＰは、骨転移し易くまた高カルシウム血症の合併頻度の高い癌細胞として知られている前骨髄性白血病細胞、Burkittsリンパ腫細胞、あるいは肺癌細胞等において高発現していることが示された。これらの結果は、γ−ＧＴＰの阻害剤が、上記癌の骨転移に伴う高カルシウム血症や骨破壊に対する有用な治療薬となることを裏付けるものである。
【００２１】
さらに、上記疾患以外にも、本発明の破骨細胞分化促進活性阻害剤は、慢性肝疾患に伴う二次性骨減少症の有効な治療薬となることが考えられる。
すなわち近年、大阪府立病院消化器内科グループの調査において、慢性肝疾患の二次性（肝性）骨減少症の頻度とその病態についての解析が行われており（肝臓 36巻, 2 号,1：p67,(1995))、これによると、ＤＸＡ法で骨塩量を測定するとともに骨代謝のパラメーターを生化学的並びに内分泌学的に検討した結果、慢性肝疾患では健常対照群に比して二次的な骨減少症の頻度が有意に高く、しかも、肝硬変に至る以前の慢性肝炎の時期に肝性骨減少症が発症しているという結果が得られた。さらに、慢性肝疾患において、骨減少症合併群は非合併群に比べてγ−ＧＴＰと総胆汁酸量が有意な高値を示したことも報告された。
このように、上記慢性肝疾患における二次性骨減少症においてγ−ＧＴＰが有意な高値を示したことが報告されたが、これら二次性骨減少症とγ−ＧＴＰとの関係については、何ら示されていない。
本発明においては、γ−ＧＴＰが破骨細胞分化促進活性を有することを、新たに見出した。この新たな発見と、上記慢性肝疾患における二次的骨減少症においてγ−ＧＴＰが有意に高値であったという報告とを併せ考慮すると、γ−ＧＴＰの有する破骨細胞分化促進活性が、この二次的骨減少症の原因となっていることが考えられる。従って、γ−ＧＴＰに対する阻害剤は、この二次的骨減少症の有効な治療薬になると考えられる。
このような本発明の破骨細胞分化促進活性阻害剤の患者への投与方法としては、前記破骨細胞分化促進剤と同様の投与法が考えられる。また投与量は、一日量 0.0001 〜100mg 程度を症状が改善されるまで投与することが可能である。
【００２２】
本発明において「γ−ＧＴＰのペプチド断片、または破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体のペプチド断片」とは、具体的には、γ−ＧＴＰまたは活性を有する誘導体の、十数〜数十のアミノ酸配列からなるペプチドを指し、好ましくは10〜20個程度のアミノ酸配列からなるペプチドを、さらに好ましくはγ−ＧＴＰのエピトープ領域を形成する10〜20個程度のアミノ酸配列からなるペプチドを指す。該エピトープ領域のアミノ酸配列は、特開平3-4782等に記載の方法により推定することが可能である。該ペプチドは、10〜20個程度の短いものであればペプチド合成装置により合成することができるし、長いものであれば通常の遺伝子工学的手法により（たとえば制限酵素処理等により）調製されたＤＮＡを、上述の動物細胞等により発現させることにより、得ることができる。
これら作製されたペプチド断片を、上記破骨細胞の分化促進活性阻害剤のスクリーニングに供することにより、該阻害活性を有するペプチド断片を、容易に選び出すことができる。
【００２３】
本発明において「γ−ＧＴＰに対する抗体、または破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体に対する抗体」は、例えば新細胞工学実験プロトコールp210秀潤社(1993)に記載された方法を用いてウサギ等を免疫することにより、容易に作製することができる。また、例えば分子生物学研究のためのタンパク実験法第4章 羊土社（1994）に述べられている手法を用いることにより、容易にモノクローナル抗体を作製することもできる。
上述のように、該γ−ＧＴＰの抗体は、コラーゲン関節炎マウスの炎症関節より分離した細胞から破骨細胞への分化を抑制することが明らかとなった。従って、このようなγ−ＧＴＰの抗体は、破骨細胞分化促進活性の有効な阻害剤となるものである。また、γ−ＧＴＰの種々の抗体のうち、いかなる抗体が破骨細胞分化促進活性阻害効果を有するかについては、上記破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法にこれら抗体を供することにより、容易に見出すことができる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明の一例として実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
マウスｃＤＮＡライブラリーの構築
１．１ マウスＢＷ５１４７細胞からのｍＲＮＡの単離
１．１．１ 全ＲＮＡの単離
マウスＢＷ５１４７細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８８）１×１０8個をＡ ＧＰＣ法（acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform method；実験医学 9, 15, p99 (1991)）に従い全ＲＮＡを分離した。即ち、まず、細胞のペレットに４Ｍのグアニジンイソチオシアネート１０ｍｌを加え、直ちに激しく振とうし、その溶液を１８Ｇニードルにより５往復通過させることでＤＮＡを部分剪断した。この溶液に２Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、水飽和フェノール１０ｍｌ及びクロロホルム−イソアミルアルコール（４９：１）２ｍｌを順次加え、添加ごとに混和した。その後激しく振とうし、１５分間氷冷した後、４℃で１０，０００ｇ、２０分間遠心した。その水層を分取し、等量のイソプロパノールを加えて良く混和した。これを−２０℃に１時間置いた後、４℃で１０，０００ｇ、１０分間遠心した。遠心後、ＲＮＡの沈殿に４Ｍグアニジンチオシアネート３ｍｌを加えて完全に溶解させ、等量のイソプロパノールを加え、−２０℃で１時間放置した。その後、４℃で１０，０００ｇ、１５分間遠心した後、上清を捨て、ＲＮＡの沈殿を７５％エタノールで洗浄することにより全ＲＮＡを得た。
【００２６】
１．１．２ ｍＲＮＡの単離
上記の方法を数回繰り返すことで全ＲＮＡを１５ｍｇ集め、容離緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳ）５ｍｌに溶解し、６５℃で２分間加熱し、直ちに室温まで急冷した。５ＭＮａＣｌを０．５５ｍｌ添加後、その溶液を洗浄緩衝液（０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳ）で平衡化したオリゴｄＴセルロース（タイプ７、ファルマシアバイオテク）０．５ｇのカラムに添加し、通過液をさらに２回、カラムに添加することによりｍＲＮＡをカラムに結合させた。カラムを洗浄緩衝液１５ｍｌで洗浄した後、結合したＲＮＡを容離緩衝液４ｍｌで溶出した。溶出液を６５℃で２分間加熱し、その後冷却し、０．５ＭＮａＣｌに調節し、再平衡カラムに再度添加して、同様に溶出操作を行った。その溶出液からエタノール沈殿によりｍＲＮＡを回収し、７５％エタノールで洗浄した。
【００２７】
１．１．３ ショ糖密度勾配遠心によるｍＲＮＡの分画
ジエチルピロカーボネイトで処理した密度勾配フラクショネータ（日立；ＤＧＦ−Ｕ）と遠心チューブ、２種類の濃度のＲＮａｓｅフリーのショ糖溶液（５％と２０％（ｗ／ｖ）ショ糖）、０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳを用意し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１Ｔｉ用チューブに密度勾配フラクショネータでショ糖勾配を作り、２時間以上室温に放置して、勾配の不連続性をなくした。次に、ｍＲＮＡを２００μｌのＴＥ溶液（９９％ジメチルスルホキサイド、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）に溶解し、３７℃で５分間処理し、４００μｌの５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳを加えて６５℃で１０分間熱処理をすることにより、その非特異的な会合を解離させた。その後急冷し、ショ糖密度勾配にのせ、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１Ｔｉローターで２５℃、２０，０００ｒｐｍ、１４時間遠心を行った。遠心後、チューブより０．５ｍｌずつ密度勾配フラクショネータで分画し、エタノール沈殿した。ｍＲＮＡの沈殿は最低３回、７５％エタノールで洗浄した。
【００２８】
１．１．４ ｍＲＮＡの同定
５０画分に分画したｍＲＮＡは、その一部を後述の２．１．３の方法に従いアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、タンパク質に翻訳させた。この翻訳産物を含む培養上清を、後述の２．２．２の方法によりアッセイ用のマウス骨髄細胞に添加して培養した後、２．３．１のＴＲＡＰ染色法により、破骨細胞が分化形成されたか否か（すなわち、どのｍＲＮＡ画分中に破骨細胞分化促進活性を有する因子が含まれているか）を同定した。その結果、活性のピークは、２７番目の分画と３２番目の画分に存在していた。
【００２９】
１．２ ｃＤＮＡライブラリーの作製
活性のピーク画分の２７番目から３３番目を活性画分として集め、この画分に対するｃＤＮＡライブラリーを、Ｇｕｂｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ法（Gene, 25, p263 (1983）) の変法にて調製した。即ち、この活性画分のｍＲＮＡ２μｇをもとに、ＸｈｏＩサイトを持つオリゴｄＴプライマーを用いて、Ｍ−ＭｕＬＶの逆転写酵素によりファーストストランドを合成した。続いて DNA Polymerase I によりセカンドストランドを合成し、ＥｃｏＲＩアダプターとのライゲーションおよびＸｈｏＩ消化を行った。その後、アダプターとプライマーをゲル濾過（Sephacryl Spin Column；ファルマシア社）により除いた。以上のｃＤＮＡ合成ステ ップはStratagene社のＺＡＰｃＤＮＡ合成キットを用い、逆転写酵素はＢＲＬ社のスーパースクリプトＩＩを用いて行った。
次に、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ切断済みＺＡＰ ＥｘｐｒｅｓｓTMベクターを先に作製したｃＤＮＡとライゲーションした後、Gigapack II Gold packing extract（ｍｃｒＡ- 、ｍｃｒＢ- 、ｍｍｒ- ；Stratagene社）を用いてパッケージングを行い、大腸菌ＰＬＫ−Ｆ' 株に感染させた。その結果、平均長２．２６ｋｂ、インディペンデントクローン数６．３×１０5 個のｃＤＮＡライブラリーが得られた。
【００３０】
実施例２
発現クローニング
概要
１．２で作製したｃＤＮＡライブラリーを、１０，０００個／プールとして計６３プールに分け、後述の２．１．２〜２．１．３の方法にて各プールのｃＲＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、タンパク質に翻訳させた。この翻訳産物を含む培養上清を、後述の２．２．２の方法によりアッセイ用のマウス骨髄細胞に添加して後述の各アッセイ法に供し、陽性と判断されたプールを選別した。更に、その陽性プールを１０のサブプールに分け、同様にしてｃＲＮＡを調製し、卵母細胞中で発現させ、その活性を測定して陽性プールを選別することを繰り返し、最終的に単一クローンを得た。
すなわち具体的アッセイとしては、１次スクリーニングは後述の２．３．１のＴＲＡＰ染色法にて破骨細胞分化促進活性を判定し、６３プールから陽性プールを３プール選別した。２次スクリーニング以降は、後述の２．３．１のＴＲＡＰ染色法、２．３．２の象牙を用いたｐｉｔ形成法、２．３．３のカルシトニン受容体の検出の、３種類の破骨細胞分化促進活性測定法の全てに陽性反応を示すプールを選別することにし、まず、上述の３プールをそれぞれ１０のサブプール（１０００クローン／プール）に分けて各アッセイを行った。
その結果、陽性反応の強さの順に上位３プールを選び、更にこの３プールをそれぞれ１０のサブプール（２００クローン／プール）に分けて３次スクリーニングを行った。その結果、陽性反応の強さの順に３つの陽性プールを選択し、これを各々１０のサブプール（２４クローン／プール）に分けて、さらに４次スクリーニングを行った。その結果、ＴＲＡＰ染色及びｐｉｔ形成活性の強い順に上位２プール選択し、更にこの２プールを全３６個の個々のクローンに分けて５次スクリーニングを行った。５次スクリーニングの結果、ＴＲＡＰ染色及びｐｉｔ形成活性の強い順に上位３クローンを選別した。この３つのクローンのうちの一つをＯＰＦａ１２と命名した。なおＯＰＦａ１２の各アッセイ結果は、後述の（結果）の項に記した。
【００３１】
２．１ アッセイ用サンプルの調製
２．１．１ ＤＮＡの調製
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに各プールのラムダファージ１×１０4 pfuを感染さ せ、１５ｃｍシャーレにまき、プラークを形成させた。このプレートに１３ｍｌのＳＭ緩衝液を加え、プレートライセートを調製した。このファージライセートにＤＥ５２（ＤＥＡＥセルロース；ワットマン社）を加えてファージＤＮＡ以外を吸着させ、遠心後の上清に再度ＤＥ５２を加え、その上清中のファージＤＮＡを回収した。このＤＮＡをフェノールとフェノール─クロロホルム（１：１）で１回ずつ抽出し、エタノール沈殿にて回収し、ファージＤＮＡとした。調製したＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、１／５０量を１％アガロース電気泳動にて定量した。
【００３２】
２．１．２ ｃＲＮＡの合成
２．１．１で調製した各プールのファージＤＮＡの少なくとも１μｇをプロテイナーゼＫ（Stratagene社）で３７℃１時間処理し、フェノール−クロロホルム処理後、エタノール沈殿により回収することによりテンプレートＤＮＡを調製した。このＤＮＡを用いて、ｍＲＮＡcappingキット（Stratagene社）に従いｃＲ ＮＡを合成した。これをフェノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿に供することによりｃＲＮＡを回収し、１／１０量を１％アガロースゲル電気泳動により定量した。その後、１μｇ／μｌの濃度に調製してマイクロインジェクション用ｃＲＮＡとした。
【００３３】
２．１．３ アフリカツメガエル卵母細胞による発現
体長１０ｃｍ程度のメスのアフリカツメガエルから卵母細胞の卵塊を取り出し、ＭＢＳ（＋Ｃａ2+；８８．０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＫＣｌ、２．４ｍＭ ＮａＳＯ3、０．３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3 ）2 ４Ｈ2 Ｏ、０．４１ｍＭ Ｃａ Ｃｌ2 ４Ｈ2 ０、０. ８２ｍＭ ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 ０、１０μｇ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌニスタチン、１５ｍＭトリス─ＨＣｌ（ｐＨ ７．６））を入れたシャーレに移し、実体顕微鏡下精密用鋏とピンセットで卵母細胞を一つずつ切り放し、ステージＶかＶＩの傷のない生きている細胞を選別した。これらの卵母細胞に１０μｌデジタルマイクロディスペンサー（Drummond社）を用いて、キャピラリーより、卵母細胞１個当たり５０ｎｌのｃＲＮＡを注入した。その後、死んだり傷ついた細胞を除き、２％ＦＣＳを含むＭＢＳにて３日間、２０℃で培養した。その培養上清を遠心し、更に０．２２μｍのフィルターを通し、残査を除くと同時に除菌した。その上清をアッセイ用サンプルとした。
【００３４】
２．２ アッセイ
２．２．１ マウス骨髄細胞の調製
６〜１２週令のマウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ；日本クレア）の大腿骨及び脛骨を無菌的に取り出し、その骨端を切り落とし、両端から１回づつ２６Ｇの針を付けたシリンジで１ｍｌのα−ＭＥＭ培地（１０％牛胎児血清、１００単位/ｍｌペニ シリンＧ、１００μｇ/ｍｌストレプトマイシンを含む）で骨髄細胞を押し出し 、良くピペッティングした後骨残査が沈殿するまで待ち、その上清を回収した。それを更に新鮮な培地で１〜２回洗い、アッセイ用の骨髄細胞を調製した。
【００３５】
２．２．２ 破骨細胞分化形成法
上記の骨髄細胞を１０-8Ｍの活性型ビタミンＤ〔１、２５（ＯＨ）2 Ｄ3〕を 含むα−ＭＥＭ培地中にけん濁させ、２×１０6 個細胞／ｍｌの濃度に調製し、９６穴プレートに１８０μｌと２．１．３で調製したアッセイ用サンプルを２０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ2 下、１または２週間培養した。その間、３−４日間隔で培地の３／４を新しい培地と交換し、新たにアッセイ用サンプルを同量添加した。
【００３６】
２．３ 破骨細胞の同定法
２．３．１ ＴＲＡＰ染色法
破骨細胞のマーカー酵素であるＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ）を基質で染色した。即ち２．２．２の培養骨髄細胞をアセトン─クエン酸緩衝液で固定した後、酒石酸存在下で基質（Naphthol AS ─MXphosphate）と色素（ Fastredviolet LB salt）を３７℃で１時間反応させることにより、染色した（ Endocrinology，122，p1373,(1988)）。
（結果）
ＯＰＦａ１２は、既知の破骨細胞分化形成因子であるＩＬ─１β（５０ｎｇ／ｍｌ）やＬＩＦ（２５Ｕ／ｍｌ）で骨髄細胞を処理し、破骨細胞を分化形成させたポジティブコントロールのＴＲＡＰ染色性と比較して、陽性と判断した。
【００３７】
２．３．２ 象牙を用いたｐｉｔ形成法
象牙より直径６ｍｍ、１ｍｍ厚の象牙質スライスを作製し、それを８０％アルコール中で超音波処理することにより滅菌した。α−ＭＥＭ培地で洗浄した後、各スライスを９６ウエルプレートのウエル底に移し、その上で２．２．２の方法に従って骨髄細胞から破骨細胞を分化誘導した。１または２週間後、象牙質スライス上の破骨細胞を２．３．１のＴＲＡＰ染色法にて染色し、０．２５％トリプシン─０．０２％ＥＤＴＡで一晩処理し、スライス上の細胞をシリコンスクレイパーで削り取った。象牙質スライス上のｐｉｔ（吸収窩）を顕微鏡下で観察し、その数またはｐｉｔあたりのメッシュ数を測定することにより骨髄細胞より分化誘導された細胞の骨吸収活性（骨分解活性）を調べた。
（結果）
ＯＰＦａ１２により分化形成された細胞の象牙質スライス上のｐｉｔ形成数は１００個であり、ポジティブコントロールであるＬＩＦ（２５Ｕ／ｍｌ）の３９個に比較して、活性は同等がそれ以上であることが判明した。
【００３８】
２．３．３ カルシトニン受容体の検出
ＬＡＢ−ＴＥＣチェンバースライドを用いて２．２．２の方法により、骨髄細胞から破骨細胞を分化誘導させた後、細胞に０．２μＣｉ／ｍｌの［125Ｉ］サ ケ・カルシトニン（アマシャム）２００μｌを加え、３７℃で１時間反応させ、チャンバーから反応液を除き、ＰＢＳで３回洗浄して反応を停止した。その後、２．５％グルタールアルデヒドで固定し、２．３．１の方法に従ってＴＲＡＰ染色した。スライドグラスからチャンバーを外し、十分に風乾させた後、暗室でエマルジョン（KodakＮＴＢ−２）にさっと浸し、余分のエマルジョンを除き、暗 箱に入れて４℃で２−７日保存した。その後、定法に従い現像し、スライドを風乾させ顕微鏡下で観察した。
（結果）
ＯＰＦａ１２により形成された細胞のオートラジオグラフィーでは、ＴＲＡＰ陽性の赤褐色に染色された細胞にカルシトニン受容体の存在を示す黒化粒子が重なって観察された。
【００３９】
（結論）
以上３通りの同定法において全てに陽性を示したことから、ＯＰＦａ１２により骨髄細胞から分化誘導された細胞は破骨細胞であり、ＯＰＦａ１２は破骨細胞分化促進活性を有している因子であると、判断した。
【００４０】
実施例３
組換えファージＤＮＡのファージミドＤＮＡへの変換
ＺＡＰ ExpressベクターはインサートＤＮＡをｐＢＫ−ＣＭＶへin vivoexcisionすることでサブクローニングすることができる。ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’大腸菌にＺＡＰ ExpressファージとExAssistヘルパーファージを感染させ ることで、ｐＢＫ−ＣＭＶファージミドを産生させ、元の大腸菌を熱処理することで死滅させ、新たにＸＬＯＬＲ大腸菌に感染させた。これに培地を加え、４５分間培養後、ＬＢプレートにプレーティングし、培養した。
【００４１】
実施例４
プラスミドＤＮＡの調製
陽性コロニーを爪楊枝で拾い２ｍｌのＬＢ（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）で一晩培養後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。このプラスミドＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、１％アガロースゲル中で電気泳動し、ＯＰＦａ１２ｃＤＮＡのベクターへの挿入を確認した。
【００４２】
実施例５
ＯＰＦａ１２ｃＤＮＡの塩基配列決定
実施例５で得られたＯＰＦａ１２ｃＤＮＡの塩基配列の決定は、Ｓａｎｇｅｒらによって開発されたダイデオキシ法によって行った（AutoRead Sequencing kit, Pharmacia Biotech社製) 。
その結果、配列表の配列番号：１に記載の２１０４ｂｐからなるｃＤＮＡが得られ、また５６８アミノ酸からなる配列番号：２のアミノ酸配列が決定された。
【００４３】
塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪの９６年１月現在の各データベースを用いて、ＯＰＦａ１２の全塩基配列と既知の塩基配列とのホモロジー検索を、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法により行った。その結果、ラットγ−ＧＴＰと９０．１％、ヒトγ−ＧＴＰと７９．８％一致していた。更にアミノ酸配列は、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴとＰＩＲの９６年１月現在のデータベースを用いて、ＯＰＦａ１２のアミノ酸配列と既知のアミノ酸配列とのホモロジー検索を、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法により行った。その結果、ラットγ−ＧＴＰと９６％、ヒトγ−ＧＴＰと８６．７％一致していた。これらの結果及び、Gene,167,p233 (1995)に記載の配列との比較より、ＯＰＦａ１２はマウス型γ−ＧＴＰであることが判明した。
以下、本発明においてクローニングされたＯＰＦａ１２を、γ−ＧＴＰと称することとする。
【００４４】
実施例６
γ−ＧＴＰの臓器特異的遺伝子発現のノーザンブロット解析
種々の組織由来のｍＲＮＡ、マウス胚の種々の発生段階のｍＲＮＡ、及び種々のヒト癌細胞株由来のｍＲＮＡが、既にブロティングされたＭＴＮブロットメ ンブレン（クローンテック社）を用いて、またプローブとして先にクローニングされたγ−ＧＴＰｃＤＮＡ全長（約２．１ｋｂｐ）を32Ｐでランダムプライム法にて標識したものを用いて、以下のノーザンブロット解析を行った。
すなわち、上記プローブを５０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド／５×ＳＳＣ／５×デンハルト／１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ／０．０１％（ｗ／ｖ）変性サケ精子ＤＮＡ中でフィルターに固定したＲＮＡに４２℃でハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃中で、次に０．１％ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃中で洗浄した。水気を除いた後、−８０℃で１−３日間オートラジオグラフィーを行った。使用したＸ線フィルムはコダックＳＢ５またはフジＡＩＦＲＸを増感スクリーンの存在下で用いた。
【００４５】
（結果）
図１には、マウスの各組織（２μｇｍＲＮＡ）のノーザンブロットの結果を示す。γ−ＧＴＰのバンドは腎臓にのみ特異的に発現し、その他の組織では全く検出されなかった。この結果は公知のヒト型γ−ＧＴＰの組織分布と一致していた。
図２には、ヒト胎児の各組織（２μｇｍＲＮＡ）のノーザンブロットの結果を示す。その結果、腎臓の他に、肝臓でより強く発現していた。「従来の技術」の項にも記述したように、肝−胆道系疾患やアルコール摂取に際し、肝臓でγ−ＧＴＰが発現誘導されることが知られている。しかし、胎児の肝臓での発現は未だ報告されておらず、本実施例にてはじめて明らかになったことである。
【００４６】
図３には、マウス７日胚から１７日胚まで（２μｇｍＲＮＡ）のノーザンブロトの結果を示す。その結果、７日胚で最大の発現を示し、１１日胚で最小となった後、徐々に発現量が増大していた。
図４には、ヒトの種々の癌細胞株（２μｇｍＲＮＡ）のノーザンブロットの結果を示す。その結果、骨転移し易くまた高カルシウム血症の合併頻度の高い癌細胞として知られている前骨髄性白血病細胞（HL-60）、Burkittsリンパ腫細胞（Raji）、及び肺癌細胞（A549）において発現していた。
以上の結果から、γ−ＧＴＰは発生期の初期から発現し、胎生期では肝臓と腎臓で、また生体では腎臓で特異的に発現していることが分かった。さらに、骨転移し易くまた高カルシウム血症合併頻度が高いと言われている癌細胞においても発現していることが分かった。
【００４７】
実施例７
γ−ＧＴＰの臓器特異的遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ解析
１．１．１に従い種々の細胞や組織から調製した全ＲＮＡ（１μｇ）より、ＲＴ−ＰＣＲキット（PERKIN ELMER社製）に従い、まず２本鎖ＤＮＡを合成し、それをテンプレートにしてＰＣＲ反応を行った。本遺伝子増幅のためのプライマー配列として、５’プライマー（５’−ＡＴＣＡＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧ−３’）および３’プライマー（５’−ＧＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡ−３’）を合成した。これらのプライマーの組み合わせで増幅されるＤＮＡサイズは２２８塩基対である。また、コントロールとしてＧ３ＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）プライマー（５’プライマーが（５’− ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣ−３’）、３’プライマーが（５' −ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’）、増幅されるＤＮＡサイズが９８３塩基対）を用いた。反応組成等は標準的手法に従いＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、熱変性９４℃で１分間、アニーリング６０℃で１分間、鎖伸張反応７２℃で２分間の条件で３０−４０サイクルで反応を行った。反応混合物の１／１０量を１％アガロースゲルで電気泳動し、バンドを確認した。
【００４８】
（結果）
図５に、各組織の全ＲＮＡ１μｇをテンプレートにして行った結果を示す。その結果、γ−ＧＴＰのクローニング源であるＢＷ５１４７細胞（レーン１）、コラーゲン関節炎モデルの炎症関節・骨部位の細胞（レーン４）、そして腎臓（レーン９）で発現していた。これらの結果は、図１のノーザンブロットの結果と矛盾するものではなかった。なお、同一のＲＮＡを用いてコントロールのＧ３ＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲも行い、これを、各ＲＮＡの分解度の指標とした。
【００４９】
実施例８
γ−ＧＴＰｃＤＮＡの哺乳動物培養細胞による発現
ｐＢＫ−ＣＭＶベクターに実施例２で得られたγ−ＧＴＰｃＤＮＡをサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させた。アルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを調製し、２回の超遠心分離法により精製した。この精製ＤＮＡをＣＯＳ−７細胞にLIPOFECTAMINE（GIBCO ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。 その後、細胞を無血清培地で５日間培養し、培養上清を回収してγ−ＧＴＰ培養上清標品とした。
上記培養上清標品の活性は、２．３．１のＴＲＡＰ染色性、２．３．２の象牙質スライスを用いたｐｉｔ形成活性、及び２．３．３のカルシトニン受容体の検出の３種類の同定法で行った。その結果、前記培養上清標品存在下、象牙質スライス上で培養した骨髄細胞は、赤褐色に染色され、ＴＲＡＰ陽性を示した。次に、象牙スライス上のＴＲＡＰ陽性細胞を物理的に削り取った結果、図６（上）に示すようにＴＲＡＰ陽性細胞残渣が残っているものの、ｐｉｔが形成されていた。一方、図６（下）に示すように、ベクターのみを導入した細胞の培養上清を用いて同様の実験を行った場合は、ＴＲＡＰ陽性細胞、ｐｉｔ共に形成されなかった。
【００５０】
図７（上）には、ＯＰＦａ１２ＤＮＡ導入細胞の培養上清存在下で培養した骨髄細胞をＴＲＡＰ染色し、125Ｉ−サーモン・カルシトニン（ホット）を反応させた結果を示す。その結果、カルシトニン受容体の存在を示す黒化粒子が検出された。また、コールドのサーモン・カルシトニンをホットの１０００倍添加した場合、図７（左下）に示すように大量のコールドで希釈され、黒化粒子が消えたことから、カルシトニンとその受容体の結合は特異的であることが確認された。一方、図７（右下）には、ベクターのみを導入した細胞の培養上清を用いて同様の実験を行った結果を示すが、ＴＲＡＰ陰性であり、また黒化粒子も検出されなかった。
以上の結果より、γ−ＧＴＰｃＤＮＡを哺乳動物培養細胞に導入し得られた培養上清は、破骨細胞分化促進活性を有することが明らかとなった。
【００５１】
実施例９
γ―グルタミル基転移触媒活性の測定
γ−ＧＴＰの従来より知られている酵素活性である、γ−グルタミル基の転移触媒活性は、γ−ＧＴ４１９「アスカ・シグマ」キット（SIGMA DIAGNOSTICS)を用いて測定した。即ち、先に調製したγ−ＧＴＰｃＤＮＡ導入細胞の培養上清をＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドとグリシルグリシンを基質として３０℃で反応させ、生じたＬ−γ−グルタミルグリシルグリシンと５−アミノ−２−ニトロ−安息香酸のうち、後者の黄色を４０５ｎｍの吸光度で測定した。反応時間に対する吸光度の増加はγ−ＧＴＰ活性に比例することから、活性を算出した。
その結果、ベクターのみを導入した細胞の培養上清の活性は検出限界以下であったのに対しγ−ＧＴＰＤＮＡ導入細胞の培養上清は、１３Ｕ／Ｌを示した。この結果より、クローニングしたγ−ＧＴＰには、破骨細胞分化促進活性と、従来より知られていたγ−グルタミル基転移触媒活性の両方を有することが確認された。
【００５２】
実施例１０
ラット腎臓由来精製γ−ＧＴＰによる破骨細胞分化促進活性の測定
ラット腎臓由来の精製したγ−ＧＴＰ（Taniguchi N.ら、Biochem.Biophys. Acta, 391, p261 (1995)）を、２．２．１〜２．２．２の破骨細胞分化形成法（以下、骨髄細胞培養系による破骨細胞分化形成法と称す）及び、以下に示す骨髄細胞と骨芽細胞様細胞株との共存培養系による破骨細胞分化形成法の、２種類のアッセイに供した。
すなわち、骨髄細胞と骨芽細胞様細胞株との共存培養系による破骨細胞分化形成法は、以下のようにして行った。まず、２．２．１で調製した骨髄細胞を５×１０-7Ｍの活性型ビタミンＤ｛１，２５（ＯＨ）2Ｄ3｝および１．２５×１０-8Ｍデキサメサゾンを含むα−ＭＥＭ培地中にけん濁させ、２×１０6個細胞／ｍｌの濃度に調製し、９６穴プレートに６０μｌ加えた。一方、骨芽細胞様細胞株であるＳＴ２細胞を骨髄細胞と同じ培地にけん濁させ、４×１０4個細胞／ｍｌの濃度に調製した後、先の骨髄細胞の入った９６穴プレートに１２０μｌ加えた。更に、種々の濃度の精製γ−ＧＴＰを２０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ2下、１週間培養した。その間、３日目に培地の３／４を新しい培地と交換し、新たにアッセイ用サンプルを同量添加した。
これら2種類の破骨細胞分化形成法を施した後、２．３．１のＴＲＡＰ染色法により、ＴＲＡＰ陽性細胞（破骨細胞）数を測定した。
【００５３】
結果を図８に示す。骨髄細胞培養系では、γ−ＧＴＰは酵素活性として９．３Ｕ／ｍｌから９３０Ｕ／ｍｌまでは用量依存的にＴＲＡＰ陽性細胞（破骨細胞）数を増加させた。しかし、９３００Ｕ／ｍｌでは逆に減少したことから、破骨細胞の分化促進活性には至適濃度が存在することが考えられた。ＴＲＡＰ陽性細胞のうち、３核以上の多核巨細胞（多核細胞）数も、９３０Ｕ／ｍｌで最大値を示した。また、骨髄細胞と骨芽細胞様細胞株との共存培養系（共存培養系）では、γ−ＧＴＰは酵素活性として９３００Ｕ／ｍｌまで用量依存的にＴＲＡＰ陽性細胞数もＴＲＡＰ陽性多核細胞数も増加させた。
以上より、γ−ＧＴＰに破骨細胞分化促進活性の存在することが確認された。
【００５４】
実施例１１
抗ラットγ−ＧＴＰ抗体による、ＣＩＡマウスの炎症関節より分離した細胞から破骨細胞への分化の抑制
１１．１ ＣＩＡマウスの作製
Ｅ．Ｄ．Ｔｒｅｎｔｈａｍらの方法（J.Exp., 146, p857 (1977)）に準じた。即ち、酢酸溶液に溶解したウシＩＩ型コラーゲン（コラーゲン研修会）をフロイントの完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混和し、ＤＢＡ／１Ｊマウス（日本チャールスリバー）の尾根部に皮内注射した。３週間後に追加免疫のためフロイントの不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）に混和したウシＩＩ型コラーゲンを、背部皮下に注射した。
【００５５】
１１．２ 炎症関節部位からの細胞の調製
日本骨代謝学会誌、第12巻、188頁（1994）、Arthritis and Rheumatism, 39, S285 (1996)、および平成６年度厚生省リウマチ調査研究事業研究報告書、130頁に記載の方法に準じた。即ち、コラーゲン関節炎を発症した部位の組織をディスパーゼ（合同酒精）で処理し、浮遊細胞を得た。この細胞を５％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地で３×１０5個細胞／ｍｌの濃度に調製した。
１１．３ 破骨細胞分化形成阻害法
上記で調製した細胞を、ヒドロキシアパタイトでコーティングしたプレート（商品名：Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｃ Ｍｕｌｔｉ−Ｔｅｓｔ：Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｘ Ｉｎｃ．）に１８０μｌ加え、更に、先の精製抗ラットγ-ＧＴＰ抗体を終濃度０〜２００μｇ／ｍｌになるように２０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ2下で５日間培養後、形成されたｐｉｔ数を計測した。その際、ＢＳＡ添加時のｐｉｔ数を１００％として抗体添加時のピット数を相対活性として表した。
【００５６】
１１．４ 結果
結果を図９に示す。非特異的イムノグロブリン（２２０μｇ／ｍｌ）で３０％程度活性が阻害されたが、抗ラットγ−ＧＴＰ抗体は用量依存的にｐｉｔ形成活性を阻害度し、２００μｇ／ｍｌで８６％の活性を阻害した。以上より、抗ラットγ−ＧＴＰ抗体は、破骨細胞への分化を抑制することが明らかとなった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、γ−ＧＴＰまたはその活性を保持する誘導体を有効成分として含有する破骨細胞分化促進剤、あるいは該γ−ＧＴＰ等を用いる破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法、さらには該γ−ＧＴＰ等に対する抗体からなる破骨細胞分化促進活性阻害剤、が提供される。
【００５８】
【配列表】
【００５９】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マウス各組織におけるγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により調べた結果の電気泳動写真である。
【図２】図２は、ヒト胎児各組織におけるγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により調べた結果の電気泳動写真である。
【図３】図３は、マウス７日胚から１７日胚までにおけるγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により調べた結果の電気泳動写真である。
【図４】図４は、ヒトの各癌細胞株におけるγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により調べた結果の電気泳動写真である。
【図５】図５は、骨、炎症部位を含む各組織および細胞におけるγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ＲＴ−ＰＣＲ解析により調べた結果の電気泳動写真である。
【図６】図６（上）は、γ−ＧＴＰｃＤＮＡをＣＯＳ細胞で発現させた培養上清中の活性を、ＴＲＡＰ染色及びｐｉｔ形成法により調べた結果の顕微鏡写真である。図６（下）は、ベクターを導入して同様の実験を行った結果の顕微鏡写真である。
【図７】図７（上）は、γ−ＧＴＰｃＤＮＡをＣＯＳ細胞で発現させた培養上清中の活性を、125Ｉカルシトニンの結合（図中、矢印で示す）により示した結果の顕微鏡写真である。図７（左下）は、大過剰のコールドカルシトニンを加えたことで、125Ｉカルシトニンの結合が消失した結果を示した顕微鏡写真である。図７（右下）は、ベクターを導入して同様の実験を行った結果を示した顕微鏡写真である。
【図８】図８は、ラット腎臓から精製したγ−ＧＴＰの破骨細胞分化促進活性を調べた結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＣＩＡマウスの炎症関節より分離した細胞の破骨細胞への分化を、抗ラットγ−ＧＴＰ抗体が抑制することを示したグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、γ−グルタミルトランスペプチターゼ（以下、γ−ＧＴＰと略す）の新たな用途に関する。さらに詳しくは、γ−ＧＴＰまたはその活性を保持する誘導体を有効成分として含有する破骨細胞分化促進剤、または該γ−ＧＴＰ等を用いる破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法、さらには該γ−ＧＴＰ等に対する抗体からなる破骨細胞分化促進活性阻害剤、に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１．破骨細胞分化促進因子
骨組織は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とによって基本的形状を変えることなく、新生骨に置換される。この過程は骨リモデリング（骨再造形）と呼ばれ、生体の機能維持に重要な役割を果たしている。
骨形成の中心的な役割を果たしている骨芽細胞は、間葉系由来の未分化細胞から分化し、骨基質を形成する。
一方、骨吸収の中心的な役割を果たしている破骨細胞は骨髄細胞に由来し、骨芽細胞との細胞間接触を介して分化することにより形成される。成熟破骨細胞は多核で増殖性の乏しい巨細胞であり、カルシトニン受容体や酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を発現する。また、骨や象牙質等の石灰化組織を吸収する活性を有している。
これら破骨細胞と骨芽細胞による骨リモデリングのバランスは、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成の繰り返しにより平衡に保たれている。しかし、ひとたびこの平衡バランスが崩れると骨組織は異常をきたし、種々の疾患を呈することになる。
【０００３】
骨リモデリングの異常により起こる代表的な疾患として、骨粗鬆症が知られている。骨粗鬆症は、骨リモデリングの代謝回転速度からみて、閉経早期あるいは甲状腺機能亢進症などにおいて認められる高回転型骨粗鬆症と、老人性、ステロイド性、糖尿病性骨粗鬆症において認められる低回転型骨粗鬆症に分類されている。それ以外では、例えば癌の骨転移に伴う高カルシウム血症や骨破壊、慢性関節リウマチに伴う骨破壊等の疾患が、上記骨リモデリングの異常により起こる疾患として知られている。これら癌の骨転移に伴う高カルシウム血症や骨破壊、あるいは慢性関節リウマチに伴う骨破壊は、破骨細胞の機能が異常に亢進した結果生じる疾患である。
【０００４】
以上のような疾患に対する有効な治療薬の探索が種々なされているが、未だ決定的な治療薬は見出されていない。アプローチの一つとして、骨髄細胞から破骨細胞への分化を促進する因子、あるいはその阻害剤が、上記疾患に対する治療薬となることが考えられる。すなわち破骨細胞の分化促進因子は、上述の如き低回転型骨粗鬆症においてみられる骨リモデリングの低回転を正常に戻すことが考えられるため（J.Bone Miner Res.,7, p65 (1992) ）、この低回転型骨粗鬆症の有効な治療薬となることが考えられる。一方、破骨細胞分化促進因子の阻害剤は、上述の如き高回転型骨粗鬆症における骨リモデリングの高回転を正常に戻すことが考えられるため（Am.J.Med.Sci., 305(1), p40(1993)及び Mebio.,11(2), p24 (1994))、この高回転型骨粗鬆症の有効な治療薬となることが考えられる。また、前記の如き破骨細胞の機能の亢進に伴う癌患者の骨破壊や、慢性間接リウマチ患者の骨破壊等にも、この破骨細胞分化促進因子の阻害剤が有効に働くことが考えられる。
破骨細胞分化促進因子は骨吸収因子とも呼ばれ、これまでに活性型のビタミンＤ３ 、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インターロイキン１、プロスタグランディン等が知られている。しかしこれらの因子は種々の問題点があり、未だ治療薬とはなっておらず、新たな破骨細胞分化促進因子の出現が望まれている。
【０００５】
２．γ−ＧＴＰ
γ−ＧＴＰは、γーグルタミルペプチドを加水分解すると同時に、そのγーグルタミル基を他のペプチドやアミノ酸に転移する反応を触媒する膜結合型酵素である。
γ−ＧＴＰは腎、膵、肝の順に活性が高く、特に腎臓では近位尿細管、肝臓では毛細胆管、膵臓では膵腺房や膵管系に広く存在している。
γ−ＧＴＰの生理的機能として、物質輸送能の高い臓器の細胞膜に結合した膜結合型酵素であるという局在性と、上述の如き酵素の反応特性から、γ−グルタミルサイクルの一員として細胞の外側から細胞内へ共役的にアミノ酸を輸送する機能を有してるという仮説が提唱されている（ Science,180, p33(1973) ）。しかし、この仮説を否定する報告も種々なされている（代謝、16,(3) (1979)、Eur.J.Biochem.,78,p609(1977)、Biochem.Biophys.Res.Commun.,65,p68(1975)、およびBiochem.Biophys.Res.Commun.,73,p 997(1976))。
【０００６】
また、γ−ＧＴＰの別の生理的機能として、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）のサルベージに関与していることが推測されている。すなわち、生体には非常に多くのグルタチオン（ＧＳＨ）が存在し、生体内酸化反応に対応して酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）として血中に放出されていることが知られている（E.,Clin.Chim.Acta,7,p755(1969)）。このＧＳＳＧもＧＳＨと同様に本酵素の基質となることが知られている。アミノ酸と異なり、このものの細胞内への輸送速度は非常に遅いため、腎近位尿細管のγ−ＧＴＰによりＧＳＨを分解し、アミノ酸にして細胞内に取り込み、元のＧＳＨを合成することで一定濃度を維持している。もし腎近位尿細管に本酵素がなく、構成アミノ酸への水解が起こらなければ、その大部分は尿中に失われてしまう。そのため、本酵素欠損症の患者尿中には大量のＧＳＳＧが見出されている（グルタチオン尿症）。これらの知見に基づき、ＧＳＳＧのサルベージが本酵素の生理機能の一つと推測されている。
【０００７】
また、γ−ＧＴＰの用途としては、肝疾患の診断薬としての用途が知られている。すなわち、肝細胞のγ−ＧＴＰは、大部分がミクロソーム分画に局在し、血中には肝由来の可溶型γ−ＧＴＰが僅かに存在している。γ−ＧＴＰは、種々の肝胆道疾患に伴い血中濃度が上昇するため、これら肝胆道疾患の有効な診断薬となっている。その中でも診断的意義の最も高い疾患が、胆汁うっ滞である。特に肝内性、肝外性うっ滞時にはアルカリ性ホスファターゼ、ロイシンアミノペプチダーゼなどの胆道系酵素とともに、著しくγ−ＧＴＰの血中濃度が上昇する。具体的な疾患としては、胆汁うっ滞を起こす薬剤性肝炎や急性アルコール性肝炎などが挙げられる。また部分的な胆汁うっ滞である原発性、転移性肝癌などの限局性肝病変及びアルコール常習者の場合では、γ−ＧＴＰは中等度の上昇を示す。急性肝炎ではアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）などのトランスアミナーゼの上昇に比し、γ−ＧＴＰの上昇は軽度である。また、慢性肝炎、肝硬変でも軽度の上昇にとどまる。このようにγ−ＧＴＰは、種々の肝疾患において特異性の高い鋭敏な診断薬として日常的に利用されている。
【０００８】
以上のように、γ−ＧＴＰの種々の生物学的機能が示唆され、また、肝疾患における診断薬としての用途が知られている。しかし該γ−ＧＴＰが、前記破骨細胞の分化促進に関与しているか否かについては、何ら明らかにされていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、γ−ＧＴＰの新たな生理機能を見出すことにより、γ−ＧＴＰまたはその活性を保持する誘導体の、新たな用途を提供することにある。すなわち、γ−ＧＴＰの破骨細胞分化促進因子としての機能を見出すことにより、γ−ＧＴＰまたはその活性を保持する誘導体を有効成分として含有する破骨細胞分化促進剤、あるいは該γ−ＧＴＰ等を用いる破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法、さらには該γ−ＧＴＰ等に対する抗体からなる破骨細胞分化促進活性阻害剤、を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、骨転移細胞であるＢＷ５１４７細胞から発現クローニング法により破骨細胞分化促進因子を探索したところ、（１）破骨細胞のマーカー酵素であるＴＲＡＰ染色性、（２）カルシトニン受容体の存在、（３）象牙の分解活性の、公知の３つの特性を有する「破骨細胞」へと分化形成させる因子を発見することに成功した。我々は、このタンパク性因子をＯＰＦａ１２と命名してさらに解析を進めたところ、驚くべきことに本発明者らがクローニングしたＯＰＦａ１２は、γ−ＧＴＰと同一物質であることが判明した。すなわち、現在まで細胞内へのアミノ酸の輸送、あるいはＧＳＳＧのサルベージといった生体内機能しか知られていなかったγ−ＧＴＰが、破骨細胞の分化促進活性という新規な機能を有することを発見し、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち本発明の要旨は、（１） γ−ＧＴＰ、または破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体、を有効成分として含有する、破骨細胞分化促進剤、（２） γ−ＧＴＰまたはγ−ＧＴＰ誘導体を用いることを特徴とする、破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法、（３）γ−ＧＴＰまたはγ−ＧＴＰ誘導体に対する抗体であって、γ−ＧＴＰまたはγ−ＧＴＰ誘導体の破骨細胞分化促進活性を阻害する機能を有する抗体からなる、破骨細胞分化促進活性阻害剤、（４） 前記（３）記載の破骨細胞分化促進活性阻害剤よりなる、高回転型骨粗鬆症、癌の骨転移に伴う高カルシウム血症又は骨破壊、慢性関節リウマチに伴う骨破壊、あるいは慢性肝疾患に伴う二次性骨減少症、に対する治療薬、並びに（５） 前記（１）記載の破骨細胞分化促進剤よりなる、低回転型骨粗鬆症に対する治療薬、に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明においてγ−ＧＴＰとは、全ての脊椎動物のγ−ＧＴＰを含むものである。既に、ヒト(Gene,73, p1 (1988)）、マウス(Gene,167, p233(1995))、ラット(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83, p937(1986)）等、脊椎動物のγ−ＧＴＰのｃＤＮＡがクローニングされている。そして、マウスとラットγ−ＧＴＰでは約９０％のホモロジーを、またヒトとラットγ−ＧＴＰでは約８０％のホモロジーを有しており、種間で非常に高いホモロジーを有することが分かっている。従って、前記文献等において開示された塩基配列よりγ−ＧＴＰ特異的なプライマーあるいはプローブを作製し、該プライマーあるいはプローブを用いて脊椎動物の種々のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明のγ−ＧＴＰを容易にクローニングすることができる。これらクローニングの方法は、例えばMolecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等に詳しく述べられており、具体的には、ハイブリダイゼーションを用いる方法、あるいはＰＣＲを用いる方法等が挙げられる。
【００１３】
また、クローニングされたｃＤＮＡの発現ベクターへの挿入、および該発現ベクターの原核性生物細胞または真核性生物細胞への導入は、いずれも前記Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等に従い、当業者ならば容易に行える状況にある。さらに、上記発現ベクター導入細胞の培養上清中に産生されたγ−ＧＴＰは、亜鉛キレートアガロース、コンカナバリンＡアガロース、セファデックスＧ−１５０等を用いる公知の方法等によって、容易に精製することができる。
【００１４】
本発明において「破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体（以下単に、活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体、と略することもある）」とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質あるいはペプチドや、生体内に存在するアレル変異体等のうち、破骨細胞分化促進活性を有するものを指す。該誘導体をコードするＤＮＡは、例えば特異的突然変異誘発 ( Methods in Enzymology, 100, p468 (1983)) やＰＣＲ法(Molecular Cloning 2nd Edt. 15章、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))等の手法により、当業者ならば容易に作製することができる。また、このようにして作製されたＤＮＡからタンパク質への発現は、前記γ−ＧＴＰと同様にして行うことができる。
【００１５】
またここで「破骨細胞分化促進活性」は、例えば、骨髄細胞に対してγ−ＧＴＰの種々の誘導体を作用させた後、破骨細胞の公知の作用−すなわち１）ＴＲＡＰ染色性、２）カルシトニン受容体の存在、３）象牙の分解活性、を調べることにより、容易に測定することができる。具体的には以下のようにして測定することができる。
【００１６】
まずアッセイ用の細胞であるが、破骨細胞は、骨髄系細胞から分化・誘導される細胞であると考えられているため、アッセイ用細胞として、この骨髄系細胞を使用する。具体的には、たとえば 6〜12週令のマウスの大腿骨および脛骨の骨端を切り落としたものをピペッティングし、沈殿した骨残渣を除いた上清部分を骨髄細胞として使用することができる。この調製された骨髄細胞を、活性型ビタミンＤを含む培養液中に懸濁させ、適当な濃度(例えば2×106個細胞/ml )に調製してプレート(例えば96穴プレート)上にまき、そこへ、被験物質であるγ−ＧＴＰの種々の誘導体を添加した後、１）ＴＲＡＰ染色法、２）象牙を用いたｐｉｔ形成法、３）カルシトニン受容体の検出法、の、破骨細胞の公知の３つの作用を調べ、これら１）〜３）の全てにポジティブであった場合は、該γ−ＧＴＰの誘導体に、破骨細胞分化促進活性が存すると判断する。ここで１）のＴＲＡＰ染色は、例えばEndocrinology, 122, p1373(1988)等に従い、まず上記の如く被験物質で処理された骨髄細胞をアセトン−クエン酸緩衝液で固定した後、酒石酸存在下で基質（Naphthol AS-Mxphosphate)と色素（Fastredviolet LB salt）を３７℃で１時間程度反応させることにより、検出することができる。また２）のｐｉｔ形成測定は、例えば、あらかじめ直径6mm、1mm厚程度の象牙質スライスを96穴ウエルプレートのウエル底に敷いたものを用意し、このウエル上で、上記の如き被験物質による骨髄細胞の処理を行い、適当な期間の後、象牙質スライス上の細胞を先のＴＲＡＰ染色し、0.25％トリプシン−0.02％ＥＤＴＡで一晩処理し、スライス上の細胞をシリコンスクレイパーで削り取った後、象牙質スライス上のｐｉｔ（吸収窩）を顕微鏡下で観察し、その数を測定することにより測定することができる。また、３）のカルシトニン受容体の検出は、例えばLAB-TECチェンバースライド上で被験物質による処理を行った細胞に対し、[125I］サケ・カルシトニンを加えて37℃で反応させた後、先のＴＲＡＰ染色を行い、その後スライドをエマルジョン（KODAK NTB-2）に浸し、暗箱中４℃で2-7日保存し、その後現像して顕微鏡下で観察することにより、検出することができる。
以上のような破骨細胞分化促進活性の測定法に種々のγ−ＧＴＰの誘導体を供することにより、上記の如き活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体を、容易に選別することができる。
【００１７】
本発明のγ−ＧＴＰまたは活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体は、破骨細胞分化促進活性を有する因子である。従ってこれらの物質を有効成分として含有する「破骨細胞分化促進剤」は、「従来の技術」の項にも記載した如く、老人性、ステロイド性、糖尿病性骨粗鬆症において認められる低回転型骨粗鬆症に対する有効な治療薬となるものである。
これら破骨細胞分化促進剤の患者への投与方法としては、静脈注射による投与が好ましいが、経口投与、坐薬としての投与、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与なども考えられる。また投与量は、一日量 0.0001 〜100mg 程度を症状が改善されるまで投与することが可能である。
【００１８】
本発明のγ−ＧＴＰまたは活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体はまた、破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニングのためにも使用できる。ここで、「破骨細胞分化促進活性阻害剤」とは、本発明のγ−ＧＴＰ等の有する破骨細胞分化促進活性を阻害する薬剤を指す。そして「破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法」は、先に述べた破骨細胞分化促進活性の測定系に、被験物質である阻害剤候補物質を添加することによって実施することができる。
【００１９】
例えば上記の破骨細胞分化促進活性測定法のうち、「２）象牙を用いたｐｉｔ形成法」により阻害剤のスクリーニングを行う際は、まず前記の如く象牙質スライス上で、マウス骨髄細胞に対し、γ−ＧＴＰと阻害剤候補物質とを添加、作用させる。その際、阻害剤候補物質に阻害作用があれば、象牙質に吸収窩（ｐｉｔ）が形成されない。この吸収窩の形成を指標に、容易に阻害剤をスクリーニングすることができる。
以上のような、γ−ＧＴＰを用いた破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法は、本発明においてγ−ＧＴＰの新たな生理機能を見出したことに伴って、初めて可能となったものである。
【００２０】
本発明において「破骨細胞分化促進活性阻害剤」とは、上記スクリーニング方法により見出されるものであり、前記もしたように、本発明のγ−ＧＴＰの有する破骨細胞分化促進活性を阻害する薬剤を意味する。このような破骨細胞分化促進活性阻害剤は、「従来の技術」にも記載したように、閉経早期あるいは甲状腺機能亢進症などにおいて認められる高回転型骨粗鬆症に対する治療薬、また癌の骨転移に伴う高カルシウム血症や骨破壊、あるいは慢性関節リウマチに伴う骨破壊等の疾患に対する有効な治療薬となるものである。
なお後述の実施例に記載の如く、本発明のγ−ＧＴＰはコラーゲン関節炎モデルの炎症部位で発現しており、またγ−ＧＴＰに対する抗体は、コラーゲン関節炎マウスの炎症関節部位より分離した細胞から破骨細胞への分化誘導を、抑制することが示された。これらの結果は、γ−ＧＴＰの阻害剤が、上記慢性関節リウマチに伴う骨破壊に対する有用な治療薬になることを裏付けるものである。さらに、本発明のγ−ＧＴＰは、骨転移し易くまた高カルシウム血症の合併頻度の高い癌細胞として知られている前骨髄性白血病細胞、Burkittsリンパ腫細胞、あるいは肺癌細胞等において高発現していることが示された。これらの結果は、γ−ＧＴＰの阻害剤が、上記癌の骨転移に伴う高カルシウム血症や骨破壊に対する有用な治療薬となることを裏付けるものである。
【００２１】
さらに、上記疾患以外にも、本発明の破骨細胞分化促進活性阻害剤は、慢性肝疾患に伴う二次性骨減少症の有効な治療薬となることが考えられる。
すなわち近年、大阪府立病院消化器内科グループの調査において、慢性肝疾患の二次性（肝性）骨減少症の頻度とその病態についての解析が行われており（肝臓 36巻, 2 号,1：p67,(1995))、これによると、ＤＸＡ法で骨塩量を測定するとともに骨代謝のパラメーターを生化学的並びに内分泌学的に検討した結果、慢性肝疾患では健常対照群に比して二次的な骨減少症の頻度が有意に高く、しかも、肝硬変に至る以前の慢性肝炎の時期に肝性骨減少症が発症しているという結果が得られた。さらに、慢性肝疾患において、骨減少症合併群は非合併群に比べてγ−ＧＴＰと総胆汁酸量が有意な高値を示したことも報告された。
このように、上記慢性肝疾患における二次性骨減少症においてγ−ＧＴＰが有意な高値を示したことが報告されたが、これら二次性骨減少症とγ−ＧＴＰとの関係については、何ら示されていない。
本発明においては、γ−ＧＴＰが破骨細胞分化促進活性を有することを、新たに見出した。この新たな発見と、上記慢性肝疾患における二次的骨減少症においてγ−ＧＴＰが有意に高値であったという報告とを併せ考慮すると、γ−ＧＴＰの有する破骨細胞分化促進活性が、この二次的骨減少症の原因となっていることが考えられる。従って、γ−ＧＴＰに対する阻害剤は、この二次的骨減少症の有効な治療薬になると考えられる。
このような本発明の破骨細胞分化促進活性阻害剤の患者への投与方法としては、前記破骨細胞分化促進剤と同様の投与法が考えられる。また投与量は、一日量 0.0001 〜100mg 程度を症状が改善されるまで投与することが可能である。
【００２２】
本発明において「γ−ＧＴＰのペプチド断片、または破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体のペプチド断片」とは、具体的には、γ−ＧＴＰまたは活性を有する誘導体の、十数〜数十のアミノ酸配列からなるペプチドを指し、好ましくは10〜20個程度のアミノ酸配列からなるペプチドを、さらに好ましくはγ−ＧＴＰのエピトープ領域を形成する10〜20個程度のアミノ酸配列からなるペプチドを指す。該エピトープ領域のアミノ酸配列は、特開平3-4782等に記載の方法により推定することが可能である。該ペプチドは、10〜20個程度の短いものであればペプチド合成装置により合成することができるし、長いものであれば通常の遺伝子工学的手法により（たとえば制限酵素処理等により）調製されたＤＮＡを、上述の動物細胞等により発現させることにより、得ることができる。
これら作製されたペプチド断片を、上記破骨細胞の分化促進活性阻害剤のスクリーニングに供することにより、該阻害活性を有するペプチド断片を、容易に選び出すことができる。
【００２３】
本発明において「γ−ＧＴＰに対する抗体、または破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体に対する抗体」は、例えば新細胞工学実験プロトコールp210秀潤社(1993)に記載された方法を用いてウサギ等を免疫することにより、容易に作製することができる。また、例えば分子生物学研究のためのタンパク実験法第4章 羊土社（1994）に述べられている手法を用いることにより、容易にモノクローナル抗体を作製することもできる。
上述のように、該γ−ＧＴＰの抗体は、コラーゲン関節炎マウスの炎症関節より分離した細胞から破骨細胞への分化を抑制することが明らかとなった。従って、このようなγ−ＧＴＰの抗体は、破骨細胞分化促進活性の有効な阻害剤となるものである。また、γ−ＧＴＰの種々の抗体のうち、いかなる抗体が破骨細胞分化促進活性阻害効果を有するかについては、上記破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法にこれら抗体を供することにより、容易に見出すことができる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明の一例として実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
マウスｃＤＮＡライブラリーの構築
１．１ マウスＢＷ５１４７細胞からのｍＲＮＡの単離
１．１．１ 全ＲＮＡの単離
マウスＢＷ５１４７細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８８）１×１０8個をＡ ＧＰＣ法（acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform method；実験医学 9, 15, p99 (1991)）に従い全ＲＮＡを分離した。即ち、まず、細胞のペレットに４Ｍのグアニジンイソチオシアネート１０ｍｌを加え、直ちに激しく振とうし、その溶液を１８Ｇニードルにより５往復通過させることでＤＮＡを部分剪断した。この溶液に２Ｍ酢酸ナトリウム１ｍｌ、水飽和フェノール１０ｍｌ及びクロロホルム−イソアミルアルコール（４９：１）２ｍｌを順次加え、添加ごとに混和した。その後激しく振とうし、１５分間氷冷した後、４℃で１０，０００ｇ、２０分間遠心した。その水層を分取し、等量のイソプロパノールを加えて良く混和した。これを−２０℃に１時間置いた後、４℃で１０，０００ｇ、１０分間遠心した。遠心後、ＲＮＡの沈殿に４Ｍグアニジンチオシアネート３ｍｌを加えて完全に溶解させ、等量のイソプロパノールを加え、−２０℃で１時間放置した。その後、４℃で１０，０００ｇ、１５分間遠心した後、上清を捨て、ＲＮＡの沈殿を７５％エタノールで洗浄することにより全ＲＮＡを得た。
【００２６】
１．１．２ ｍＲＮＡの単離
上記の方法を数回繰り返すことで全ＲＮＡを１５ｍｇ集め、容離緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳ）５ｍｌに溶解し、６５℃で２分間加熱し、直ちに室温まで急冷した。５ＭＮａＣｌを０．５５ｍｌ添加後、その溶液を洗浄緩衝液（０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳ）で平衡化したオリゴｄＴセルロース（タイプ７、ファルマシアバイオテク）０．５ｇのカラムに添加し、通過液をさらに２回、カラムに添加することによりｍＲＮＡをカラムに結合させた。カラムを洗浄緩衝液１５ｍｌで洗浄した後、結合したＲＮＡを容離緩衝液４ｍｌで溶出した。溶出液を６５℃で２分間加熱し、その後冷却し、０．５ＭＮａＣｌに調節し、再平衡カラムに再度添加して、同様に溶出操作を行った。その溶出液からエタノール沈殿によりｍＲＮＡを回収し、７５％エタノールで洗浄した。
【００２７】
１．１．３ ショ糖密度勾配遠心によるｍＲＮＡの分画
ジエチルピロカーボネイトで処理した密度勾配フラクショネータ（日立；ＤＧＦ−Ｕ）と遠心チューブ、２種類の濃度のＲＮａｓｅフリーのショ糖溶液（５％と２０％（ｗ／ｖ）ショ糖）、０．１ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳを用意し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１Ｔｉ用チューブに密度勾配フラクショネータでショ糖勾配を作り、２時間以上室温に放置して、勾配の不連続性をなくした。次に、ｍＲＮＡを２００μｌのＴＥ溶液（９９％ジメチルスルホキサイド、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ）に溶解し、３７℃で５分間処理し、４００μｌの５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳを加えて６５℃で１０分間熱処理をすることにより、その非特異的な会合を解離させた。その後急冷し、ショ糖密度勾配にのせ、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１Ｔｉローターで２５℃、２０，０００ｒｐｍ、１４時間遠心を行った。遠心後、チューブより０．５ｍｌずつ密度勾配フラクショネータで分画し、エタノール沈殿した。ｍＲＮＡの沈殿は最低３回、７５％エタノールで洗浄した。
【００２８】
１．１．４ ｍＲＮＡの同定
５０画分に分画したｍＲＮＡは、その一部を後述の２．１．３の方法に従いアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、タンパク質に翻訳させた。この翻訳産物を含む培養上清を、後述の２．２．２の方法によりアッセイ用のマウス骨髄細胞に添加して培養した後、２．３．１のＴＲＡＰ染色法により、破骨細胞が分化形成されたか否か（すなわち、どのｍＲＮＡ画分中に破骨細胞分化促進活性を有する因子が含まれているか）を同定した。その結果、活性のピークは、２７番目の分画と３２番目の画分に存在していた。
【００２９】
１．２ ｃＤＮＡライブラリーの作製
活性のピーク画分の２７番目から３３番目を活性画分として集め、この画分に対するｃＤＮＡライブラリーを、Ｇｕｂｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ法（Gene, 25, p263 (1983）) の変法にて調製した。即ち、この活性画分のｍＲＮＡ２μｇをもとに、ＸｈｏＩサイトを持つオリゴｄＴプライマーを用いて、Ｍ−ＭｕＬＶの逆転写酵素によりファーストストランドを合成した。続いて DNA Polymerase I によりセカンドストランドを合成し、ＥｃｏＲＩアダプターとのライゲーションおよびＸｈｏＩ消化を行った。その後、アダプターとプライマーをゲル濾過（Sephacryl Spin Column；ファルマシア社）により除いた。以上のｃＤＮＡ合成ステ ップはStratagene社のＺＡＰｃＤＮＡ合成キットを用い、逆転写酵素はＢＲＬ社のスーパースクリプトＩＩを用いて行った。
次に、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ切断済みＺＡＰ ＥｘｐｒｅｓｓTMベクターを先に作製したｃＤＮＡとライゲーションした後、Gigapack II Gold packing extract（ｍｃｒＡ- 、ｍｃｒＢ- 、ｍｍｒ- ；Stratagene社）を用いてパッケージングを行い、大腸菌ＰＬＫ−Ｆ' 株に感染させた。その結果、平均長２．２６ｋｂ、インディペンデントクローン数６．３×１０5 個のｃＤＮＡライブラリーが得られた。
【００３０】
実施例２
発現クローニング
概要
１．２で作製したｃＤＮＡライブラリーを、１０，０００個／プールとして計６３プールに分け、後述の２．１．２〜２．１．３の方法にて各プールのｃＲＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、タンパク質に翻訳させた。この翻訳産物を含む培養上清を、後述の２．２．２の方法によりアッセイ用のマウス骨髄細胞に添加して後述の各アッセイ法に供し、陽性と判断されたプールを選別した。更に、その陽性プールを１０のサブプールに分け、同様にしてｃＲＮＡを調製し、卵母細胞中で発現させ、その活性を測定して陽性プールを選別することを繰り返し、最終的に単一クローンを得た。
すなわち具体的アッセイとしては、１次スクリーニングは後述の２．３．１のＴＲＡＰ染色法にて破骨細胞分化促進活性を判定し、６３プールから陽性プールを３プール選別した。２次スクリーニング以降は、後述の２．３．１のＴＲＡＰ染色法、２．３．２の象牙を用いたｐｉｔ形成法、２．３．３のカルシトニン受容体の検出の、３種類の破骨細胞分化促進活性測定法の全てに陽性反応を示すプールを選別することにし、まず、上述の３プールをそれぞれ１０のサブプール（１０００クローン／プール）に分けて各アッセイを行った。
その結果、陽性反応の強さの順に上位３プールを選び、更にこの３プールをそれぞれ１０のサブプール（２００クローン／プール）に分けて３次スクリーニングを行った。その結果、陽性反応の強さの順に３つの陽性プールを選択し、これを各々１０のサブプール（２４クローン／プール）に分けて、さらに４次スクリーニングを行った。その結果、ＴＲＡＰ染色及びｐｉｔ形成活性の強い順に上位２プール選択し、更にこの２プールを全３６個の個々のクローンに分けて５次スクリーニングを行った。５次スクリーニングの結果、ＴＲＡＰ染色及びｐｉｔ形成活性の強い順に上位３クローンを選別した。この３つのクローンのうちの一つをＯＰＦａ１２と命名した。なおＯＰＦａ１２の各アッセイ結果は、後述の（結果）の項に記した。
【００３１】
２．１ アッセイ用サンプルの調製
２．１．１ ＤＮＡの調製
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに各プールのラムダファージ１×１０4 pfuを感染さ せ、１５ｃｍシャーレにまき、プラークを形成させた。このプレートに１３ｍｌのＳＭ緩衝液を加え、プレートライセートを調製した。このファージライセートにＤＥ５２（ＤＥＡＥセルロース；ワットマン社）を加えてファージＤＮＡ以外を吸着させ、遠心後の上清に再度ＤＥ５２を加え、その上清中のファージＤＮＡを回収した。このＤＮＡをフェノールとフェノール─クロロホルム（１：１）で１回ずつ抽出し、エタノール沈殿にて回収し、ファージＤＮＡとした。調製したＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断し、１／５０量を１％アガロース電気泳動にて定量した。
【００３２】
２．１．２ ｃＲＮＡの合成
２．１．１で調製した各プールのファージＤＮＡの少なくとも１μｇをプロテイナーゼＫ（Stratagene社）で３７℃１時間処理し、フェノール−クロロホルム処理後、エタノール沈殿により回収することによりテンプレートＤＮＡを調製した。このＤＮＡを用いて、ｍＲＮＡcappingキット（Stratagene社）に従いｃＲ ＮＡを合成した。これをフェノール−クロロホルム処理、エタノール沈殿に供することによりｃＲＮＡを回収し、１／１０量を１％アガロースゲル電気泳動により定量した。その後、１μｇ／μｌの濃度に調製してマイクロインジェクション用ｃＲＮＡとした。
【００３３】
２．１．３ アフリカツメガエル卵母細胞による発現
体長１０ｃｍ程度のメスのアフリカツメガエルから卵母細胞の卵塊を取り出し、ＭＢＳ（＋Ｃａ2+；８８．０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＫＣｌ、２．４ｍＭ ＮａＳＯ3、０．３ｍＭ Ｃａ（ＮＯ3 ）2 ４Ｈ2 Ｏ、０．４１ｍＭ Ｃａ Ｃｌ2 ４Ｈ2 ０、０. ８２ｍＭ ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 ０、１０μｇ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、５０Ｕ／ｍｌニスタチン、１５ｍＭトリス─ＨＣｌ（ｐＨ ７．６））を入れたシャーレに移し、実体顕微鏡下精密用鋏とピンセットで卵母細胞を一つずつ切り放し、ステージＶかＶＩの傷のない生きている細胞を選別した。これらの卵母細胞に１０μｌデジタルマイクロディスペンサー（Drummond社）を用いて、キャピラリーより、卵母細胞１個当たり５０ｎｌのｃＲＮＡを注入した。その後、死んだり傷ついた細胞を除き、２％ＦＣＳを含むＭＢＳにて３日間、２０℃で培養した。その培養上清を遠心し、更に０．２２μｍのフィルターを通し、残査を除くと同時に除菌した。その上清をアッセイ用サンプルとした。
【００３４】
２．２ アッセイ
２．２．１ マウス骨髄細胞の調製
６〜１２週令のマウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ；日本クレア）の大腿骨及び脛骨を無菌的に取り出し、その骨端を切り落とし、両端から１回づつ２６Ｇの針を付けたシリンジで１ｍｌのα−ＭＥＭ培地（１０％牛胎児血清、１００単位/ｍｌペニ シリンＧ、１００μｇ/ｍｌストレプトマイシンを含む）で骨髄細胞を押し出し 、良くピペッティングした後骨残査が沈殿するまで待ち、その上清を回収した。それを更に新鮮な培地で１〜２回洗い、アッセイ用の骨髄細胞を調製した。
【００３５】
２．２．２ 破骨細胞分化形成法
上記の骨髄細胞を１０-8Ｍの活性型ビタミンＤ〔１、２５（ＯＨ）2 Ｄ3〕を 含むα−ＭＥＭ培地中にけん濁させ、２×１０6 個細胞／ｍｌの濃度に調製し、９６穴プレートに１８０μｌと２．１．３で調製したアッセイ用サンプルを２０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ2 下、１または２週間培養した。その間、３−４日間隔で培地の３／４を新しい培地と交換し、新たにアッセイ用サンプルを同量添加した。
【００３６】
２．３ 破骨細胞の同定法
２．３．１ ＴＲＡＰ染色法
破骨細胞のマーカー酵素であるＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ）を基質で染色した。即ち２．２．２の培養骨髄細胞をアセトン─クエン酸緩衝液で固定した後、酒石酸存在下で基質（Naphthol AS ─MXphosphate）と色素（ Fastredviolet LB salt）を３７℃で１時間反応させることにより、染色した（ Endocrinology，122，p1373,(1988)）。
（結果）
ＯＰＦａ１２は、既知の破骨細胞分化形成因子であるＩＬ─１β（５０ｎｇ／ｍｌ）やＬＩＦ（２５Ｕ／ｍｌ）で骨髄細胞を処理し、破骨細胞を分化形成させたポジティブコントロールのＴＲＡＰ染色性と比較して、陽性と判断した。
【００３７】
２．３．２ 象牙を用いたｐｉｔ形成法
象牙より直径６ｍｍ、１ｍｍ厚の象牙質スライスを作製し、それを８０％アルコール中で超音波処理することにより滅菌した。α−ＭＥＭ培地で洗浄した後、各スライスを９６ウエルプレートのウエル底に移し、その上で２．２．２の方法に従って骨髄細胞から破骨細胞を分化誘導した。１または２週間後、象牙質スライス上の破骨細胞を２．３．１のＴＲＡＰ染色法にて染色し、０．２５％トリプシン─０．０２％ＥＤＴＡで一晩処理し、スライス上の細胞をシリコンスクレイパーで削り取った。象牙質スライス上のｐｉｔ（吸収窩）を顕微鏡下で観察し、その数またはｐｉｔあたりのメッシュ数を測定することにより骨髄細胞より分化誘導された細胞の骨吸収活性（骨分解活性）を調べた。
（結果）
ＯＰＦａ１２により分化形成された細胞の象牙質スライス上のｐｉｔ形成数は１００個であり、ポジティブコントロールであるＬＩＦ（２５Ｕ／ｍｌ）の３９個に比較して、活性は同等がそれ以上であることが判明した。
【００３８】
２．３．３ カルシトニン受容体の検出
ＬＡＢ−ＴＥＣチェンバースライドを用いて２．２．２の方法により、骨髄細胞から破骨細胞を分化誘導させた後、細胞に０．２μＣｉ／ｍｌの［125Ｉ］サ ケ・カルシトニン（アマシャム）２００μｌを加え、３７℃で１時間反応させ、チャンバーから反応液を除き、ＰＢＳで３回洗浄して反応を停止した。その後、２．５％グルタールアルデヒドで固定し、２．３．１の方法に従ってＴＲＡＰ染色した。スライドグラスからチャンバーを外し、十分に風乾させた後、暗室でエマルジョン（KodakＮＴＢ−２）にさっと浸し、余分のエマルジョンを除き、暗 箱に入れて４℃で２−７日保存した。その後、定法に従い現像し、スライドを風乾させ顕微鏡下で観察した。
（結果）
ＯＰＦａ１２により形成された細胞のオートラジオグラフィーでは、ＴＲＡＰ陽性の赤褐色に染色された細胞にカルシトニン受容体の存在を示す黒化粒子が重なって観察された。
【００３９】
（結論）
以上３通りの同定法において全てに陽性を示したことから、ＯＰＦａ１２により骨髄細胞から分化誘導された細胞は破骨細胞であり、ＯＰＦａ１２は破骨細胞分化促進活性を有している因子であると、判断した。
【００４０】
実施例３
組換えファージＤＮＡのファージミドＤＮＡへの変換
ＺＡＰ ExpressベクターはインサートＤＮＡをｐＢＫ−ＣＭＶへin vivoexcisionすることでサブクローニングすることができる。ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’大腸菌にＺＡＰ ExpressファージとExAssistヘルパーファージを感染させ ることで、ｐＢＫ−ＣＭＶファージミドを産生させ、元の大腸菌を熱処理することで死滅させ、新たにＸＬＯＬＲ大腸菌に感染させた。これに培地を加え、４５分間培養後、ＬＢプレートにプレーティングし、培養した。
【００４１】
実施例４
プラスミドＤＮＡの調製
陽性コロニーを爪楊枝で拾い２ｍｌのＬＢ（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）で一晩培養後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。このプラスミドＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、１％アガロースゲル中で電気泳動し、ＯＰＦａ１２ｃＤＮＡのベクターへの挿入を確認した。
【００４２】
実施例５
ＯＰＦａ１２ｃＤＮＡの塩基配列決定
実施例５で得られたＯＰＦａ１２ｃＤＮＡの塩基配列の決定は、Ｓａｎｇｅｒらによって開発されたダイデオキシ法によって行った（AutoRead Sequencing kit, Pharmacia Biotech社製) 。
その結果、配列表の配列番号：１に記載の２１０４ｂｐからなるｃＤＮＡが得られ、また５６８アミノ酸からなる配列番号：２のアミノ酸配列が決定された。
【００４３】
塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪの９６年１月現在の各データベースを用いて、ＯＰＦａ１２の全塩基配列と既知の塩基配列とのホモロジー検索を、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法により行った。その結果、ラットγ−ＧＴＰと９０．１％、ヒトγ−ＧＴＰと７９．８％一致していた。更にアミノ酸配列は、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴとＰＩＲの９６年１月現在のデータベースを用いて、ＯＰＦａ１２のアミノ酸配列と既知のアミノ酸配列とのホモロジー検索を、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法により行った。その結果、ラットγ−ＧＴＰと９６％、ヒトγ−ＧＴＰと８６．７％一致していた。これらの結果及び、Gene,167,p233 (1995)に記載の配列との比較より、ＯＰＦａ１２はマウス型γ−ＧＴＰであることが判明した。
以下、本発明においてクローニングされたＯＰＦａ１２を、γ−ＧＴＰと称することとする。
【００４４】
実施例６
γ−ＧＴＰの臓器特異的遺伝子発現のノーザンブロット解析
種々の組織由来のｍＲＮＡ、マウス胚の種々の発生段階のｍＲＮＡ、及び種々のヒト癌細胞株由来のｍＲＮＡが、既にブロティングされたＭＴＮブロットメ ンブレン（クローンテック社）を用いて、またプローブとして先にクローニングされたγ−ＧＴＰｃＤＮＡ全長（約２．１ｋｂｐ）を32Ｐでランダムプライム法にて標識したものを用いて、以下のノーザンブロット解析を行った。
すなわち、上記プローブを５０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド／５×ＳＳＣ／５×デンハルト／１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ／０．０１％（ｗ／ｖ）変性サケ精子ＤＮＡ中でフィルターに固定したＲＮＡに４２℃でハイブリダイズさせ、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃中で、次に０．１％ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、５０℃中で洗浄した。水気を除いた後、−８０℃で１−３日間オートラジオグラフィーを行った。使用したＸ線フィルムはコダックＳＢ５またはフジＡＩＦＲＸを増感スクリーンの存在下で用いた。
【００４５】
（結果）
図１には、マウスの各組織（２μｇｍＲＮＡ）のノーザンブロットの結果を示す。γ−ＧＴＰのバンドは腎臓にのみ特異的に発現し、その他の組織では全く検出されなかった。この結果は公知のヒト型γ−ＧＴＰの組織分布と一致していた。
図２には、ヒト胎児の各組織（２μｇｍＲＮＡ）のノーザンブロットの結果を示す。その結果、腎臓の他に、肝臓でより強く発現していた。「従来の技術」の項にも記述したように、肝−胆道系疾患やアルコール摂取に際し、肝臓でγ−ＧＴＰが発現誘導されることが知られている。しかし、胎児の肝臓での発現は未だ報告されておらず、本実施例にてはじめて明らかになったことである。
【００４６】
図３には、マウス７日胚から１７日胚まで（２μｇｍＲＮＡ）のノーザンブロトの結果を示す。その結果、７日胚で最大の発現を示し、１１日胚で最小となった後、徐々に発現量が増大していた。
図４には、ヒトの種々の癌細胞株（２μｇｍＲＮＡ）のノーザンブロットの結果を示す。その結果、骨転移し易くまた高カルシウム血症の合併頻度の高い癌細胞として知られている前骨髄性白血病細胞（HL-60）、Burkittsリンパ腫細胞（Raji）、及び肺癌細胞（A549）において発現していた。
以上の結果から、γ−ＧＴＰは発生期の初期から発現し、胎生期では肝臓と腎臓で、また生体では腎臓で特異的に発現していることが分かった。さらに、骨転移し易くまた高カルシウム血症合併頻度が高いと言われている癌細胞においても発現していることが分かった。
【００４７】
実施例７
γ−ＧＴＰの臓器特異的遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ解析
１．１．１に従い種々の細胞や組織から調製した全ＲＮＡ（１μｇ）より、ＲＴ−ＰＣＲキット（PERKIN ELMER社製）に従い、まず２本鎖ＤＮＡを合成し、それをテンプレートにしてＰＣＲ反応を行った。本遺伝子増幅のためのプライマー配列として、５’プライマー（５’−ＡＴＣＡＴＣＧＧＣＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧ−３’）および３’プライマー（５’−ＧＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡ−３’）を合成した。これらのプライマーの組み合わせで増幅されるＤＮＡサイズは２２８塩基対である。また、コントロールとしてＧ３ＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）プライマー（５’プライマーが（５’− ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣ−３’）、３’プライマーが（５' −ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’）、増幅されるＤＮＡサイズが９８３塩基対）を用いた。反応組成等は標準的手法に従いＤＮＡサーマルサイクラーを用いて、熱変性９４℃で１分間、アニーリング６０℃で１分間、鎖伸張反応７２℃で２分間の条件で３０−４０サイクルで反応を行った。反応混合物の１／１０量を１％アガロースゲルで電気泳動し、バンドを確認した。
【００４８】
（結果）
図５に、各組織の全ＲＮＡ１μｇをテンプレートにして行った結果を示す。その結果、γ−ＧＴＰのクローニング源であるＢＷ５１４７細胞（レーン１）、コラーゲン関節炎モデルの炎症関節・骨部位の細胞（レーン４）、そして腎臓（レーン９）で発現していた。これらの結果は、図１のノーザンブロットの結果と矛盾するものではなかった。なお、同一のＲＮＡを用いてコントロールのＧ３ＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲも行い、これを、各ＲＮＡの分解度の指標とした。
【００４９】
実施例８
γ−ＧＴＰｃＤＮＡの哺乳動物培養細胞による発現
ｐＢＫ−ＣＭＶベクターに実施例２で得られたγ−ＧＴＰｃＤＮＡをサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させた。アルカリ−ＳＤＳ法によりＤＮＡを調製し、２回の超遠心分離法により精製した。この精製ＤＮＡをＣＯＳ−７細胞にLIPOFECTAMINE（GIBCO ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。 その後、細胞を無血清培地で５日間培養し、培養上清を回収してγ−ＧＴＰ培養上清標品とした。
上記培養上清標品の活性は、２．３．１のＴＲＡＰ染色性、２．３．２の象牙質スライスを用いたｐｉｔ形成活性、及び２．３．３のカルシトニン受容体の検出の３種類の同定法で行った。その結果、前記培養上清標品存在下、象牙質スライス上で培養した骨髄細胞は、赤褐色に染色され、ＴＲＡＰ陽性を示した。次に、象牙スライス上のＴＲＡＰ陽性細胞を物理的に削り取った結果、図６（上）に示すようにＴＲＡＰ陽性細胞残渣が残っているものの、ｐｉｔが形成されていた。一方、図６（下）に示すように、ベクターのみを導入した細胞の培養上清を用いて同様の実験を行った場合は、ＴＲＡＰ陽性細胞、ｐｉｔ共に形成されなかった。
【００５０】
図７（上）には、ＯＰＦａ１２ＤＮＡ導入細胞の培養上清存在下で培養した骨髄細胞をＴＲＡＰ染色し、125Ｉ−サーモン・カルシトニン（ホット）を反応させた結果を示す。その結果、カルシトニン受容体の存在を示す黒化粒子が検出された。また、コールドのサーモン・カルシトニンをホットの１０００倍添加した場合、図７（左下）に示すように大量のコールドで希釈され、黒化粒子が消えたことから、カルシトニンとその受容体の結合は特異的であることが確認された。一方、図７（右下）には、ベクターのみを導入した細胞の培養上清を用いて同様の実験を行った結果を示すが、ＴＲＡＰ陰性であり、また黒化粒子も検出されなかった。
以上の結果より、γ−ＧＴＰｃＤＮＡを哺乳動物培養細胞に導入し得られた培養上清は、破骨細胞分化促進活性を有することが明らかとなった。
【００５１】
実施例９
γ―グルタミル基転移触媒活性の測定
γ−ＧＴＰの従来より知られている酵素活性である、γ−グルタミル基の転移触媒活性は、γ−ＧＴ４１９「アスカ・シグマ」キット（SIGMA DIAGNOSTICS)を用いて測定した。即ち、先に調製したγ−ＧＴＰｃＤＮＡ導入細胞の培養上清をＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドとグリシルグリシンを基質として３０℃で反応させ、生じたＬ−γ−グルタミルグリシルグリシンと５−アミノ−２−ニトロ−安息香酸のうち、後者の黄色を４０５ｎｍの吸光度で測定した。反応時間に対する吸光度の増加はγ−ＧＴＰ活性に比例することから、活性を算出した。
その結果、ベクターのみを導入した細胞の培養上清の活性は検出限界以下であったのに対しγ−ＧＴＰＤＮＡ導入細胞の培養上清は、１３Ｕ／Ｌを示した。この結果より、クローニングしたγ−ＧＴＰには、破骨細胞分化促進活性と、従来より知られていたγ−グルタミル基転移触媒活性の両方を有することが確認された。
【００５２】
実施例１０
ラット腎臓由来精製γ−ＧＴＰによる破骨細胞分化促進活性の測定
ラット腎臓由来の精製したγ−ＧＴＰ（Taniguchi N.ら、Biochem.Biophys. Acta, 391, p261 (1995)）を、２．２．１〜２．２．２の破骨細胞分化形成法（以下、骨髄細胞培養系による破骨細胞分化形成法と称す）及び、以下に示す骨髄細胞と骨芽細胞様細胞株との共存培養系による破骨細胞分化形成法の、２種類のアッセイに供した。
すなわち、骨髄細胞と骨芽細胞様細胞株との共存培養系による破骨細胞分化形成法は、以下のようにして行った。まず、２．２．１で調製した骨髄細胞を５×１０-7Ｍの活性型ビタミンＤ｛１，２５（ＯＨ）2Ｄ3｝および１．２５×１０-8Ｍデキサメサゾンを含むα−ＭＥＭ培地中にけん濁させ、２×１０6個細胞／ｍｌの濃度に調製し、９６穴プレートに６０μｌ加えた。一方、骨芽細胞様細胞株であるＳＴ２細胞を骨髄細胞と同じ培地にけん濁させ、４×１０4個細胞／ｍｌの濃度に調製した後、先の骨髄細胞の入った９６穴プレートに１２０μｌ加えた。更に、種々の濃度の精製γ−ＧＴＰを２０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ2下、１週間培養した。その間、３日目に培地の３／４を新しい培地と交換し、新たにアッセイ用サンプルを同量添加した。
これら2種類の破骨細胞分化形成法を施した後、２．３．１のＴＲＡＰ染色法により、ＴＲＡＰ陽性細胞（破骨細胞）数を測定した。
【００５３】
結果を図８に示す。骨髄細胞培養系では、γ−ＧＴＰは酵素活性として９．３Ｕ／ｍｌから９３０Ｕ／ｍｌまでは用量依存的にＴＲＡＰ陽性細胞（破骨細胞）数を増加させた。しかし、９３００Ｕ／ｍｌでは逆に減少したことから、破骨細胞の分化促進活性には至適濃度が存在することが考えられた。ＴＲＡＰ陽性細胞のうち、３核以上の多核巨細胞（多核細胞）数も、９３０Ｕ／ｍｌで最大値を示した。また、骨髄細胞と骨芽細胞様細胞株との共存培養系（共存培養系）では、γ−ＧＴＰは酵素活性として９３００Ｕ／ｍｌまで用量依存的にＴＲＡＰ陽性細胞数もＴＲＡＰ陽性多核細胞数も増加させた。
以上より、γ−ＧＴＰに破骨細胞分化促進活性の存在することが確認された。
【００５４】
実施例１１
抗ラットγ−ＧＴＰ抗体による、ＣＩＡマウスの炎症関節より分離した細胞から破骨細胞への分化の抑制
１１．１ ＣＩＡマウスの作製
Ｅ．Ｄ．Ｔｒｅｎｔｈａｍらの方法（J.Exp., 146, p857 (1977)）に準じた。即ち、酢酸溶液に溶解したウシＩＩ型コラーゲン（コラーゲン研修会）をフロイントの完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と混和し、ＤＢＡ／１Ｊマウス（日本チャールスリバー）の尾根部に皮内注射した。３週間後に追加免疫のためフロイントの不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）に混和したウシＩＩ型コラーゲンを、背部皮下に注射した。
【００５５】
１１．２ 炎症関節部位からの細胞の調製
日本骨代謝学会誌、第12巻、188頁（1994）、Arthritis and Rheumatism, 39, S285 (1996)、および平成６年度厚生省リウマチ調査研究事業研究報告書、130頁に記載の方法に準じた。即ち、コラーゲン関節炎を発症した部位の組織をディスパーゼ（合同酒精）で処理し、浮遊細胞を得た。この細胞を５％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地で３×１０5個細胞／ｍｌの濃度に調製した。
１１．３ 破骨細胞分化形成阻害法
上記で調製した細胞を、ヒドロキシアパタイトでコーティングしたプレート（商品名：Ｏｓｔｅｏｌｏｇｉｃ Ｍｕｌｔｉ−Ｔｅｓｔ：Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｘ Ｉｎｃ．）に１８０μｌ加え、更に、先の精製抗ラットγ-ＧＴＰ抗体を終濃度０〜２００μｇ／ｍｌになるように２０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ2下で５日間培養後、形成されたｐｉｔ数を計測した。その際、ＢＳＡ添加時のｐｉｔ数を１００％として抗体添加時のピット数を相対活性として表した。
【００５６】
１１．４ 結果
結果を図９に示す。非特異的イムノグロブリン（２２０μｇ／ｍｌ）で３０％程度活性が阻害されたが、抗ラットγ−ＧＴＰ抗体は用量依存的にｐｉｔ形成活性を阻害度し、２００μｇ／ｍｌで８６％の活性を阻害した。以上より、抗ラットγ−ＧＴＰ抗体は、破骨細胞への分化を抑制することが明らかとなった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明により、γ−ＧＴＰまたはその活性を保持する誘導体を有効成分として含有する破骨細胞分化促進剤、あるいは該γ−ＧＴＰ等を用いる破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法、さらには該γ−ＧＴＰ等に対する抗体からなる破骨細胞分化促進活性阻害剤、が提供される。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マウス各組織におけるγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により調べた結果の電気泳動写真である。
【図２】図２は、ヒト胎児各組織におけるγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により調べた結果の電気泳動写真である。
【図３】図３は、マウス７日胚から１７日胚までにおけるγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により調べた結果の電気泳動写真である。
【図４】図４は、ヒトの各癌細胞株におけるγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ノーザンブロット解析により調べた結果の電気泳動写真である。
【図５】図５は、骨、炎症部位を含む各組織および細胞におけるγ−ＧＴＰｍＲＮＡの発現分布を、ＲＴ−ＰＣＲ解析により調べた結果の電気泳動写真である。
【図６】図６（上）は、γ−ＧＴＰｃＤＮＡをＣＯＳ細胞で発現させた培養上清中の活性を、ＴＲＡＰ染色及びｐｉｔ形成法により調べた結果の顕微鏡写真である。図６（下）は、ベクターを導入して同様の実験を行った結果の顕微鏡写真である。
【図７】図７（上）は、γ−ＧＴＰｃＤＮＡをＣＯＳ細胞で発現させた培養上清中の活性を、125Ｉカルシトニンの結合（図中、矢印で示す）により示した結果の顕微鏡写真である。図７（左下）は、大過剰のコールドカルシトニンを加えたことで、125Ｉカルシトニンの結合が消失した結果を示した顕微鏡写真である。図７（右下）は、ベクターを導入して同様の実験を行った結果を示した顕微鏡写真である。
【図８】図８は、ラット腎臓から精製したγ−ＧＴＰの破骨細胞分化促進活性を調べた結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ＣＩＡマウスの炎症関節より分離した細胞の破骨細胞への分化を、抗ラットγ−ＧＴＰ抗体が抑制することを示したグラフである。
Claims (5)
- γ−グルタミルトランスペプチターゼ（γ−ＧＴＰ）、または破骨細胞分化促進活性を有するγ−ＧＴＰ誘導体、を有効成分として含有する、破骨細胞分化促進剤。
- 前記γ−ＧＴＰまたは前記γ−ＧＴＰ誘導体を用いることを特徴とする、破骨細胞分化促進活性阻害剤のスクリーニング方法。
- 前記γ−ＧＴＰまたは前記γ−ＧＴＰ誘導体に対する抗体であって、γ−ＧＴＰまたはγ−ＧＴＰ誘導体の破骨細胞分化促進活性を阻害する機能を有する抗体からなる、破骨細胞分化促進活性阻害剤。
- 請求項３記載の破骨細胞分化促進活性阻害剤よりなる、高回転型骨粗鬆症、癌の骨転移に伴う高カルシウム血症又は骨破壊、慢性関節リウマチに伴う骨破壊、あるいは慢性肝疾患に伴う二次性骨減少症、に対する治療薬。
- 請求項１記載の破骨細胞分化促進剤よりなる、低回転型骨粗鬆症に対する治療薬。
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