CN105524272A - 硫辛酸修饰的聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物的制备和应用 - Google Patents
硫辛酸修饰的聚乙二醇-聚氨基酸嵌段共聚物的制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了硫辛酸修饰的聚乙二醇-聚氨基酸两亲三嵌段共聚物的制备和应用，所述两亲三嵌段聚合物的亲水链为聚乙二醇，中间疏水链段为聚谷氨酸苄酯，末端疏水链段为聚苯丙氨酸，且中间链段的侧链用硫辛酸修饰。所述两亲三嵌段聚合物在水中自组装形成外冠为聚乙二醇，中间壳为硫辛酸修饰的聚谷氨酸苄酯，内核为聚苯丙氨酸的聚合物纳米胶束；可以通过对纳米胶束进行交联，得到稳定的还原敏感的壳交联纳米胶束，使得纳米胶束在细胞外和血液中不易解离，从而保证纳米胶束包封的药物稳定；一旦进入肿瘤细胞，纳米胶束则快速解交联而解离，将药物快速释放出来，产生高效治疗效果；克服了药物在体内易泄漏、输送效率低、细胞内释放慢等局限。
Description
技术领域
本发明涉及一种改性的两亲三嵌段聚合物，具体涉及一种中间疏水性链段侧链用硫辛酸修饰的两亲三嵌段聚合物。
背景技术
由于纳米载体可以增强渗透和保留(EPR)效应，对抗癌药物靶向控制释放，近年来，各种纳米载体被开发用于改善癌症化疗效果。聚合物胶束作为一种纳米载体，由于其优异的性质：延长药物循环时间，提高药物溶解度以及增强EPR效应被动靶向肿瘤部位等能力而广泛应用于药物输送。两亲性聚合物通过分子间的相互作用在水中可以自组装形成聚合物纳米胶束(Micelles)。纳米胶束作为药物载体进入体内，可以有效地减少人体网状内皮系统(RES)巨噬细胞的吞噬，能穿越细胞间隙，可通过人体最小的毛细血管及血脑屏障(BBB)并被细胞组织吸收，释放出抗癌胶束杀死癌变细胞。同时，纳米胶束可以避免药物活性丧失，有利于药物的贮藏和运输。因此聚合物纳米胶束在药物的控制释放上具有巨大应用潜力。
将末端官能化的亲水链段作为大分子引发剂开环聚合反应形成具有疏水链段的两亲结构，是制备两亲聚合物的最主要方法之一。常见的术端官能化的亲水链段包括聚乙二醇(PEG)、聚磷酸酯(PEEP)等。常用的可生物降解的疏水链段包括聚酯(聚己内酯，聚丙交酯等)和聚氨基酸(如聚γ-苄酯-L-谷氨酸、聚γ-苄酯-L-天冬氨酸、聚苯丙氨酸和聚亮氨酸等)。作为亲水链段，聚乙二醇(PEG)具有高度的亲水性和良好的生物相容性及血液相容性，能被机体迅速排出体外而不产生任何毒副作用。作为疏水链段，天然和合成的聚氨基酸具有良好的生物相容性，生物降解性，代谢产物对人体无害，且无免疫原性(Wuetal.Biomaterials，2013，34：5262-5272；Wang，etal.SoftMatter，2013，9：692-699；Ding，etal.Polym.Chem.2011，2：2857-2864)。
然而通过自组装形成的两亲聚合物的聚集体如胶束、纳米胶束、聚合物囊泡等药物载体往往不够稳定，注入体内被血液大量稀释而解离，造成药物过早释放而不能将药物输送至靶向位点。通过共价键交联是目前用来提高纳米药物载体稳定性的主要方法。交联可分为核交联或壳交联(Wu，etal.J.Control.Release，2012，164：338-345；Hu，etal.Macromolecules，2013，46：6243-6256；Jin，etal.SoftMatter，2012，8：11809-11816)。但对于理想的药物释放载体而言，需要的是一种对体内环境敏感的可逆交联，即：在体内血液中非常稳定能长循环，进入细胞后，能对胞内环境具有响应性而解除交联，将药物释放出来。近年来，开发具有环境(pH、温度、氧化还原环境等)敏感性的纳米载体成为研究热点之一(Chen，etal.J.Control.Release，2013，169：171-179；Zhong，etal.Biomacromolecules，2013，14：3723-3730)。然而，到目前为止，关于可生物降解的、环境敏感的、可逆交联的纳米药物载体的报道较少。
发明内容
本发明目的是提供一种两亲三嵌段聚合物的制备及应用的方法。
为达到上述目的，本发明具体技术方案是，一种两亲三嵌段聚合物，所述两亲三嵌段聚合物的链段为一种亲水性聚合物和两种疏水性聚合物组成，中间链段的侧链为硫辛酰基。
上述技术方案中，所述亲水聚合物可选用的原料为本领域技术人员公知的原料，所述亲水性聚合物可选自但不限于：聚乙二醇；所述亲水聚合物的分子量为1000～10000Da。所述中间疏水性聚合物可选自但不限于：聚谷氨酸苄酯、聚天冬氨酸苄酯、聚N-苄氧羰基赖氨酸中的一种；所述中间疏水性聚合物的分子量为500～5000Da。所述末端疏水性聚合物可选自但不限于：聚苯丙氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸中的一种；所述末端疏水性聚合物的分子量为2000～10000Da。
上述技术方案中，所述两亲三嵌段聚合物中间链段被硫辛酸修饰，其中硫辛酰基的取代度(每个中间链段聚合物单元中硫辛酸的个数)为20～100％。
制备上述两亲三嵌段聚合物的方法为本领域技术人员公知的技术，以硫辛酸修饰的聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯-聚苯丙氨酸(PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe)的制备为例来说明两亲三嵌段聚合物的制备方法，PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe聚合物可通过对开环聚合得到的聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯-聚苯丙氨酸(PEG-PBLG-PPhe)的侧链进行修饰得到：首先用PEG-NH2对BLG-NCA和Phe-NCA依次开环聚合得到PEG-PBLG-PPhe，然后用乙二胺将所得聚合物胺解后再与硫辛酸发生酰化反应，制备一系列硫辛酸修饰的聚谷氨酸链段单元的PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe，其合成路线如图1所示。
上述技术方案中，所述两亲三嵌段聚合物中硫辛酸修饰的聚谷氨酸链段单元可通过加入的BLG-NCA与PEG、Phe-NCA的比例、反应时间、反应温度等来调节。
上述技术方案中，由于聚乙二醇作为亲水链段，两种聚氨基酸作为疏水链段，得到两亲性三嵌段聚合物，可以自组装形成纳米胶束，然后可以通过还原剂如二硫代苏糖醇(DTT)对壳上的硫辛酰基的五元环进行交联，来增加纳米胶束的稳定性，形成壳交联纳米胶束，这种壳交联纳米胶束对细胞内的还原环境敏感，能解除交联。
因此，本发明的另一目的为提供一种交联纳米胶束。
为达到上述目的，本发明具体技术方案是，一种交联纳米胶束，所述纳米胶束的外冠亲水层由亲水性聚合物构成，中间壳由硫辛酸修饰的疏水性聚合物构成，内核疏水层由疏水性聚合物构成。
上述技术方案中，所述交联纳米胶束的粒径为30～200纳米，粒径分布PDI为0.05～0.35。
制备上述交联纳米胶束的方法包括以下步骤：
(1)将上述两亲三嵌段聚合物通过自组装形成纳米胶束，所述纳米胶束的外冠亲水层由亲水性聚合物构成，中间壳由侧链为硫辛酰基的疏水性聚合物构成，内核疏水层由疏水性聚合物构成；
(2)将步骤(1)中纳米胶束的中间壳层交联，通过对硫辛酰基的五元环的交联来稳定纳米胶束结构，得到壳交联纳米胶束。
上述技术方案中，步骤(1)中所述两亲三嵌段聚合物在水中自组装形成以两种聚氨基酸为疏水部分的尺寸稳定，分布均一的纳米胶束，所述纳米胶束的粒径为30～200nm。
上述技术方案中，步骤(2)中所述的交联可采用但不局限于下列方法：
利用巯基-二硫键交换(thiol-disulfideexchange)反应，通过1，4-二硫代-D，L-苏丁醇(DTT)对步骤(1)所得纳米胶束中的含二硫键的五元环进行化学交联；其中，1，4-二硫代-D，L-苏糖醇(DTT)的用量相对于取代的硫辛酸的摩尔数的5～30％，纳米胶束能够被成功交联。
上述技术方案所得壳交联纳米胶束的稳定性相对于没有交联的纳米胶束大大提高，即使稀释100倍(模拟IV注射)也不发生解离；对150mM的氯化钠盐的水溶液稳定，粒径变化不大。
上述技术方案所得壳交联纳米胶束在还原环境中可以被解交联，用以解交联的还原剂可选自但不限于：含巯基的分子，如1，4-二硫代-D，L-苏糖醇(DTT)，谷胱甘肽(GSH)或含三价磷的化合物，如三(2-氯乙基)磷酸酯(tris(2-carboxyethyl)-phosphine，TCEP)；例如当DTT的浓度为10mM的时候，上述壳交联纳米胶束会被解交联。
因为上述壳交联纳米胶束具有还原敏感性，所以可以应用所述壳交联纳米胶束作为药物载体，可提高壳交联纳米胶束在体内血液循环时的稳定性，提高交联纳米胶束被肿瘤细胞内吞的效率，从而提高药物的生物利用度，同时壳交联纳米胶束可方便排除体外。
本发明的另一目的为提供上述壳交联纳米胶束的应用，所述壳交联纳米胶束作为药物载体的应用。
为达到上述目的，本发明的具体技术方案为，应用上述两亲三嵌段聚合物作为药物载体的方法，包括以下步骤：
(1)药物先溶在有机溶液中，再与所述两亲三嵌段聚合物的有机溶液共同搅拌，然后再滴加二次水，将得到的溶液搅拌1小时后透析，得到包裹药物的纳米胶束；
(2)对形成的纳米胶束加入5～30mol％相对于双硫键的1，4-二硫代-D，L-苏糖醇(DTT)对壳上硫辛酰基进行交联得到包裹药物的壳交联纳米胶束。
上述技术方案中，所述药物可选自但不局限于：疏水性药物中的一种。本领域技术人员可以根据需要选择所需包封的药物分子。
优选的技术方案中，PEG-pGlu(EDA-LA)10-PPhe，其中，PEG具有优异的生物相容性，在体内能溶于组织液中，能被机体迅速排出体外而不产生任何毒副作用，其安全性得到FDA认证；聚氨基酸生物相容性好，在体内可被酶降解成小分子而被排出体外，其侧链可以接上药物，交联剂或者是能改进高分子的物理性质的侧基；硫辛酸是FDA批准的一种内源性的抗氧化剂，可以去除机体自由基，降低血糖。因此整个体系具有非常优良的生物相容性。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
(1)由于本发明的两亲三嵌段聚合物中间壳层的疏水链段侧链修饰有硫辛酰基，因此可以通过对两亲三嵌段聚合物自组装形成的纳米胶束进行交联，得到稳定的还原敏感性壳交联纳米胶束，该壳交联纳米胶束在细胞外和血液中不易解离，从而保证纳米胶束包封的药物稳定；克服了药物在体内易被泄漏、运载效率低等不足。
(2)一旦进入肿瘤细胞，壳交联纳米胶束在细胞还原性条件下则快速解交联而解离，药物快速释放出来，从而产生高效治疗作用；
附图说明
图1是PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe两亲三嵌段聚合物的合成路线图；
图2是PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe载药交联胶束的制备及其在细胞内还原响应性药物释放过程示意图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一，合成聚合物PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe20(DP＝10，PEG：Mn＝5kDa)
在氮气保护下，将CH3O-PEG-NH2(0.3g，0.06mmo)溶于干燥DMF(3mL)中，向其中加入BLG-NCA(189.4mg，0.72mmol)，将体系升温至35℃，搅拌反应24h后，再向其中加入Phe-NCA(252.1mg，1.32mmol)以及DMF(6mL)，继续在35℃下，搅拌反应24h。在无水乙醚中沉降得到PEG-PBLG-PPhe三嵌段聚合物。
在氮气保护下，将PEG-PBLG-PPhe(0.2g，0.182mmol的苄基官能团)在40℃下溶解于干燥的DMF(4mL)中，向其中加入蒸馏过的乙二胺(0.656g，10.92mmol)，搅拌反应36h后，向体系中滴加10％的乙酸溶液(12mL)，用0.01M的HCl水溶液透析3次，蒸馏水透析3次，冷冻干燥得到PEG-pGlu(EDA)-PPhe聚合物盐酸盐。
在氮气保护下，将PEG-pGlu(EDA)-PPhe(0.08g，0.00727mmol)溶于干燥的DMF(4mL)中，再向其中依次加入硫辛酸(21.42mg，0.104mmol)，DCC(22.25mg，0.108mmol)，NHS(11.96mg，0.104mmol)，TEA(14.22mg，0.141mmol)，在室温下搅拌反应2d后，抽滤除去DCU，最后用无水乙醚沉降两次得到PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe聚合物。真空干燥48小时，产率71％。核磁结果表明其结构为PEG-pGlu(EDA-LA)10-PPhe，其中硫辛酸修饰的聚谷氨酸链段单元聚合度为10。
实施例二，合成聚合物PEG-pGlu(EDA-LA)5-PPhe20(DP＝5，PEG：Mn＝5kDa)
在氮气保护下，将CH3O-PEG-NH2(0.4g，0.08mmo)溶于干燥DMF(4mL)中，向其中加入BLG-NCA(126.2mg，0.48mmol)，将体系升温至35℃，搅拌反应24h后，再向其中加入Phe-NCA(336.2mg，1.76mmol)以及DMF(8mL)，继续在35℃下，搅拌反应24h。在无水乙醚中沉降得到PEG-PBLG-PPhe三嵌段聚合物。
在氮气保护下，将PEG-PBLG-PPhe(0.3g，0.1945mmol的苄基官能团)在40℃下溶解于干燥的DMF(6mL)中，向其中加入蒸馏过的乙二胺(0.58g，9.726mmol)，搅拌反应36h后，向体系中滴加10％的乙酸溶液(7.2mL)，用0.01M的HCl水溶液透析3次，蒸馏水透析3次，冷冻干燥得到PEG-pGlu(EDA)-PPhe聚合物盐酸盐。
在氮气保护下，将PEG-pGlu(EDA)-PPhe(0.14g，0.09369mmol)溶于干燥的DMF(4mL)中，再向其中依次加入硫辛酸(25.1mg，0.1218mmol)，DCC(26.1mg，0.1265mmol)，NHS(14.0mg，0.1218mmol)，TEA(30.3mg，0.3092mmol)，在室温下搅拌反应2d后，抽滤除去DCU，最后用无水乙醚沉降两次得到PEG-pGlu(EDA-LA)-PPhe聚合物。真空干燥48小时，产率65％。核磁结果表明其结构为PEG-pGlu(EDA-LA)5-PPhe，其中硫辛酸修饰的聚谷氨酸链段单元聚合度为5。
实施例三，PEG-pGlu(EDA-LA)10-PPhe20(DP＝10，PEG：Mn＝5kDa)纳米胶束制备
聚合物PEG-pGlu(EDA-LA)10-PPhe纳米胶束通过透析方法制备。具体过程是：将2mg聚合物PEG-pGlu(EDA-LA)10-PPhe溶在1mL二甲亚砜中，在25℃搅拌条件下，向其中滴加5mL去离子水。得到的溶液搅拌1h后，装入预先准备好的透析袋中(SPECTRA/POR，MWCO：3500)，用去离子水透析24h。纳米胶束130.2纳米，粒径分布为0.188。
实施例四，PEG-pGlu(EDA-LA)5-PPhe20(DP＝5，PEG：Mn＝5kDa)纳米胶束制备
聚合物PEG-pGlu(EDA-LA)5-PPhe20纳米胶束通过透析方法制备。具体过程是：将2mg聚合物PEG-P(BLG-LA)5-PPhe20溶在1mL二甲亚砜中，在25℃搅拌条件下，向其中滴加5mL去离子水。得到的溶液搅拌1h后，装入预先准备好的透析袋中(SPECTRA/POR，MWCO：3500)，用去离子水透析24h。纳米胶束尺寸为145.1纳米，粒径分布为0.198。
按照实施例三和例四制备不同单元的壳层链段聚合物，并测试所得两亲三嵌段聚合物形成的纳米胶束的尺寸和分布，结果如表1所示：
表1不同单元的壳层链段的两亲三嵌段聚合物纳米胶束
实施例五，PEG-P(BLG-LA)10-PPhe20(DP＝10，PEG：Mn＝5kDa)纳米胶束壳交联
为了得到壳交联的聚合物纳米胶束，将实施例三中形成的聚合物纳米胶束(0.45毫克/毫升)溶液调节pH至8.5，并通氮气10分钟，加入1mg/mL1，4-二硫代-D，L-苏丁醇(DTT)25.3μL，将混合液在室温氩气保护条件下搅拌反应24小时。得到的壳交联纳米胶束用去离子水透析，除去没反应的DTT。壳交联纳米胶束尺寸为113.0纳米，粒径分布为0.219，对高度稀释(模拟静脉注射)，生理盐度(150mM)有显著的稳定性。
实施例六，PEG-P(BLG-LA)5-PPhe20(DP＝5，PEG：Mn＝5kDa)纳米胶束制备
为了得到壳交联的聚合物纳米胶束，将实施例四中形成的聚合物纳米胶束(0.50毫克/毫升)溶液调节pH至8.5，并通氮气10分钟，加入1mg/mL1，4-二硫代-D，L-苏糖醇(DTT)12.6μL，将混合液在室温氩气保护条件下搅拌反应24小时。得到的壳交联纳米胶束用去离子水透析，除去没反应的DTT。壳交联纳米胶束尺寸为124.0纳米，粒径分布为0.239，对高度稀释(模拟静脉注射)，生理盐度(150mM)有显著的稳定性。
按照实施例五和例六制备不同单元的壳层链段聚合物的壳交联纳米胶束，并测试形成的壳交联纳米胶束的尺寸和分布，结果如表2所示：
表2不同单元的壳层链段两亲三嵌段聚合物的壳交联纳米胶束
实施例七：过量DTT使壳交联的聚合物纳米胶束解交联PEG-P(BLG-LA)10-PPhe20(DP＝10，PEG：Mn＝5kDa)
氩气保护下，将称好的DTT加到2.0ml交联了的Dex-LA聚合物纳米胶束(0.001毫克/毫升)的玻璃样品池中，使最终DTT的浓度分别是0，10mM。
Claims (9)
1.一种两亲三嵌段聚合物，其特征在于：所述两亲三嵌段聚合物的链段由一种亲水性聚合物和两种疏水性聚合物组成，中间链段的侧链为硫辛酰基。
2.根据权利要求1所述的两亲三嵌段聚合物，其特征在于：所述亲水性聚合物选自聚乙二醇；所述亲水聚合物的分子量为1000～10000Da。所述中间疏水性聚合物选自：聚谷氨酸苄酯、聚天冬氨酸苄酯、聚N-苄氧羰基赖氨酸中的一种；所述中间疏水性聚合物的分子量为500～5000Da。所述末端疏水性聚合物选自：聚苯丙氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸中的一种；所述术端疏水性聚合物的分子量为2000～10000Da。
3.根据权利要求1所述的两亲三嵌段聚合物，其特征在于：所述两亲三嵌段聚合物中间链段被硫辛酸修饰，其中硫辛酰基的取代度(每个中间链段聚合物单元中硫辛酸的个数)为20～100％。
4.一种交联纳米胶束，其特征在于：所述交联纳米胶束由权利要求1、2或3所述的两亲三嵌段聚合物构成，所述交联纳米胶束的外冠亲水层由亲水性聚合物构成，中间壳由硫辛酸修饰的疏水性聚合物构成，内核疏水层由疏水性聚合物构成。
5.根据权利要求4所述的交联纳米胶束，其特征在于：所述交联纳米胶束的粒径为30～200纳米，粒径分布PDI为0.05～0.35。
6.根据权利要求4所述的交联纳米胶束，其特征在于：制备上述交联纳米胶束的方法包括以下步骤：
(1)将权利要求1、2或3所述的两亲三嵌段聚合物通过自组装形成纳米胶束，所述纳米胶束的亲水外冠由亲水性聚合物构成，中间壳层由侧链为硫辛酰基的疏水性聚合物构成，内核疏水层由疏水性聚合物构成；
(2)将步骤(1)中纳米胶束的中间壳层交联，通过对硫辛酰基的五元环交联来稳定纳米胶束结构，得到壳交联纳米胶束。
7.根据权利要求6所述的壳交联纳米胶束，其特征在于：步骤(2)中所述的交联方法为：
利用巯基-二硫键交换反应，通过1，4-二硫代-D，L-苏糖醇对步骤(1)所得纳米胶束中的含二硫键的五元环进行化学交联；其中，1，4-二硫代-D，L-苏糖醇(DTT)的用量相对于取代的硫辛酸的摩尔数的5～20％。
8.权利要求4、5、6、和7所述的壳交联纳米胶束作为药物载体的应用。
9.应用权利要求4、5、6、或7所述的壳交联纳米胶束作为为药物载体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)药物先溶在有机溶液中，再与权利要求所述两亲三嵌段聚合物的有机溶液共同搅拌，然后再滴加二次水，将得到的溶液搅拌后透析，得到包裹药物的纳米胶束；
(2)对形成的纳米胶束加入5～20mol％相对于双硫键的1，4-二硫代-D，L-苏糖醇进行交联得到包裹药物的壳交联纳米胶束；
(3)步骤(2)中包裹药物的壳交联纳米胶束在还原性环境下，DTT含量大于等于10mM时，解交联释放药物。
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