CN103131005A - 氨基酸嵌段共聚物及其制备方法和复合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）结构的氨基酸嵌段共聚物及其制备方法，本发明还提供了包括上述氨基酸嵌段共聚物和水性介质的复合物。该共聚物中的聚（乙二醇）为亲水段，可保护纳米粒子在血液循环稳定性，苯丙氨酸单元提供强的π-π堆积效应及疏水作用来稳定纳米粒子的组装，防止纳米粒子在血液循环中解体，谷氨酸单元则提供有效的药物运载基团。该嵌段共聚物具有制备简单、生物相容性好、稳定性好；易于与许多生物活性成分进行复合实现高效的药物运载；能够在体内控制释放这些活性药物成分。这些复合物纳米粒子在生物医学领域尤其是肿瘤治疗领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及氨基酸技术领域，尤其涉及氨基酸嵌段共聚物及其制备方法和复合物。
背景技术
聚氨基酸类高分子具有和天然多肽相类似结构和性质，是一类具有良好生物相容性、生物降解性、侧基可修饰性的新型高分子材料，广泛应用于生物医学领域，如生物分离、组织工程、基因治疗和药物控制释放等。
L-谷氨酸聚合物是侧链带有羧基的聚氨基酸，由于其侧羧基的良好反应活性，可以通过静电作用或共价作用担载各种类型的分子或离子化合物，因而具有广阔的应用领域。L-苯丙氨酸聚合物由于其强大的π-π堆积作用和疏水作用可以提高聚合物的组装稳定性，同时也可以通过该作用担载各种疏水的生物活性成分。聚（L-谷氨酸-co-L-苯丙氨酸）将两者的优势结合起来，使该类氨基酸聚合物有着更为广泛的应用前景，但是由于单独的聚氨基酸在生理条件下由于缺乏稳定剂的保护，容易在体内环境下沉积或者被体内的淋巴系统快速的清除，因此大大限制了其作为药物载体方面的应用。为了提高聚氨基酸的性能，向聚氨基酸中引入第二组分是一种常用的制备聚氨基酸嵌段共聚物的方法。其中，聚乙二醇类高分子既溶于水又溶于有机溶剂，同时具有良好的生物相容性、抗凝血性、低免疫性和无毒性，被广泛应用于生物医药领域。
为了提高聚氨基酸在医学上的应用范围，研究者考虑将其作为载体，担载各种具有生物医用活性的成分。专利号为200810050407.X的中国专利公开了一种高分子键合阿霉素药、其纳米胶囊及其制备方法，其中，制备的聚乙二醇-聚乳酸-阿霉素键合药是利用聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的羧基与阿霉素的氨基缩合形成共价键实现了阿霉素的担载。但是这种方法却也带来新的问题，如结构不明确、键合在高分子 上的药物和游离或包裹在载体里的很难区分、化学键作用太强使其从载体上释放困难等难题，从而限制了高分子键合药应用。而利用物理担载抗癌药物的载体由于具有担载过程简单、药物释放机制明确等优势而很多进入临床研究。因此，本发明考虑了一种氨基酸嵌段共聚物，其实现了药物的担载并具有较好的生物相容性与药效持久。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种氨基酸嵌段共聚物，该共聚物用于运载生物活性成分，并具有良好的生物相容性，且药效持久。
有鉴于此，本发明提供了一种氨基酸嵌段共聚物，具有式（Ⅰ）结构或式（Ⅱ）结构：
其中，R1独立的选自氢、烷基或取代烷基；
R2独立地选自-NH-或-R5（CH2）rNH-，R5为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；
R3独立地选自氢或者阳离子；
R4独立地选自氢或疏水基团；
20≤m≤500；5≤n1≤200；5≤n2≤200。
优选的，所述R1独立地选自C1~C40烷基或由巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD类短肽、LHRH类短肽或叶酸取代的烷基。
优选的，所述R3为金属阳离子或有机阳离子，所述金属阳离子为 钠、钾、钙或镁；所述有机阳离子为胺的阳离子。
优选的，所述R4独立地选自C4~C20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基或脱氧胆酸基。
本发明还提供了一种具有式（Ⅰ）结构的氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括：
具有式（III）或式（IV）结构的化合物与受保护的氨基酸单体在有机溶剂中反应，得到带有保护基的化合物；
将所述带有保护基的化合物脱保护，得到具有式（I）结构的氨基酸嵌段共聚物；所述氨基酸单体为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐；
其中，R1独立的选自氢、烷基或取代烷基；
R5为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-；
20≤m≤500；1≤r≤10。
本发明还提供了一种具有式（Ⅱ）结构的氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括：
具有式（Ⅴ）或式（Ⅵ）结构的化合物与受保护的氨基酸单体在有机溶剂中反应，得到带有保护基的化合物；
将所述带有保护基的化合物脱保护，得到具有式（Ⅱ）结构的氨基酸嵌段共聚物；所述氨基酸单体为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐；
其中，R5为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-；
20≤m≤500；1≤r≤10。
本发明还提供了一种复合物，包含：上述方案所述的氨基酸嵌段共聚物和水性介质。
优选的，所述复合物还含有活性成分。
优选的，所述活性成分为药物或生物造影试剂。
优选的，所述复合物的存在状态为胶束、纳米粒子、溶液、粉末或薄膜。
本发明提供了一种具有式（Ⅰ）或式（Ⅱ）结构的氨基酸嵌段共聚物，该物质用于运载生物活性成分。本发明以聚（乙二醇）-b-聚（L-谷氨酸-co-L-苯丙氨酸）为载体，其中聚乙二醇为亲水段，可保护纳米粒子在血液循环稳定性；苯丙氨酸单元提供强的π-π堆积效应及疏水作用来稳定纳米粒子的组装，防止纳米粒子在血液循环中解体；谷氨酸单元则提供有效的药物运载基团。该嵌段共聚物以及基于该嵌段共聚物复合生物医用活性成分的复合物的表面电位为负值，生理条件下具有稳定的胶束组装和体内的长循环。因此，由于乙二醇单元、苯丙氨酸单元与谷氨酸单元的存在，本发明所述的嵌段共聚物用于担载生物活性成分具有良好的生物相容性，且药效持久。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的嵌段共聚物以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例10和实施例12制备的阿霉素复合物的流体力学半径分布图；
图3为本发明实施例10制备的阿霉素复合物的透射电子显微镜照片；
图4为本发明实施例12制备的阿霉素复合物在pH为5.5和7.4的释放结果图；
图5为本发明实施例1~4制备的嵌段共聚物对Hela细胞的毒性考察结果图；
图6为本发明实施例10与实施例14制备的阿霉素复合物以及阿霉素裸药对Hela细胞的毒性考察结果图；
图7为本发明实施例28提供的阿霉素以及阿霉素复合物的细胞内吞激光共聚焦图片。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明实施例公开了一种氨基酸嵌段共聚物，具有式（Ⅰ）结构或式（Ⅱ）结构：
其中，R1独立的选自氢、烷基或取代烷基；
R2独立地选自-NH-或-R5(CH2)rNH-，其中，R5为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；
R3独立地选自氢或者阳离子；
R4独立地选自氢或疏水基团；
m为聚合度，20≤m≤500；n1为谷氨酸聚合度，5≤n1≤200；n2为苯丙氨酸聚合度，5≤n2≤200。
上述式（I）或式（II）所述的聚（乙二醇）-b-聚（L-谷氨酸-co-L-苯丙氨酸）嵌段共聚物，若以聚乙二醇单元为A单元，聚（L-谷氨酸）单元为B单元，聚（L-苯丙氨酸）为C单元，则所述嵌段共聚物为A(BC)或(CB)A(BC)嵌段构型的嵌段共聚物，其中聚氨基酸段L-谷氨酸和L-苯丙氨酸为无规共聚物。
所述R1独立的优选为C1~C40烷基或由巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD类短肽、LHRH类短肽、叶酸取代的烷基。
所述R3中阳离子优选为金属阳离子或有机阳离子；所述金属阳离子优选为钠、钾、钙或镁阳离子；所述有机阳离子优选为胺的阳离子。
所述R4独立的优选为C4~C20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基、脱氧胆酸基。
m为聚合度，20≤m≤500，优选为40≤m≤250；n1为谷氨酸聚合度，5≤n1≤200，优选为10≤n1≤100；n2为苯丙氨酸聚合度，5≤n2≤200，优选为10≤n1≤50。
在本发明中，作为优选方案，所述具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物中，R1为甲基；R2为-NH-；R3为氢；R4为氢；此时，所述氨基酸嵌段共聚物具有式（I-a）或式（II-a）结构；
在式（I-a）或式（II-a）中，m为聚合度，20≤m≤500，优选为40≤m≤250；n1为谷氨酸聚合度，5≤n1≤200，优选为10≤n1≤100；n2为苯丙氨酸聚合度，5≤n2≤200，优选为10≤n1≤50。
本发明还提供了具有式（I）结构的氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括：
具有式（III）或式（IV）结构的化合物与受保护的氨基酸单体在有机溶剂中反应，得到带有保护基的化合物；
将所述带有保护基的化合物脱保护，得到具有式（I）结构的氨基 酸嵌段共聚物；所述氨基酸单体为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐；
其中，R1独立的选自氢、烷基或取代烷基；
R5为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-；
m为聚合度，20≤m≤500；r为聚合度，1≤r≤10。
所述R1独立的优选为C1~C40烷基或由巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD类短肽、LHRH类短肽、叶酸取代的烷基。
所述的（III）或式（IV）结构的单氨基聚乙二醇通过本领域技术人员熟知的方法获得。所述的有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺和二氧六环中的一种或两种，所述反应优选在无水条件下进行。
本发明还提供了一种具有式（Ⅱ）结构的氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括：
具有式（Ⅴ）或式（Ⅵ）结构的化合物与受保护的氨基酸单体在有机溶剂中反应，得到带有保护基的化合物；
将所述带有保护基的化合物脱保护，得到具有式（Ⅱ）结构的氨基酸嵌段共聚物；所述氨基酸单体为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐；
其中，R5为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-；
m为聚合度，20≤m≤500；r为聚合度，1≤r≤10。
所述具有式（V）或式（VI）的聚乙二醇类聚合物通过本领域技 术人员熟知的方法获得。所述的有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺和二氧六环中的一种或两种，所述反应优选在无水条件下进行。
本发明对所述具有式（Ⅰ）结构的嵌段共聚物的制备方法优选按照以下方法制备：
无水无氧条件下，γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐与具有式（III）或式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚在有机溶剂中搅拌反应，得到带有保护基的化合物；将所述带有保护基的化合物脱保护，得到具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物。
所述嵌段共聚物利用具有式（III）或式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚中含有的伯胺基引发γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐发生开环聚合而制备。
所述具有式（III）或式（IV）结构的聚乙二醇单甲醚、所述γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐与L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐的摩尔比优选为1：5~200：5~200，更优选为1：10~100：10~50。所述搅拌反应的温度优选为20℃~30℃。所述搅拌反应的时间优选为48h~96h。
本发明对所述具有式（Ⅱ）结构的氨基酸嵌段共聚物优选按下述方法制备：
无水无氧条件下，γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐与具有式（V）或式（VI）的聚乙二醇在有机溶剂中搅拌反应，得到带有保护基的化合物；将所述带有保护基的化合物脱保护，得到具有式（II）结构的嵌段共聚物；
所述嵌段共聚物利用具有式（V）或式（VI）结构的聚乙二醇含有的伯胺基引发γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐发生开环聚合制备。
所述具有式（V）或式（VI）结构的聚乙二醇、所述γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐的摩尔比优选为1：5~200：5~200，更优选为1：10~100：10~50。所述搅拌反应的温度优选为20℃~30℃。所述搅拌反应的时间优选为48h~96h。
本发明对所述带有保护基的嵌段共聚物脱保护的方法没有特殊 限制，一般选择在溴化氢乙酸溶液中脱保护法。
所述溴化氢乙酸溶液法包括以下步骤：
在冰浴下将带有保护基的化合物溶解于二氯乙酸中，搅拌条件下向得到的溶液中加入溴化氢质量分数为33%的溴化氢乙酸溶液，然后升温至25℃搅拌反应1h，将反应产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，在纯水中透析至少72h，透析过程中换水10~15次，冷冻干燥，得到具有式（I）或式（II）结构嵌段共聚物的冻干粉。
本发明在制备具有式（I）或式（II）结构嵌段共聚物过程中，以γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐为原料，对这两种氨基酸-N-内羧酸酐来源没有特殊限制，可以按照以下方法制备：
L-谷氨酸和苯甲醇在浓硫酸的作用下发生反应，经后处理得到γ-苯甲基-L-谷氨酸酯，所述γ-苯甲基-L-谷氨酸酯与双（三氯甲基）碳酸酯反应，得到γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-内羧酸酐；
L-苯丙氨酸与双（三氯甲基）碳酸酯反应，得到L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐。
本发明还提供了一种复合物，所述复合物用于担载生物医用活性成分，该复合物中含有上述的氨基酸嵌段共聚物和水性介质，所述复合物具有聚谷氨酸段和聚乙二醇段，聚乙二醇段为亲水链段，聚（L-谷氨酸-co-L-苯丙氨酸）段为疏水链段，因此复合物在水性介质中可以自发组装成形成胶束，聚乙二醇段处于胶束外壳，生物活性成分在包裹在聚（L-谷氨酸-co-L-苯丙氨酸）的内核，受到这两部分的保护，可以大大提高其在血液循环中的稳定性。
所述复合物中还含有至少一种活性成分；所述活性成分优选为药物、生物造影试剂。所述药物优选为蒽环类药物或铂类抗癌药物。所述蒽环类药物优选为柔红霉素、阿霉素、阿柔比星、表阿霉素、伊达比星、戊柔比星、米托蒽醌，更优选为阿霉素。所述铂类抗癌药优选为顺铂。所述生物造影试剂优选为近红外染料cy5.5、cy5.0、吲哚菁 绿（ICG），更优选为吲哚菁绿。所述水性介质优选为水、生理盐水、缓冲溶液、葡萄糖注射液、组织培养液或体液，更优选为水或缓冲溶液，所述水或缓冲溶液的pH值优选为6.0~8.0，更优选为7.0~7.6。
本发明所述的复合物可以采用胶束、纳米粒子、溶液、粉末或薄膜的形式。所述复合物存在形式特别优选为稳定的胶束溶液或冻干粉末。本发明的复合物胶束在水性介质中的流体动力学半径优选为10nm~2000nm，更优选为10nm~500nm。
按照本发明，所述复合物胶束的制备方法可以按下述方法制备：生物医用活性成分和具有式（I）或式（II）结构的嵌段共聚物在水性介质中复合，得到复合物胶束。
本发明中所制得的复合物以阿霉素复合物为例进行更加详细的说明:
阿霉素（DOX）是一种广泛用于临床化疗小分子抗癌药，其作用机制主要是阿霉素分子能作用于细胞DNA或RNA，抑制其合成，进而有效杀死肿瘤细胞。该品抗瘤谱较广，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用，适用于急性白血病（淋巴细胞性和粒细胞性）、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌（未分化小细胞性和非小细胞性）、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤，一般作为第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。目前临床多为静脉滴注的方式给药，静注后药物迅速分布全身，毒副作用大，主要表现为：白细胞和血小板减少、脱发、心脏毒性、药物溢出导致的组织溃疡及坏死。同时，其在血液中半衰期短，造成其达到病灶部位的比例很低、对体内脏器产生较大的毒副作用。因此通过高分子载体担载DOX是提高其药效、降低其毒性的重要途径。本发明提供的阿霉素复合物胶束是阿霉素与式（I）或式（II）结构所示的嵌段共聚物在水性介质中通过静电复合作用结合形成的一种复合物。将所述阿霉素复合物胶束经过避光透析、冻干得到阿霉素复合物冻干粉。
在本发明中，所述静电复合优选在避光条件下进行。所述静电复 合的时间优选2h~72h，更优选2h~24h。在所述静电复合过程中，所述嵌段共聚物的羧基浓度优选为0.1mM~100mM，更优选为2mM~20mM。所述水性介质优选为水、生理盐水、葡糖糖注射液、缓冲溶液、组织培养液或体液，更优选为水或缓冲溶液，所述水或缓冲溶液的pH值优选为6.0~8.0，更优选为7.0~7.6。
所述透析时间优选为24h~72h，更优选48h~72h，换水次数优选6~10次。
所述冻干为液氮速冻或其他冷冻方法，在冻干过程中可加入少量冻干保护剂，如小分子氨基酸、各种寡糖、甘露醇中的一种或几种，所述保护剂的加入可有效避免复合物的聚集和提高冻干粉的复溶后复合物的溶解性和分散性。由于本发明涉及的大部分阿霉素复合物具有良好水溶性和复溶后溶解性和分散性，可以不加入所述保护剂。所述阿霉素复合物冻干粉复溶后，测定溶液中阿霉素的浓度为0.01~5mg/mL。
本发明提供了一种氨基酸嵌段共聚物，具有式（I）或式（II）所示的结构，该物质尤其用于运载生物医用活性成分。聚氨基酸类高分子具有良好的生物相容性和生物降解性，本发明以聚（乙二醇）-b-聚（L-谷氨酸-co-L-苯丙氨酸）为载体，其中聚（乙二醇）为亲水段，可保护纳米粒子在血液循环稳定性，苯丙氨酸单元提供强的π-π堆积效应及疏水作用来稳定纳米粒子的组装，防止纳米粒子在血液循环中解体，谷氨酸单元则提供有效的药物运载基团，同时还可以通过控制聚（L-谷氨酸-co-L-苯丙氨酸）无规共聚物中疏水苯丙氨酸和亲水的谷氨酸的量，实现对电位大小、纳米粒子粒径的有效控制。该嵌段共聚物以及基于该嵌段共聚物复合生物医用活性成分的复合物的表面电位为负值，生理条件下具有稳定的胶束组装和体内的长循环。该载体不仅制备简单，无须使用有机溶剂或其他外加辅料，而且具有良好的生物相容性、生物降解性、体内长循环性，同时具有可修饰的功能基团，应用范围较广。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的氨基酸 嵌段共聚物及其制备方法与复合物进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
向干燥的反应瓶内加入4.00g数均分子量为5000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于40mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将2.10gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐与1.53gL-苯丙氨酸-N-内羧酸酐溶解于36mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。
取5.00g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于50mL二氯乙酸中，冰浴下加入15mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。
对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果参见图1，图1为实施例1制备的嵌段共聚物以三氟乙酸作为溶剂时的核磁共振氢谱图。结果表明，实施例1得到的嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R3中100%为氢；所述嵌段共聚物的产率为70%，其中，n1=10，n2=10，m=113，记为mPEG113-b-P(Glu10-co-Phe10)。
实施例2
向干燥的反应瓶内加入4.00g数均分子量为5000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于40mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.20gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐与1.53gL-苯丙氨酸-N-内羧酸酐溶解于60mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在 室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。
取5.0g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于50mL二氯乙酸中，冰浴下加入15mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。
对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，实施例2得到的嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R3中100%为氢；所述嵌段共聚物的产率为70%，其中，n1=20，n2=10，m=113，记为mPEG113-b-P(Glu20-co-Phe10)。
实施例3
向干燥的反应瓶内加入4.00g数均分子量为5000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于40mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将2.10gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐与2.30gL-苯丙氨酸-N-内羧酸酐溶解于45mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。
取5.0g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于50mL二氯乙酸中，冰浴下加入15mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。
对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，实施例3得到的嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R3中100%为氢；所述嵌 段共聚物的产率为70%，其中，n1=10，n2=15，m=113，记为mPEG113-b-P(Glu10-co-Phe15)。
实施例4
向干燥的反应瓶内加入4.00g数均分子量为5000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于40mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.20gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐与2.30gL-苯丙氨酸-N-内羧酸酐溶解于65mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。
取5.0g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于50mL二氯乙酸中，冰浴下加入15mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。
对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，实施例4得到的嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R3中100%为氢；所述嵌段共聚物的产率为70%，其中，n1=20，n2=15，m=113，记为mPEG113-b-P(Glu20-co-Phe15)。
实施例5
向干燥的反应瓶内加入1.60g数均分子量为2000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将2.10gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐与1.53gL-苯丙氨酸-N-内羧酸酐溶解于40mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二 甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。
取5.00g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于50mL二氯乙酸中，冰浴下加入15mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。
对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，实施例5得到的嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R3中100%为氢；所述嵌段共聚物的产率为70%，其中，n1=10，n2=10，m=45，记为mPEG45-b-P(Glu10-co-Phe10)。
实施例6
向干燥的反应瓶内加入1.60g数均分子量为2000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于16mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将2.10gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐与2.30gL-苯丙氨酸-N-内羧酸酐溶解于45mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。
取3.00g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于30mL二氯乙酸中，冰浴下加入9mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。
对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，实施例5得到的嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R3中100%为氢；所述嵌段共聚物的产率为70%，其中，n1=10，n2=15，m=45，记为 mPEG45-b-P(Glu10-co-Phe15)。
实施例7
向干燥的反应瓶内加入1.60g数均分子量为2000的具有式（V）结构的聚乙二醇单甲醚，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.21gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐与3.06gL-苯丙氨酸-N-内羧酸酐溶解于75mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。
取5.00g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于50mL二氯乙酸中，冰浴下加入15mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式（II-a）结构的嵌段共聚物。
对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，实施例7得到的嵌段共聚物具有式（II-a）结构，其中，R3中100%为氢；所述嵌段共聚物的产率为70%，其中，n1=10，n2=10，m=45，记为P(Glu10-co-Phe10)-b-PEG45-b-P(Glu10-co-Phe10)。
实施例8
向干燥的反应瓶内加入1.60g数均分子量为2000的具有式（V）结构的聚乙二醇单甲醚，与60mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于20mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将8.42gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐与3.06L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐溶解于120mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉 降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。
取8.00g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于80mL二氯乙酸中，冰浴下加入24mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式（II-a）结构的嵌段共聚物。
对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，实施例8得到的嵌段共聚物具有式（II-a）结构，其中，R3中100%为氢；所述嵌段共聚物的产率为70%，其中，n1=20，n2=10，m=45，记为P(Glu20-co-Phe10)-b-PEG45-b-P(Glu20-co-Phe10)。
实施例9
向干燥的反应瓶内加入8.00g数均分子量为10000的具有式（III）结构的聚乙二醇单甲醚，与100mL无水甲苯在130℃下共沸除水3h后，减压抽干剩余的甲苯；将得到的固体溶解于80mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液；将4.20gγ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐与1.53gL-苯丙氨酸-N-内羧酸酐溶解于60mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液；在氮气氛围中，将第一溶液与第二溶液混合，在室温、氮气保护条件下搅拌反应72h；反应结束后，减压抽干N,N-二甲基甲酰胺，然后将得到的固体溶解于二氯甲烷中，再用乙醚进行沉降，抽滤，干燥后，得到聚带有保护基的化合物。
取5.0g所述的带有保护基的化合物在25℃下溶解于50mL二氯乙酸中，冰浴下加入15mL溴化氢质量浓度为33%的溴化氢乙酸溶液，搅拌反应1h，将产物用乙醚沉降，过滤、洗涤、干燥后用N,N-二甲基甲酰胺溶解，纯水中透析72h，透析过程中换水10次，然后冷冻干燥得到具有式（I-a）结构的嵌段共聚物。
对得到的嵌段共聚物进行核磁共振分析，结果表明，实施例9得到的嵌段共聚物具有式（I-a）结构，其中，R3中100%为氢；所述嵌段共聚物的产率为70%，其中，n1=20，n2=10，m=227，记为mPEG227-b-P(Glu20-co-Phe10)。
实施例10
将40mg实施例1得到的mPEG113-b-P(Glu10-co-Phe10)溶解于24mL去离子水中，调节pH值为7.0~7.6，加入10mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为4：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-15.76±1.49mV。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，结果参见图2，图2为实施例10和实施例12制备的阿霉素复合物的流体力学半径分布图，实施例10制备的复合物胶束流体力学半径在20nm~300nm之间。利用透射电子显微镜（TEM）观察复合物胶束组装形貌，结果参见图3，图3为实施例10制备的阿霉素复合物的透射电子显微镜照片，结果显示实施例10得到的阿霉素复合物均为球形的自组装结构，粒径分布均匀。
利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例10得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过以下公式计算阿霉素在纳米粒子中的包埋效率（DLE）和包埋量（DLC）；
实施例10制备的阿霉素复合物的包埋效率为98.0%，包埋量为19.6%。
实施例11
将45mg实施例1得到的mPEG113-b-P(Glu10-co-Phe10)溶解于24mL去离子水中，调节pH值为7.0~7.6，加入5mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻 干燥得到载体与阿霉素质量比为9：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-21.51±3.56mV。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，实施例11制备的复合物胶束流体力学半径在20nm~300nm之间。
实施例12
将40mg实施例3得到的mPEG113-b-P(Glu10-co-Phe15)溶解于24mL去离子水中，调节pH值为7.0~7.6，加入10mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为4：1的阿霉素复合物。
利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例12得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为93.1%，包埋量为18.62%。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-13.99±1.39mV。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，结果参见图2，图2为实施例10和实施例12制备的阿霉素复合物的流体力学半径分布图，其中■曲线为实施例10制备的复合物胶束，●曲线为实施例12制备的复合物胶束，实施例12制备的复合物胶束流体力学半径在40nm~400nm之间，由图2可见，随着嵌段共聚物中苯丙氨酸链接数的增加，在相同的载药量下，其制备的复合物胶束的粒径略有增大。
实施例13
将45mg实施例3得到的mPEG113-b-P(Glu10-co-Phe15)溶解于24mL去离子水中，调节pH值7.0~7.6，加入5mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻 干燥得到载体与阿霉素质量比为9：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-18.55±2.39mV。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在70nm~400nm之间。
实施例14
将40mg实施例2得到的mPEG113-b-P(Glu20-co-Phe10)溶解于24mL去离子水中，调节pH值7.0~7.6，加入10mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为4：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-40.77±6.24mV。
利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例14得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为99.9%，包埋量为19.99%。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在20nm~300nm之间。
实施例15
将45mg实施例2得到的mPEG113-b-P(Glu20-co-Phe10)溶解于24mL去离子水中，调节pH值为7.0~7.6，加入5mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为9：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-47.85±7.34mV。
利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例15得到的阿霉素 复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为99.9%，包埋量为9.99%。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在20nm~300nm之间。
实施例16
将33mg实施例2得到的mPEG113-b-P(Glu20-co-Phe10)溶解于24mL去离子水中，调节pH值为7.0~7.6，加入16.5mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为2：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-39.64±5.25mV。
利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例14得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为91.5%，包埋量为30.5%。
对实施例14~16制备的复合物胶束的包埋效率和包埋量进行分析可知，在共聚物mPEG113-b-P(Glu20-co-Phe10)与阿霉素的质量比的比值在2~10的范围时，包封率均在90%以上，可见该嵌段共聚物对阿霉素具有良好的担载能力。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在20nm~300nm之间。
实施例17
将45mg实施例4得到的mPEG113-b-P(Glu20-co-Phe15)溶解于24mL去离子水中，调节pH值为7.0~7.6，加入5mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为9：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-38.77±7.35mV。
利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例15得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为98.1%，包埋量为9.81%。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在30nm~300nm之间。
实施例18
将40mg实施例4得到的mPEG113-b-P(Glu20-co-Phe15)溶解于24mL去离子水中，调节pH值至7.0~7.6，加入10mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为4：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-36.86±6.35mV。
利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例15得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为97.1%，包埋量为19.42%。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在30nm~300nm之间。
实施例19
将40mg实施例4得到的mPEG113-b-P(Glu20-co-Phe15)溶解于24mL去离子水中，调节pH值7.0~7.6，加入20mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为2：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测 试，其Zeta电位为-30.65±5.77mV。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在30nm~300nm之间。
实施例20
将40mg实施例5得到的mPEG45-b-P(Glu10-co-Phe10)溶解于24mL去离子水中，调节pH值7.0~7.6，加入10mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为4：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-25.90±5.56mV。
利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例20得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为99.1%，包埋量为19.82%。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在10nm~300nm之间。
实施例21
将40mg实施例6制备的mPEG45-b-P(Glu10-co-Phe15)溶解于24mL去离子水中，调节pH值7.0~7.6，加入10mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为4：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-22.75±4.77mV。
利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例21得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为98.3%，包埋量为19.66%。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在10nm~300nm之间。
实施例22
将40mg实施例7制备的P（Glu10-co-Phe10）-b-PEG45-b-P（Glu10-co-Phe10）溶解于24mL去离子水中，调节pH值至7.0~7.6，加入10mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为4：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-27.67±3.88mV。
利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例22得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为99.3%，包埋量为19.86%。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在10nm~300nm之间。
实施例23
将40mg实施例8制备的P（Glu20-co-Phe10）-b-PEG45-b-P（Glu20-co-Phe10）溶解于24mL去离子水中，调节pH值7.0~7.6，加入10mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为4：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-55.08±6.76mV。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在 10nm~300nm之间。
实施例24
将40mg实施例9得到的mPEG227-b-P(Glu20-co-Phe10)溶解于24mL去离子水中，调节pH值7.0~7.6，加入10mg阿霉素，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离阿霉素，得到阿霉素复合物胶束；将得到的阿霉素复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与阿霉素质量比为4：1的阿霉素复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-36.86±4.88mV。
利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定实施例22得到的阿霉素复合物中阿霉素的浓度，通过实施例10中的公式计算得到阿霉素在纳米粒子中的包埋效率为98.9%，包埋量为19.78%。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，复合物胶束流体力学半径在20nm~300nm之间。
对实施例11~24制备的复合物胶束的Zeta表面电位进行分析可知，该发明的嵌段共聚物制备的阿霉素复合物胶束表面均带有负电荷。
实施例25
取5mg的实施例12制备的阿霉素复合物溶解在5mL0.01M的pH值为5.5的磷酸盐缓冲溶液中，然后转移至截留分子量为3500的透析袋，用45mL相应pH值的缓冲液进行透析，透析在温度为37℃、转速为100的恒温振荡箱中进行，每隔特定时间取样4mL，并补充相应量的缓冲液；利用紫外-可见光谱在480nm的吸收测定释放液的浓度，得到累计释放百分比随着时间增加的变化关系，释放结果如图4所示，图中■曲线为阿霉素复合物在pH值为7.4的释放结果，●曲线为阿霉素复合物在pH值为5.5的释放结果。由图4可知，该体外释放结果显示阿霉素胶束具有缓释能力，且其释放受pH影响，在pH5.5环境下比pH7.4环境下释放更快。
实施例26
收集对数期Hela细胞，接种入96孔板内，每孔中含有100μL（104个）细胞；在37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养24h；
经过24h后弃去培养液，采用培养基将实施例1、实施例2、实施例3和实施例4制备的嵌段共聚物稀释为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、15.625μg/mL、7.8125μg/mL7个浓度，加入96孔板内，每孔加入200μL，每种浓度3个复孔；在37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养48h；
经过48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，计算得到各个浓度的嵌段共聚物的细胞存活率。
结果参见图5，图5中
柱形图为实施例1制备的嵌段共聚物对Hela细胞的毒性考察结果，
柱形图为实施例2制备的嵌段共聚物对Hela细胞的毒性考察结果，
柱形图为实施例3制备的嵌段共聚物对Hela细胞的毒性考察结果，
柱形图为实施例4制备的嵌段共聚物对Hela细胞的毒性考察结果图，结果表明，在各浓度的嵌段共聚物下细胞存活率均在85%以上，由此证明本发明使用的嵌段共聚物具有良好的生物相容性。
实施例27
收集对数期Hela细胞，接种入96孔板内，每孔中含有100μL（104个）细胞；在37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养24h；
24h后弃去培养液，用培养基将阿霉素纯药及实施例10和实施例12制备的阿霉素复合物稀释为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL6个浓度的样品，将各个样品加入96孔板，每孔加入200μL，每种浓度6个复孔；在37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养48h；
经过48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二甲基四氮唑溴盐溶液，继续培养4h；终止培养，吸去 孔内培养液，每孔加入200μL二甲基亚砜，低速振荡10min，用酶标仪检测各孔在492nm处的吸收值，换算得到各个浓度的阿霉素及阿霉素复合物的细胞存活率。
阿霉素纯药及阿霉素复合物体外抑瘤实验的效果参见图6，图6为本发明实施例10、实施例14制备的阿霉素复合物以及纯药阿霉素对Hela细胞的毒性考察结果图，其中，■曲线为阿霉素裸药对细胞的毒性效果，●曲线和▲曲线分别为实施例10和实施例14制备的阿霉素复合物对细胞的毒性效果，由图6可知，阿霉素复合物与阿霉素均有很强的癌细胞杀伤能力，并呈现明显的计量与药效关系，在部分浓度范围内，担载的阿霉素复合物的细胞存活率更低，其抑瘤效果比纯药更加明显。由此可见，担载后的阿霉素复合物对癌细胞比纯阿霉素有更强大的杀伤能力。
实施例28
收集对数期Hela细胞，调整细胞浓度，接种入6孔板内（每孔2×105个，1.8mL），37°C培养24h；
用培养基稀释DOX和载药纳米粒子，以DOX终浓度5μg/mL为基准，加入200μL溶液；37°C，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养3小时；3h后，弃培养液液，PBS清洗细胞3~5次；弃PBS，每孔加入1mL4%多聚甲醛，固定10分钟；弃甲醛，PBS洗3~5次后，每孔加入1~2μL的DAPI，于1mL PBS中避光标记10分钟，弃标记液，PBS洗5次；加2μl甘油封片，激光共聚焦显微镜观察。
附图7所示为利用激光共聚焦显微镜观察到的阿霉素和担载阿霉素的复合物的细胞内吞结果。A为纯药阿霉素的激光共聚焦显微镜结果，B为实施例14制备的阿霉素复合物的激光共聚焦显微镜结果；DAPI为细胞核核染色剂，DOX为阿霉素荧光，Merged为叠加效果图。如结果所示，裸药阿霉素作为一个小分子能够通过扩散作用快速进入细胞并作用于细胞核；阿霉素复合物在相同时间相同浓度下有更强的进入细胞能力，并且大部分作用细胞核，这与前面实施例28中的体外抑瘤实验结果相符。由于阿霉素复合物是以纳米粒子的形式经过内吞作用进入细胞，该细胞内吞的结果进一步显示了该阿霉素复合物纳米 粒子出色的细胞内吞速度和在细胞内吞单元（内涵体及溶酶体）低的pH作用下的快速释放。
实施例29
将45mg实施例1制备的mPEG113-b-P(Glu10-co-Phe10)溶解于24mL去离子水中，调节pH值至7.0~7.6，加入5mg吲哚菁绿，室温避光搅拌24h，纯水透析48h，换水6次以除去游离吲哚菁绿，得到吲哚菁绿复合物胶束；将得到的吲哚菁绿复合物胶束溶液在无菌条件下迅速冷冻，冷冻干燥得到载体与吲哚菁绿质量比为9：1的吲哚菁绿复合物。
将得到的阿霉素复合物复溶，对形成的复合物胶束进行电位测试，其Zeta电位为-19.76±1.89mV。
复溶后，将阿霉素复合物胶束浓度稀释到0.1mg/mL，利用动态光散射分析，测定胶束的流体力学半径，实施例30制备的复合物胶束流体力学半径在20nm~300nm之间。
利用紫外-可见光谱在780nm的吸收测定实施例29得到的吲哚菁绿复合物中吲哚菁绿的浓度，通过实施例10中的公式计算得到吲哚菁绿在纳米粒子中的包埋效率为96.1%，包埋量为9.61%。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种氨基酸嵌段共聚物，具有式（Ⅰ）结构或式（Ⅱ）结构：
其中，R1独立的选自氢、烷基或取代烷基；
R2独立地选自-NH-或-R5（CH2）rNH-，R5为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1≤r≤10；
R3独立地选自氢或者阳离子；
R4独立地选自氢或疏水基团；
20≤m≤500；5≤n1≤200；5≤n2≤200。
2.根据权利要求1所述的氨基酸嵌段共聚物，其特征在于，所述R1独立地选自C1~C40烷基或由巯基、糖残基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亚胺、马来酰亚胺、生物素、RGD类短肽、LHRH类短肽或叶酸取代的烷基。
3.根据权利要求1所述的氨基酸嵌段共聚物，其特征在于，所述R3为金属阳离子或有机阳离子，所述金属阳离子为钠、钾、钙或镁；所述有机阳离子为胺的阳离子。
4.根据权利要求1所述的氨基酸嵌段共聚物，其特征在于，所述R4独立地选自C4~C20的烷基、苯甲基、胆固醇基、胆酸基或脱氧胆酸基。
5.一种具有式（Ⅰ）结构的氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括：
具有式（III）或式（IV）结构的化合物与受保护的氨基酸单体在有机溶剂中反应，得到带有保护基的化合物；
将所述带有保护基的化合物脱保护，得到具有式（I）结构的氨基酸嵌段共聚物；所述氨基酸单体为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐；
其中，R1独立的选自氢、烷基或取代烷基；
R5为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-；
20≤m≤500；1≤r≤10。
6.一种具有式（Ⅱ）结构的氨基酸嵌段共聚物的制备方法，包括：
具有式（Ⅴ）或式（Ⅵ）结构的化合物与受保护的氨基酸单体在有机溶剂中反应，得到带有保护基的化合物；
将所述带有保护基的化合物脱保护，得到具有式（Ⅱ）结构的氨基酸嵌段共聚物；所述氨基酸单体为γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐和L-苯丙氨酸-N-内羧酸酐；
其中，R5为-O-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-；
20≤m≤500；1≤r≤10。
7.一种复合物，包含：权利要求1~4任一项所述的氨基酸嵌段共聚物和水性介质。
8.根据权利要求7所述的复合物，其特征在于，所述复合物还含有活性成分。
9.根据权利要求8所述的复合物，其特征在于，所述活性成分为药物或生物造影试剂。
10.根据权利要求7~9任一项所述的复合物，所述复合物的存在状态为胶束、纳米粒子、溶液、粉末或薄膜。
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